IT202000016666A1 - Nuovo ceppo della specie lacticaseibacillus rhamnosus, sue composizioni e loro uso nel trattamento di infezioni genitourinarie - Google Patents

Description

DESCRIZIONE dell?invenzione avente per titolo:

?Nuovo ceppo della specie Lacticaseibacillus rhamnosus, sue composizioni e loro uso nel trattamento di infezioni genitourinarie?

La presente invenzione si riferisce ad un nuovo ceppo batterico, isolato e caratterizzato, appartenente alla specie Lacticaseibacillus rhamnosus, recentemente riclassificata (Zheng et al., 2020), precedentemente classificata come Lactobacillus rhamnosus, a sue composizioni e al loro uso nel trattamento di infezioni e/o infiammazioni genitourinarie.

Le infezioni genitourinarie rappresentano un problema diffuso, in particolare nella popolazione femminile. La presenza sia nel tratto intestinale sia nel tratto genito-urinario di ceppi di batteri benefici, in quantit? appropriate e fortemente adesi alle mucose permette il mantenimento della condizione di omeostasi dell?ecosistema microbico del tratto intestinale e genito-urinario, e la protezione da eventuali agenti patogeni. Prevalentemente, i patogeni del tratto genitourinario hanno origine nel tratto intestinale e possono, successivamente, colonizzare la regione periuretrale e la vescica causando infezioni nel tratto urinario, nonch? colonizzare la vagina causando infezioni vulvovaginali. Inoltre, pi? frequentemente, le infezioni genitali sono delle disbiosi, dipendenti da una alterazione del normale ecosistema vaginale per riduzione dei lattobacilli e conseguente crescita quantitativa dei batteri, aerobi ed anaerobi, e lieviti che fanno parte del normale ecosistema vaginale (patogeni opportunisti).

La terapia delle infezioni genito-urinarie nella tecnica nota, in particolare per il trattamento di infezioni vaginali quali le vaginiti batteriche e le candidosi vulvovaginali, si basa sostanzialmente sull?utilizzo di antibiotici o antimicotici. Tuttavia, detti trattamenti antibiotici e antimicotici presentano degli svantaggi. In particolare, la terapia antibiotica ? accompagnata da effetti collaterali di varia frequenza e gravit? tra cui: diarrea a breve termine, lieve eruzione cutanea o altre reazioni allergiche, feci molli, mal di stomaco, nausea, perdita di appetito, infezioni micotiche vaginali o orali. Inoltre, l?uso periodico di antibiotici ? associato allo sviluppo di resistenze agli antibiotici da parte dei batteri patogeni e ad alti tassi di recidive nelle patologie. Infine, non sempre gli antibiotici comunemente utilizzati sono efficaci nel trattamento delle vaginiti microbiche, in quanto molte forme di vaginiti sono causate sia da batteri che da lieviti (vaginiti a componente mista).

In alternativa ai trattamenti con antibiotici o antimicotici, negli ultimi anni ? stato proposto l?utilizzo di ceppi di batteri probiotici per il trattamento di infezioni genito-urinarie (o disbiosi genito-urinarie), in particolare ceppi di lattobacilli che, come noto, svolgono un ruolo essenziale nel mantenimento della condizione di omeostasi dell?ecosistema microbico del tratto genito-urinario. Tuttavia, i ceppi di batteri probiotici noti nello stato dell?arte non sempre risultano efficaci nel trattamento delle infezioni genito-urinarie, in particolare quando dette infezioni sono causate da una pluralit? di patogeni di natura batterica e/o micotica. Inoltre, le capacit? antimicrobiche dei ceppi batterici probiotici risultano altamente variabili non solo da specie a specie, ma anche da ceppo a ceppo (capacit? antimicrobica ceppo-specifica).

In aggiunta, detti ceppi di batteri probiotici dell?arte nota indicati per il trattamento di infezioni genitourinarie spesso non presentano le caratteristiche necessarie per la loro somministrazione orale.

Per questo, ? fortemente richiesta l?individuazione di nuovi trattamenti per le infezioni e/o infiammazioni del tratto genito-urinario alternativi ai convenzionali trattamenti antibiotici o antimicotici, che siano altamente efficaci verso un ampio spettro di patogeni sia di natura batterica che micotica, ben tollerati, esenti da effetti collaterali rilevanti e somministrabili sia via orale sia via topica. Inoltre, ? richiesta l?individuazione di nuovi trattamenti che riducano o eliminino il problema delle recidive in dette infezioni e/o infiammazioni del tratto genito-urinario.

La Richiedente, a seguito di un?intensa e prolungata attivit? di ricerca e sviluppo, al fine di risolvere il problema tecnico sopra riportato ha isolato (da un soggetto femmina sano), identificato e caratterizzato uno specifico ceppo batterico del genere Lacticaseibacillus appartenente alla specie Lacticaseibacillus rhamnosus ed identificato come Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DMS 33500 (in breve, ceppo batterico dell?invenzione). Inoltre, la Richiedente ha identificato composizioni comprendenti il ceppo batterico dell?invenzione (in breve, composizioni dell'invenzione), vantaggiosamente formulate per somministrazione orale e/o topica.

Il ceppo batterico della presente invenzione, e conseguentemente le sue composizioni, ? risultato capace di inibire contestualmente, sia in vitro sia in vivo, batteri e lieviti responsabili delle principali infezioni genitourinarie, di avere attivit? antiinfiammatoria e antiossidante. Inoltre, detto ceppo batterico presenta le caratteristiche tecniche per essere somministrato tal quale o in forma di una composizione secondo l?invenzione per via orale, oltre che per via topica.

Il ceppo batterico della presente invenzione e le sue composizioni non presentano effetti collaterali rilevanti e possono essere somministrati a tutte le categorie di soggetti aventi bisogno, comprese donne in gravidanza o allattamento, o soggetti con altre comorbidit?.

Infine, il ceppo batterico della presente invenzione e le sue composizioni sono di facile preparazione ed economicamente vantaggiose.

