ITBO20070037A1 - Preparazione di n-alchilsolfonati della fenotiazina di elevata purezza e loro uso nei saggi chemiluminescenti per la misura dell'attivita' della perossidasi - Google Patents
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Description
PREPARAZIONE DI N-ALCHILSOLFONATI DELLA FENOTIAZINA DI
ELEVATA PUREZZA E LORO USO NEI SAGGI CHEMILUMINESCENTI
PER LA MISURA DELL’ ATTIVITÀ' DELLA PEROSSIDASI
I derivati solubili in acqua della fenotiazina, e specialmente gli N-alchilsolfonati descritti nella presente invenzione, sono composti utili in varie applicazioni commerciali, incluso l’utilizzo come reagenti per saggi chimici e biologici, e in particolare come intensificato ri dell’attività dell’enzima perossidasi nei saggi chemiluminescenti con luminolo, e come acceleratori in sistemi perossidasi/acceleratore nella composizione di detergenti e in sistemi per la conversione dell’energia solare in energia chimica o elettrica.
La classe di composti concernente la presente invenzione può essere rappresentata dalla formula:
dove M<+>è un catione ed n è un numero intero. Il catione può essere H\ un catione monovalente (such as H\ Na\ Li<+>. K<+>, NH4<+>), altri cationi inorganici, cationi organici, eccetera, o cationi polivalenti (inclusi i cationi divalenti) in cui la carica rimanente è soddisfatta da altri anioni (ad esempio alogenuri, nitrati, solfati, fosfati) o formare sali multipli con altre molecole di N-alchilsolfonati della fenotiazina. La catena alchilica -(CRiR2)n- che connette il gruppo solforico all'azoto della fenotiazina può contenere un qualsiasi numero di gruppi metilenici ≥ 2, anche se n = 3 (propile) and n= 4 (butile) sono particolarmente preferiti. I gruppi metilenici CR1R2presentì nella catena alchilica possono essere disostituiti , monosostituiti o non sostituiti.
Questa classe di composti è relativamente costosa, soprattutto perché le procedure di sintesi utilizzate attualmente sono inefficienti. Inoltre, e più significativamente, ì prodotti preparati con le attuali procedure sono molto difficili da ottenere nella forma estremamente pura richiesta nei saggi immunoenzimatici basati sulla determinazione dell’attività della perossidasi tramite chemiluminescenza.
Un processo sintetico per la sintesi del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio è descritto da Y. Kawanishi, N. Kìtamura and S, Tazuke, J. in “Coulombic Effect of Photoinduced Electron-Transfer Reactions between Phenothiazines and Viologens”, J. Phys. Chem, 1986; 90:2469-2475. Questo metodo richiede due passaggi:
(1) Si fa reagire il sale sodico della fenotiazina con un eccesso di 1 ,3-dibromopropano. II prodotto, la 10-(3-bromopropil)fenotiazina è ottenuto con una resa dei 18% dopo purificazione cromatografia su colonna (AhO^/esano),
(2) La 10-(3-bromopropil)fenotiazina purificata è fatta reagire con un leggero eccesso di solfito di sodio in acetonitrile-acqua (4/1 v/v). Il solvente è allontanato, e il prodotto grezzo è sciolto in una piccola quantità di metanolo e reprecipitato con benzene secco. Il precipitato è raccolto su filtro, seccato e purificato per cromatografia su gel. Il prodotto purificato, il 3-(fenotiazin-10-il)propano-1 -soffocato di sodio è ottenuto con una resa del 51% ,
In questa maniera si ottiene il composto desiderato, il sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato con una resa totale di appena il 9%, e con massiccio impiego di costosi metodi cromatografici. Una procedura simile è descritta anche da M, Sakaguchi, M. Hu and L. K, in “Photoionization of Alkylphenothiazines in Vescicles: Effects of thè Alkyl Chain Length and thè Vesicle Surface Charge", J. Phys. Chem, 1990; 94:870-874; la resa non è indicata).
