KR20180018410A

KR20180018410A - 항암 약물 내성 바이오마커 SerpinB2

Info

Publication number: KR20180018410A
Application number: KR1020170101399A
Authority: KR
Inventors: 이상국; 박헌주; 배송이; 홍지영
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2016-08-11
Filing date: 2017-08-10
Publication date: 2018-02-21

Abstract

본원은 SerpinB2 바이오마커의 검출시약을 포함하는 제피티닙(gefitinib) 내성 비소세포 폐암 진단용 조성물에 관한 것으로, 본원에서 상기 바이오마커는 제피티닙에 내성이 생긴 비소세포폐암 세포에서 발현이 낮다는 것을 밝혀 상기 바이오마커를 이용하여 제피티닙 내성 비소세포 폐암을 진단할 뿐만 아니라 또한 상기 SerpinB2 바이오마커를 제피티닙 내성 비소세포 폐암용 항암제 개발에 유용하게 활용할 수 있다.
또한 본원은 SerpinB2 발현 증가제를 포함하는 제피티닙 내성 비소세포 폐암 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, SerpinB2 발현 증가에 의해 침윤성 및 invadopodia 유사 구조의 길이를 감소시켜 암 전이를 억제할 수 있음을 개시하고, 다프난 다이터페노이드계 화합물인 유안후아딘 또는 유안후아신이 상기 SerpinB2 발현을 증가시키므로 암 전이 억제에 유효하다.

Description

항암 약물 내성 바이오마커 SerpinB2 {SerpinB2 as biomarker for detecting cancer with resistance to anticancer agents}

본원은 항암제 내성 바이오마커 SerpinB2에 관한 것이다.

전 세계적으로 암 발생률 및 사망률은 꾸준히 증가하는 추세에 있어 효과적인 항암제 개발의 중요성 또한 증가하고 있다. 통계청 자료에 의하면 특히, 폐암은 국내에서 암사망률 제1위의 질환이며 최근 10년 동안 다른 암에 비하여 증가속도가 가장 빠르며 앞으로도 폐암 발생 및 사망률은 지속적으로 증가하여 20 ~ 30년 후에는 현재의 두 배 이상까지 증가 될 것이라 추정된다. 비소세포 폐암(Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC)은 암과 관련된 사망의 주된 원인이 되는 암 중 하나이다. 폐암에 대한 치료는 크게 수술법, 방사선 치료법, 항암화학 치료법 등으로 구분할 수 있으나 대부분의 경우 항암화학 약물을 추가로 투여함으로서 더 높은 치료 효과를 얻고 있고 진행성 폐암에서는 항암화학요법 또는 방사선치료가 주된 치료이다. 지난 10년간, 백금 화합물과 비노렐빈(vinorelbine), 젬사이타빈(gemcitabine), 택산(taxane)계와 같은 새로운 항암제의 병용투여에 의하여 삶의 질과 생존율은 크게 증가하였다. 그럼에도 불구하고, 진행성 비소세포폐암의 1년 생존율은 35%, 2년 생존률은 15 ~ 20% 밖에 되지 않으며 폐암은 현재 치료법으로 치료한계점에 도달하였다.

최근 특정한 생물학적 기전을 억제하여 치료효과의 상승 및 부작용을 감소시키고자 하는 새로운 개념의 치료법인 분자표적치료(Molecular targeted therapy)가 개발되었다. 제피티닙 [gefitinib; 상품명, 이레사(Iressa)]과 같은 일부 약제는 비소세포폐암에서 분자표적치료제로서 가장 먼저 미국식품의약청에서 승인을 받아 이미 임상에 적용되어 환자들에게 도움을 주고 있다.

제피티닙(Gefitinib)은 최초로 시판된 경구로 복용하는 상피세포 성장인자 수용체-타이로신 인산화 효소 억제제(EGFR-TKI)이며 전임상연구에서 폐암, 대장암, 유방암 등 여러 고형암의 성장을 억제하는 효과를 나타냈다(William Pao et al (2005) J Clin Oncol 23:2556-2568; Herbst R et al (2004) Nat Rev Cancer 4:956-65;Miller VA et al (2004) J Clin Oncol 22:1103-1109).

제피티닙(Gefinitib)은 작은 합성 아닐리노퀴나졸린(anilinoquinazoline)으로 다른 타이로신 키나아제(tyrosine kinase, TK)에는 최소한의 활성도를 나타내고 상피세포 성장인자 수용체-타이로신 인산화 효소(EGFR-TK)를 선택적으로 억제한다. 또한 분열인자 활성화 단백질 인산화효소(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)를 억제하며 연이은 핵전사인자(nuclear transcription factor)인 씨-포스 (c-fos)를 억제한다. 기본적으로 이 약제는 성장을 억제하지만 높은 용량에서는 세포사멸을 유도하기도 한다. 제피티닙은 기존의 세포독성 항암제가 갖고 있는 골수 억제, 신독성, 오심, 구토, 탈모 등의 심각한 독성 및 부작용의 문제를 개선하였을 뿐 아니라 경구 치료가 가능하게 되었다.

하지만 암은 매우 복잡한 경로로 발전하기 때문에 특정 표적인자만을 선택적으로 억제하는 이러한 분자표적치료제는 장기 투여에 의한 내성이 생기는 문제점이 있으며 특정 유전자의 돌연변이 상태에 따라 선택적인 치료효과를 나타내는 단점이 있다. 특히 비소세포암에서는 EGFR-TKI(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor) 내성과 같이 선천적이거나 후천적으로 생기는 약물에 대한 내성이 암 치료에 있어서 주된 난관이 되고 있다. 비소세포성 폐암에 대한 화학요법제인 제피티닙에 대해서도 약물 내성이 생기는 문제점이 있어, 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)의 T790M 변이나 protooncogene인 c-Met의 발현 등에 의해 약제내성이 생긴다. 이에 EGFR, KRAS, 그리고 AXL 등과 같이 폐암에 예후를 알 수 있거나 약물 내성에 관련성이 높은 마커들을 탐색하는 연구가 집중적으로 진행되고 있다.

대한민국 등록특허 제10-1388635호는 ‘다프난 다이터페노이드(Daphnane diterpenoid)계 물질의 상피세포 성장인자 수용체(EGFR）저해제인 제피티닙(Gefitnib) 내성 인간 폐암 세포에 유용한 항암제’에 관한 것으로, 다프난 다이터페노이드계 화합물이 제피티닙 내성 폐암에 유용하다는 것이 개시되어 있다.

대한민국 등록특허 제10-0946562호는 ‘원화 추출물로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물’에 관한 것으로 원화추출물 유래 화합물로서 다프난 다이터페노이드계 화합물이 개시되어 있다.

하지만 항암제 특히 제피티닙 내성 암을 진단할 수 있는 바이오마커 및 암전이 억제제에 대해 개시되어 있거나 시사되어 있지 않다.

본원은 항암제 내성 바이오마커 SerpinB2 및 그 용도를 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 SerpinB2 바이오마커의 검출시약을 포함하는, 제피티닙(gefitinib) 내성 비소세포 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

본원에 따른 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약으로 예를 들면 마커의 단백질 수준 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이고, 상기 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약을 포함한다.

