ES2388007T3 - Preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina de alta pureza y su uso en ensayos de quimioluminiscencia para la medición de la actividad peroxidasa - Google Patents

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Abstract

Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina, caracterizado porque la síntesisconsiste en:a. La preparación del anión de fenotiazina,b. La reacción de dicho anión con un éster alquilsulfónico cíclico (sultona)con la precipitación de dichos N-alquilsulfonatos de fenotiazina en forma cristalina,en el que la etapa a. de preparación del anión de fenotiozina tiene lugar in situ en una solución que contienetetrahidrofurano mediante la adición de una base y en la que dicho éster alquilsulfónico cíclico (sultona) estáseleccionado de entre 1,3-profano sultona y 1,4-butano sultona.

Description

Preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina de alta pureza y su uso en ensayos de quimioluminiscencia para la medición de la actividad peroxidasa
Los derivados de fenotiazina, solubles en agua y, especialmente, los N-alquilsulfonatos descritos en la presente invención, son compuestos útiles para diversas aplicaciones comerciales, incluyendo su uso como reactivos para ensayos químicos y biológicos y, en particular, como potenciadores de la actividad de la enzima peroxidasa en ensayos de quimioluminiscencia con luminol, y como aceleradores en sistemas peroxidasa/acelerador en la composición de detergentes y en sistemas para la conversión de la energía solar en energía química o eléctrica.
La clase de compuestos relacionados con la presente invención puede ser representada por la fórmula (I):
en la que M+ es un catión y n es un número entero. El catión puede ser H+, un catión monovalente (tal como H+, Na+, Li+, K+, NH4+), otro catión inorgánico, un catión orgánico, etc., o un catión polivalente (incluyendo cationes divalentes) donde la carga restante es neutralizada por otros aniones (por ejemplo, haluros, nitratos, sulfatos, fosfatos) o puede formar múltiples sales con otras moléculas de N-alquilsulfonatos de fenotiazina.
25 La cadena alquilo -(CR1R2)n-, que conecta el grupo sulfónico al nitrógeno de fenotiazina, puede contener cualquier número � 2 de grupos metileno, aunque n = 3 (propilo) y n = 4 (butilo) son especialmente preferentes. Los grupos metileno CR1R2 en la cadena alquilo pueden ser disustituidos, monosustituidos o no sustituidos.
Esta clase de compuestos es relativamente costosa, especialmente debido a que los procedimientos sintéticos actuales son ineficientes. Además, y de manera más significativa, los productos preparados según los procedimientos
30 actuales son muy difíciles de obtener en la forma extremadamente pura requerida por los ensayos inmunoenzimáticos basados en la determinación de la actividad peroxidasa por medio de quimioluminiscencia.
Un procedimiento sintético para la síntesis de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio es descrito por Y. Kawanishi, N. Kitamura y S. Tazuke, J. en " Coulombic Effect of Photoinduced Electron-Transfer Reactions between Phenothiazines and Viologens", J. Phys. Chem. 1986; 90:2469-2475. Este procedimiento requiere dos etapas:
35 (1) La sal de sodio de fenotiazina se hace reaccionar con un exceso de 1,3-dibromopropano. El producto, 10-(3bromopropil) fenotiazina se obtiene con un rendimiento del 18% después de una purificación mediante cromatografía en columna (Al2O3/hexano).
(2) La 10-(3-bromopropil)fenotiazina purificada se hace reaccionar con un ligero exceso de sulfito de sodio en acetonitrilo-agua (4/1 v/v). El solvente es eliminado y el producto crudo es disuelto en una pequeña cantidad de
40 metanol y se vuelve a precipitar con benceno seco. El precipitado es recogido sobre un filtro, es secado y purificado mediante cromatografía en gel. El producto purificado, 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio, se obtiene con un rendimiento del 51%.
Según este procedimiento, el producto deseado, 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio, se obtiene con un rendimiento total de sólo el 9%, y con el uso masivo de procedimientos cromatográficos costosos. Un procedimiento 45 similar es descrito también por M. Sakaguchi, M. Hu y L. K, en " Photoionization of Alkylphenothiazines in Vesicles: Effects of the Alkyl Chain Length and the Vesicle Surface Charge", J. Phys. Chem., 1990; 94:870-874; el rendimiento no
se muestra).