Nel brevetto Statunitense No. US 5,171,668 “Method of thè Chemiluminescence Assays of thè Activity of Peroxidase”, assegnato a Fujirebio, si descrive per la prima volta l’uso delle fenotiazìne N-aìchilsolfonate, ed in particolare il 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato di sodio, come intensificatori delia chemiluminescenza del lumìnolo. Tale brevetto non contiene alcuna descrizione della procedura specifica di preparazione delle fenotiazìne alchi (solfo nate utilizzate come intensificatori, ma si limita a citare i metodi generali di sintesi di fenotiazìne riportati in Bodea et al., Advances in Heterocyclic Chemistry, 1968; 9:322-460. Le prestazioni ottenute da Fujirebio con le fenotiazine aichìlsolfonate, ed in particolare con il 3-(fenotiazìn-10-ii)propan-1 -solfonato di sodio, non sono peraltro significativamente superiori a quelle osservate con un intensificatore di riferimento come il 4-iodofenolo, se non nei termini piuttosto vaghi dì una "maggior riproducibilità".
In contrasto, il brevetto Statunitense No. US 6,432,662 “Assay of Peroxidase Activity", assegnato a Pierce, descrive un metodo per il saggio dell’attività delia perossidasì che pur utilizzando gli stessi intensificatori descrìtti nel brevetto Fujirebio US 5,171,668, ed in particolare il 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio, rivendica prestazioni molto superiori in termini di intensità e cinetica del segnale chemiluminescente. Secondo il brevetto US 6,432,662 tale differenza in prestazioni è attribuita alla presenza di impurezze presenti nell’intensificatore. In particolare, la presenza dì fenotiazina nell’intensificatore disattiva l'enzima perossidasì ed è quindi estrememente deleteria per la produzione del segnale chemiluminescente. Il metodo indicato in US 6,432,662 per la preparazione deli’intensifìcatore, il 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio, è quello precedentemente citato di Y. Kawanishi, N. Kitamura and S. Tazuke. Il brevetto Statunitense No. US 6,432,662 dichiara inoltre che il prodotto ottenuto con tale procedura contiene “impurezze, o tracce di impurezze che non sono eliminabili tramite i metodi convenzionali noti all’arte", senza tuttavia rivelare alcun metodo specìfico di purificazione,
D’altra parte, occorre sottolineare che la necessità di impiegare materiali di elevata purezza nei substrati per la chemiluminescenza è ampiamente nota
Per esempio, nell’articolo di M.A. Motsenbocker e K. Kondo, “Improvements to Enhanced Horseradish Peroxidase Detection Sensìtivity” J. Biolum. Chemilumin., 1994; 9:15-20 (1994) si dichiara che: Ί risultati sono coerenti con un semplice meccanismo di interferenza, secondo cui i radicali dell’intensificatore prodotti dall’enzima sono neutralizzati preferenzialmente da contaminanti presenti nel iuminolo, nell’ intensifica tore e nel solvente utilizzato per solubilizzare l’intensificatore. Il consumo di questi intereferenti ritarda l’emissione di luce e reduce il limite di rivelabilità della perossidasi (HRP).
E' evidente che il metodo di sintesi del sodio 3-(fenotiazin-10-i!)propan-1- solfonato inizialmente descritto da Y. Kawanishi, N. Kitamura and S. Tazuke e successivamente utilizzato in US 6,432,662 è non solo inefficiente (resa totale 9%), ma genera un prodotto contaminato da impurezze molto difficili da eliminare. La presenza di tali impurezze è incompatibile con l’impiego del 3-(fenotiazìn-10-il)propan-1 -solfo nato di sodio come intensificato re della chemiluminescenza nei saggi per la determinazione della perossidasi.