Questi scopi ed altri ancora, che risulteranno chiari dalla descrizione dettagliata che segue, sono raggiunti dal ceppo batterico e dalle composizioni della presente invenzione grazie alle caratteristiche tecniche rivendicate nelle unite rivendicazioni.

FIGURE

Figura 1: Profilo PFGE del DNA genomico del ceppo TOM22.8 (DSM 33500).

Figura 2: valori di conta microbica espressi in log cfu/ml di essudato vaginale al momento dell?arruolamento (T0), dopo 10 gg (T1) e dopo un mese dal trattamento orale e topico con il ceppo TOM22.8.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

Forma oggetto della presente invenzione un ceppo batterico del genere Lacticaseibacillus appartenente alla specie Lacticaseibacillus rhamnosus identificato come Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 e depositato presso il

con numero di deposito DSM 33500 da in data 17 Aprile 2020 (in breve, ceppo batterico dell?invenzione o Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500).

Il ceppo batterico Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 presenta le caratteristiche tecniche funzionali e di sicurezza come riportato nella parte sperimentale. In particolare, il ceppo batterico Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ha mostrato attivit? antagonista verso un ampio spettro di batteri e lieviti, ad esempio verso Gardnerella vaginalis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, e Candida tropicalis; attivit? antiinfiammatoria e antiossidante; capacit? di aderire alla mucosa intestinale; capacit? di produrre esopolisaccaridi (EPS); buona attitudine alla liofilizzazione e stabilit?; ottime caratteristiche che permettono la sua somministrazione per via orale (gastroenterale).

Inoltre, il ceppo batterico Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? in grado di ripristinare l?equilibrio del microbiota del tratto genito-urinario aumentando la numerosit? dei lattobacilli, ed esercitando in questo modo un?azione inibitoria contro i patogeni opportunisti. Infatti, generalmente si assiste alla proliferazione di microrganismi patogeni opportunisti nel microbiota del tratto genito-urinario in conseguenza ad una riduzione dei lattobacilli (disbiosi).

Forma oggetto della presente invenzione una composizione (in breve, composizione dell?invenzione) comprendente o, alternativamente, consistente di detto ceppo batterico Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e almeno un additivo e/o eccipiente di grado farmaceutico o alimentare accettabile.

Detto ceppo batterico ? stato depositato in accordo con le previsioni del Trattato di Budapest; il depositante di detto ceppo di batteri descritto e rivendicato nella presente domanda di brevetto e il titolare della stessa esprimono il loro consenso a rendere disponibili il ceppo per tutta la durata del brevetto.

Il ceppo batterico Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500, tal quale o compreso nella composizione dell?invenzione, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, pu? essere un ceppo batterico vitale (o ceppo probiotico) o un derivato di detto ceppo, in cui detto derivato ? capace di esercitare analoga attivit? benefica sulla salute dell?ospite del corrispondente ceppo batterico vitale. Preferibilmente, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500, tal quale o compreso nella composizione dell?invenzione, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, ? un ceppo batterico vitale (o ceppo probiotico).

Sono definiti ?probiotici? i microorganismi (e.g. ceppi di batteri) vivi e vitali che, quando somministrati in quantit? adeguata, conferiscono benefici alla salute dell?ospite (definizione FAO/WHO, 2002); il termine ?probiotico? fa riferimento a microorganismi presenti negli alimenti o aggiunti ad essi o somministrati sotto forma di capsule, compresse, etc..

Nel contesto della presente invenzione, con il termine ?derivato? del ceppo batterico (o ?derivato? del ceppo) viene inteso il ceppo batterico tindalizzato o sonicato, i lisati del ceppo batterico, gli estratti o la frazione parietale del ceppo batterico (denominati, paraprobiotici), i metaboliti o bioprodotti metabolici o esopolisaccaridi (EPS) generati dal ceppo batterico (denominati, postbiotici) e/o qualsiasi altro prodotto di derivazione dal ceppo batterico noto al tecnico del ramo. Detti derivati sono ottenuti secondo metodologie note al tecnico del ramo. Preferibilmente con il termine ?derivato? del ceppo batterico viene inteso il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 tindalizzato.

Nel contesto della presente invenzione gli additivi e/o eccipienti di grado farmaceutico o alimentare accettabili comprendono tutte le sostanze ausiliarie note all?esperto del ramo per la preparazione di composizioni in forma solida, semi-solida o liquida, come, ad esempio, carrier, diluenti, solventi, solubilizzanti, acidificanti, addensanti, edulcoranti, aromatizzanti, coloranti, dolcificanti, lubrificanti, tensioattivi, conservanti, stabilizzanti, tamponi per stabilizzare il pH, e loro miscele.

La composizione dell?invenzione comprendente il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, pu? comprendere inoltre almeno un prebiotico, preferibilmente scelto tra: un polisaccaride non amidaceo o beta-glucano, un fructano, un frutto-oligosaccaride (FOS), galatto-oligosaccaride (GOS), xilitolooligosaccaride (XOS), una inulina, una pirodestrina, gli oligosaccaridi della soia; pi? preferibilmente scelto tra: inulina, frutto-oligosaccaride (FOS), galattooligosaccaride (GOS), xilitolo-oligosaccaride (XOS), gomma di guar, e loro miscele.

La composizione dell?invenzione, comprendente il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e, opzionalmente, un prebiotico (e.g. inulina), pu? comprendere inoltre almeno uno o pi? ulteriori ceppi batterici probiotici o loro derivati, preferibilmente uno o pi? ulteriori ceppi appartenenti alla famiglia Lactobacillaceae, pi? preferibilmente uno o pi? ulteriori ceppi appartenenti alla specie Lacticaseibacillus rhamnosus.