다른 양태에서 본원은 제피티닙에 대한 내성을 나타내는 비소세포 폐암 진단에 대한 정보를 제공하기 위하여, 상기 진단이 필요한 대상체의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료에서 SerpinB2 바이오마커를 검출하는 단계; 및 상기 검출결과, 상기 대상체의 시료에서 내성을 나타내지 않는 대조군과 비교하여 상기 SerpinB2 바이오마커의 발현이 감소한 경우, 상기 대상체의 시료를 제니티닙에 대한 내성시료로 판단하는, SerpinB2 바이오마커를 검출하는 방법을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 SerpinB2을 포함하는 제피티닙(gefitinib)에 내성을 갖는 암의 전이 억제 또는 암의 치료, 특히 폐암, 더욱 특히 비소폐암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또 다른 양태에서 본원은 SerpinB2의 발현 증가제로서 유안후아딘(yuanhuadine) 또는 유안후아신(yuanhuacine)을 포함하는 제피티닙(gefitinib)에 내성을 갖는 비소세포 폐암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에 따른 SerpinB2 바이오마커는 제피티닙 내성 비소세포 폐암을 진단할 수 있다.

또한 본원은 SerpinB2 또는 이의 발현 증가제를 포함하는 항암제, 또는 제피티닙 내성 비소세포 폐암 전이 억제용 조성물에 관한 것으로, 본원에 따른 SerpinB2 발현증가는 제피티닙 내성 비소세포 폐암에서 침윤성 및 인베이도포디아(invadopodia) 유사구조의 길이를 감소시켜 항암제 내성극복, 암치료 또는 암 전이 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본원의 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 Serpin B2의 단백질 (a), mRNA (b) 발현 및 면역조직화학적 분석 (c) 결과를 나타낸 것이며, 또한 폐암세포주(H292) 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에 24시간 동안 100 nM 제피티닙(gefitinib) 처리 후 SerpinB2의 단백질 (d), mRNA (e) 발현을 나타낸 것이다. 그리고 정상 폐세포주인 MRC-5 대비 폐암세포주(H292) 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 SerpinB2, 유로키나제 플라스미노겐 활성화(urokinase plasminogen activator, uPA) (f) mRNA 발현비율을 나타낸 것이며 (g)는 SerpinB2 발현에 비해 정상 폐세포주인 MRC-5, 폐암세포주(H292) 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 SerpinB2와 유로키나제 플라스미노겐 활성화(urokinase plasminogen activator, uPA) mRNA 발현비율을 나타낸 것이다. 도 1의 결과는 제피티닙(gefitinib) 처리에 따른 SerpinB2 감소 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주에서의 낮은 SerpinB2 발현을 확인함으로써 SerpinB2가 제피티닙(gefitinib) 내성마커임을 나타낸다.
도 2는 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef) xenograft 종양모델에서 Serpin B2의 단백질 (a), mRNA (b) 발현억제 효과에 나타낸 것이며 또한 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H1993-Gef)에서의 serpin B2 단백질 (c), mRNA (d) 발현저해 및 H292 세포의 증식 (e), 침윤능 (f)에 미치는 제피티닙(gefitinib)의 영향을 나타낸 것이다. 도 2의 결과는 SerpinB2가 제피티닙(gefitinib) 내성마커로 작용할 수 있음을 나타낸다.
도 3은 폐암세포주(H292) 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 침윤능 및 인베이도포디아(invadopodia) 유사 구조 길이의 변화를 나타낸 것이다. 도 3의 결과는 SerpinB2의 기능을 바탕으로 한 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주의 전이 능력 증가를 제시하며, 암전이 억제를 통한 암 치료 및 제피티닙의(gefitinib) 내성 극복의 암치료에서의 필요성을 나타낸다.
도 4는 폐암세포주(H292) 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 SerpinB2 의존적 침윤능 및 제피티닙(gefitinib) 감수성 변화를 나타낸 것이다. 도 4의 결과는 SerpinB2와 폐암세포주의 전이 능력의 상관관계를 밝히고, SerpinB2 조절을 통한 암전이 억제 및 제피티닙(gefitinib) 내성 극복을 나타낸다.
도 5는 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서 SerpinB2 과발현을 위한 pEGFP-N1-SERPINB2 plasmid transfection후 (a) confocal laser microscope (b) mRNA (c) 단백질 발현을 나타낸 것이다. 도 5의 결과는 SerpinB2 형질 감염으로 공 촛점 현미경, mRNA 및 단백질에서의 과발현을 나타낸다.
도 6은 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서 침윤능 및 인베이도포디아(invadopodia) 유사구조에 있어 유안후아딘(yuanhuadine, YD)의 영향을 나타낸 것이다. 도 6의 결과는 SerpinB2 감소가 초래한 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주의 전이 능력을 유안후아딘(yuanhuadine, YD)가 억제함을 나타낸다.
도 7은 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서 유로키나제 플라스미노겐 활성화(urokinase plasminogen activator, uPA) 발현에 있어 유안후아딘(yuanhuadine, YD)의 영향을 나타낸 것이다. 도 7의 결과는 YD의 SerpinB2 및 uPA 조절을 통한 암전이 억제 기전을 나타낸다.
도 8은 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서 기질 금속 단백질분해효소(matrix metalloproteinase 2, MMP2), MAP 인산화효소(mitogen activated protein kinase, MAPK) 및 카데린(cadherin) 발현에 있어 유안후아딘(yuanhuadine, YD)의 영향을 나타낸 것이다. 도 8의 결과는 YD의 의한 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주 전이 능력 억제를 나타낸다.
도 9는 이종이식(Xenograft) 종양모델에서의 유로키나제 플라스미노겐 활성화(urokinase plasminogen activator, uPA)계, E-카데린(E-cadherin), N-카데린(N-cadherin) 관련 단백질발현에 미치는 유안후아딘(yuanhuadine, YD)의 영향을 나타낸 것이다. 도 9의 결과는 종양이종이식 동물 모델에서 YD의 암전이 억제 효과를 나타낸다.

본 발명은 유로키나아제 플라스미노겐 활성화(Urokinase Plasminogen Activator, uPA) 시스템의 구성 요소인 SerpinB2 (Plasminogen activator inhibitor type 2) 바이오마커가 항암제 특히 제피티닙 내성 비소세포암의 마커로서 작용하며, 상기 바이오마커의 발현을 증가시키면 제피티닙 내성 비소세포암의 내성을 극복하고 암전이를 억제할 수 있으며, 또한 원화 추출물 유래 화합물인 다프난 다이터페노이드계 화합물이 상기 마커의 발현을 증가시켜 암치료제로 사용할 수 있다는 발견에 근거한 것이다.

특히 본원의 바이오마커 SerpinB2가 후천적으로 제피티닙에 내성이 생긴 비소세포 폐암(NSCLC) 세포에서 SerpinB2의 발현이 낮다는 것을 최초로 밝혀내고 SerpinB2 발현이 낮아지게 되면 제피티닙 내성세포에서 인베이도포디아(invadopodia) 유사구조의 길이가 증가하고 세포 주변에 돌출된 부분이 생긴다는 것을 밝혔다.