BREVE DESCRIZIONE DELL’ INVENZIONE
Un’ oggetto della presente invenzione è un nuovo metodo per la sintesi di fenotiazina N-alchilsolfonati di purezza eccezionale e con alte rese. Il metodo consiste nella reazione dell’anione della fenotiazina con alchil sultoni (solfonati ciclici) in un solvente opportuno. Si tratta di una procedura semplice e diretta, basata sulla cristallizzazione del prodotto puro dalla miscela di reazione. Al contrario, le impurezze rimangono in soluzione e quindi sono rimosse in maniera estremamente semplice ed efficace. La straordinaria purezza delle fenotiazine N-alchilsolfonate ottenute con il metodo della presente invenzione è di essenziale importanza per il loro utilizzo come infensificatori della chemiluminescenza nei saggi dell'attività della perossidasi. Ciò costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione.
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL’INVENZIONE
Al contrario del metodo di letteratura, che necessita di due passaggi, Sa procedura della presente invenzione richiede un solo passaggio.
In particolare, l'anione della fenottazìna è generato in situ per aggiunta di una base forte, quale il sodio idruro, la sodio amide, il butil litio, la litio diisopropilamide e simili, in un solvente opportuno, quale il tetraidrofurano, il dietil etere, il t-butilmetil etere, il diossano, il dimetil o il dietil etere del glicole etilenico, il dimetil o il dietil etere del diglicole etilenico, e altri solventi simili.
Si aggiunge poi un estere alchilsolfonico ciclico, noto anche come sultone, puro o in discioìto nel solvente. La catena alchilìca , [-(CRiR2)n-], presente nell'estere alchilsolfonico ciclico può essere una semplice catena alchilìca non sostituita, [— (CH2)n— ]fdove n = ≥ 2, o gli atomi di idrogeno possono essere sostituiti parzialmente o interamente. Sostiuenti tipici sono i gruppi alchilici, specialmente gruppi metilici, atomi di fluoro, gruppi trifluorometilici, eteri metilici, etilici o alchilici. Sono preferite semplici catene alchiliche non sostuitite. Specialmente preferiti sono gli esteri alchilsolfonici ciclici con n=3 (1,3-propan sultone) e n=4 (1,4-butan sultone). Al termine della reazione il prodotto si separa spesso dalla soluzione in forma cristallina e con elevato grado di purezza. Se si desidera un grado ancora maggiore di purezza, è sufficiente ricristallizzare il prodotto da etanolo, acqua, o loro miscele.
Possono essere utilizzati altri alchil sultonì, tra cui 1-(2-etossì-1 ,1 ,3,3,3-pentafluoro)-propan sultone, che può essere preparato per reazione di triossido di zolfo con alcheni fluorurati. Analogamente si possono utilizzare altri sultoni ottenibili per reazione di alcheni e dieni con S03-diossano. Ad esempio, il 2,3,3-trimetilbutene reagisce con S03-diossano per dare il 1-(2, 3, 3-trimetil)butan-3-su Itone.
I prodotti ottenuti con il metodo della presente invenzione, e in particolare il 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio e il 4-(fenotiazin~10-il)butan-1-solfonato di sodio sono di purezza molto elevata. In partìcolar modo sono totalmente esenti da tracce di fenotiazina, che causa la disattivazione dell'enzima perossidasi, quale la perossidasi del rafano.
La straordinaria purezza del sodio 3-(fenotiazin-10-il)propan solfonato e del sodio 4-(fenotiazin-10-il)butan solfonato ottenuti con il metodo della presente invenzione ne consente l’impiego come intensificatori della chemiluminescenza anche in quantità considerevolmente elevate.