La composizione dell?invenzione, comprendente il ceppo Lactobacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e, opzionalmente, un prebiotico (e.g. inulina) e/o almeno un ulteriore ceppo batterico probiotico o un suo derivato, pu? comprendere inoltre almeno un ulteriore componente attivo, preferibilmente adiuvante per il trattamento di una infezione e/o infiammazione genitourinaria, selezionato tra: un prodotto vegetale (botanicals), o il suo estratto o derivato, come ad esempio cranberry (Vaccinum Macrocarpon), semi di pompelmo, ibisco, salvia, timo, zenzero, curcuma, uva ursina (Arctostaphylos uva-ursi); un olio essenziale, come ad esempio tea tree oil; una vitamina del gruppo B, C, D, A o E; una sostanza antiossidante, ad esempio glutatione, un polifenolo (e.g. resveratrolo), coenzima Q10, astaxantina o acido lipoico; un minerale, ad esempio zinco, magnesio o manganese-rame; D-mannosio, lattoferrina, L-metionina, acido ialuronico, glucosamina, condroitina, collagene, una sostanza ad attivit? estrogenica, e loro miscele.

La composizione dell?invenzione, comprendente il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e, opzionalmente, un prebiotico e/o un ulteriore probiotico e/o un ulteriore componente attivo, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, pu? comprendere inoltre detto almeno un additivo e/o eccipiente di grado farmaceutico o alimentare accettabile, cio? una sostanza priva di attivit? terapeutica adatta per uso farmaceutico o alimentare. Nel contesto della presente invenzione gli additivi e/o eccipienti accettabili per uso farmaceutico o alimentare comprendono tutte le sostanze ausiliarie note all?esperto del ramo per la preparazione di composizioni in forma solida, semi-solida o liquida, come, ad esempio, diluenti, solventi (tra cui acqua, glicerina, alcol etilico), solubilizzanti, acidificanti, addensanti, edulcoranti, aromatizzanti, coloranti, dolcificanti, lubrificanti, tensioattivi, conservanti, stabilizzanti, tamponi per stabilizzare il pH e loro miscele.

Dette composizioni dell?invenzione, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, possono essere una composizione farmaceutica (or Live Biotherapeutic Products), una composizione per dispositivo medico, un integratore alimentare, un alimento (o novel food o alimento a fini medici speciali), una composizione per un integratore alimentare o alimento, o, alternativamente, una composizione per uso cosmetico.

Le composizioni della presente invenzione, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, possono essere formulate per uso orale, per uso topico, quale topico vaginale o genitale, per uso rettale, per inalazione nasale (e.g. spray o gocce), per inalazione orale (e.g. spray, polveri secche per inalazione). Preferibilmente, le composizioni della presente invenzione sono per uso orale o topico vaginale/genitale.

Nel contesto della presente invenzione con il termine per uso orale viene intesa sia la somministrazione orale (o gastroenterica) sia la somministrazione sublinguale (o buccale).

La composizione della presente invenzione pu? essere formulata per uso orale in forma solida, ad esempio, scelta tra: compresse, compresse masticabili, compresse orosolubili, capsule, granuli, scaglie, polvere, polvere solubile, polvere orosolubile; o, alternativamente, in forma liquida, ad esempio, scelta tra: soluzioni, sospensioni, emulsioni, liquido dispensabile in forma di spray, sciroppi; o, alternativamente, in forma semiliquida, ad esempio, scelta tra: soft-gel, gel; preferibilmente la composizione dell?invenzione ? per uso orale in forma solida.

Alternativamente, la composizione della presente invenzione pu? essere formulata per uso topico, preferibilmente topico vaginale o genitale, o per uso rettale in forma solida scelta tra: ovuli, candelette, capsule, supposte; o, alternativamente, in forma liquida scelta tra: soluzioni, sospensioni o emulsioni per lavaggi vaginali (lavande); o, alternativamente, in forma semiliquida scelta tra: gel, schiuma o crema.

Forma oggetto della presente invenzione il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e le sue composizioni, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, per uso come medicamento.

Forma oggetto della presente invenzione il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e le sue composizioni, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, per uso in un metodo di trattamento, preventivo e/o curativo, di infezioni e/o infiammazioni del tratto genito-urinario (o tratto genitale e/o urinario), e di disturbi o sintomi associati, in un soggetto avente bisogno (i.e. un mammifero), preferibilmente un soggetto umano maschio o femmina, pi? preferibilmente un soggetto umano femmina; in cui detto metodo di trattamento comprende la somministrazione al soggetto di una quantit? terapeuticamente efficace di detto ceppo batterico della presente invenzione o di una sua composizione.

Secondo un primo aspetto della presente invenzione, dette infezioni e/o infiammazioni del tratto genitourinario, preferibilmente del tratto genitale, e disturbi o sintomi associati sono selezionati tra: vaginite batterica e/o micotica, candidosi vaginale (o vulvovaginale), vaginosi batterica, vaginite atrofica, infezioni batteriche e/o micotiche dei genitali maschili, balanite, postite e balanopostite, dolore e/o prurito alla zona genitali, disuria, stranguria, secrezioni vaginali maleodoranti, secchezza vaginale, e dispareunia; in cui dette infezioni e/o infiammazioni possono essere acute o croniche.

Vantaggiosamente, per il trattamento della vaginite atrofica, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500, utilizzato tal quale o in forma di composizione secondo quanto descritto nella presente invenzione, pu? essere in associazione con una sostanza ad attivit? estrogenica, ad esempio un fitoestrogeno scelto tra: un isoflavone (e.g. genisteina, daidzeina, biocaina A, gliciteina), un cumestano (e.g. cumestrolo e metossicumestrolo), un lignano (e.g. enterodiolo, enterolattone), un derivato da una pianta (e.g. soia, trigoglio rosso, legumi), e loro miscele.

Secondo un ulteriore aspetto della presente invenzione, dette infezioni e/o infiammazioni del tratto genitourinario, preferibilmente del tratto urinario, e disturbi o sintomi associati sono selezionati tra: infezioni batteriche e/o micotiche del tratto urinario (UTI, dall?inglese urinary tract infection) o del basso tratto urinario, cistiti, uretriti, prostatiti, infezioni del basso tratto urinario in soggetti portatori di cateteri vescicali, dolore e/o prurito alla zona genitale, disuria e minzione dolorosa; in cui dette infezioni e/o infiammazioni possono essere acute o croniche.

