IT202000017146A1 - Metodi e kit per la diagnosi del tumore del polmone - Google Patents
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
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- G—PHYSICS
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Description
"METODI E KIT PER LA DIAGNOSI DEL TUMORE DEL POLMONE?
CAMPO DELL'INVENZIONE
La presente invenzione riguarda un metodo per la diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo e/o per fornire una prognosi sullo sviluppo di un tumore del polmone in un individuo, comprendente la rivelazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in campioni biologici. L?invenzione si riferisce inoltre a kit e reagenti per la rivelazione dei livelli di espressione di detta isoforma 4, nonch? ad un composto inibitore di detta isoforma 4 per uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone.
STATO DELL?ARTE
Il tumore del polmone rappresenta la terza neoplasia maligna pi? diffusa al mondo e costituisce la principale causa di morte per tumore nei paesi industrializzati, con di pi? di un milione di decessi all?anno.
Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), che rappresenta circa l?85% dei casi, ? una forma neoplastica particolarmente aggressiva, caratterizzata da un comportamento clinico estremamente variabile, e da un tasso di sopravvivenza a cinque anni non superiore al 15% dal momento del riscontro clinico della malattia. Questa drammatica condizione ? principalmente legata alla mancanza di strumenti di diagnosi precoce e al riconoscimento di sintomi nelle sole fasi avanzate del tumore. Si stima infatti che in circa l?80% dei pazienti, al momento della diagnosi, sia riscontrata una neoplasia di origine metastatica. La prognosi ? migliore se il tumore ? individuato in una sua fase di sviluppo iniziale, quando ancora suscettibile di un trattamento chirurgico radicale, con un danno funzionale limitato.
Per queste ragioni, una diagnosi precoce e corretta del tumore polmonare ha una rilevanza cruciale per ridurre l?impatto della malattia e in particolare per migliorare le possibilit? di sopravvivenza e qualit? di vita per i pazienti oncologici.
Le tecniche di diagnostica per immagine quali la tomografia computerizzata, ad oggi lo strumento pi? utilizzato per la diagnosi del tumore polmonare, presentano alcune importanti limitazioni, quali il costo elevato e la necessit? di ripetere la scansione; inoltre per ottenere la conferma definitiva della diagnosi, si rende quasi sempre necessario l?impiego di procedure diagnostiche pi? invasive, ad esempio interventi di biopsia polmonare.
In questo contesto emerge pertanto l?esigenza di identificare strumenti diagnostici alternativi, ad esempio marcatori specifici e selettivi per il tumore polmonare, che possano essere facilmente rilevati nel siero o altri fluidi biologici del paziente mediante procedure non invasive, anche in una fase precoce del cancro.
Solo pochi marcatori vengono ad oggi utilizzati nella routine clinica. Molti altri sono disponibili ma non vengono utilizzati nella routine per il loro basso grado di sensibilit? e specificit?.
Studi recenti hanno identificato il ruolo della forma attiva della proteina caspasi-4 come marcatore in vitro per la diagnosi e/o prognosi del tumore al polmone.
Esistono cinque isoforme della caspasi 4: la struttura proteica della isoforma 1 della caspasi-4, nota anche come isoforma a, ? costituita da tre domini; i) il dominio CARD (Caspase activation and recruitment domain) che va dall?aminoacido (aa) 1 ad aa-90, dominio reponsabile del legame con la porzione di acido lipoteicoico del lipopolisaccaride (LPS) (Shi J et al., 2014) attraverso il riconoscimento della proteina transmemebrana TMEM214 (Shi J et al., 2014); ii) il dominio p20 che va dagli aa100-270, dominio catalitico o LARGE SUBUNIT, che include il sito attivo e la tasca per il substrato; iii) il dominio p10, definito anche come SMALL SUBUNIT, che va dagli aa290-377 e che include una parte della tasca del substrato e l?interfaccia per la omodimerizzazione, necessaria per rendere attivo l?intero complesso enzimatico affinch? quest?ultimo esplichi la sua attivit? biologica (Figura 1). Il taglio proteolitico che avviene dopo omodimerizzazione, ? all?interfaccia tra il dominio p20 and p10 (Figure 1A). La tasca del substrato ? caratterizzata da 4 strutture (Figura 1B), identificate come S1-4. S1 e S3 (Figure 1B) sono simili e altamente conservate tra le caspasi, mentre S4 differisce tra le varie classi di caspasi. La porzione S2 ? altamente specifica a seconda delle caspasi prese in considerazione, e pertanto, ? caratterizzata da siti di legame diversi per substrati specifici in virt? del contesto biologico.
Le isoforme 2-5 della caspasi-4 possono derivare da uno splicing alternativo non-sense della isoforma 1. In particolare, esistono: la isoforma ? (o isoforma 2), con dimensioni di 36 kDa, composta da 321 aa e mancante degli aa 1-56, che costituiscono parte del dominio CARD della isoforma ? (o isoforma 1); la isoforma 3, che manca degli aa 117-377, dal peso di 13 kDa; la isoforma 4, che manca degli aa 264-377 ed ha un peso di 30 kDa; e la isoforma 5, che manca degli aa 158-377, dal peso di 18kDa.
La domanda di brevetto Europeo EP3111223A1 descrive un metodo per la diagnosi e/o prognosi del tumore al polmone comprendente la determinazione o quantificazione della sola forma attiva della caspasi-4 umana in un campione isolato da un paziente. In questa domanda di brevetto non ? fatto alcun riferimento al tipo di isoforma della caspasi-4 associato ad una diagnosi positiva del tumore del polmone.
Sebbene gli studi condotti finora abbiano consentito di individuare nuovi possibili marcatori tumorali e target terapeutici, resta tuttavia ancora molto sentita nel settore la necessit? di individuare marcatori diagnostici pi? accurati che permettano una diagnosi corretta e rapida del tumore al polmone, senza necessit? di ricorrere ad interventi bioptici, e che possano fornire informazioni pi? approfondite riguardo le caratteristiche e lo sviluppo della patologia.
SOMMARIO DELL'INVENZIONE
Gli inventori hanno condotto numerosi studi volti ad elucidare il ruolo della proteina umana caspasi-4 come marcatore per la diagnosi e/o prognosi in vitro del tumore del polmone.