본원의 마커 SerpinB2 (Plasminogen activator inhibitor type 2)는 세린 프로테아제 억제제(세르핀) 수퍼 패밀리 중의 Clade B 서브 그룹의 멤버이며, 세린 프로테아제 플라스미노겐 활성화제에 대한 저해 활성으로 인해서 플라스미노겐 활성화 저해제 타입2 (Plasminogen Activator Inhibitor-2, PAI-2)로 알려져 있다. SerpinB2는 uPA계인 uPA/uPAR/SerpinE1 (PAI-1이라고 함) 시스템의 주요 요소 중 하나이다. uPA 시스템은 세포 외 기질(ECM)의 분해 조절에 관여하며 활성 uPAR 바인딩 uPA는 비활성 플라스미노겐을 플라스민으로 변환시키는데, 이것은 직접 ECM 분자를 분해하고 잠재 성장 인자를 방출하며, pro-matrix metalloproteinases (pro-MMPs)의 활성화를 통해 ECM 분자를 간접적으로 분해한다. uPA의 시스템에서의 SerpinB2, SerpinE1의 역할은 uPA와 비가역적 공유 착물의 형성을 통해 uPA를 억제하는 것이다. 이 복합체는 이후 엔도사이토시스(endocytosis)를 촉진하기 위해서 low-density lipoprotein receptor-related proteins (LRP)와 상호작용하여, 이후 분해된다. 또한, SerpinE1는 ECM component vitronectin, LRP 그리고 the very-low-density lipoprotein receptor (VLDLR)와 직접적으로 상호작용하여 세포 부착을 촉진하고 암세포의 이동 및 증식을 초래한다.

본원의 마커 SerpinB2는 그 유전자 및 단백질 서열이 공지된 것으로 인간 서열은 NM_002575, NP_002566로 공지되어 있다.

본원에서 제피티닙 내성 비소세포 폐암은, 비소세포 폐암의 수용성 돌연변이를 표적인자로 하는 표적항암제인 제피티닙에 내성이 생긴 비소세포 폐암이다. 상기 비소세포 폐암(NSCLC)은 소세포 폐암(small cell lung cancer)이 아닌 상피성 폐암(epithelial lung cancer)을 말하며, 폐선암종 또는 편평세포암종이라고 한다. 상기 비소세포암은 암세포의 크기와 모양에 따라 3가지 subtype인 편평상피세포암(squamous cell lung cancer), 선암(adenocarcinoma), 대세포암(large-cell lung cancer)으로 분류되며, 이들 모두 본원의 비소세포암에 포함된다.

본원에서 용어 진단은 특정 질병 또는 질환에 대하여 검사 대상체의 질환에 대한 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상체의 예후(prognosis)(예컨대 질환의 단계 또는 진행상태 판별 또는 치료에 대한 질환의 반응성 결정)를 판정하는 것 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본원에서 용어 진단용 바이오마커, 마커 또는 진단 마커란 질환이 발생한 대상체 유래의 시료 예를 들면 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 질환의 치료를 위해 적절한 치료를 받은 대상체의 조직 또는 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 시료에 비하여 질환이 발생한 대상체 유래의 시료에서 감소 양상을 보이는 단백질 또는 핵산을 일컫는 것으로, 본원에 따른 일 구현예에서는 SerpinB2 단백질 또는 유전자 또는 그 단편으로, 그 발현이 제피티닙 내성 비소세포 폐암 대상체 유래의 시료에서 감소한다.

본원에서 생물학적 시료란 바이오마커 검출이 가능한 하나 이상의 성분을 포함하는 물질 또는 물질의 혼합물을 일컫는 것으로 생물체, 특히 인간 유래의 세포, 조직 또는 체액, 예를 들면 전혈, 뇨, 혈장, 및 혈청을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 생물체에서 직접적으로 유래된 것은 물론 인비트로에서 배양된 세포 또는 조직을 포함한다. 본원에 따른 마커의 검출을 위해 다양한 시료가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 한 구현예에서는 전혈, 혈청 및/또는 혈장이 사용될 수 있다. 다른 구현예에서는 질환이 발생한 또는 발생이 의심되는 또는 발생가능성이 있는 생물체에서 수득한 조직 또는 세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.

본원에서 검출이란, 정량 및/또는 정성 분석을 포함하는 것으로, 존재, 부존재의 검출 및 발현량 검출을 포함하는 것으로 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원의 마커 SerpinB2는 그 유전자 및 단백질 서열이 공지된 것으로 인간 서열은 NM_002575, NP_002566로 공지되어 있고, 이를 근거로 적절한 검출 방법을 선택할 수 있을 것이다.

본원에 따른 마커는 정량적 또는 정성적 분석을 통해 핵산, 특히 mRNA 및/또는 단백질의 존재 여부의 검출 및/또는 이의 발현량 자체, 발현량의 변화, 발현량 차이의 수준에서 검출될 수 있다.

이러한 본원에 따른 바이오마커의 검출은 마커의 기능적 특징 및/또는 항원적 특징에 기반을 둔 것일 수 있다.

본원에 따른 마커는 마커의 활성 또는 기능의 검출, 또는 단백질을 코딩하는 핵산, 특히 mRNA 수준 및/또는 단백질 수준에서 특이적으로 상호작용하는 물질을 사용하여 검출될 수 있다.

이런 측면에서 본원에 따른 검출시약은 본원에 따른 마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 다양한 방식으로 정량적 또는 정석적 분석을 통해 검출할 수 있는 시약이다.

본원에 따른 마커의 정량적 및 정성적 분석에는 공지된 핵산 및 단백질을 정성 또는 정량적으로 검출하는 다양한 방법이 사용될 수 있다.

단백질 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직 면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 용액/현탁액 중에서 표지된 항체와의 결합 및 유세포 분석기를 통한 검출, 질량분석기 또는 항체와 같은 단백질 어레이 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

또는 핵산 수준에서의 정성적 또는 정략적 검출 방법으로는 핵산 전사 및 증폭 시스템, eTag 시스템, 표지된 비드를 기본으로 하는 시스템, 핵산 어레이와 같은 어레이 시스템 등을 이용한 방법이 사용될 수 있다.

이러한 방법은 공지된 것으로 예를 들면 chip-based capillary electrophoresis: Colyer et al. 1997. J Chromatogr A. 781(1-2):271-6; mass spectroscopy: Petricoin et al. 2002. Lancet 359: 572-77; eTag systems: Chan-Hui et al. 2004. Clinical Immunology 111:162-174; microparticle-enhanced nephelometric immunoassay: Montagne et al. 1992. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 30:217-22 등을 참조할 수 있다.

일 구현예에서는 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), RIA (Radio Immuno Assay) 등과 같은 샌드위치 방식의 면역분석법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은 고상의 기질 예를 들면 글라스, 플라스틱 (예를 들면 폴리스티렌), 폴리사카라이드, 나일론 또는 나이트로셀룰로스로 제작된 비드, 막, 슬라이드 또는 마이크로타이터플레이트에 결합된 제1항체에 생물학적 시료를 추가한 후, 직접 또는 간접 검출이 가능한 표지물질 예를 들면 ³H 또는 ¹²⁵I와 같은 방사선 물질, 형광물질, 화학발광물질, 햅텐, 바이오틴, 디그옥시제닌 등으로 표지되거나 또는 기질과의 작용을 통해 발색 또는 발광이 가능한 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 말레이트 데하이드로게나아제와 같은 효소와 컨쥬게이션된 항체와의 결합을 통해 단백질은 정성 또는 정량적으로 검출할 수 있다.

다른 구현예에서는 항원 항체 결합을 통해 마커를 간단하게 검출할 수 있는 Ouchterlony 플레이트, 웨스턴블랏, Crossed IE, Rocket IE, Fused Rocket IE, Affinity IE와 같은 면역 전기영동(Immuno Electrophoresis)이 사용될 수 있다. 상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984 등에 기재되어 있다. 상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석하여 즉, 정상 시료와의 시그널 대조를 수행함으로써, 질환 발생 여부를 진단할 수 있다.