En la patente US No. 5.171.668 "Method of the Chemiluminescence Assays of the Activity of Peroxidase", concecida a Fujirebio, se describe, por primera vez, el uso de derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazinas y, en particular, de 3(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio, como potenciadores de la quimioluminiscencia de luminol. Esta patente no contiene ninguna descripción específica del procedimiento de preparación de los derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazinas empleados como potenciadores, sino que hace referencia, simplemente, a los procedimientos sintéticos generales de fenotiazinas indicados en Bodea et al, Advances in Heterocyclic Chemistry, 1968; 9:322-460. Los resultados obtenidos por Fujirebio con derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazina y, en particular, con 3-(fenotiazina10-il)propano-1-sulfonato de sodio, no son significativamente mejores que los observados con un potenciador estándar, tal como 4-yodofenol, a excepción de una "mayor reproducibilidad", definida vagamente.
Por el contrario, la patente US No. 6.432.662, "Assay of Peroxidase Activity", concedida a Pierce, describe un procedimiento para el ensayo de la actividad peroxidasa, el cual, aunque usa los mismos potenciadores que los descritos en la Patente US No. 5.171.668 de Fujirebio y, en particular, 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio, se afirma que ofrece un rendimiento muy superior en términos de cinética e intensidad de la señal quimioluminiscente. Según la patente US No. 6.432.662, dicha diferencia de rendimiento se atribuye a la presencia de impurezas en el potenciador. En particular, la presencia de fenotiazina en el potenciador desactiva la enzima peroxidasa y, por tanto, es extremadamente perjudicial para la producción de la señal quimioluminiscente.
El procedimiento descrito en la patente US No. 6.432.662 para la preparación del potenciador, 3-(fenotiazin-10il)propano-1-sulfonato de sodio, es el procedimiento de Y. Kawanishi, N. Kitamura y S . Tazuke, indicado anteriormente. Además, según la patente US No. 6.432.662, el producto obtenido con este procedimiento contiene "impurezas o trazas de impurezas que no pueden ser eliminadas mediante procedimientos convencionales conocidos en la técnica", sin revelar ningún procedimiento de purificación específico.
Por otra parte, hay que subrayar que la necesidad de usar materiales de alta pureza en sustratos para quimioluminiscencia es ampliamente conocida.
Por ejemplo, el artículo de M.A. Motsenbocker y K. Kondo, " Improvements to Enhanced Horseradish Peroxidase Detection Sensitivity" J. Biolum. Chemilumin., 1994; 9:15-20 (1994) afirma que: "Los resultados son consistentes con un mecanismo de interferencia sencillo mediante el cual los radicales del potenciador producidos por la enzima son neutralizados preferentemente por los contaminantes en el luminol, en el potenciador y en el solvente usado para solubilizar el potenciador. El consumo de estos interferentes retrasa la emisión de luz y reduce el límite de detección de la peroxidasa (HRP)".
Es evidente que el procedimiento de síntesis de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio, descrito inicialmente por Y. Kawanishi, N. Kitamura y S. Tazuke, y usado subsiguientemente en la patente US No. 6.432.662, no sólo es ineficiente (rendimiento del 9%), sino que genera un producto contaminado con impurezas que son muy difíciles de eliminar. La presencia de estas impurezas es incompatible con el uso de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio como potenciador de la quimioluminiscencia en ensayos para la determinación de la peroxidasa.
ELECTROANALYSIS, 18(18), 1771-1777, 2006 divulga un procedimiento de preparación de PPSA ácido (3-(10Hfenoxazin-10-il)-1-propanosulfónico) vía un procedimiento de dos etapas que comprende la reacción de fenoxazina con NaH en dioxano, seguido por una reacción con 1,3-propanosulfona y la precipitación del producto.
JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY, 94(2), 870-4, 1990 divulga un procedimiento de preparación (PC3SO3Na) vía un procedimiento de dos etapas que comprende la reacción de fenotiazina con NaH y un 1,3-dibromopropano, seguido por una reacción con Na2SO3.
Breve descripción de la invención
Un objeto de la presente invención es un nuevo procedimiento para la síntesis de derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazina de excepcional pureza y en altos rendimientos. El procedimiento consiste en la reacción del anión de fenotiazina con una alquil sultona (sulfona cíclica) en un solvente apropiado.