Grazie a questi studi, gli autori della presente invenzione hanno scoperto che non tutte le isoforme della proteina umana caspasi-4 sono marcatori efficaci per la diagnosi del tumore al polmone: al contrario, la rivelazione o quantificazione della isoforma 4 consente da sola di ottenere una diagnosi pi? accurata della patologia.
In particolare, gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente trovato che i livelli di espressione della isoforma 4 della caspasi-4 sono significativamente pi? elevati rispetto ai livelli della isoforma 1 della caspasi-4 all?interno della massa tumorale dei pazienti affetti da tumore al polmone (Figura 3A).
Una ulteriore caratteristica associata ai livelli di espressione della isoforma 4 della caspasi-4 rispetto alla isoforma 1 ? di tipo prognostico. Infatti, come chiaramente mostrato nella sezione sperimentale della presente descrizione (Figura 5), gli inventori hanno trovato che tanto pi? elevati sono i livelli di isoforma 4 rispetto ai livelli di isoforma 1, tanto minore ? la probabilit? di sopravvivenza del paziente. Inoltre, gli autori della presente invenzione hanno anche scoperto che i livelli di espressione della isoforma 4 sono significativamente pi? elevati nel sangue di pazienti malati rispetto al sangue di soggetti sani o di pazienti con patologie respiratorie non tumorali, riscontrando, sorprendentemente, che il grado di espressione di tale marcatore consente di discriminare tra la forma benigna e maligna del tumore con elevata sensibilit? e specificit?.
Pertanto, lo scopo della presente invenzione ? quello di fornire dei metodi e kit per una diagnosi e/o prognosi in vitro pi? accurata del tumore al polmone, comprendenti la quantificazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della caspasi-4 in un campione biologico ottenuto da un paziente in esame. Tali metodi prevedono, in particolare, l?impiego di un anticorpo, progettato dagli inventori, in grado di riconoscere un epitopo specifico della isoforma 4 che differisce in tre amminoacidi dalla isoforma 1 della proteina caspasi-4.
Oltre ad essere di supporto per la formulazione di una diagnosi corretta e rapida, i metodi e kit oggetto dell?invenzione consentono di poter effettuare la diagnosi e/o prognosi direttamente su campioni di plasma del paziente in esame, senza la necessit? di dover ricorrere all?impiego di tecniche di indagine diagnostica invasive o particolarmente costose. Vantaggiosamente, i metodi e kit oggetto della presente invenzione potrebbero essere impiegati anche per monitorare lo sviluppo del tumore e valutare l?efficacia di una terapia, agevolando l?adozione di nuovi approcci terapeutici mirati.
In aggiunta a quanto gi? illustrato, gli autori della presente invenzione hanno trovato che l?espressione della subunit? ?large? della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 ? in grado di promuovere la proliferazione tumorale. L?identificazione del ruolo della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 nel tumore del polmone ha pertanto una importante rilevanza anche da un punto di vista terapeutico: l?impiego di composti inibitori di detta isoforma 4 ha un elevato potenziale per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento della patologia, ad esempio riducendo significativamente la proliferazione tumorale.
Formano pertanto oggetto dell?invenzione:
un metodo in vitro o ex vivo per la diagnosi del tumore del polmone in un individuo, comprendente il passaggio di:
a. rivelare i livelli di espressione di un primo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto primo biomarcatore ? l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4;
un metodo in vitro o ex vivo per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone in un individuo, comprendente il passaggio di:
a. rivelare i livelli di espressione di un primo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto primo biomarcatore ? l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4;
un metodo in vitro o ex vivo per fornire una prognosi sullo sviluppo del tumore al polmone in un individuo, comprendente il passaggio di:
a. rivelare i livelli di espressione di un primo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto primo biomarcatore ? l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4;
l?uso in vitro della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 come biomarcatore per la diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone;
un anticorpo o un suo frammento in grado di legare specificatamente l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4;
un kit ed il suo uso per la diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, comprendente mezzi per rivelare i livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in un campione biologico, detto kit comprendendo almeno un agente per rivelare i livelli di espressione di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4;
un composto inibitore della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 per uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone, in cui detto inibitore ? Ac-VVDC-NH2;
e un metodo di screening in vitro per l?identificazione di un composto candidato per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone comprendente il seguente passaggio: a. determinare l?attivit? della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in presenza e in assenza di detto composto candidato, dove una riduzione e/o inibizione dell?attivit? di detta isoforma-4 indica che detto composto ? idoneo per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone.
Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata.
BREVE DESCRIZIONE DELLE FIGURE
Figura 1. Struttura nota della caspasi-4 (isoforma 1).
Figura 2. La isoforma 4 della caspasi-4 ? presente nella massa tumorale di pazienti con NSCLC (A). Dati rappresentativi di mRNA sequencing della isoforma 4 nella massa tumorale (B).
Figura 3. Livelli proteici della isoforma 4 della caspasi-4 nella massa tumorale di pazienti con NSCLC (A). ROC analisi (B).
Figura 4. Livelli proteici pi? alti della isoforma 4 della caspasi-4 nel sangue di pazienti con NSCLC rispetto ai sani, noncancerosi, fumatori e tumori benigni (A). ROC analisi (B).
Figura 5. Minore probabilit? di sopravvivenza in pazienti NSCLC positive alla isoforma 4 della caspasi-4 nella massa tumorale.
Figura 6. La isoforma 4 induce proliferazione tumorale (A), che pu? essere inibita dal composto 6 (B).
DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE
GLOSSARIO
I termini impiegati nella presente descrizione sono come generalmente compresi dall?esperto della tecnica, salvo ove diversamente indicato.
Con l?espressione ?rivelare i livelli di espressione? si intende, nella presente descrizione, rivelare la presenza e/o quantificare i livelli di espressione della specifica isoforma del biomarcatore, ovvero della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, oppure, quando specificato, della isoforma 1 della proteina umana caspasi 4.