Vantaggiosamente, per il trattamento della cistite, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500, utilizzato tal quale o in forma di composizione secondo quanto descritto nella presente invenzione, pu? essere in associazione con una sostanza, o suoi estratti e/o derivati, scelta tra: mirtillo rosso, cranberry (Vaccinum Macrocarpon), semi di pompelmo, uva ursina (Arctostaphylos uva-ursi), manganese-rame olio essenziale tea tree oil, o loro miscele.

Il ceppo di batteri della presente invenzione e le sue composizioni, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, possono essere per uso nel trattamento delle suddette infezioni e/o infiammazioni del tratto genitourinario sia come terapia unica sia come terapia coadiuvante di ulteriori terapie farmacologiche.

Ad esempio, nel trattamento delle infezioni e/o infiammazioni del tratto genitourinario o urinario, il ceppo batterico dell?invenzione e le sue composizioni possono essere di supporto a un trattamento antibiotico.

Il ceppo batterico della presente invenzione e le sue composizioni, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, possono essere per uso terapeutico, preventivo e/o curativo, per la riduzione o soppressione della comparsa delle recidive delle infezioni e/o infiammazioni del tratto genito-urinario in un soggetto maschio o femmina avente bisogno, preferibilmente in un soggetto femmina (e.g. infezioni vaginali).

Preferibilmente, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e/o le sue composizioni, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, sono per uso in un metodo di trattamento, preventivo e/o curativo, di infezioni e/o infiammazioni del tratto vaginale o vulvovaginale di origine batterica e/o micotica, e di disturbi o sintomi associati, preferibilmente vaginite batterica e/o micotica, candidosi vaginale (o vulvovaginale) e vaginosi batterica; in cui detta composizione ? formulata per uso orale o topico vaginale.

Vantaggiosamente, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e le composizioni della presente invenzione, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, sono per uso in un metodo di trattamento, preventivo e/o curativo, di infezioni e/o infiammazioni del tratto genito-urinario, preferibilmente della vagina, causate da batteri aerobi e/o anaerobi e/o lieviti comunemente ritrovati nelle infezioni del basso tratto genito-urinario, quali ad esempio Gardnerella vaginalis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, Candida tropicalis.

Infatti, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ha mostrato attivit? antimicrobica verso: Gardnerella vaginalis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Candida krusei, Candida glabrata, e Candida tropicalis; in particolare, verso Escherichia coli ATCC 700414, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Gardnerella vaginalis ATCC 14018, Gardnerella vaginalis ATCC 14019, Candida albicans ATCC 10231, Candida krusei ATCC 14243, Candida glabrata ATCC 90030, e Candida tropicalis ATCC 13803.

La vaginite ? un'infiammazione acuta o cronica della vagina causate da una infezione spesso collegata a un cambiamento nel normale equilibrio del microbiota vaginale (disbiosi vaginale). Le principali cause di vaginite sono le infezioni da batteri (vaginosi batterica) e le infezioni da lieviti (vaginite micotica o candidosi vaginale). Le vaginiti sono spesso causate da una popolazione mista di batteri aerobi ed anaerobi (e.g. Gardnerella vaginalis) e lieviti (e.g. Candida albicans e/o Candida spp.) che coesistono e concorrono allo sviluppo dell?infezione. Inoltre, livelli ridotti di estrogeni dopo la menopausa possono causare una vaginite denominata vaginite atrofica. Le infezioni vaginali non trattate possono portare, oltre a disturbi locali, a ulteriori complicazioni. Ad esempio, la vaginosi batterica pu? causare il parto prematuro o infezioni post partum per la donna incinta, malattia infiammatoria pelvica, complicanze post-chirurgiche (dopo aborto, isterectomia o taglio cesareo), maggiore vulnerabilit? all'infezione da HIV o a malattie sessualmente trasmesse (clamidia, micoplasmi, papilloma virus, herpes virus) che possono causare infertilit? o tumori dell?utero a causa di alcuni ceppi oncogeni di papilloma virus.

Nel contesto della presente invenzione, con il termine disbiosi viene inteso uno squilibrio microbico (e.g. di batteri e lieviti) su una superficie o mucosa del corpo.

La vaginosi batterica (BV) ? una malattia della vagina causata da un'eccessiva crescita di batteri patogeni opportunisti che derivano dall?ecosistema vaginale stesso. L?infezione da vaginosi batterica in un soggetto aumenta il rischio di contrarre ulteriori infezioni a trasmissione sessuale, incluso l'HIV, e di parto pretermine.

La candidosi vaginale (o vulvovaginale) ? l'infezione micotica che risulta dalla proliferazione incontrollata, a livello della vagina, di un lievito della specie Candida, in particolare della Candida albicans.

La balanite ? una infiammazione del glande, la postite del prepuzio e la balanopostite di entrambi.

Secondo un aspetto dell'invenzione, il ceppo batterico Lacticasibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 e le sue composizioni, secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione descritte, sono per uso in un metodo di trattamento per la colonizzazione con Lactobacilli dalla mucosa del tratto genito-urinario (e.g. vagina) e/o per prevenire o inibire la colonizzazione e/o la crescita di agenti patogeni (e.g. patogeni opportunisti) in detto tratto genito-urinario, e/o per ripristinare il microbiota di detto tratto genito-urinario in un soggetto maschio o femmina in stato di bisogno, preferibilmente in un soggetto femmina, ad esempio in casi di disbiosi e/o dopo trattamenti medici severi come quelli con antibiotici o radiazioni.

Vantaggiosamente, per essere effettivo nei metodi di trattamento descritti nella presente invenzione, detto ceppo batterico Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? somministrato tal quale o come composizione dell?invenzione ad un soggetto avente necessit? in una dose giornaliera orale e/o topica che comprende detto ceppo di batteri in una quantit? compresa nell?intervallo da 10x10<6 >CFU a 10x10<11 >CFU, preferibilmente da 10x10<8 >CFU a 10x10<10 >CFU, pi? preferibilmente in una concentrazione di circa 10x10<8 >CFU o 10x10<9 >CFU (CFU: Colony Forming Unit).