El procedimiento es simple y directo, basado en la cristalización del producto puro a partir de la mezcla de reacción. Por el contrario, las impurezas permanecen en solución y, a continuación, son eliminadas de una manera muy sencilla y efectiva.
La extraordinaria pureza de los derivados de N-alquilsulfonato de fenotiazina obtenidos mediante el procedimiento de la presente invención es de vital importancia para su uso como potenciadores de quimioluminiscencia en los ensayos de la peroxidasa. Este es un objeto adicional de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
− Figura 1: gráfico de la señal de quimioluminiscencia como una función de la concentración de [3-(fenotiazin10-il)propano-1-sulfonato de sodio].
− Figura 2: gráfico de la señal de quimioluminiscencia como una función de la concentración de solución de sustrato.
− Figura 3: gráfico de la señal de quimioluminiscencia como una función del pH.
− Figura 4: gráfico de la señal de quimioluminiscencia como una función de la composición de la solución de sustrato.
Descripción detallada de la invención
En contraste con el procedimiento de la literatura, que requiere dos etapas, el procedimiento de la presente invención requiere sólo una etapa.
En particular, el anión de fenotiazina es generado in situ mediante la adición de una base, tal como hidruro sódico, amida de sodio, butil-litio, diisopropilamida de litio y similares, en tetrahidrofurano, 1,3-propano sultona o 1,4-butano sultona se añade a continuación, neta o disuelta en un solvente.
Al final de la reacción, frecuentemente, el producto se separa de la solución en forma cristalina y con un alto grado de pureza. Si se desea un grado de pureza todavía mayor, es suficiente con recristalizar el producto a partir de etanol, agua o sus mezclas.
Los productos obtenidos mediante el procedimiento de la presente invención y, en particular, 3-(fenotiazin-10il)propano-1-sulfonato de sodio y 4-(fenotiazin-10-il)butano-1-sulfonato de sodio son de muy alta pureza. En particular, están totalmente libres de trazas de fenotiazina, lo que causa la inactivación de las enzimas de peroxidasa, tales como la peroxidasa de rábano.
La extraordinaria pureza de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio y 4-(fenotiazin-10-il)butano-1-sulfonato de sodio obtenidos mediante el procedimiento de la presente invención permite que sean usados como potenciadores de la quimioluminiscencia, incluso en cantidades considerablemente grandes. Por ejemplo, un sustrato típico para la detección de la quimioluminiscencia de la peroxidasa contiene (a) la sal sódica de luminol preferentemente a una concentración entre 2 y 12 mM, más preferentemente, a una concentración entre 5 y 10 mM; además, contiene (b) un potenciador de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio y 4-(fenotiazin-10-il) butano-1-sulfonato de sodio, preparados según la presente invención, a una concentración entre 2 y 8 mM, más preferentemente a una concentración de entre 3 y 6 mM, y también (c) una fuente de peróxido, preferentemente a una concentración entre 2 y 10 mM y, más preferentemente, a una concentración de entre 4 y 8 mM.
La solución de sustrato, conocida también como solución de trabajo, es tamponada, preferentemente, entre pH 7,8 y 9,0, más preferentemente, entre pH 8,2 y pH 8,8. El tampón puede ser Tris, tricina, ecc.
La solución de sustrato puede ser preparada justo antes de su uso, o si no, puede ser obtenida mezclando dos soluciones, una que contiene luminol y el potenciador y la otra, la fuente de peróxido. Una vez preparada, la estabilidad de la solución está limitada a aproximadamente 24 horas, si se mantiene a 4-8ºC. Una formulación especialmente preferente consiste en:
− Solución A: 10,0 mM sodio luminol; 6,0 mM 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio en 0,3 M tampón Tris, pH 9,6
− Solución B: 8,0 mM perborato de sodio en 50 mM tampón de acetato, pH 5,0
Ambas soluciones son estables durante al menos 12 meses a 4-8ºC. C. La solución de trabajo es preparada justo antes de su uso mezclando volúmenes iguales de las Soluciones A y B. El pH de la mezcla debe estar entre pH 8,4 y pH 8,7. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que debido a que la reacción de quimioluminiscencia está influenciada por la concentración de luminol, del potenciador y el pH, es necesario optimizar la composición del sustrato dependiendo de la aplicación.