Con il generico termine ?tumore del polmone? nella presente invenzione, sono indicate tutte le forme di neoplasia polmonare che originano da tessuti epiteliali, rientranti nella categoria del carcinoma polmonare, nonch? le forme tumorali di origine neuroendocrina, quale il carcinoide polmonare, o di origine linfatica, quale il linfoma polmonare. Vi sono due tipologie principali di tumore del polmone che originano dal tessuto epiteliale che compone le strutture polmonari, le quali rappresentano insieme oltre il 95% di tutte le neoplasie che colpiscono questi organi: il tumore polmonare a piccole cellule, noto anche come microcitoma, e il tumore polmonare non a piccole cellule, spesso abbreviato come NSCLC dall?inglese ?non-small-cell lung cancer?. Il tumore del polmone non a piccole cellule pu? essere suddiviso a sua volta in tre forme principali: i) il carcinoma spinocellulare, noto anche come squamocellulare o carcinoma a cellule squamose; ii) l?adenocarcinoma e iii) il carcinoma a grandi cellule.
Il termine ?epitopo?, usato nel contesto della presente invenzione, pu? essere inteso come quella porzione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 che ? in grado di essere riconosciuta e legata in maniera specifica da un anticorpo, o determinante antigenico.
Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente scoperto che la isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 rappresenta un biomarcatore efficace del tumore del polmone in un individuo, e che la rivelazione dei livelli di espressione di detta isoforma 4 pu? essere impiegata per ottenere una diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo sviluppo del tumore del polmone in maniera rapida ed accurata, e senza bisogno di ricorrere a tecniche di indagine invasive.
Gli autori dell?invenzione hanno inoltre scoperto che ? possibile impiegare la rivelazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 per ottenere informazioni di tipo prognostico sullo sviluppo del tumore del polmone in un individuo, permettendo di prevedere in maniera accurata la probabilit? di sopravvivenza di un paziente affetto da tale patologia.
? pertanto oggetto della presente invenzione, un metodo per la diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo e/o per fornire una prognosi sullo sviluppo del tumore del polmone in un individuo, comprendente il passaggio di:
a. rivelare i livelli di espressione di un primo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto primo biomarcatore ? l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4.
Con il termine ?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4? la presente invenzione si riferisce alla proteina di peso molecolare pari a 30 kDa, avente una sequenza amminoacidica che differisce dalla sequenza canonica, ovvero dalla sequenza della isoforma 1, o isoforma a, della caspasi-4 umana, (i) per l?assenza degli amminoacidi 264-377 aa e (ii) per la sostituzione della sequenza amminoacidica ?ANR? all?estremit? C-terminale (frammento in posizione 261-263 aa) con la sequenza ?GEC?.
In maniera pi? specifica, detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 si riferisce, nella presente descrizione, alla proteina umana identificata dal codice P49662-4 nel database UniProt, versione aggiornata luglio 2020, qui riportata come SEQ ID. No 1.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il metodo ivi descritto pu? essere impiegato per la diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo e/o per fornire una prognosi sullo sviluppo di una qualsiasi delle tipologie di neoplasia del polmone di un individuo.
Secondo un aspetto preferito, il metodo oggetto dell?invenzione, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte, potr? essere impiegato per la diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo e/o per fornire una prognosi sullo sviluppo del tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC). Secondo un aspetto della presente invenzione, detto passaggio a. di rivelazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, pu? essere effettuato su un campione biologico isolato da un individuo, selezionato dal gruppo costituito da campione istologico, sangue intero, plasma o siero. Con campione istologico secondo la presente invenzione si intende ad esempio una porzione o frammento di tessuto polmonare, o in particolare una porzione o frammento di tessuto polmonare tumorale, ad esempio ottenuti a seguito di resezione chirurgica della massa tumorale del polmone di un individuo, o ancora un campione di cellule isolate. Per la preparazione di detti campioni istologici potr? essere impiegata una qualsiasi delle tecniche istologiche note al tecnico del settore.
Il termine ?individuo? usato nella presente descrizione si riferisce, secondo un aspetto dell?invenzione, ad un essere umano, ad esempio un fumatore o un individuo soggetto ad esposizione ad agenti cancerogeni chimici quali amianto (asbesto), radon, o metalli pesanti.
Secondo un aspetto ulteriore dell?invenzione, detto individuo pu? essere un soggetto asintomatico, o un soggetto che presenta sintomi di lieve, moderata o severa entit?. Detto individuo pu? anche essere un soggetto al quale siano stati diagnosticati uno o pi? noduli polmonari.
Detto individuo, secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione, pu? comprendere un soggetto che sia stato sottoposto a terapia antitumorale, ad esempio radioterapia o chemioterapia.
Secondo un aspetto della presente invenzione, detto metodo diagnostico e/o prognostico pu? comprendere un secondo passaggio a? di rivelare i livelli di espressione di un secondo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto secondo biomarcatore ? l?isoforma 1 della proteina umana caspasi-4.
Con il termine ?isoforma 1 della proteina umana caspasi-4?, la presente invenzione si riferisce alla isoforma canonica della proteina umana caspasi-4, avente un peso molecolare pari a 43.262 kDa, e costituita da tre domini principali: il dominio CARD (aa 1-90), il dominio p20 o ?subunit? large? (aa 100-270), e il dominio p10, definito anche come ?subunit? small? (aa 290-377). In particolare, la presente invenzione si riferisce alla isoforma 1 della proteina umana caspasi-4 identificata con il codice P49662-1 nel database UniProt versione aggiornata luglio 2020.
Secondo un aspetto preferito di detta invenzione, detta isoforma 1 della proteina umana caspasi-4 ha SEQ ID No.2.
Il metodo oggetto della presente invenzione, secondo una qualsiasi delle sue forme di realizzazione, pu? anche includere un ulteriore passaggio b. di confrontare il valore di espressione determinato nel passaggio a. con un valore di riferimento. Per cui un valore di espressione rivelato ? pi? elevato rispetto a quello di riferimento indicher? una diagnosi e/o una prognosi negativa, mentre un valore inferiore indicher? una diagnosi e/o una prognosi positiva.