Le suddette dosi giornaliere possono essere somministrate al soggetto in stato di bisogno in un'unica dose (dose singola) o in dosi ripetute, ad esempio due, tre o quattro dosi giornaliere.

Se non diversamente specificato, l?espressione composizione o altro che comprende un componente in una quantit? ?compresa in un intervallo da x a y? intende che detta componente pu? essere presente nella composizione o altro in tutte le quantit? presenti in detto intervallo, anche se non esplicitate, estremi dell?intervallo compresi.

Se non diversamente specificato, l?indicazione che una composizione ?comprende? uno o pi? componenti o sostanze significa che altri componenti o sostanze possono essere presenti oltre a quello, o quelli, specificamente indicati.

Per ?metodo di trattamento? nell?ambito della presente invenzione si intende un intervento su un soggetto avente bisogno, comprendente la somministrazione del ceppo di batteri o di una composizione dell?invenzione, avente come finalit? l?eliminazione, la riduzione/diminuzione o la prevenzione di una patologia o malattia e dei suoi sintomi o disturbi.

Con il termine ?soggetto/i? nell?ambito della presente invenzione vengono indicati mammiferi, preferibilmente soggetti umani di sesso femminile o maschile, pi? preferibilmente soggetti umani di sesso femminile.

Il termine ?quantit? terapeuticamente efficace? si riferisce alla quantit? di composto attivo o ceppo di batteri che elicita la risposta biologica o medicinale in un tessuto, sistema, mammifero o essere umano che viene ricercata e definita da un individuo, ricercatore, veterinario, medico o altro clinico o assistente sanitario.

Il termine "dispositivo medico" nel contesto della presente invenzione ? utilizzato nel significato secondo il decreto legislativo 24 febbraio 1997, n. 46 o secondo il nuovo Regolamento sui dispositivi medici (UE) 2017/745 (MDR).

Il termine "novel food" nel contesto della presente invenzione ? utilizzato nel significato secondo il Regolamento CE 258 del 1997

Un esempio di composizione secondo l?invenzione ? riportato in Tabella 1.

Tabella 1. 10B: 10 miliardi.

PARTE SPERIMENTALE

I. ISOLAMENTO DEL CEPPO Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500, CARATTERIZZAZIONE FENOTIPICA E GENOTIPICA

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? stato isolato dall?ecosistema vaginale di una paziente sana, reclutata presso la Clinica Ostetrica Ginecologica ?Policlinico-Vittorio Emanuele?, Universit? degli Studi di Catania, impiegando il substrato di crescita De Man, Rogosa and Sharpe (MRS).

Il ceppo ? stato sottoposto a caratterizzazione fenotipica: osservazione morfologica al microscopio, colorazione di Gram, prova della catalasi, capacit? di produrre spore e valutazione della motilit? (Tabella 2).

Tabella 2

Il ceppo ? stato sottoposto a caratterizzazione genotipica: PCR specie specifica tuf-gene, e tipizzazione a livello di ceppo attraverso l?analisi Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE), in accordo con quanto richiesto nelle line guida FAO/WHO 2002 (vedi allegato).

In particolare, il ceppo TOM22.8 (DSM 33500) ? stato geneticamente caratterizzato a livello di specie mediante sequenziamento del gene 16S rDNA. L'analisi ha mostrato che il ceppo TOM22.8 (DSM 33500) appartiene alla specie Lacticaseibacillus rhamnosus. Inoltre, ? stata eseguita la tipizzazione molecolare (genetic fingerprinting) del ceppo TOM22.8(DSM 33500) mediante gel elettroforesi in campo pulsato (PFGE). I risultati del profilo genomico del ceppo TOM 22.8 sono esposti in Figura 1.

II. PERFORMANCE DI SICUREZZA

In accordo con quanto riportato nelle linee guide per probiotici e prebiotici, redatte dal Ministero della Salute, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 ? stato sottoposto a valutazione dei requisiti di sicurezza. In dettaglio, sono state studiate: l?attivit? emolitica, la capacit? di produrre DNAse e gelatinasi, l?attivit? idrolasica dei sali biliari (BSH), la capacit? di degradare la mucina nonch? l?antibiotico resistenza nei confronti di svariati antibiotici di cui l?EFSA ha stabilito i valori di break-point.

Di seguito in dettaglio le caratterizzazioni effettuate sul ceppo in studio.

II.1. Attivit? emolitica.

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? stato rivitalizzato in terreno MRS broth e incubato a 37?C per 18-24 ore. La coltura cellulare in fase esponenziale di crescita ? stata trasferita, mediante striscio di propagazione, in piastre Blood Agar contenenti il 5% di sangue defibrinato di montone (Biolife, Milano, Italia) e incubate a 37?C per 24?48 ore. L'attivit? emolitica ? stata determinata visivamente e distinta come ?-emolisi, ?-emolisi o ?emolisi basata sulla presenza di une zone chiare, aloni verdi o nessuna zona intorno alle colonie, rispettivamente. I risultati, riportati in Tabella 3, sono stati espressi come (presenza di attivit?) e ? (assenza di attivit?). Il ceppo testato non ha mostrato attivit? emolitica.

Tabella 3

II.2. Capacit? di produrre DNAse e gelatinase.

La produzione di DNAse ? stata testa trasferendo 5 ?l di una coltura cellulare in fase esponenziale di crescita su piastre di DNAse agar (Oxoid). Dopo incubazione a 37 ? C per 48 ore, le piastre sono state coperte con HCl 1 N per 5 minuti. La presenza di zone chiare intorno alle colonie viene considerata come indicatore di positivit? alla produzione di DNase. La produzione di gelatinase ? stata valutata utilizzando piastre di agar gelatina (30 g/L di gelatina, 5 g/L di peptone, 3 g/L di estratto di lievito e 17 g/L di agar). Dopo incubazione a 37 ? C per 48 h, la superficie delle piastre ? stata ricoperta con ammonio solfato saturo (Meck). La presenza di zone chiare intorno alle colonie viene considerata come indicatore di positivit? dell?attivit? gelatinasica.