El sustrato quimioluminiscente, obtenido de esta manera, puede ser usado en un gran número de ensayos de quimioluminiscencia de peroxidasa de rábano, tanto en solución como en aplicaciones de transferencia, incluyendo inmunotransferencia o transferencia Western, transferencia en mancha o transferencia Dot, transferencia de ADN o transferencia Southern, transferencia de ARN o transferencia Northern o cualquier otro sistema de membrana que usa peroxidasa de rábano, u otras peroxidasas, tal como una enzima marcadora para la cuantificación de antígenos, anticuerpos y ácidos nucléicos.
Ejemplos
Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar aspectos específicos de la invención. Sin embargo, no se pretende que estos ejemplos limiten la invención.
Ejemplo 1
Síntesis de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio
Una porción de hidruro de sodio (17,7 g, 0,44 moles), dispersada en aceite mineral, es lavada primero con éter de petróleo (p.e. 40-60ºC) y, a continuación, es suspendida en 200 ml de tetrahidrofurano seco, en un matraz de tres cuellos, de 2 L. Una solución de fenotiazina (80,0 g, 0,4 moles) disuelta en tetrahidrofurano (400 ml) es añadida bajo argón, a través de una cánula. La mezcla es agitada, siempre bajo argón, durante una hora a temperatura ambiente y, a continuación, durante 30 minutos a 50ºC. La mezcla adquiere un color naranja, después de la formación del anión de fenotiazina. Después de que la suspensión se ha enfriado a 0ºC, una solución de 1,3-propanosultona (35 ml, 0,4 moles) en tetrahidrofurano es añadida también a través de una cánula. El color de la mezcla cambia, casi inmediatamente, a amarillo claro. La mezcla es agitada a 0ºC durante treinta minutos después de la adición de la sultona y, a continuación, a temperatura ambiente durante otros treinta minutos.
Durante este período, la mezcla se vuelve casi incolora y homogénea, con la disolución total del material en suspensión. Subsiguientemente, el producto precipita en forma cristalina. Al final de la reacción, el producto es separado de la solución mediante filtración y es lavado a fondo, primero con tetrahidrofurano y, a continuación, con éter. Rendimiento: 127,6 g (92,9%). El producto ya es de alta pureza. En particular, un análisis cromatográfico (HPLC, A = 254 nm) muestra que el contenido de fenotiazina en el producto es inferior a 0,0002 partes (mol/mol). Otras impurezas pueden ser eliminadas eficientemente mediante recristalización a partir de etanol. Masa molecular (C15H14NaO3S2): 343,40. 1H RMN 300 MHz, D2O) 5: 6,9-7,1 (m, 4H, ArH), 6,7-6,9 (m, 4H, ArH), 3,8 (t, 2H,-CH2-N, J = 9,9 Hz), 2,5 (t, 2H, -CH2-S, J = 11,2 Hz), 1,8-2,0 (m, 2H,-CH2-CH2-CH2). Masa molecular del ácido libre (C15H15O3S2): 321,42. MS (API-ES): 322,0 [MH]+.
Ejemplo 2
Síntesis de 4-(fenotiazin-10-il)butano-1-sulfonato de sodio
La síntesis de 4-(fenotiazin-10-il)butano-1-sulfonato de sodio es similar a la descrita en el Ejemplo anterior. La única diferencia reside en que se usa una solución de 1,4-butano sultona (41 ml, 0,40 moles) en tetrahidrofurano (200 ml) en lugar de la solución de 1,3-propanosultona. De nuevo, el producto, 4-(fenotiazin-10-il)butano-1-sulfonato de sodio, cristaliza a partir de la mezcla de reacción. Rendimiento: 122,4 g (85,6%). El producto ya es de alta pureza. En particular, un análisis cromatográfico (HPLC, A = 254 nm) muestra que el contenido de fenotiazina en el producto es inferior a 0,0002 partes (mol/mol).
Masa molecular (C16H16NaO3S2): 357,42. 1H RMN (300 MHz, D2O) 5: 6,9-7,1 (m, 4H, ArH), 6,7-6,9 (m, 4H, ArH), 3,7 (t, 2H,-CH2-N, J = 9,9 Hz), 2,5 (t, 2H,-CH2-SO3Na, J = 11,2 Hz), 1.5-1.8 (m, 4H,-CH2-C2H4-CH2). Masa molecular del ácido libre (C16H17O3S2): 335,44. MS (API-ES): 336,3 [MH]+.