Secondo un aspetto dell?invenzione, detto valore di riferimento pu? essere derivato da una analisi effettuata su un campione biologico di un individuo affetto da tumore oppure da una analisi effettuata su un campione biologico di un inviduo sano. Un possibile valore di riferimento pu? ad esempio corrispondere al livello di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 all?interno di un campione biologico ottenuto da un individuo affetto da tumore del polmone o da altro tumore, oppure da un individuo sano. Detto valore di riferimento pu? anche corrispondere al livello di espressione della isoforma 1 della proteina umana caspasi-4 all?interno di un campione biologico ottenuto da un individuo affetto da tumore o da un individuo sano.
Secondo un aspetto dell?invenzione, il metodo per la diagnosi del tumore del polmone secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte, potr? ulteriormente comprendere i seguenti passaggi:
b. confrontare il valore di espressione determinato nel passaggio a. con un valore di riferimento ottenuto da un individuo affetto da tumore;
c. diagnosticare il tumore del polmone quando il valore ottenuto al punto a. ? maggiore o uguale detto valore di riferimento.
? anche oggetto dell?invenzione un metodo per la diagnosi del tumore del polmone di un individuo, secondo una qualsiasi delle forme precedentemente descritte, ulteriormente comprendente i seguenti passaggi:
b. confrontare il valore di espressione determinato nel passaggio a. con un valore di riferimento ottenuto da un individuo sano;
c. diagnosticare il tumore del polmone quando il valore ottenuto al punto a. ? significativamente maggiore di detto valore di riferimento.
Nel caso di un metodo per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, un valore di riferimento adeguato pu? essere un valore corrispondente al livello di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, rivelato in un campione biologico ottenuto dallo stesso individuo in momenti diversi nel corso della terapia e/o durante il periodo di malattia.
La presente invenzione riguarda dunque anche un metodo per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, ad esempio per monitorare la risposta di un individuo affetto da tumore del polmone ad una terapia, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte, ulteriormente comprendente il passaggio di:
b. confrontare il valore ottenuto al punto a. con un valore di riferimento, in cui un aumento del valore ottenuto al punto a. rispetto a detto valore di riferimento indica un peggioramento dello sviluppo della malattia e/o una risposta negativa ad una terapia, mentre una riduzione del valore ottenuto al punto a. rispetto a detto valore di riferimento indica un miglioramento dello sviluppo e/o una regressione della malattia, e/o una risposta positiva ad una terapia. L?invenzione riguarda anche un metodo per la prognosi del tumore del polmone di un individuo, comprendente i seguenti passaggi:
a. rivelare i livelli di espressione di un primo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto primo biomarcatore ? l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4;
a?. rivelare i livelli di espressione di un secondo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto secondo biomarcatore ? l?isoforma 1 della proteina umana caspasi-4;
b. confrontare il valore ottenuto al punto a. con il valore ottenuto al punto a?, in cui un valore ottenuto al punto a. significativamente maggiore del valore ottenuto al punto a? indica una prognosi negativa o sfavorevole, e viceversa.
Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, detta prognosi negativa o sfavorevole si riferisce ad una probabilit? di sopravvivenza inferiore.
Con l?espressione ?rivelare i livelli di espressione di un primo biomarcatore? secondo la presente descrizione si intende ?rivelare la presenza? e/o ?quantificare? i livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in un campione biologico ottenuto da un individuo, in termini relativi o assoluti, secondo uno qualsiasi dei metodi disponibili al tecnico del settore; secondo un aspetto dell?invenzione, nei metodi qui descritti la rivelazione e/o quantificazione dei livelli di espressione della isoforma 4 possono essere effettuate mediante l?esecuzione di un test in vitro.
Esempi non limitanti di test in vitro idonei ad essere impiegati per la rivelazione della presenza e/o per la quantificazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, includono, ad esempio, un saggio immunologico, un saggio basato su aptamero, un saggio istologico o citologico, un saggio colorimetrico, un saggio di attivit? della proteina, o un saggio di livello di espressione di mRNA.
Tutte le tipologie di test in vitro sopra indicate sono note al tecnico del settore, che, sapendo quale isoforma della proteina caspasi-4 debba essere rivelata e/o quantificata e su quale campione debba essere effettuato detto test, potr? selezionare il protocollo pi? idoneo.
Un saggio immunologico adatto per la rivelazione della presenza e/o per la quantificazione dei livelli di espressione della isoforma 4, secondo la presente invenzione, ? un saggio immunologico che prevede l?impiego di almeno un anticorpo o un suo frammento in grado di legare in modo specifico detta isoforma 4. Un anticorpo particolarmente idoneo ad essere impiegato in un saggio immunologico secondo la presente invenzione, ? un anticorpo o un suo frammento in grado di legare in modo specifico detta isoforma 4 e incapace di legare e/o riconoscere qualsiasi altra isoforma della proteina umana caspasi-4.
Con l?espressione ?incapace di legare e/o riconoscere qualsiasi altra isoforma della proteina umana caspasi-4? si intende, ad esempio, un anticorpo o un suo frammento caratterizzato da una affinit? di legame per una qualsiasi altra isoforma della proteina umana caspasi-4 significativamente pi? bassa rispetto alla affinit? di legame per la isoforma 4 della proteina umana caspasi-4. In altri termini, un anticorpo idoneo ad essere impiegato in un saggio immunologico secondo la presente invenzione, ? un anticorpo o un suo frammento che in un saggio di binding (legame) e/o di affinit? mostri una capacit? di binding verso una qualsiasi altra isoforma della caspasi-4 significativamente pi? bassa o trascurabile rispetto alla capacit? di binding verso la isoforma 4 della caspasi-4.