Ad esempio, una tipico substrato per la rivelazione chemiluminescente dell'attività della perossidasi contiene (a) il sale sodico del luminolo preferibilmente in concentrazione compresa fra 2 e 12 mM, più preferibilmente in concentrazione compresa fra 5 e 10 mM; contiene inoltre (b) un intensificatore, 3-{fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio o 4-{fenotiazin-10-il)butan-1 -solfonato di sodio, preparati secondo la presente invenzione, preferibilmente in concentrazione compresa fra 2 e 8 mM, più preferibilmente nella concentrazione compresa fra 3 e 6 mM; ed inoltre (c) una sorgente di perossido, preferibilmente In concentrazione compresa fra 2 e 10 mM, e più preferìbilmente in concentrazione compresa fra 4 e 8 mM. La soluzione substrato, nota anche come soluzione di lavoro, è tamponata preferibilmente fra pH 7,8 e 9,0, più preferibilmente tra pH 8,2 e pH 8,8. Il tampone utilizzato può essere il Tris, la tricina, ecc.
La soluzione substrato può essere preparata al momento dell’uso, oppure può essere ottenuta mescolando due soluzioni contenenti rispettivamente il luminolo e l’intensificatore e la sorgente di perossido. Una volta preparata, la stabilità della soluzione substrato è limitata a circa 24 ore, se mantenuta a 4-8 °C. Una formulazione particolarmente preferita consiste in:
- Soluzione A: (in Tris 0,3 M, pH 9,6): sodio luminolo, 10,0 mM; sodio 3-(fenotiazm-10-il)propan solfonato, 6,0 mM.
- Soluzione B: (in Tampone acetato 50 mM): sodio perborato 8,0 mM in Tampone Acetato 50 mM
Entrambe le soluzioni sono stabili per almeno 12 mesi a 4-8<D>C. La soluzione di lavoro viene preparata al momento dell'uso mescolando volumi uguali delle soluzioni A e B, Il pH della miscela deve essere compreso compreso fra pH 8,4 e 8,7.
Occorre comunque tener presente che dato che la reazione chemiluminescente è influenzata dalla concentrazione relative del luminolo, deH’intensificatore e dal pH, è necessario ottimizzare la composizione del substrato a seconda dell'applicazione,
Il substrato chemiluminescente cosi ottenuto può essere utilizzato in un gran numero di saggi chemiluminescenti della perossidasi del rafano, sia in soluzione che in applicazioni di “blottìng", fra cui i Western Blot, i Dot Blot, i Southern Blot, i Northern Blot o qualsiasi altri sistema su membrana che utilizzi la perossidasi del rafano, o altre perossidasi, come marcatore enzimatico per la quantificazione di antigeni, di anticorpi e acidi nucleici.
ESEMPI
l seguenti esempi intendono illustrare specifici aspetti dell'invenzione, ma a titolo non limitativo.
ESEMPIO 1
Sìntesi del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato di sodio
Una porzione di sodio idruro (17,7 g, 0,44 moli) dispersa in olio minerale viene prima lavata con etere di petrolio (bp 40-60 °C) e poi sospesa in 200 mL di tetraidrofurano secco, in un pallone a tre colli da 2 L. Una soluzione di fenotiazina (80,0 g, 0,4 moli) dissolta in tetraidrofurano (400 mL) viene aggiunta tramite cannula sotto argon. La miscela è agitata, sempre sotto argon, per un’ora a temperatura ambiente e poi per 30 minuti a 50 °C . La miscela assume un colore arancio, in seguito alla formazione dell’anione della fenotiazina. Successivamente si raffredda la miscela a 0 °C. Si aggiunge, sempre tramite cannula, una soluzione di 1 ,3-propansultone (35 mL, 0,4 moli) in tetraidrofurano. Il colore della soluzione vira quasi immediatamente al giallo chiaro. Si continua ad agitare la miscela a 0 °C per trenta minuti dalla fine dell’aggiunta del sultone e poi a temperatura ambiente per altri trenta minuti. Durante questo periodo, la miscela diventa prima quasi incolora e omogenea, con dissoluzione completa del materiale in sospensione. Successivamente il prodotto precipita in forma cristallina. Al termine delia reazione, i! prodotto viene separato dalla soluzione per filtrazione e lavato a fondo prima con tetraidrofurano e poi con etere. Resa: 127,6 g (92,9%). Il prodotto ottenuto è già di elevata purezza. In particolare, l’analisi cromatografica (HPLC, λ = 254 nm ) mostra che il contenuto di fenotiazina presente nel prodotto è inferiore a 0.0002 parti (mole/mole). Altre impurezze possono essere efficientemente eliminate per ricristallizzazione da etanolo. Massa molecolare (Ci5Hi4Na03S2): 343,40.<1>H NMR (300 MHz, D20) 6: 6,9-7, 1 (m, 4H, Ar H), 6, 7-6, 9 (m, 4H, Ar H), 3,8 (t, 2H, -CH2-N-, J=9,9 Hz), 2,5 (t, 2H, -CH2-S, J=11 ,2 Hz), 1, 8-2,0 (m, 2H, -CH2-CHrCH2). Massa molecolare dell’acido libero (C15H1503S2): 321,42. MS (API-ES): 322,0 [MHj<+>.