이러한 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 상기 마커에 특이적으로 결합하는 항체, 기질, 핵산 또는 펩타이드 앱타머, 또는 상기 마커와 특이적으로 상호작용하는 수용체 또는 리간드 또는 보조인자 등이 사용될 수 있다. 상기 본원의 마커와 특이적으로 상호작용 또는 결합하는 시약 또는 물질은 칩 방식 또는 나노입자(nanoparticle)와 함께 사용될 수 있다.

본원의 마커는 또한 핵산 수준 특히 mRNA 수준에서의 공지된 다양한 방법을 사용하여 정량적 및/또는 정성적으로 검출될 수 있다.

핵산 수준에서의 정성적 또는 정량적 검출 방법으로는 예를 들면 mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)/중합효소 연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석(NPA) 예를 들면 RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이 또는 칩 또는 노던블랏 등을 이용한 방식이 사용될 수 있으며, 이러한 분석법은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, 당업자라면 본원의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 량의 시료 검출에 유용하다. 또한 본원에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 핵산 수준에서의 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 본원 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍을 포함한다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 본원에 사용되는 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 상술한 바와 같은 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다. 일구현예에서는 mRNA 검출을 위해 노던 블랏 또는 역전사 PCR(중합효소연쇄반응)이 사용된다. 후자의 경우 검체의 RNA를 특히 mRNA를 분리한 후, 이로부터 cDNA를 합성한 후, 특정 프라이머, 또는 프라이머 및 프로브의 조합을 사용하여, 검체 중의 특정 유전자를 검출하는 것으로, 특정 유전자의 존재/부존재 또는 발현량을 결정할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 예를 들면 (Han, H. et al, 2002. Cancer Res. 62: 2890-6)에 기재되어 있다.

다른 양태에서 본원은 또한 SerpinB2 바이오마커의 검출 시약을 포함하는 검체의 제피티닙 내성 비소세포 폐암 진단용 키트에 관한 것이다.

본원에 따른 키트에 포함되는 검출시약은 앞서 언급한 바를 참고 할 수 있으며, 키트는 사용안내서를 추가로 포함할 수 있다.

전이로 암 세포는 세포의 이동과 침윤을 통해 원래 부위에서 떨어진 다른 장기의 2차 부위로 퍼지게 되는데 암 세포는 액틴 세포 골격 리모델링과 lamellipodia, filopodia, invadopodia와 같은 침입 구조의 형성에 의해서 전이와 침윤 특성을 얻게 된다. 일반적으로 lamellipodia와 filopodia는 이차원 배양에서 수평 이동을 하게 되는 반면 invadopodia와 podosomes는 생체내 환경과 유사한 3차원 매트릭스 내를 이동하는 데 필요한 구조이다. Podosomes는 몇 분의 짧은 시간 내 약하게 ECM을 분해하는 반면, invadopodia는 최대 1시간 동안 강하게 ECM을 분해한다. 따라서 약제 내성 암세포에 의해 중재되는 이동 및 침윤 억제는 내성의 극복에 중요하다.

본원에서는 제피티닙 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서 SerpinB2가 하향 발현되어 있으며, 침윤성과 invadopodia 유사구조 길이가 증가한 것을 밝혔다.

나아가 SerpinB2가 저발현된 세포주에 Serpin 발현 증가제를 처리하였을 때 SerpinB2의 고발현이 유도되고 H292-Gef 세포의 침윤성과 invadopodia 유사 구조의 길이를 감소됨을 밝혔다. 이러한 침윤성과 invadopodia 유사구조 길이가 감소되면 암 전이가 억제될 수 있다.

따라서 다른 양태에서 본원은 또한 SerpinB2 또는 그 발현 증가제를 유효성분으로 포함하는, 제피티닙 내성 비소세포 폐암 전이 억제 또는 전이를 억제하여 비소세포 폐암을 치료하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용된 용어 “치료”란 질환, 또는 질환으로 인한 증상 또는 상태의 억제, 제거, 경감, 완화, 개선, 및/또는 예방을 포함하는 개념이다.

본원에서는 제피티닙 내성 비소세포 폐암에서 상기 SerpinB2 마커의 발현을 증가시키면 침윤성과 invadopodia 유사구조 길이가 감소하는 것을 밝혔다.

본원에 따른 약학 조성물은 암의 전이를 억제하여 치료가 가능하며, 특히 폐암, 더욱 특히 비소폐암, 더더욱 특히 제피티닙 내성을 나타내는 비소세포 폐암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.

따라서 SerpinB2 발현 증가제는 제피티닙 내성 비소세포 폐암 전이 억제제로서 사용될 수 있다. 여기에서 발현은 mRNA로의 전사 및 단백질로의 번역 수준에서의 조절을 포함하는 것이며, 활성의 조절은 발현된 단백질이 세포내에서 제 기능할 수 있도록 하는 생물학적 작용을 의미한다.

이에 본원의 일 구현예에서는 SerpinB2 유전자 또는 단백질을 포함하는 암 전이 억제용 약학 조성물에 관한 것이다.

본원에 따른 SerpinB2 유전자 또는 단백질 서열의 예는 앞서 언급한 바와 같다. SerpinB2 단백질은 그 유전자를 공지의 벡터에 클로닝하여 세포에서 발현시킨 후 분리 정제하여 사용할 수 있으며, 당업자라면 적절한 방법의 선택이 가능하다.

본원의 다른 구현예에서 상기 SerpinB2 발현 증가제가 치료제로 사용될 수 있다. 이러한 발현 증가제는 다프난 다이터페노이드계 화합물인 유안후아딘(Yuanhuadine) 또는 유안후아신(Yuanhuacine) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염이다.

상기 유안후아딘(하기 화학식 1의 화합물) 또는 유안후아신(하기 화학식 2의 화합물)은 본원 발명자에 의해 출원된 대한민국 등록특허 제10-1388635호에 개시된 화합물로, 본원에서는 상기 화합물들이 SerpinB2의 발현을 증가시킴으로써 침윤성 및 invadopodia 유사구조 길이를 감소시킴을 밝혔다.

[화학식 1]

[화학식 2]

본원의 조성물은 상기 언급한 SerpinB2 발현 증가제 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 또는 유효성분의 용해성 및/또는 흡수성을 유지/증가시키는 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 또한 본원의 조성물은제피티닙 내성 비소세포 폐암 전이 억제 또는 예방을 위하여 단독으로, 또는 수술, 약물치료 및 생물학적반응조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본원의 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다.

본원의 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니며, 공지된 투여방법을 적용할 수 있으며, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우 피부에 붙이는 패치형, 코/호흡기를 통해 투여할 수 있으며, 신속한 치료효과를 얻기 위해서는 정맥내 주사에 의한 투여가 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여 시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 매우 다양할 수 있다. 전형적인 약물의 경우 투약 단위체는, 예를 들어 약 0.01 mg 내지 100 mg를 포함하나 상기 범위의 이하 및 이상의 범위를 배제하는 것은 아니다. 일일 투여량은 약 1μg 내지 10g 일 수 있으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험방법

제피티닙 ( geifitnib ) 내성 폐암세포주 (H292- Gef )의 구축

제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주에서의 SerpinB2 발현량을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Bae SY et al. (2016) Sci. Rep. 6;32258). 사람 폐암 세포주 H292는 한국 세포주 은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받았다.