In una particolare forma di realizzazione, la rivelazione e/o quantificazione dei livelli di espressione della isoforma 4 possono essere effettuate mediante un saggio immunologico, impiegando almeno un anticorpo in grado di legare specificatamente un epitopo della sequenza di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, comprendente almeno il frammento in posizione 261-263 aa della porzione C-terminale di detta isoforma-4, corrispondente alla sequenza amminoacidica ?GEC?. Ad esempio un epitopo corrispondente agli ultimi 13,12,11,10,9,8,7,6,5,43 amminoacidi della porzione C-terminale di detta isoforma-4. Come precedentemente menzionato, la sequenza di tre amminoacidi ?GEC? in posizione 261-263 aa della sequenza della isoforma-4 della caspasi-4 consente di differenziare in maniera specifica detta isoforma rispetto alla isoforma 1 della caspasi-4, quest?ultima caratterizzata dalla sequenza amminoacidica ?ANR? in posizione 261-263 aa.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, detto anticorpo in grado di legare specificatamente detta isoforma 4 della proteina umana caspasi 4, ? un anticorpo in grado di legare specificatamente un epitopo della sequenza di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 comprendente il frammento 252-263 aa, corrispondente alla sequenza: VIIVQACRGGEC (SEQ ID No.3).
Dette rivelazione e/o quantificazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 potranno essere effettuate, ad esempio, mediante un saggio ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), impiegando un anticorpo o un suo frammento in grado di riconoscere in modo specifico detta isoforma 4, in particolare un anticorpo in grado di legare detto epitopo della sequenza di detta isoforma 4 comprendente la sequenza Gly-Glu-Cys, ad esempio il peptide VIIVQACRGGEC (SEQ ID No.3).
Un saggio di espressione dei livelli di mRNA pu? essere effettuato per verificare se la isoforma 4 sia trascritta in detto campione biologico ottenuto da un individuo. Tale saggio pu? essere condotto, ad esempio, mediante esperimenti di RT-PCR o ?reazione a catena della polimerasi inversa?, seguiti da esperimenti di mRNA sequencing. L?estrazione di mRNA da detto campione biologico ottenuto da un individuo pu? essere effettuata secondo una qualsiasi delle tecniche note al tecnico del settore, ad esempio utilizzando reagenti e kit commerciali.
? oggetto della presente invenzione anche l?uso della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 come biomarcatore per la diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, e in particolare del tumore del polmone non a piccole cellule (NSCL).
La presente invenzione riguarda inoltre un anticorpo o un suo frammento in grado di legare specificatamente l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, in particolare e suo uso nella diagnosi e/o nel monitoraggio dello sviluppo e/o nella prognosi del tumore del polmone di un individuo. Secondo una forma di realizzazione della presente invenzione, detto anticorpo ? un anticorpo o un suo frammento in grado di legare un epitopo della sequenza C-terminale di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 comprendente la sequenza Gly-Glu-Cys, ad esempio l?epitopo corrisponder? agli ultimi 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 amminoacidi della SEQ ID no.1, in una forma di realizzazione preferita corrisponder? il frammento VIIVQACRGGEC (SEQ ID No. 3). Secondo un aspetto preferito dell?invenzione detto anticorpo ? un anticorpo monoclonale o policlonale in grado di legare un epitopo della sequenza C.terminale di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, in particolare comprendente il frammento VIIVQACRGGEC (SEQ ID No.
3).
L?anticorpo oggetto dell?invenzione potr? essere prodotto secondo una qualsiasi delle tecniche convenzionali note nel settore; a titolo meramente esemplificativo detto anticorpo potr? essere ottenuto immunizzando un topo, o un altro mammifero, contro l?epitopo desiderato, in particolare contro utilizzando un peptide corrispondente alla sequenza C-terminale di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, detto frammento/epitopo corrisponder? ad esempio agli ultimi 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 amminoacidi della SEQ ID no.1, in una forma di realizzazione preferita sar? il peptide VIIVQACRGGEC (SEQ ID No:3). Questa operazione potr? essere ad esempio svolta mediante iniezione dell?epitopo desiderato nell?animale. A seguito dell?uccisione dell?animale, sar? possibile isolare le cellule B secernenti detto anticorpo contro l?epitopo desiderato; queste cellule isolate potranno essere fuse a turno con una linea di cellule B tumorali immortalizzate, di tipo mieloma, in modo da produrre una linea cellulare di ibridoma, la quale potr? essere mantenuta in coltura per la produzione di anticorpi monoclonali contro l?epitopo desiderato.
? oggetto della presente invenzione anche l?uso in vitro di un anticorpo o un suo frammento secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte, nella diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, in particolare nel tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
L?invenzione riguarda inoltre un kit ed il suo uso per la diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, comprendente mezzi per rivelare i livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in un campione biologico, detto kit comprendendo almeno un agente per rivelare i livelli di espressione di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4.
Secondo una forma preferita di realizzazione, detto kit potr? comprendere almeno un anticorpo o un suo frammento in grado di riconoscere, e legare, un epitopo di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 comprendente il frammento VIIVQACRGGEC della sequenza della proteina.
Il kit potr? inoltre comprendere mezzi per rivelare i livelli di espressione di detta isoforma 1 della proteina umana caspasi-4 in un campione biologico, ad esempio un anticorpo o un suo frammento in grado di legare in maniera specifica detta isoforma 1.
Secondo una forma di realizzazione, detto kit potr? comprendere anche mezzi per la rivelazione del legame tra detto anticorpo e detta isoforma 4 e/o detta isoforma 1, ad esempio anticorpi in grado di riconoscere detta isoforma 4 e/o detta isoforma 1, coniugati ad un agente marcatore.
In una forma di realizzazione, saranno compresi nel kit oggetto dell?invenzione anche mezzi di controllo che potranno essere ad esempio impiegati per comparare i livelli di espressione della isoforma 4 con valori di riferimento ottenuti dal controllo appropriato, ad esempio controlli che hanno livelli di espressione di detta isoforma 4 e/o detta isoforma 1 noti. Tali mezzi di controllo comprendono ad esempio un campione biologico ottenuto da un soggetto sano o da un soggetto malato, in cui ? stata precedentemente misurato il livello di espressione di detta isoforma 4 e/o detta isoforma 1.
Tali mezzi di controllo possono anche comprendere uno o pi? agenti che non siano in grado di legare detta isoforma 4 e/o uno o pi? campioni non contenenti detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, in modo da poter verificare la validit? del test effettuato.
Il kit secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ivi descritte potr? inoltre includere componenti ausiliari, quali buffers, fluorofori, cromofori, agenti diluenti e/o istruzioni per l?uso.
Detto kit potr? anche comprendere un dispositivo per la rivelazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 come descritto di seguito.
La rivelazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 per la diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo e/o per fornire una prognosi sullo sviluppo del tumore del polmone in un individuo, pu? essere effettuata anche impiegando un dispositivo, ad esempio in forma di chip, predisposto a tale rivelazione, ovvero in grado di riconoscere e di legare detta isoforma 4 presente in un campione biologico ottenuto da un individuo in esame.
La presente invenzione si riferisce pertanto anche ad un dispositivo per la diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo e/o per fornire una prognosi sullo sviluppo del tumore del polmone in un individuo, comprendente almeno un agente in grado di riconoscere, o legare, la isoforma 4 della proteina umana caspasi-4.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, detto almeno un agente in grado di riconoscere, o legare, detta isoforma 4 della proteina caspasi-4, ? un anticorpo in grado di riconoscere un epitopo di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 comprendente il frammento VIIVQACRGGEC della sequenza della proteina (SEQ ID No.3).
Detto dispositivo pu? comprendere un materiale di supporto sul quale detto agente in grado di riconoscere, o legare, la isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 ? immobilizzato. Esempi non limitanti di materiali di supporto idonei ad essere impiegati per la realizzazione di un dispositivo secondo la presente invenzione includono, ad esempio, vetrini, wafers di silicio, carta, membrane di cellulosa.
Il riconoscimento o legame della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 da parte di/con l?agente immobilizzato potrebbe ad esempio essere tradotto e/o amplificato in un segnale ottico o elettrico. In una forma di realizzazione, le molecole di isoforma 4 legate dall?agente immobilizzato, potranno essere rivelate mediante l?impiego di almeno un anticorpo specifico in grado di legare detta isoforma 4, coniugato ad un agente marcatore, ad esempio un fluoroforo.
Come evidente in Figura 6A, gli autori della presente invenzione hanno trovato che l?espressione della subunit? ?large? della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 ? in grado di favorire la proliferazione di cellule tumorali. A seguito del trattamento di dette cellule tumorali con il composto Ac-VVDC-NH2, gli inventori hanno rilevato una significativa riduzione della crescita tumorale nelle cellule trasfettate con la subunit? ?large? della isoforma 4 (Figura 6B).
Alla luce di queste osservazioni sperimentali, la capacit? di inibire detta isoforma 4 rappresenta una strategia efficace per il trattamento o per la prevenzione del tumore del polmone.
? quindi anche oggetto della presente invenzione un composto inibitore della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 per uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone, in cui detto inibitore ? Ac-VVDC-NH2.
Secondo un aspetto preferito dell?invenzione, detto composto inibitore pu? essere impiegato per il trattamento e/o per la prevenzione del tumore del polmone non a piccole cellule.
Detto composto inibitore, o una composizione farmaceutica idonea comprendente detto composto inibitore, potranno essere somministrati utilizzando una qualsiasi tecnica compresa nello stato della tecnica nell?ambito dell?oncologia, della pneumologia o simili, ad un paziente che ne abbia bisogno. Tale somministrazione potrebbe essere effettuata una o pi? volte, secondo gli opportuni dosaggi, anche in base al grado di risposta del paziente alla terapia, determinato ad esempio monitorando i livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 secondo uno qualsiasi dei metodi precedentemente descritti.
? anche oggetto della presente invenzione un metodo in vitro per valutare e selezionare composti inibitori alternativi della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4, potenzialmente utilizzabili per la prevenzione e/o per il trattamento del tumore del polmone.
? pertanto oggetto della presente invenzione, un metodo di screening in vitro per l?identificazione di un composto candidato per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone comprendente il seguente passaggio:
a. determinare l?attivit? della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in presenza e in assenza di detto composto candidato, dove una riduzione e/o inibizione dell?attivit? di detta isoforma-4 indica che detto composto ? idoneo per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone.
In una forma di realizzazione del metodo di screening oggetto dell?invenzione, detto passaggio a. pu? essere effettuato mediante una qualsiasi delle tecniche note nel settore per la determinazione della attivit? di proteine caspasi, in particolare della attivit? della proteina umana caspasi-4.
? anche oggetto della presente invenzione un metodo di screening in vitro per l?identificazione di un composto candidato per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone comprendente i seguenti passaggi:
a. trattare cellule in coltura con detto composto candidato, in cui dette cellule sono cellule di tumore polmonare;
b. rilevare i livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 prima e dopo detto passaggio di trattamento b., dove una riduzione di detti livelli di espressione dopo detto passaggio di trattamento b. indica che detto composto ? idoneo per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone. Secondo un aspetto della presente invenzione, detto passaggio b. di rivelazione dei livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 comprende la rivelazione della presenza e/o la quantificazione dei livelli di espressione di detta isoforma 4 secondo una qualsiasi delle tecniche note nel settore, e/o secondo una qualsiasi delle tecniche precedentemente menzionate.
In una forma di realizzazione preferita, detto passaggio b. di rivelazione dei livelli di espressione di detta isoforma 4 pu? essere effettuato mediante un saggio immunologico impiegando un anticorpo o un suo frammento in grado di legare in maniera specifica detta isoforma 4, in particolare un anticorpo o un suo frammento in grado di legare un epitopo della sequenza di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 comprendente il frammento VIIVQACRGGEC (SEQ ID No.3).
Secondo un aspetto ulteriore dell?invenzione, il metodo di screening in vitro secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte, pu? comprendere anche i passaggi seguenti:
a. trattare cellule in coltura con detto composto candidato, in cui dette cellule sono cellule di tumore polmonare;
b. determinare e/o quantificare i livelli di proliferazione tumorale prima e dopo detto passaggio di trattamento a., dove una riduzione e/o una inibizione della proliferazione tumorale dopo detto passaggio di trattamento a. indica che detto composto ? idoneo per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone.
In una forma di realizzazione del metodo di screening secondo la presente invenzione, detto passaggio c. pu? essere effettuato mediante l?impiego di un fluorocromo in grado di valutare la proliferazione cellulare, conducendo un?analisi mediante flussocitometria. Un esempio di tale fluorocromo ? fornito dal composto ?carboxyfluorescein succinimidyl ester? (CFSE) fluorescente, un composto fortemente lipofilo in grado di legare covalentemente gli amminogruppi di macromolecole intracellulari e il quale pu? essere trattenuto all?interno delle cellule. Il CFSE persiste all?interno delle cellule consentendo un?analisi a lungo termine delle cellule marcate e della proliferazione delle cellule prese in esame.