ESEMPIO 2
Sintesi del 4-(fenotiazin-10-il)butan-1-solfonato di sodio
La sintesi del 4-(fenotiazin-10-i!)butan-1-solfonato di sodio simile a quella descritta nell’Esempio precedente. L’unica differenza consiste nell’utilizzo di una soluzione di 1,4-butan sultone (41 mL, 0,40 moli) in tetraidrofurano (200 ml_) al posto dell’analoga soluzione di 1 ,3-butansultone. Anche in questo caso Il prodotto, 4-(fenotiazin-1 0-il)buian~1 -solfonato di sodio, cristallizza dalla miscela di reazione. Resa: 122,4 g (85,6 %). %). Il prodotto ottenuto è già di elevata purezza. In particolare, l’analisi cromatografica (HPLC, λ = 254 nm ) mostra che il contenuto di fenotiazina presente nel prodotto è inferiore a 0.0002 parti (mole/mole). Massa molecolare (Ci6Hi6Na03S2): 357,42. NMR (300 MHz, D20) 5: 6,9-7, 1 (m, 4H, ArH), 6, 7-6,9 (m, 4H, ArHj, 3,7 (t, 2H, -CH2-N-, J=9,9 Hz), 2,5 (t, 2H, -CH2-S03Na, J=11,2 Hz), 1,5 -1,8 (m, 4H, -CH2-C2H4-CH2). Massa molecolare dell'acido libero (C16H17O3S2): 335,44. MS (API-ES): 336,3 [MH]<+>.
ESEMPIO 3
Dipendenza della concentrazione del 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solforiate di sodio sulla reazione luminolo-perossido-perossidasi
Tutte le misure riportate nell’ Esempio 3 sono state effettuate con un fluorometro Eclipse (Varian), in modalità Bio/Chemiluminescenza (lunghezza d’onda di emissione: 425 nm; fenditura di emissione: 20 nm). Si prepara una serie dì substrati in Tampone Tris 0,1 M, pH 8,6 con le seguenti composizioni:
- [luminolo sale sodico] = 2,50 mM
- [perborato di sodio] = 2,00 mM
- [3-(fenotiazin-10-i!)propan-1-solfonato di sodio] = 11,5 μΜ, 23 μΜ, 47 μΜ,94 μΜ, 188μΜ, 375 μΜ, 1500 μΜ e 3000 μΜ.