Per entrambi i test, i risultati, riportati in Tabella 4, sono stati espressi come: - (assenza di attivit?), (presenza di attivit?). Il ceppo testato non ha mostrato capacit? di produrre DNAse e gelatinase.

Tabella 4

II.3. Attivit? idrolasica dei sali biliari (BSH).

L'attivit? BSH ? stata saggiata impiegando piastre di agar MRS addizionate dello con 0,5% (p/v) di acido taurodesossicolico (TDCA, Sigma). Colture cellulari in fase esponenziale di crescita sono state trasferite sulla superficie del terreno di coltura sopra menzionato e incubate anaerobicamente per 48 ore a 37? C. La precipitazione dell'acido taurodesossicolico attorno alle colonie viene considerata come indicatore di positivit? dell?attivit? gelatinasica.

I risultati, riportati in Tabella 5, sono stati espressi come: - (assenza di attivit?), (presenza di attivit?). Il ceppo testato non ha mostrato capacit? idrolasica dei sali biliari.

Tabella 5

II.4. Capacit? di degradare la mucina.

La capacit? del ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 di degradare la mucina ? stata valutata utilizzando un idoneo terreno di crescita modificato mediante l'aggiunta dello 0,5% (p/v) di porcine stomach type III (Sigma-Aldrich Corp.). La coltura cellulare in fase esponenziale di crescita ? stata trasferita nel succitato mezzo di crescita e le piastre sono state incubate anaerobicamente a 37 ?C per 72 ore. Successivamente, le piastre sono state colorate con 0,1% (p/v) di amido black (Merck KGaA) in acido acetico 3,5 M per 30 minuti, quindi lavate con acido acetico 1,2 M (Merck KGaA). La presenza di aloni attorno alle colonie ? stata considerata come un risultato positivo.

I risultati, riportati in Tabella 6, sono stati espressi come: - (assenza di attivit?), (presenza di attivit?). Il ceppo testato non ha mostrato capacit? di degradare la mucina.

Tabella 6

II.5. Suscettibilit? agli antibiotici e determinazione della MIC.

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? considerato resistente o sensibile agli antibiotici testati, secondo quanto riportato dall'Autorit? europea per la sicurezza alimentare (EFSA), mediante la valutazione della minima concentrazione inibente (MIC) usando come riferimento i cut-off suggeriti dall?EFSA (2012). Per ciascun antibiotico testato, il ceppo ? stato classificato come resistenti (R) o sensibile (S). Come si evince dai risultati, riportati in Tabella 7, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 risulta sensibile a tutti gli antibiotici testati. Il ceppo, inoltre, non ha evidenziato geni di antibiotico resistenza a livello del genoma. In Tabella 6, i valori di breackpoint per ciascun antibiotico testato sono riportati tra parentesi e sono espressi in ?g/ml.

Tabella 7

III. PERFORMANCE FUNZIONALI

III.1. Resistenza al lisozima.

La capacit? del ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 di sopravvivere in presenza di lisozima ? stata valutata in MRS broth dopo 0, 30, e 120 minuti di incubazione a 37?C. La tolleranza al lisozima ? stata determinata mediante conteggio in piastra delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati, riportati in Tabella 8 come media e deviazione standard, sono espressi come log cfu/ml. ? stata, inoltre, valutata la % di sopravvivenza, calcolata tenendo conto della densit? di popolazione finale (cfuF) e iniziale (cfuI) (cfuF/cfuI *100) e il valore 80% ? stato considerato come limite minimo di sopravvivenza. Il ceppo testato ha mostrato capacit? di sopravvivere in presenza di lisozima, presentando % di sopravvivenza pari al 94% e 91 % dopo incubazione a 37?C per 30 e 120 minuti rispettivamente.

Tabella 8

III.2. Tolleranza a bassi valori di pH.

La capacit? del ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 di tollerare bassi valori di pH ? stata testata in MRS broth acidificato a pH 2,0 e pH 3,0 mediante di HCl 1 M. MRS a pH 6,2 ? stato usato come controllo. Il ceppo in studio ? stato rivitalizzato in brodo MRS e la sospensione cellulare in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/mL) ? stata inoculata nel mezzo di coltura acidificato. Aliquote sono state prelevate immediatamente dopo l'inoculo (0 ore) e dopo 2 e 4 ore di incubazione a 37?C. La tolleranza ai bassi valori di pH ? stata determinata mediante conteggio in piastra delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati, espressi come log cfu/ml, sono riportati come media e deviazione standard. ? stata, inoltre, valutata la % di sopravvivenza, calcolata tenendo conto della densit? di popolazione finale (cfuF) e iniziale (cfuI) (cfuF/cfuI *100) e il valore 80% ? stato considerato come limite minimo di sopravvivenza.

Il ceppo testato ha mostrato capacit? di sopravvivere a pH 3,0 e 2,0, presentando % di sopravvivenza maggiore all?80% dopo incubazione a 37?C per 2 ore e 4 ore (Tabella 9). La percentuale di sopravvivenza a pH 3,0 dopo 4 ore ? pari al 91%. La percentuale di sopravvivenza a pH 2,0 dopo 4 ore ? pari all?85%.

Tabella 9

III.3. Tolleranza ai sali di bile.

La capacit? del ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 di sopravvivere in presenza di sali di bile (bovine bile salts, Oxgall; Sigma-Aldrich), a concentrazioni finali dello 0,5% e dell?1,0% ? stata valutata come segue. Il ceppo in studio ? stato rivitalizzato in brodo MRS e la sospensione cellulare in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/mL) ? stata inoculata in MRS broth contenente le percentuali di sali di bile sopra riportate. MRS senza sali di bile ? stato utilizzato come controllo. Aliquote sono state prelevate immediatamente dopo l'inoculo (0 ore) e dopo 2 e 4 ore di incubazione a 37 ? C e si ? proceduto al conteggio in piastre delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati, riportati in Tabella 10 e espressi come log cfu/ml, sono riportati come media e deviazione standard. ? stata, inoltre, valutata la % di sopravvivenza, calcolata tenendo conto della densit? di popolazione finale (cfuF) e iniziale (cfuI) (cfuF/cfuI *100) e il valore 80% ? stato considerato come limite minimo di sopravvivenza.