? anche qui descritto un metodo per la prevenzione e/o il trattamento del tumore del polmone, in particolare con il tumore del polmone non a piccole cellule comprendente un passaggio di somministrare ad un individuo che ne abbia bisogno, un composto inibitore della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione precedentemente descritte.
Tale metodo potr? comprendere un primo passaggio di rivelare l?espressione di uno dei biomarcatori qui descritti secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione ed un secondo passaggio di somministrazione di un agente terapeutico per il trattamento di detto tumore, detto secondo passaggio potr? prevedere la somministrazione di uno o pi? farmaci adatti per il trattamento della patologia.
ESEMPI
Materiali e metodi
Campioni umani. Pazienti di NSCLC sono stati diagnosticati di tumore polmonare operabile. Pertanto, previo consenso informato da parte del paziente, i campioni umani sono stati ottenuti a seguito di resezione chirurgica durante il periodo 2014-2017. L?approvazione del Comitato etico risponde al numero 1254/2014. L?et? dei soggetti sani, non cancerosi era di 40?10 (media ?S.E.M) mentre quella dei pazienti NSCLC era di 60?10 (media ?S.E.M).
RT-PCR e mRNA sequencing. I tessuti di polmone sono stati sottoposti alla estrazione di mRNA utilizzando kit commerciali (Qiagen, USA) e sottoposti a retrotrascrizione inversa per ottenere cDNA da sottoporre a RT-PCR o sequenziamento tramite metodo Sanger.
ELISA. La presenza della isoforma 4 della caspasi-4 ? stata rivelata mediante metodo ELISA a sandwich ottenuta sintetizzando un anticorpo custom sulla base della sequenza diversa della isoforma 4 dalla isoforma 1 (sequenza nucleotidica diversa riportata in letteratura: GGTGGTGAGTGCTGA). Il test ELISA ? stato effettuato sia su tessuto polmonare che su plasma.
Trasfezioni. Le cellule A549, adenocarcinoma polmonare, sono state trasfettate mediante kit commerciabili per 72 ore in modo transiente con i vettori plasmidici: 1. PC4-1, che mima l?intera isoforma 1 della caspasi-4; 2. PC4-2, che mima il CARD+la subunit? LARGE; 3. PC4-3, che mima la subunit? LARGE+SMALL della isoforma 1; 4. PC4-4, che mima la subunit? LARGE della isoforma 1 e 5. PC4-5, che mima la subunit? LARGE della isoforma 4 della caspasi-4. La proliferazione cellulare ? stata valutata tramite metodo della CFSE (1?M), analizzato mediante flussocitometria. In alcuni esperimenti, le cellule trasfettate marcate con CFSE, sono state sottoposte a trattamento con due composti leader (composto 5: COMP-5; compost 6: COMP-6).
Analisi statistica. L?analisi statistica dei risultati ? stata effettuata tramite software GraphPad 8.04 (Prism, USA) mediante metodo One-Way ANOVA seguito da post-test Bonferroni o Mann-Whitney t test, laddove ritenuto necessario. Le curve di sopravvivenza sono state analizzate mediante metodo di Kaplan-Meier. I dati ritenuti significativi mostravano un valore p<0.05.
Risultati sperimentali
Al fine di comprendere se la isoforma 4 ? trascritta nelle masse tumorali polmonari, sono stati condotti esperimenti di RT-PCR (Figure 2A), seguiti da esperimenti di mRNA sequencing (Figure 2B). Come indicato nelle figure 2A e 2B, tali esperimenti hanno dimostrato che la isoforma 4 ? espressa nella massa tumorale. In particolare, la sequenza nucleotidica che differisce tra la isoforma 1 e 4 ? la seguente GGTGGTGAGTGCTGA (SEQ ID No.4) quest?ultima presente nella isoforma 4 ma non nella isoforma 1, a seguito di uno splicing alternativo di mRNA tra esone 5 e introne 6. Per provare la presenza della isoforma 4 ma non della isoforma 1, ? stato impiegato un anticorpo custom, in grado di riconoscere un epitopo specifico della isoforma 4 che differisce in 3 aminoacidi dalla isoforma 1. In seguito, ? stato costruito un kit ELISA custom in grado di identificare i livelli proteici della isoforma 4, definiti con metodo quantitativo. Si ? trovato che la isoforma 4 ? maggiormente espressa della isoforma 1 nella massa tumorale di 55 pazienti su 85, rappresentando il 64.7% dei campioni umani testati (Figure 3A).
In particolare, la isoforma 4 ? significativamente pi? elevata nella massa tumorale, identificata come LK (Figure 3A) rispetto al tessuto sano, identificato come sano (healthy) (Figure 3A), e non canceroso (Figura 3A). Inoltre, l?analisi ROC ha evidenziato un?area sottesa alla curva (AUC) di 0.7419.
Allo stesso modo, sono stati testati i livelli circolanti della isoforma 4 della caspasi-4. Tali livelli erano significativamente pi? elevati nel sangue di pazienti con NSCLC (p<0.0001) rispetto a soggetti sani o di pazienti con patologie respiratorie non tumorali (Figura 4A, H vs LK). Da notare, i livelli della isoforma 4 della caspasi-4 in pazienti con amartoma (tumori benigni polmonari), come anche nel caso di soggetti fumatori, non riscontravano livelli elevati di tale proteina (Figura 4A), definendo la isoforma 4 della caspasi-4 la proteina in grado di discriminare tra la forma benigna e quella maligna del tumore. L?analisi ha mostrato un valore di AUC pari a 0.895 (Figure 4B).
Una ulteriore caratteristica associata ai livelli di isoforma 4 della caspasi-4 ? di tipo prognostica. Infatti, si ? osservato che pazienti che mostravano livelli pi? elevati di isoforma 4 rispetto alla isoforma 1 avevano una pi? bassa probabilit? di sopravvivenza (Figure 5). In particolare, la mediana di sopravvivenza per i pazienti positivi alla isoforma 4 ? di 319 giorni (10 mesi) vs 1090 giorni (36 mesi) dei pazienti positivi alla isoforma 1 (Figure 5).