Ad una cuvetta per fluorimetria di polimetimetacrilato, contenente 2 mi-di ciascun substrato, si aggiungono 10 pL di una soluzione di 0,5 pg/mL di perossidasi del rafano (HRP-Type VIIA). Si mescola per alcuni secondi con un vortex e si inizia a misurare il segnale luminescente, in tutti i casi il segnale chemiluminesente raggiunge un livello di plateau entro alcuni minuti, dopodiché rimane stabile per almeno trenta minuti. Si riporta in grafico la dipendenza del segnale chemiluminescente (valore di plateau) per ciascun substrato, Figura 1. Il segnale luminescente cresce molto rapidamente all’aumentare della concentrazione dell 'intensificato re, [3-(fenotiazin-10-il)propano-1-soifonato di sodio], fino a raggiungere il valore massimo tra 0,5 e 1 mM. Aumentando ulteriormente la concentrazione dell’intensificatore, il segnale chemiluminescente inizia a calare lentamente. Alla concentrazione più elevata di intensìficatore, 3,0 mM, il segnale è circa il 70% del valore massimo.
ESEMPIO 4
Dipendenza della concentrazione del luminolo sulla reazione luminoloperossido-perossidasi intensificata
da 3-(fenotiazin-1Q-il)propan-1-solfonato di sodio
Tutte le misure riportate nell’Esempio 4 sono state effettuate con un fluorometro Eclipse (Varian), in modalità Bio/Chemiluminescenza (lunghezza d’onda di emissione; 425 nm; fenditura di emissione; 20 nm). Si prepara una serie di substrati in Tampone Tris 0,1 M pH 8,6 con le seguenti composizioni; - [luminolo sale sodico] = 0,625 mM, 1,25 mM, 2,50 mM, 5,0 mM e 10 mM.
- [perborato di sodio] = 2,00 mM.
- [3-(fenotiazin-1 0-il)propan-1 -solfonato dì sodio] = 0,75 mM.
Ad una cu vetta per fluorimetria di polimetimetacrilato, contenente 2 mL di ciascun substrato, si aggiungono 10 pL di una soluzione di 0,5 pg/mL di perossidasi del rafano (HRP-Type VIIA). Si mescola per alcuni secondi con un vortex e si inizia a misurare il segnale luminescente. In tutti i casi il segnale chemiluminesente raggiunge un livello di plateau entro alcuni minuti, dopodiché rimane stabile per almeno trenta minuti. Si riporta in grafico la dipendenza del segnale chemiluminescente (valore di plateau) per ciascun substrato, Figura 2. Il segnale luminescente cresce gradualmente fino a livellarsi alla massima concentrazione di luminolo utilizzata, 10 mM.
ESEMPIO 5
Dipendenza dal pH della reazione luminolo-perossido-perossidasi intensificata dal 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio.
Tutte le misure riportate nell'Esempio 4 sono state effettuate con un fluorometro Eciipse (Varian), in modalità Bio/Chemiluminescenza (lunghezza d’onda di emissione: 425 nm; fenditura di emissione: 10 nm; Filtro di emissione: Aperto; voltaggio Fotomoltiplicatore: Medio). Si prepara una soluzione in Tampone Tris 0,125 M, pH 9,1 con la seguente composizione: - [luminolo sale sodico] = 5,00 mM
- [perborato di sodio] = 4,00 mM
- [3-(fenotiazin-10-il)propan-1-solfonato di sodio] = 1,50 mM
Si prepara una serie di cuvette di polimetilmetacrilato, ciascuna contente 2 mL della soluzione substrato. A ogni cuvetta si aggiungono piccoli volumi di HCI 5 M 0 12 M, in modo da aggiustare il pH sui seguenti valori: 9,02, 8,76, 8,51, 8,41, 8,28, 8,14 e 7,95, e senza in nessun caso produrre variazioni nel volume totale superiori al 5%. Successivamente si aggiungono a ciascuna cuvetta 10 pL di una soluzione dì 0,5 pg/mL di perossidasi del rafano (HRP-Type VIIA). Si mescola la soluzione per alcuni secondi con un vortex e si inizia a misurare il segnale luminescente, che in tutti ì casi raggiunge un valore costante entro pochi secondi. Dai risultati ottenuti, che sono riportati in Figura 3, si evince che il segnale chemiluminescente raggiunge il valore massimo nell'intervallo compreso tra pH 8,3 e pH 8,6.