Il ceppo testato ha mostrato capacit? di sopravvivere in presenza di sali di bile alle concentrazioni dello 0,5% e dell?1%. La percentuale di sopravvivenza allo 0,5% di sali bile dopo 4 ore di incubazione ? pari all?82%. La percentuale di sopravvivenza all?1% di sali di bile dopo 4 ore ? pari all?88%.

Tabella 10

III.4. Sopravvivenza durante simulazione della digestione GI.

La capacit? del ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 di sopravvivere durante il transito gastrointestinale (GI) ? stata determinata in vitro impiegando succo gastrico simulato (SGJ) e fluido intestinale simulato (SIF). In dettaglio, SGJ (0,3% pepsina, 0,5% NaCl, aggiustato a pH 2 aggiungendo HCl 1 M) e SIF (0,1% pancreatina, 0,5% sale biliare, 0,5% NaCl, 0,4% fenolo, aggiustati a pH 8 aggiungendo 1 M NaOH) sono stati preparati immediatamente prima dell'uso e sterilizzati utilizzando un filtro in acetato di cellulosa da 0,22 ?m (filtri Minisart, Sartorius, Gottinga, Germania). Tutti i prodotti chimici sono stati ottenuti da Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Colture cellulari in fase esponenziale di crescita (9 log cfu/ml) sono state pellettizzate mediante centrifugazione e risospese in tampone fosfato (PBS). La sospensione cellulare ottenuta ? stata miscelata con SGJ e incubata per 2 ore a 37 ? C, in condizioni di microaerofilia sotto agitazione (200 rpm). Le cellule, pellettizzate per centrifugazione, sono state nuovamente sospese in SIF e incubate a 37? C per 3 ore. Le cellule trattate con SGJ e SGJ-SIF sono state sottoposte a conteggio in piastra delle cellule vitali. L?analisi ? stata effettuata in triplicato e i risultati, riportati in Tabella 11 e espressi come log cfu/ml, sono riportati come media e deviazione standard.

Il ceppo ha presentato un?ottima sopravvivenza durante il transito gastrointestinale simulato in condizioni statiche.

Tabella 11

III.5. Attivit? antimicrobica.

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? stato testato per l'attivit? antagonistica usando Escherichia coli ATCC 700414, Escherichia coli ATCC 25922, Staphilococcus aureus ATCC 6538, Gardnerella vaginalis ATCC 14018, G. vaginalis ATCC 14019, Candida albicans ATCC 10231, Candida krusei ATCC 14243, Candida glabrata ATCC 90030 e Candida tropicalis ATCC 13803 come microrganismi bersaglio. Il test ? stato eseguito mediante agar spot test. Dopo incubazione a 37?C per 48 ore, l?attivit? antimicrobica ? stata valutata mediante misura dell?alone di inibizione ottenuto. I risultati, riportati in Tabella 12, sono stati espressi come ? (nessuna attivit?); (alone di inibizione di diametro <10 mm); + (alone di inibizione di diametro compreso tra 11 e 20 mm); ++ (alone di inibizione di diametro > 20 mm).

Il ceppo in studio ha mostrato attivit? antimicrobica nei confronti dei patogeni testati.

Tabella 12

III.6. Attivit? anti-infiammatoria in macrofagi.

Le linee cellulari LX-2 e U937, utilizzate come modello in vitro di infiammazione, sono state sospese in Dulbecco?s modified Eagle?s medium (DMEM) 1 g/L D-glucosio (Gibco, Life Technologies, Milano, Italia) integrato con 10% v / v di siero bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, California, USA), 1% di penicillina/streptomicina (Carlo Erba, Milano, Italia) e 60 mg/mL di gentamicina (Gibco). Le cellule U937 sono state differenziate in macrofagi attraverso il trattamento con 200 nM di PMA (Phorbol 12-miristato 13acetato) per 72 h. Al fine di simulare il processo infiammatorio, le cellule sono state pretrattate con lipopolisaccaride (LPS) ad una concentrazione di 100 ng/mL per 2 ore. L'effetto antinfiammatorio dei ceppi in studio ? stato valutato trattando le cellule differenziate con i ceppi batterici alla concentrazione di 10 ?g/mL per 6 ore. Alla fine del trattamento, le cellule sono state lavate con PBS, raccolte mediante tripsinizzazione e quindi lisate per l'estrazione dell?RNA. La quantificazione dei geni COX-1 (Ciclooxygenase-1), COX-2, IL-8 e IL-10 ? stata effettuata mediante real-time qRT-PCR.

Dall?analisi effettuata si evince che il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 presenta attivit? antiinfiammatoria in macrofagi, determinando la riduzione dell?interleuchina pro-infiammatoria IL-8 e l?incremento l?interleuchina antiinfiammatoria IL-10 (Tabella 13).

Tabella 13

III.7. Attivit? antiossidante.

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? stato testato per l'attivit? antiossidante impiegando 1 mL di surnatante (privo di cellule) addizionato di 1 mL di PBS (0,1 M, pH 7,0) e 1 mL di acido linoleico (50 mM) in etanolo (99,5%). L'ossidazione ? stata misurata mediante determinazione del tiocianato ferrico. Idrossitoluene butilato (BHT) e ?-tocoferolo (1 mg/mL) sono stati usati come controlli positivi. Il brodo MRS ? stato impiegato come controllo negativo. I risultati, riportati in Tabella 14, sono espressi come valori di assorbanza a 500mn. L?analisi ? stata effettuata in triplicato.

Il ceppo testato ha mostrato attivit? antiossidante.