제피티닙(gefitinib) 내성 사람 폐암 세포주 H292 (H292-Gef)는 H292 세포에 제피티닙(gefitinib)의 농도를 1μM 까지 점진적으로 증가하며 지속적으로 처리하여 내성을 획득시킨 후 사용하였다. H292, H292-Gef 세포는 열에 의해 불활성화된 10% 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS), 100 units/mL 페니실린(penicillin), 100μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)과 250ng/mL 암포테리신 비(amphotericin B)가 포함되어 있는 로즈웰 파크 메모리얼 연구소 1640 (Roswell Park Memorial Institute 1640, RPMI) 배지를 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂) 조건에서 1주일에 2~3회 계대 배양하였다. 특히, 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)는 계대 1일 후 제피티닙(gefitinib)을 각각 1μM 처리하여 내성을 유지시켰다. 모든 세포는 액체질소로부터 녹인 다음 3회 이상 계대를 거치고 나서 실험에 이용하였다.

폐암세포주 (H292) 및 제피티닙 ( Geftinib ) 내성 폐암세포주 (H292- Gef )에서의 SerpinB2 단백질 발현량 확인

사람 폐암 세포주 H292 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H292-Gef의 SerpinB2 발현량을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Hong JY et al. (2011) J Nat Prod 74:2012-8).

제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 SerpinB2 발현량을 확인하기 위하여 폐암세포주(H292) 및 내성 폐암세포주(H292-Gef)를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지로 100 mm 배양접시에 1ⅹ10⁶개의 농도로 깔고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 인산 완충 생리식염수 (PBS)로 2회 세척하였다. 부착된 세포를 회수하여 PBS로 2회 세척한 후 끓고 있는 2ⅹ 시료 loading buffer (250 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% SDS, 10% glycerol, 0.006% bromophenol blue, 2% β-mercaptoethanol, 50 mM sodium fluoride와 5 mM sodium orthovanadate)를 넣어 세포를 파쇄시키고 이를 100℃에서 5분간 두었다. 식힌 후 20℃에서 보관하였고 사용 직전에 37℃에서 녹여 단백질 정량 및 전기영동에 이용하였다. 80μg의 단백질을 5~12% SDS-polyacrylamide gel (#456-1036, Bio-rad, Hercules, CA)을 이용하여 138 V에서 2시간 동안 전기영동을 수행하였다. 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인 (membrane, ISEQ15150, Millipore, Bedford, MA)으로 100 V에서 1시간 동안 옮긴 후 PBST로 2회 세척하고 blocking buffer (5% non-fat dry milk in PBS containing 0.1% Tween-20 (PBST))에 주입하여 상온에서 1시간 동안 진탕기에서 배양하였다. 그 다음 PBST로 5분간 3회씩 세척한 후 해당 단일항체를 PBST로 3% 비지방 건조 우유(non-fat dry milk)로 희석하여 멤브레인과 함께 4℃에서 18시간 반응시켰다. 멤브레인[Membrane, ISEQ 1S150, Millipore, Bedford, MA)을 PBST로 5분간 3회 세척한 후 HRP(horseradish peroxidase)-결합 이차항체를 PBST로 3% 탈지분유로 1:1,000~1:2,000의 비율로 희석하여 멤브레인(membrane)과 함께 상온에서 3~4시간 반응시켰다. 이후 PBST로 5분간 3회 세척한 후 화학발광(chemiluminescent) 시약(LabFrontier, Suwon, Korea)으로 처리하여 LAS-3000 (Fuji Film Corp., Japan)에서 Serpin B2 및 β-actin의 단백질 발현 정도를 확인하여 도 1a에 나타내었다.

폐암세포주 (H292) 및 제피티닙 ( Geftinib ) 내성 폐암세포주 (H292- Gef )에서의 SerpinB2 유전자 발현량 확인

사람 폐암 세포주 H292 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H292-Gef의 SerpinB2 유전자 발현량을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Bae SY et al. (2016) Sci. Rep. 6;32258).

제피티닙(geifitnib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 SerpinB2 발현량을 확인하기 위하여 폐암세포주(H292) 및 내성 폐암세포주(H292-Gef)를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지로 100 mm 배양접시에 1ⅹ10⁶개의 농도로 깔고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양한 후 인산 완충 생리식염수 (PBS)로 2회 세척하였다. 부착된 세포를 PBS로 2회 세척한 후 TRI reagent (TRIZol (#15596-026, Invitrogen, Grand Island, NY))를 이용하여 세포를 파괴후 CHCl₃를 첨가하여 RNA를 추출하고 isopropyl alcohol을 이용하여 침전시켰다. RNA 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후 공기 중에서 건조시킨 후 nuclease-free water (AM9937, Ambion, Austin, TX)를 이용하여 녹인 다음 55℃에서 10분간 가열하고, 70℃에서 5분간 열처리하여 RNA가 single strand 상태로 존재하도록 하였다. Total RNA를 NanoDrop (ND-1000, Dae Myung Sceince, Seoul, Korea)을 이용하여 정량하여 1μg/μL으로 희석한 후 avian myeloblastosis virus (AMV) reverse transcriptase (M5108, Promega, Madison, WI)과 oligo(dT)15 primer (C110B, Promega, Madison, WI)를 이용하여 cDNA를 제조하였다. iQTM SYBR® Green Supermix (#170-8880, Bio-Rad, Hercules, CA), target gene-specific primers [표 1]를 이용하여 target gene을 MiniOpticonTM Real-time PCR Detection system (CFB-3120, Bio-Rad, Hercules, CA)에서 증폭시켰다. Real-time PCR 조건은 95℃에서 20초간 변성(denaturation)시킨 뒤 95℃에서 20초 (denaturation), 56℃에서 20초 (annealing), 72℃에서 30초 (elongation)의 PCR cycle을 40회 반복하였고 이후 95℃에서 1분 및 55℃에서 1분간 최종 단계를 거쳤다. MJ Opticon Monitor software (Opticon Monitor 3.1.32, Bio-rad, Hercules, CA)를 이용하여 리박 등(Livak KJ et al (1996) Method 25:402-408)의 방법에 의하여 Ct 값을 결정하였고, 시료의 β-액틴의 Ct 값으로 보정하여 폐암세포주(H292) 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암세포주(H292-Gef)에서의 Serpin B2의 mRNA 발현을 도 1b에 나타내었다.

[표 1] real-time PCR을 위한 target gene-specific primer 서열

이종이식동물모델 (in vivo tumor xenograft ) 실험 조직으로부터 제피티닙 (Geftinib) 내성 폐암세포주 (H292- Gef )에서의 SerpinB2 면역조직화학적 분석

사람 폐암 세포주 H292 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H292-Gef의 SerpinB2 면역조직화학적 분석(immunohistochemistry)을 하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Bae SY et al. (2016) Sci. Rep. 6;32258).

Xenograft 암조직을 이종이식동물모델로부터 확보하여 PBS에 희석된 4% paraformaldehyde에 고정시키고 파라핀 블록을 제작하여 단면 슬라이드를 제조하였다. 조직의 단면 슬라이드는 연속적으로 탈파라핀화하고 재수화하여 항원 회수를 실시하였다. 슬라이드를 항 SerpinB2 항체와 함께 배양하고 LSABTM + System-HRP 키트 (Dako, Glostrup, Denmark)를 사용하여 검출한 후 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대조 염색하였다. 염색된 부분을 현미경으로 관찰하고 사진을 찍어 도 1C에 나타내었다.