ESEMPIO 6
Confronto tra il 3-(fenotiazin-10-inpropan-1-solfonato di sodio. il 4-iodofenoio,
l’acido p-cumanco e l’acido 4-iodifenilboronico
Tutte le misure riportate nell’Esempio 4 sono state effettuate con un fluorometro Eclipse (Varian), in modalità Βίο/Chemiluminescenza (lunghezza d’onda di emissione: 425 nm; fenditura di emissione: 20 nm).
Si prepara una serie di covette di polimetilmetacrilato, ciascuna contenente 2 mL delle seguenti soluzioni substrato in Tampone Tris 0,1 M pH 8,6 , 1,25 mM luminolo sale sodico, 2,50 mM H2O2:
Soluzione A: 0,68 mM acido p-cumarico
- Soluzione B: 0,77 mM acido 4-iodofenil doronico
- Soluzione C: 0,62 mM p-iodofenolo
Soluzione D: 0,75 mM 3-(fenotiazin-10-il)propan-t -solfonato di sodio
E’ stata preparato un ulteriore substrato, Soluzione E, con la seguente composizione:
- luminoìo, sale sodico 5 mM
- sodio 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato 3 mM
- sodio perborato 4 mM
Successivamente si aggiungono a ciascuna covetta 10 pL di una soluzione di 0,5 pg/mL di perossidasi del rafano (HRP-Type VII A). Si mescola la soluzione per alcuni secondi con un vortex e si inizia a misurare il segnale luminescente per un periodo di 30 min. I risultati ottenuti sono riportati in grafico in Figura 4.
ESEMPIO 7
Substrato per la Misura della Perossidasi tramite Chemiluminescenza
Una Soluzione di Lavoro (Substrato per Chemiluminescenza) per la misura della Perossidasi può essere ottenuta mescolando in parti uguali le seguenti soluzioni:
- Soluzione Acceleratore/Luminolo; luminolo, sale sodico 10 mM; sodio 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 - solfonato (Acceleratore), preparato come descritto nell’Esempio 1, 6 mM in tampone Tris 0,3 M, pH 9, 6.
- Soluzione di Perossido: 8 mM sodio perborato in tampone Acetato 50 mM, pH 5,0
Pertanto la Soluzione di Lavoro (Substrato per Chemiluminescenza) contiene:
- luminolo, sale sodico 5,0 mM
- sodio 3-(fenotiazìn-10-il)propano solfonato 3,0 mM
- sodio perborato 4,0 mM
- sodio acetato 0,25 mM
in tampone Tris 0,15 M pH 8,6.
ESEMPIO 3
Applicazione della reazione chemiluminescente intensificata dal sodio 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato in un saggio della perossidasi su membrana
Su un foglio di membrana di nitrocelllosa comunemente usata per il Western Blot, tagliato a misura di circa 2,5 x 5,0 cm sono stati sportati 2 pL di soluzioni a diversa concentrazione di Perossidasi del Rafano (HRP) in Tampone Tris 0,1 M pH 7,4 contente BSA (albumina di siero bovina). Ciascuno spot è stato ripetuto in quadruplicato. In questo modo è stato creato sulla membrana una matrice di 4 x 7 spot. La membrana è stat lasciata asciugare all’aria e poi lavata due volte in tampone Tris 0,1 M pH 7,4. Una volta asciutta, la membrana è stata adagiata su un vetrino da microscopio e inserita in uno strumento NightOwl per imaging. È stata poi preparata la Soluzione di Lavoro mescolando:
- 500 pL soluzione A preparata come da Esempio 7
- 500 pL soluzione B preparata come da Esempio 7
con cui è stata cosparsa la membrana. Sono state effettuate letture di 10 secondi ogni 5 minuti per mezz’ora. I dati ottenuti sono riportati nella seguente Tabella:
Da dati ottenuti si ricava un limite di rivelabilìtà per la Perossidasi del Rafano (HRP) di circa 10 pg (200 fmol).