Al fine di comprendere il ruolo della isoforma 4 nella crescita tumorale, le cellule A549, cellule di adenocarcinoma polmonare, sono state trasfettate con vettori specifici, contenenti porzioni specifiche della isoforma 1 e isoforma 4 come descritto in Figura 6A. Si ? osservato che la isoforma 4 e 1 sono in grado di promuovere entrambe la proliferazione tumorale quando la subunit? LARGE ? espressa rispetto alle altre strutture considerate (Figure 6A). Infine, le cellule trasfettate con la subunit? large della isoforma 1 (PC4-4) e 4 (PC4-5) sono state trattate con leading compound al fine di verificare una riduzione della crescita tumorale. Si ? osservato che il trattamento con il composto 6 (CMP6) alla concentrazione 10nM, ma non il composto 5 (30nM), ? in grado di ridurre in modo significativo la crescita tumorale delle cellule A549 trasfettate con la porzione LARGE della isoforma 4 (Figura 6B).
LISTA SEQUENZE NELLA DESCRIZIONE SEQ ID No:1 Sequenza Amminoacidica della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 (https://www.uniprot.org/uniprot/P49662#P49662-4) MAEGNHRKKPLKVLESLGKDFLTGVLDNLVEQNVLNWKEEEKKKYYDAKTEDKVRVMADS MQEKQRMAGQMLLQTFFNIDQISPNKKAHPNMEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKE RAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLT ARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNN RNCLSLKDKPKVIIVQACRGGEC
SEQ ID No:2 Sequenza Amminoacidica della isoforma 1 della proteina umana caspasi-4 (https://www.uniprot.org/uniprot/P49662#P49662-1) MAEGNHRKKPLKVLESLGKDFLTGVLDNLVEQNVLNWKEEEKKKYYDAKTEDKVRVMADS MQEKQRMAGQMLLQTFFNIDQISPNKKAHPNMEAGPPESGESTDALKLCPHEEFLRLCKE RAEEIYPIKERNNRTRLALIICNTEFDHLPPRNGADFDITGMKELLEGLDYSVDVEENLT ARDMESALRAFATRPEHKSSDSTFLVLMSHGILEGICGTVHDEKKPDVLLYDTIFQIFNN RNCLSLKDKPKVIIVQACRGANRGELWVRDSPASLEVASSQSSENLEEDAVYKTHVEKDF IAFCSSTPHNVSWRDSTMGSIFITQLITCFQKYSWCCHLEEVFRKVQQSFETPRAKAQMP TIERLSMTRYFYLFPGN
SEQ ID No:3 Sequenza Amminoacidica dell?epitopo della sequenza della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 comprendente il frammento 252-263 aa.
VIIVQACRGGEC SEQ ID No:4 Sequenza nucleotidica che differenzia l?isoforma 4 dall?isoforma 1 della proteina umana caspasi-4
GGTGGTGAGTGCTGA
Claims (13)
1. Metodo in vitro o ex vivo per la diagnosi e/o per monitorare lo sviluppo e/o per fornire una prognosi sullo sviluppo del tumore del polmone in un individuo, comprendente il passaggio di:
a. rivelare i livelli di espressione di un primo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto primo biomarcatore ? l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4.
2. Metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto tumore del polmone ? il tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
3. Metodo secondo le rivendicazioni 1 o 2, in cui detto campione biologico ? selezionato dal gruppo costituito da campione istologico, sangue intero, plasma o siero.
4. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, comprendente un ulteriore passaggio a? di rivelare i livelli di espressione di un secondo biomarcatore in un campione biologico isolato da detto individuo, in cui detto secondo biomarcatore ? l?isoforma 1 della proteina umana caspasi-4.
5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui detto passaggio di rivelazione comprende l'esecuzione di un test in vitro selezionato dal gruppo costituito da un saggio immunologico, un saggio basato su aptamero, un saggio istologico o citologico o un saggio di livello di espressione di mRNA, in particolare in cui in detto saggio immunologico ? utilizzato almeno un anticorpo o un suo frammento in grado di legare in modo specifico detta isoforma 4 e non l?isoforma 1.
6. Uso in vitro della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 come biomarcatore per la diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, in particolare del tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
7. Anticorpo o un suo frammento in grado di legare specificatamente l?isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 e non l?isoforma 1.
8. Uso in vitro di un anticorpo o un suo frammento secondo la rivendicazione 7 per uso nella diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, in particolare nel tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
9. Kit per la diagnosi e/o prognosi e/o per monitorare lo sviluppo del tumore del polmone, comprendente mezzi per rivelare i livelli di espressione della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in un campione biologico, detto kit comprendendo almeno un agente per rivelare i livelli di espressione di detta isoforma 4 della proteina umana caspasi-4.
10. Il kit secondo la rivendicazioni 9, ulteriormente comprendente mezzi per rivelare i livelli di espressione di detta isoforma 1 della proteina umana caspasi-4 in un campione biologico.
11. Composto inibitore della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 per uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone, in cui detto inibitore ? Ac-VVDC-NH2.
12. Composto inibitore secondo la rivendicazione 11, in cui detto tumore del polmone ? tumore del polmone non a piccole cellule (NSCLC).
13. Metodo di screening in vitro per l?identificazione di un composto candidato per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone comprendente il seguente passaggio: determinare l?attivit? della isoforma 4 della proteina umana caspasi-4 in presenza e in assenza di detto composto candidato, dove una riduzione e/o inibizione dell?attivit? di detta isoforma-4 indica che detto composto ? idoneo per l?uso nel trattamento e/o nella prevenzione del tumore del polmone.
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| TERLIZZI MICHELA ET AL: "Circulating and tumor-associated caspase-4: a novel diagnostic and prognostic biomarker for non-small cell lung cancer", ONCOTARGET, vol. 9, no. 27, 10 April 2018 (2018-04-10), pages 19356 - 19367, XP055775111 * |
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