폐암세포주 (H292) 및 제피티닙 ( gefitinib ) 내성 폐암세포주 (H292- Gef )에 제피티닙 ( gefitinib ) 처리에 의한 SerpinB2 및 uPA의 단백질 및 유전자 발현 변화 확인

사람 폐암 세포주 H292 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H292-Gef에 제피티닙(gefitinib) 처리 후 SerpinB2 및 uPA의 단백질 및 유전자 발현 변화를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Bae SY et al. (2016) Sci. Rep. 6;32258).

폐암세포주(H292) 및 내성 폐암세포주(H292-Gef)를 10% FBS가 포함된 RPMI 배지로 100 mm 배양접시에 1ⅹ10⁶개의 농도로 깔고, 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간을 배양 후 배지에 희석된 100 nM 제피티닙(gefitinib)를 주입하고 다시 24시간 배양하였다. Serpin B2 및 uPA 단백질 발현 확인은 위의 실험예 2의 방법으로 실시하여 도 1d에 나타내었으며 Serpin B2 및 uPA 유전자 발현 확인은 실험예 3의 방법으로 실시하여 도 1e에 나타내었다.

정상 폐세포주 ( MRB -5) 대비 폐암세포주 (H292) 및 제피티닙 ( geifitnib ) 내성 폐암세포주 (H292- Gef )에서의 SerpinB2 , uPA 유전자 발현 비율 확인

정상 폐세포주인 MRC-5 대비 폐암세포주 (H292) 및 제피티닙 (gefitinib) 내성 폐암세포주 (H292-Gef)에서의 SerpinB2, 유로키나제 플라스미노겐 활성화 (urokinase plasminogen activator, uPA)을 발현 비율을 확인하기 위하여 각 세포주를 실험예 3의 방법에 따라 실시하여 Serpin B2 및 uPA의 유전자 발현 비율을 도 1f 및 1g에 나타내었다.

제피티닙 ( gefitinib ) 내성 폐암세포주 (H292- Gef ) xenograft 종양모델에서 Serpin B2의 단백질 및 유전자 발현량 확인

사람 폐암 세포주 H292 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H292-Gef xenograft 종양 모델에서의 SerpinB2 단백질 및 유전자 발현량을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Bae SY et al. (2016) Sci. Rep. 6;32258).

사람 폐암 세포주 H292 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H292-Gef 세포를 1x10⁷/200 μL 세포 농도로 피하 주사하여 종양 크기가 주사 40일 후 1000 mm³에 달하였을 때 동물의 종양 조직을 절제하고 Serpin B2 단백질 발현 정도를 단백질 발현 분석법(Western blot analysis)을 통하여 분석하였다 (도 1-1a). Serpin B2 유전자 발현 정도는 real-time PCR법을 통하여 분석하였다 (도 1-1b).

폐암세포주 H1993 및 제피티닙 ( gefitinib ) 내성 폐암세포주 (H1993- Gef )에서의 SerpinB2 단백질 및 유전자 발현량 확인

사람 폐암 세포주 H1993 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H1993-Gef의 SerpinB2 단백질 및 유전자 발현량을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Bae SY et al. (2016) Sci. Rep. 6;32258).

사람 폐암 세포주 H1993 및 제피티닙(gefitinib) 내성 폐암 세포주 H1993-Gef의 SerpinB2 단백질 발현량은 단백질 발현 분석법(Western blot analysis)을 통하여 분석하였으며 (도 1-1c) Serpin B2 유전자 발현 정도는 real-time PCR 법을 통하여 분석하였다 (도 1-1d).

폐암세포주 H292의 증식에 미치는 제피티닙 ( gefitinib )의 영향 확인

사람 폐암세포주 H292의 증식에 미치는 제피티닙 (gefitinib)의 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 술포로다민 B (sulforhodamine B: SRB)법으로 실험을 수행하였다 (Lee SK et al. (2008) Chem Biol Interact 115:215-28).

본 발명에 이용된 사람 폐암세포주 H292를 10% FBS, 1% PSF 등을 함유한 RPMI 배지에서 계대 배양하였다. 96-well plate의 각 well에 10% DMSO에 녹아 있는 시료 10μL와 세포현탁액 190μL(5 x 10⁴ cells/mL)을 주입하고 37℃, 5% CO₂환경에서 3일간 배양하였으며, 따로 최소 16 well에 실험에 사용한 동일한 세포현탁액 190μL를 주입하고 37℃에서 30분간 배양하여 zero-day control로 하였다. 배양 후 50% trichloroacetic acid (TCA) 용액을 각 well에 50μL씩 주입하고 4℃에서 30분간 세포를 고정한 뒤, 수돗물로 5회 세척하고 공기중에 방치하여 plate를 건조시킨 다음 0.4% sulforhodamine B(SRB)가 포함된 1% 초산용액을 각 well에 100μL씩 주입하여 염색시키고, 1시간 후 1% 초산으로 세척하여 공기 중에서 건조시킨다. 10 mM Tris-base를 각 well에 200μL씩 가하여 결합된 염색액을 용해시켜 혼합한 후 ELISA reader를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다 (도 1-1e).

폐암세포주 H292의 침윤능에 미치는 제피티닙 ( gefitinib )의 영향 확인

폐암세포주 H292의 침윤능에 미치는 제피티닙(gefitinib)의 영향을 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Bae SY et al. (2016) Sci. Rep. 6;32258).

Transwell (Corning Costar, Cambridge, MA)을 거꾸로 놓고 0.2% gelatin (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 15μL를 transwell의 하부에 조심스럽게 도말하고 약 40분간 방치하여 완전히 말린 다음 transwell을 뒤집어 원 상태로 놓고 matrigel (BD Biosciences)을 PBS로 30배 희석한 다음 희석액 15μL를 도말하고 약 1시간 30분간 건조하였다. Well에 600μL의 10% FBS, 1% PSF 등을 함유한 RPMI 배지를 주입하고 여기에 transwell을 넣었다. 대조구 및 제피티닙을 희석한 무혈청 RPMI 배지에 H292 세포를 100μL당 2 X 10⁵ 세포농도가 되도록 조정하고 24시간 배양한 후 transwell의 아래부분으로 침윤된 세포를 PBS에 희석한 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 고정하고 헤마톡실린(hematoxylin)으로 10분간 염색하였다. 위상차현미경을 이용하여 100배율로 관찰하고 사진 촬영하여 invasion assay를 실시하였다 (도 1-1f).

실시예 1. 제피티닙 ( Geftinib ) 내성 폐암세포주 (H292- Gef )에서 SerpinB2 마커의 발현 감소 확인

Gefitinib에 sensitive한 비소세포 폐암(Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC) 세포주인 H292로부터 geftinib 내성 세포주인 H292-Gef 세포주를 제조하여 cDNA microarray을 통해 두 세포주에서 다르게 발현되는 gene들을 확인한 결과 SerpinB2 의 발현이 H292-Gef 세포에서 H292보다 매우 약하게 발현되고 있었으며 in vitro 에서 SerpinB2의 단백질과 유전자 발현을 확인할 수 있었다 (도 1a, 1b). 또한 종양 조직을 분석한 결과에서도 H292-Gef 세포로 만들어진 종양에서 SerpinB2의 단백질과 유전자 발현 모두 낮게 발현됨을 보였다 (도 1c, 도 2a, 2b). 또한 다른 NSCLC 세포인 H1993-Gef 세포에서도 SerpinB2의 발현은 낮게 나타남을 확인할 수 있었다 (도 2c, 2d).