Ejemplo 3
Dependencia de la reacción luminol-peróxido-peroxidasa sobre la concentración de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1sulfonato de sodio
Todas las mediciones indicadas en el Ejemplo 3 fueron llevadas a cabo con un espectrofluorímetro (Varian Eclipse), modo Bio/Quimioluminiscencia (longitud de onda de emisión: 425 nm; rendija de emisión: 20 nm). Se preparan una serie de sustratos en 0,1 M Tampón Tris, pH 8,6, con las composiciones siguientes:
− [sal de sodio luminol] = 2,50 mM
− [perborato sódico] = 2,00 mM
− 3-(fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato = 11,5 µM, 23 µM, 47 µM, 94 µM, 188 µM, 375 µM, 1.500 µM y 3000 µM.
A una cubeta de fluorimetría de polimetilmetacrilato que contiene 2 ml de cada sustrato, se añaden 10 µl de una solución de 0,5 µg/ml de peroxidasa de rábano (HRP-Tipo VIIA). Después de mezclar la solución con un vórtice durante unos pocos segundos, se inicia la medición de la señal luminiscente. En todos los casos, la señal quimioluminiscente alcanza una meseta en unos pocos minutos y, a continuación, permanece estable durante al menos treinta minutos. La dependencia de la señal quimioluminiscente (valor meseta) para cada sustrato, se indica gráficamente en la Figura 1. La señal luminiscente crece muy rápidamente con una concentración creciente del potenciador, 3-(fenotiazin-10
il)propano-1-sulfonato, hasta que alcanza un valor máximo entre 0,5 y 1 mM. Al elevar adicionalmente la concentración del potenciador, la señal quimioluminiscente comienza a declinar lentamente. A la máxima concentración del potenciador, 3,0 mM, la señal es de aproximadamente el 70% del valor máximo.
Ejemplo 4
Dependencia de la reacción luminol-peróxido-peroxidasa mejorada con 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio sobre la concentración de luminol
Todas las mediciones indicadas en el Ejemplo 4 fueron llevadas a cabo con un espectrofluorímetro (Varian Eclipse), modo Bio/Quimioluminiscencia (longitud de onda de emisión: 425 nm; rendija de emisión: 20 nm). Se preparan una serie de sustratos en 0,1 M Tampón Tris, pH 8,6, con las composiciones siguientes:
− [sal de sodio luminol] = 0,625 mM, 1,25 mM, 2,50 mM, 5,0 mM, 10 mM.
− [perborato sódico] = 2,00 mM
− 3-(fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato = 0,75 mM
A una cubeta de fluorimetría de polimetilmetacrilato, que contiene 2 ml de cada sustrato, se añaden 10 µl de una solución de 0,5 µg/ml de peroxidasa de rábano (HRP-Tipo VIIA). Después de mezclar la solución con un vórtice durante unos pocos segundos, se inicia la medición de la señal luminiscente. En todos los casos, la señal quimioluminiscente alcanza una meseta en unos pocos minutos y, a continuación, permanece estable durante al menos treinta minutos. La dependencia de la señal quimioluminiscente (valor meseta) para cada sustrato, se indica gráficamente en la Figura 2. La señal luminiscente crece gradualmente muy rápidamente con una concentración creciente del luminol, hasta que alcanza un valor máximo entre 0,5 y 1 mM. Al elevar adicionalmente la concentración del potenciador, la señal quimioluminiscente comienza a declinar lentamente. A la máxima concentración del potenciador, 3,0 mM, la señal es de aproximadamente el 70% del valor máximo. La señal luminiscente crece gradualmente, y alcanza una meseta a la máxima concentración de luminol usada en el experimento, 10 mM.
Ejemplo 5
Dependencia del pH de la reacción de luminol-peróxido-peroxidasa mejorada por 3-(fenotiazin-10-il) propano-1sulfonato de sodio
Todas las mediciones indicadas en el Ejemplo 5 fueron llevadas a cabo con un fluorímetro (Varian Eclipse), modo Bio/Quimioluminiscencia (longitud de onda de la emisión: 425 nm; rendija de emisión: 10 nm; filtro de emisión: abierto; tensión fotomultiplicador: media). Se prepara una serie de sustratos en 0,125 M Tampón Tris, pH 9,1, con la siguiente composición:
− [sal de sodio luminol] = 5,0 mM.