Claims (1)
- RIVENDICAZIONI 1. Un processo sintetico per la preparazione di N-Alchilsolfonati della fenotiazina, caratterizzato dal fatto di richiedere: a. la preparazione dell’ anione della fenotiazina b. la reazione di suddetto anione con un estere alchì [solfonico ciclico (sultone) 2. Un processo sintetico per la preparazione di N-Alchilsolfonati della fenotiazina secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il contenuto di fenotiazina in suddetti N-alchilsolfonati è inferiore a 0.0002 parti (mole/mole). 3. Un processo sintetico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che suddetto N-alchilsolfonato è il sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan solfonato e il suddetto estere alchilsolfonico ciclico è il propan sultone. 4. Un processo sintetico secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il suddetto N-alchilsolfonato è il sale sodico dei 4-(fenotiazin-10-ii)butan-1 -solfonato e il suddetto estere alchilsolfonico ciclico è il butan sultone. 5. Un processo sintetico secondo la rivendicazione 3, caratterizzato dal fatto che il contenuto di fenotiazina in suddetto sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan solfonato è inferiore a 0.0002 parti (mole/mole) 6. Un processo sintetico secondo la rivendicazione 4, caratterizzato dai fatto che il contenuto di fenotiazina in suddetto sale sodico del 3-(fenotiazin-10-il)propan solfonato è inferiore a 0.0002 parti (mole/mole). 7. Una composizione per la misura dell'attività della perossidasi comprendente luminolo, una sorgente di perossido ed un intensificatore, caratterizzata dal fatto che suddetto intensificatore è un sale N-Alchilsolfonato della fenotiazina preparato secondo il processo sintetico delle rivendicazioni 1 e 2. 8. Una composizione per la misura dell’attività della perossidasi comprendente luminolo, una sorgente di perossido ed un intensificatore, caratterizzata dal fatto che suddetto intensificatore è il 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio preparato secondo il processo sintetico delie rivendicazioni 3 e 4. 9. Una composizione per la misura dell'attività della perossidasi comprendente luminolo, una sorgente di perossido ed un intensificatore, caratterizzata dai fatto che suddetto intensificatore è il 3-(fenotiazin-10-il)propan-1 -solfonato di sodio preparato secondo il processo sintetico delle rivendicazioni 5 e 6. 10. Un processo per la misura di un analita in una soluzione di test basato su un saggio di legame specifico monitorato da una reazione luminescente catalizzata dalla perossidasi, caratterizzato dal fatto di comprendere: la reazione di un anticorpo marcato con perossidasi con un antigene per formare un complesso antigene-anticorpo; la reazione di suddetto complesso antigene-anticorpo con un anticorpo fisso; una composizione per la misura dell’attività della perossidasi preparata secondo la rivendicazione 7 . 11. Un processo per la misura di un a natila in una soluzione di test basato su un saggio di legame specifico monitorato da una reazione luminescente catalizzata dalla perossidasi, caratterizzato dal fatto di comprendere: la reazione di un anticorpo marcato con perossidasi con un antigene per formare un complesso antigene-anticorpo; la reazione di suddetto complesso antigene-anticorpo con un anticorpo fisso; una composizione per la misura dell’attività della perossidasi preparata secondo la rivendicazione 8 . 12. Un processo per la misura di un analita in una soluzione di test basato su un saggio di legame specifico monitorato da una reazione luminescente catalizzata dalla perossidasi, caratterizzato dal fatto di comprendere: la reazione di un antìcorpo marcato con perossidasi con un antigene per formare un complesso antigene-anticorpo; la reazione di suddetto complesso antigene-anticorpo con un anticorpo fìsso; una composizione per la misura dell’attività della perossidasi preparata secondo la rivendicazione 9.
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