또한 Geftinib의 SerpinB2에 대한 영향을 확인하기 위하여 세포에 geftinib을 24시간 동안 처리 후 H292-Gef 세포에서는 기본적으로 발현되는 양이 매우 낮기 때문에 그 차이를 관찰하기 힘든 반면 H292 세포에서는 geftinib을 처리함에 따라 발현이 감소하였다. H292 세포에서 SerpinB2의 발현은 달라졌음에도 불구하고, geftinib의 증식억제 및 항 침윤성은 유지되었다 (도 2e, 2f).

더불어 SerpinB2의 주요한 타겟인 uPA은 암환자들의 예후와 밀접한 관련이 있으나 gefinib을 처리하였을 때 두 세포주에서 uPA의 단백질 발현 차이는 보이지 않았으나 SerpinB2와 uPA(혹은 PLAU) mRNA 발현은 geftinib에 의해 H292와 H292-Gef세포 모두에서 SerpinB2의 발현이 감소하였고 uPA발현은 H292-Gef 세포에서만 증가되었다 (도 1e). 정상 폐 세포주인 MRC5에서 분석한 결과 암 세포주에서 정상 폐 세포주에서 보다 SerpinB2는 낮게 발현되고 있고 uPA는 높게 발현됨을 알 수 있었다. SerpinB2의 발현을 기준으로 보았을 때 uPA 발현은 MRC5 세포에서는 낮게 나타나고 H292-Gef 세포에서는 높게 나타났다. 따라서 SerpinB2 및 uPA 유전자 발현 비율은 정상과 암세포에서 다르다는 것을 알 수 있었다 (도 1g). 종합적으로 H292 모세포에 지속적으로 geftinib을 처리하였을 때 SerpinB2의 발현은 낮아지게 되고 정상 폐 세포에서보다 H292-Gef에서 SerpinB2와 uPA의 발현 비율은 낮아지게 된다.

실시예 2. SerpinB2 발현 감소에 의한 H292- Gef 세포에서의 침윤성과 invadopodia 유사구조 길이 증가 확인

uPA 시스템의 기능으로 SerpinB2의 저발현은 H292-Gef 세포의 침윤성 증가로 이어질 수 있다. 실질적으로, H292-Gef 세포의 침윤성이 H292 세포에 비해 약 5배 증가되어 있음을 확인하였다 (도 3a). 이미 쥐의 흑색종세포에서 SerpinB2가 과발현 되면 기존의 형성과정에는 영향을 주지 않으면서 invadopodia-like 구조 길이가 줄어들고 이는 migration과 invasion의 감소로 이어진다는 보고가 있다. 이러한 연구 결과를 토대로 H292와 H292-Gef 세포의 invadopodia 유사 구조 길이를 측정한 결과 세포를 3D 콜라겐 젤에서 키운 후 위상차 현미경으로 관측해 본 결과 H292 세포보다 H292-Gef세포의 invadopodia 유사 구조 길이가 증가한 것을 확인하였다 (도 3b). Invadopodia는 풍부한 양의 actin filaments (F-actin)와 Arp2/3 actin nucleation complex, neural-Wiskott Aldrich Syndrom protein (N-WASP), cortactin과 같은 actin assembly machinery로 구성되어 있음으로 3D에서 배양된 세포를 형광이 부착된 phalloidin F-actin으로 immunocytochemical staining을 진행하고 또한 돌출된 부분을 측정하기 위해 adapter protein과 invadopodia 특정 바이오마커인 Src substrate Tks5를 확인해 본 결과 invadopodia 유사 구조의 돌출된 부분이 H292-Gef 세포에서 높게 발현되는 것을 재확인하였으며 (도 3c, 3d), SerpinB2의 발현은 낮아져 있었다 (도 3d). 최종적으로 H292-Gef 세포에서 SerpinB2의 발현이 낮아져 invadopodia 유사 구조 길이를 늘임으로써 침윤성을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다.

실시예 3. SerpinB2에 의한 H292-Gef 세포의 invadopodia 구조의 elongation확인

H292-Gef 세포에서 SerpinB2의 낮은 발현과 invadopodia 유사구조 길이 증가 및 침윤성에 미치는 영향을 분석하기 위하여 H292와 H292-Gef 세포를 SERPINB2 small interfering RNA (siRNA) 또는 SERPINB2-expressing plasmid (pEGFP-N1-SERPINB2)을 transfection 하여 pEGFP-N1-SERPINB2 construct의 효율성을 검증하였다. pEGFP-N1-SERPINB2을 transfection 시킨 H292-Gef 세포는 GFP을 발현하게 되고 SERPINB2의 mRNA 발현은 공벡터인 pEGFP-N1을 transfection 시킨 세포보다 30배 증가되어 있었다 (도 5b). SerpinB2 단백질 발현은 GFP tagging으로 74 kDa에서 관찰할 수 있었다 (도 5c).

SerpinB2의 발현차이가 두 세포주의 침윤성에 미치는 영향을 분석하였을 때 SERPINB2 siRNA을 transfection 시킨 H292 세포의 invasion은 scrambled siRNA을 transfection 시킨 H292 세포에서보다 4배 이상 증가되어 있었다 (도 4a).

그와 반대로 H292-Gef에 pEGFP-N1-SERPINB2-transfected H292-Gef은 pEGFP-N1 transfected H292-Gef 세포에 비해 침윤하는 것이 감소되었다 (도 4b). 또한, H292-Gef 세포에서 SerpinB2의 과발현은 invadopodia 같은 구조를 짧게 만들었고 (도 4c) SerpinB2의 변화는 두 세포주의 geftinib 민감도에도 영향을 주었다. 반대로 SERPINB2-knockdown은 H292 세포의 geftinib 민감도를 낮추었고 SERPINB2 과발현은 H292-Gef의 geftinib 민감도를 증가시켰다 (도 4d, 4e). 결론적으로 SerpinB2의 발현 수준은 H292-Gef 세포에서 geftinib 민감도와 관련이 있고 낮은 수준의 SerpinB2 발현은 invadopodia-like 구조의 길이를 증가시키는 것으로 나타났다.

실시예 4. 항종양 약물에 의한 SerpinB2 발현증가가 H292-Gef 세포의 침윤성을 억제함을 확인

저 발현된 SerpinB2을 타겟으로 하여 geftinib 내성을 극복하는 효능물질로 유안후아딘(yuanhuadine, YD)을 제시하였으며 (도 6a) NSCLC 세포 증식과 geftinib과의 상승효과를 분석하였다. 10 nM YD를 24시간 처리한 결과 H292-Gef 세포에서 SerpinB2의 발현이 크게 증가되었다 (도 6b). 또한 H292-Gef 세포에서 5, 10 nM의 YD는 MTT로 독성을 측정한 결과 세포 생존율은 90% 이상이었으며 (도 6c), YD는 효과적으로 H292-Gef 세포의 침윤성과 이동을 억제시켰다 (도 6d, 6e). 도 4c에서 보여지는 결과와 마찬가지로 10 nM의 YD을 처리하였을 때 invadopodia 유사구조 길이를 감소시키는 것으로 나타났다 (도 6f). 결론적으로 YD는 SerpinB2의 고발현을 유도하고 H292-Gef 세포의 침윤성과 invadopodia 유사 구조의 길이를 감소시키는 것으로 나타났다.