− [perborato de sodio] = 4,00 mM
− 3-(fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato = 1,50 mM
Se prepara una serie de cubetas de fluorimetría de polimetilmetacrilato, que contiene, cada una, 2 ml de sustrato. A cada cubeta se añade una pequeña cantidad de 5M o 12M HCl, con el fin de ajustar el pH a los valores siguientes: 9,02, 8,76, 8,51, 8,41, 8,28, 8,14 y 7,95, y limitando los cambios en el volumen total a menos del 5%. A continuación, se añaden, a cada cubeta, 10 µl de una solución de 0,5 µg/ml de peroxidasa de rábano (HRP-Tipo VIIA). Después de mezclar la solución con un vórtice durante unos pocos segundos, se inicia la medición de la señal luminiscente. En todos los casos, la señal quimioluminiscente alcanza un valor constante dentro de unos pocos segundos. A partir de los resultados obtenidos, que se muestran en la Figura 3, es evidente que la señal quimioluminiscente alcanza el valor máximo en el intervalo entre pH 8,3 y pH 8,6.
Ejemplo 6
Comparación entre 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio, p-yodofenol, ácido p-cumárico y ácido 4yodofenilborónico
Todas las mediciones indicadas en el Ejemplo 6 fueron llevadas a cabo con un espectrofluorímetro (Varian Eclipse), modo Bio/Quimioluminiscencia (longitud de onda de emisión: 425 nm; rendija de emisión: 20 nm). Se preparan una serie de cubetas de fluorimetría de polimetilmetacrilato, conteniendo cada una 2 ml de la solución de sustrato siguiente en 0,1 M Tampón Tris, pH 8,6. 1,25 mM de sal de sodio luminol, 2,50 mM H2O2:
− Solución A: 0,68 mM de ácido p-cumárico
− Solución B: 0,77 mM de ácido 4-yodofenilborónico
− Solución C: 0,62 mM de p-yodofenol
− Solución D: 0,75 mM de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio Se preparó otro sustrato, Solución E, con la composición siguiente:
− 5 mM de sal de sodio luminol
− 3 mM de 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio
− 4 mM de perborato de sodio Subsiguientemente, se añaden, a cada cubeta, 10 µl de una solución de 0,5 µg/ml de peroxidasa de rábano (HRP-Tipo VIIA). Después de mezclar la solución con un vórtice durante unos pocos segundos, la señal luminiscente es medida durante 30 min. Los resultados obtenidos se muestran en un gráfico en la Figura 4.
Ejemplo 7
Sustrato para medir la peroxidasa mediante quimioluminiscencia Una solución de trabajo (substrato de quimioluminiscencia) para medir la peroxidasa puede ser obtenida mezclando partes iguales de las soluciones siguientes: − Solución luminol/potenciador: 10 mM de luminol, sal de sodio y 6 mM 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio (potenciador), preparado tal como se describe en el Ejemplo 1 en 0,3 M Tampón Tris, pH 9,6. − Solución de peróxido: 8 mM perborato de sodio en 50 mM, pH 5,0 tampón de acetato
Por tanto, la solución de trabajo (sustrato de quimioluminiscencia) contiene:
− 5,0 mM luminol, sal de sodio 5,0 mM
− 3,0 mM 3-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio
− 4 mM perborato sódico
− 0,25 mM acetato de sodio en 0,15 mM Tampón Tris Tris, pH 8,6. Ejemplo 8 Aplicación de la reacción quimioluminiscente mejorada mediante 3-(fenotiazin-10-il) propano-1-sulfonato de sodio a un ensayo de membrana de peroxidasa.
Sobre una lámina de membrana de nitrocelulosa, usada comúnmente para los ensayos de transferencia Western, cortada a aproximadamente 2,5 x 5,0 cm, se aplicaron 2 µl de soluciones que contenían diferentes concentraciones de peroxidasa de rábano (HRP) en 0,1 M Tampón Tris, pH 7,4 con adición de BSA (albúmina de suero bovino). Cada punto fue repetido cuatro veces. De esta manera, se creó una matriz de 4x7 puntos en la membrana. La membrana fue secada con aire y fue lavada dos veces con 0,1 M Tampón Tris, pH 7,4. Una vez seca, la membrana fue colocada en un portaobjetos de microscopio y fue insertada en un instrumento de obtención de imágenes (Nightowl, Berthold Technologies). A continuación, se preparó una solución de trabajo mezclando:
− 500 µl de solución A, preparada como en el Ejemplo 7
− 500 µl de solución B, preparada como en el Ejemplo 7
y fue espolvoreada sobre la membrana. Se realizaron lecturas de diez segundos cada 5 minutos, durante media hora. Los datos obtenidos se muestran en la Tabla siguiente: Estos datos proporcionan un límite de detección para la peroxidasa de rábano (HRP) de aproximadamente 10 pg (200 fmol).