실시예 5. H292-Gef세포에서 YD에 의한 SerpinB2 발현 조절 확인

SerpinB2는 내인성 uPA의 억제제로 YD에 의한 SerpinB2 upregulation이 uPA 발현에 미치는 영향을 분석하였다. YD는 SerpinB2 단백질 발현을 시간 의존적으로 증가시켰고 uPA는 감소시켰다 (도 7a). 또한 YD는 uPA의 mRNA 발현에는 영향을 주지 않으면서 SERPINB2의 mRNA 발현을 증가시켰다 (도 7b). 이로부터 YD에 의한 SerpinB2의 upregulation은 uPA 단백질의 분해를 조절하며 전사활성에는 영향을 미치지 않는다고 예상할 수 있다. 또한 uPA의 mRNA 발현양을 SERPINB2의 발현양과 비교하였을 때 uPA의 mRNA 발현은 YD를 처리한 세포의 SerpinB2 발현과 비교하였을 때 감소되어있고 이러한 발현 경향은 도 1g에서 보여지는 MRC5 정상 폐세포에서의 발현 경향과 비슷하다. uPAR/uPA-SerpinB2 complex가 LRP와의 상호작용에 의해 세포 안으로 이동하게 되면서 complex는 분해를 위해 endosome에 sort되고 lysosomes에서 분해된다. 10 nM YD을 6시간 동안 H292-Gef 세포에 처리하였을 때 SerpinB2 발현이 매우 증가되어있음을 관찰하였고 uPA, SerpinB2와 lysosomal 마커인 LAMP1의 co-localization을 확인하였다 (도 7c, 7d). 또한 SerpinB2/uPA, SerpinB2/LAMP1, uPA/LAMP1의 Pearsons coefficients는 모두 0.5 이상으로 co-localization 양성을 나타냈으며 (도 7e) 이러한 결과는 YD가 uPA의 lysosomal 분해를 유도하는 것으로 추정되어진다. 따라서 YD는 in vitro에서 효과적으로 SerpinB2 단백질 발현을 증가시키고 uPA 단백질발현을 저해시킴을 알 수 있었다.

실시예 6. YD에 의한 MMP2 활성과 MAPK 신호전달 억제 및 H292- Gef 세포에서의 cadherins 발현 변화 확인

uPA는 proMMP들을 활성화시킨다고 알려져 있기 때문에 H292-Gef 세포에서 YD가 MMP에 미치는 영향을 검증하였다. 10 nM YD을 24시간 동안 처리한 결과 MMP2 발현은 줄어들었으며 (도 8a), 더 나아가 YD가 MMP2의 proteolytic 활성을 억제시키는지 알아보기 위해 YD을 72시간 처리한 후의 배양액을 이용해 gelatin zymography을 수행한 결과 도 8b에서 보는 바와 같이 YD (2, 4 nM)은 MMP2 활성을 억제시켰다.

Epithelial-mesenchymal transition (EMT)은 세포가 형질전환이 되는 과정으로써 epithelial 형질에서 mesenchymal 형질로 바뀌는 것을 뜻하고 종종 전이성 암에서 관찰되어 진다. YD가 H292-Gef 세포의 침윤성을 저해시킴에 따라 EMT 마커들인 E-cadherin과 mesenchymal N-cadherin의 발현을 측정한 결과 도 8a에서 볼 수 있듯이 YD는 E-cahderin 발현을 증가시키고 N-cadherin 발현을 감소시켰다.

Mitogen activated protein kinase (MAPK) 신호는 세포의 운동성과 MMP 분비를 증진시켜 imvadopodia/podosomes 돌출부분 생성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 YD가 H292-Gef 세포에서 MAPK에 미치는 영향을 분석한 결과 H292-Gef 세포에 10 nM YD 처리시 활성화된 p38 (p-p38)과 ERK (p-ERK)가 감소하는 것을 알 수 있었다 (도 8c). 또한 MEK1-ERK 신호전달 억제제인 PD98059와 YD을 H292-Gef 세포에 병용처리 후 E-cadherin과 N-cadherin의 변화를 측정하여 YD에 의한 ERK 조절, SerpinB2와 EMT의 연관성을 분석하였다 (도 8d). 그 결과 ERK은 YD와 PD98059에 의해 활성화가 억제되었다. PD98059의 처리는 E-cadherin은 증가시켰으나 N-cadherin 발현에는 영향을 미치지 않았다. 그러나 이 둘을 병용처리 하였을때는 E-cadherin은 증가하고 N-cadherin은 감소하였다. 또한 PD98059가 YD에 의해 유도된 SerpinB2 발현을 감소시키는 것으로 보아 MEK/ERK 신호전달이 SerpinB2 조절에 관여하는 것으로 보여진다. 따라서 YD처리에 따른 MMP-2와 MAPK 신호감소, 그리고 cadherin 조절은 ECM 분해와 invadopodia 유사 구조의 돌출부분을 억제 시키는데 관여하는 것을 알 수 있다.

또한 YD가 in vivo에서 SerpinB2, uPA, E-cadherin, N-cadherin과 같은 주요 인자 조절에 관여하는 것을 규명하기 위해 종양 조직 내에서 YD의 영향을 SerpinB2, uPA, E-cadherin, N-cadherin의 주요인자들에 대해 immunohistochemistry로 염색시켜 분석한 결과 in vitro에 나타난 바와 같이 YD을 처리한 그룹 (1mg/kg)은 대조구에 비해 SerpinB2와 E-cadherin의 발현은 매우 증가하였고 uPA와 N-cadherin의 발현은 억제되었다 (도 9a, 9b).

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims

SerpinB2 (Plasminogen activator inhibitor type 2) 바이오마커의 검출시약을 포함하는, 제피티닙(gefitinib) 내성 비소세포 폐암 진단용 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 검출 시약은 상기 바이오마커를 단백질 또는 핵산 수준에서 검출할 수 있는 시약인, 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 마커의 단백질 수준 검출 시약은 웨스턴블랏, ELISA, 방사선면역분석, 면역확산법, 면역 전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 질량분석, 또는 단백질 마이크로어레이용 시약이고,
상기 핵산 수준 검출 시약은 중합효소연쇄반응, 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 중합효소연쇄반응, Nuclease 보호 분석(RNase, S1 nuclease assay), in situ 교잡법, 핵산 마이크로어레이 또는 노던블랏에 사용되는 시약인, 조성물.
제피티닙에 대한 내성을 나타내는 비소세포 폐암 진단에 대한 정보를 제공하기 위하여,
상기 진단이 필요한 대상체의 시료를 제공하는 단계;
상기 시료에서 SerpinB2 바이오마커를 검출하는 단계; 및
상기 검출결과, 상기 대상체의 시료에서 내성을 나타내지 않는 대조군과 비교하여 상기 SerpinB2 바이오마커의 발현이 감소한 경우, 상기 대상체의 시료를 제피티닙에 대한 내성시료로 판단하는, SerpinB2 바이오마커를 검출하는 방법.
SerpinB2을 포함하는 제피티닙(gefitinib)에 내성을 갖는 암의 전이 억제 또는 암 치료용 약학 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 암은 비소세포 폐암인, 암의 전이 억제 또는 암 치료용 약학 조성물.
SerpinB2의 발현 증가제로서 유안후아딘(yuanhuadine) 또는 유안후아신(yuanhuacine)을 포함하는 제피티닙(gefitinib)에 내성을 갖는 비소세포 폐암 치료용 약학 조성물.