Nº de fila
Peroxidasa de rábano (µg) Intensidad de señal (promedio de 4 puntos ± ds
1 2 3 4 5 6 7
2,36E-03 7,87E-04 2,62E-04 8,74E-05 2,91E-05 9,71E-06 0 701 ± 91 404 ± 51 192 ± 7,2 79,8 ± 5,3 30,4 ± 1,3 19,2 ± 7,8 9,2 ± 2,9

Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina, caracterizado porque la síntesis consiste en:
    a. La preparación del anión de fenotiazina,
    5 b. La reacción de dicho anión con un éster alquilsulfónico cíclico (sultona)
    con la precipitación de dichos N-alquilsulfonatos de fenotiazina en forma cristalina,
    en el que la etapa a. de preparación del anión de fenotiozina tiene lugar in situ en una solución que contiene
    tetrahidrofurano mediante la adición de una base y en la que dicho éster alquilsulfónico cíclico (sultona) está seleccionado de entre 1,3-profano sultona y 1,4-butano sultona.
    10 2. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina según la reivindicación 1, caracterizado porque dichos N-alquilsulfonatos de fenotiazina presentan la fórmula química (I)
    en la que
    M+ es un catión monovalente, polivalente, orgánico o inorgánico, preferentemente H+, Na+, Li+, K+, NH4+,
    R1 y R2 son H y
    25 n es igual a 3 ó 4.
  2. 3.
    Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonatos de fenotiazina según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha base está seleccionada de entre hidruro de sodio, amida de sodio, butil litio, diisopropilamida de litio.
  3. 4.
    Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según una cualquiera de las
    30 reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho N-alquilsulfonato es la sal sódica de 4-(fenotiazin-10il)propano-1-sulfonato.
  4. 5. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho N-alquilsulfonato es la sal sódica de 4-(fenotiazin-10-il)butano1-sulfonato.
    35 6. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según la reivindicación 4, caracterizado porque el contenido de fenotiazina en dicho 4-(fenotiazin-10-il)propano-1-sulfonato de sodio es inferior a 0,0002 partes (mol/mol).
  5. 7. Procedimiento sintético de preparación de N-alquilsulfonato de fenotiazina según la reivindicación 5,
    caracterizado porque el contenido de fenotiazina en dicho 4-(fenotiazin-10-il)butano-1-sulfonato de sodio es 40 inferior a 0,0002 partes (mol/mol ).
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201236239A (en) 2010-11-16 2012-09-01 Solvay Rechargeable metal or metal-ion cell
WO2014080378A1 (en) 2012-11-26 2014-05-30 University Of Cape Town Phenothiazine derivatives and their use against tuberculosis
EP3268489A1 (en) * 2015-03-13 2018-01-17 Li-Cor, Inc. Fluorogenic and chromogenic substrate
WO2023225776A1 (zh) * 2022-05-23 2023-11-30 孙嘉怡 一种制备高灵敏性稳定化学发光底物液方法及其在免疫检测中应用
US20250326851A1 (en) 2022-09-09 2025-10-23 Bayer Aktiengesellschaft Medical use of ccr8 antibodies and dosing schedule
WO2024071042A1 (ja) * 2022-09-30 2024-04-04 保土谷化学工業株式会社 化合物、正孔輸送材料、および該化合物を用いた光電変換素子

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68911633T2 (de) * 1988-09-30 1994-04-07 Fujirebio Kk Verfahren zur Bestimmung von Peroxidase-Aktivität unter Verwendung von Chemilumineszenz.
US6432662B1 (en) 1997-04-15 2002-08-13 Pierce Chemical Company Assay of peroxidase activity
US20020192736A1 (en) * 2001-02-23 2002-12-19 Pierce Chemical Company Assay of peroxidase activity

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