Tabella 14

III.8. Auto-aggregazione, idrofobicit? e coaggregazione. Un ml di sospensione cellulare in tampone PBS (10<9 >cfu/mL) ? stata vortexata per 10 secondi e incubato a temperatura ambiente per 5 ore. Successivamente, un'aliquota (0,1 ml) della fase superiore della sospensione ? stata miscelata con 500 ?l di tampone PBS e l'assorbanza a 600 nm ? stata determinata. L'autoaggregazione (Auto-A%) ? stata espressa come riduzione percentuale dell'assorbanza dopo 5 h (?Abs x 100) rispetto a quella della sospensione originale (Abst0) come segue: Auto-A%=?Abs/Abst0 x 100 L?idrofobicit? (H%) ? stata determinata miscelando ugual volume di xylene e sospensione cellulare in PBS (10<9 >cfu/mL). Dopo incubazione a 37? C for 10 min la sospensione ? stata mantenuta a 37? C for 5 h al fine di ottenere la separazione di fase. La fase acquosa ? stata prelevata e sottoposta a determinazione dell?assorbanza a 600 nm. L?idrofobicit? ? stata calcolata come riduzione percentuale dell?assorbanza (?Abs x 100) della fase acquosa dopo incubazione rispetto all?assorbanza della sospensione base: H% = ?Abs/Abst0 x 100.

La co-aggregazione (Co-A%) ? stata valutata usando i ceppi Escherichia coli 555, Gardnerella vaginalis ATCC 14018, Candida albicans ATCC 10231, and Candida krusei ATCC 14243 come co-aggregation partners. Ugual volume (2 mL) della sospensione cellulare del ceppo TOM 22.8 e di ciascuno dei ceppi patogeni sono state miscelate e vortexate pe 30 secondi quindi mantenute a temperatura ambiente per 5 h. L?assorbanza a 600nm della miscela TOM 22.8+patogeno (Abs(TOM22.8+pat)) e del solo ceppo TOM 22.8 (AbsTOM22.8) ? stata determinata. La co-aggregazione ? stata calcolata come segue: Co-A%= ((AbsCA15+ Abspat)/2 ? Abs(CA15+ pat) / (AbsCA15 + Abspat/2) x 100.

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ha presentato buona autoaggregazione, idrofobicit? e coaggregazione con i patogeni testati, evidenziando in maniera indiretta la capacit? del ceppo di aderire alla mucosa intestinale e impedire lo sviluppo dei patogeni nel tratto gastro-intestinale (Tabella 15).

Tabella 15

III.9. Produzione di perossido di idrogeno.

La capacit? di produrre perossido di idrogeno (H2O2) ? stata valutata coltivando il ceppo su agar MRS contenente 0,25 mg / mL di 3,3?,5,5?-tetrametilbenzidina e 0,01 mg / mL di horseradish perossidasi. Dopo incubazione in condizioni anaerobiche per 72 ore, le piastre sono state esposte all'aria e la produzione di H2O2 ? stata valutata in base alla comparsa di colorazione blu. I risultati, in Tabella 16, sono stati espressi come ? (assenza di produzione) o (produzione di H2O2).

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ha mostrato capacit? di produrre H2O2.

Tabella 16

III.10. Produzione di esopolisaccaridi (EPS).

? stata testata in piastra mediante loop touch test. Colture cellulari in fase esponenziale di crescita sono state propagate in terreno di coltura De Man, Rogosa and Sharpe (MRS) agar (Oxoid). Dopo incubazione a 37 ?C per 48 ore, la produzione di EPS ? stata valutata sulla base della presenza colonie mucoidi. I risultati, riportati in Tabella 17, sono stati espressi come: - (nessuna produzione di EPS); (produzione di EPS).

Il ceppo testato ha mostrato capacit? di produrre EPS.

Tabella 17

III.11. Stabilit? del ceppo dopo liofilizzazione e incapsulamento.

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 ? stato sottoposto a liofilizzazione e incapsulamento. La vitalit? del ceppo incapsulato ? stata valutata per 12 mesi, in condizioni di frigoconservazione e conservazione a temperatura ambiente, mediante conteggio in piastra delle cellule vitali. Al momento dell?incapsulamento la densit? di popolazione del ceppo TOM 22.8 ? stata pari a 1,33 x 10<10>.

Il ceppo in studio ha presentato una buona attitudine alla liofilizzazione e una buona stabilit? fino a 12 mesi, in capsule poste sia a temperatura ambiente sia in condizioni refrigerate (Tabella 18).

Tabella 18

IV: STUDIO CLINICO

Studio sugli effetti del ceppo di batteri Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500 nel trattamento della vaginite batterica e/o delle infezioni micotiche.

Il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22. 8 DSM 33500 ? stato sottoposto a valutazione della sua efficacia attraverso un trial in vivo presso la Clinica Ostetrica Ginecologica ?Policlinico-Vittorio Emanuele? e diretto dal Prof. Antonio Cianci, direttore della clinica sopramenzionata. Lo studio prevede un arruolamento di 70 pazienti di sesso femminile che presentano segni e sintomi riconducibili a vaginite batterica e/o infezioni micotiche alle quali viene somministrato, per 10 giorni, per uso orale o topico vaginale, il ceppo Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 DSM 33500.

Ciascuna paziente viene sottoposta a prelievo dell?essudato vaginale con le seguenti tempistiche:

- T0: al momento dell?arruolamento,

- T1: dopo 10 giorni dall?inizio della terapia (alla fine della somministrazione del ceppo),

- T2: dopo un mese dalla fine della terapia.

Per ciascun tempo di studio (T0, T1 e T2) si procede al prelievo dell?essudato vaginale e alla caratterizzazione del microbiota presso il Dipartimento di Agricoltura, Alimentazione e Ambiente dell?Universit? degli Studi di Catania mediante:

- l?esame microscopico del morfotipo della popolazione batterica; le comunit? microbiche e la popolazione lattobacillare, distinte su base morfologica e tintoriale al Gram, sono state valutate in termini semiquantitativi (assente; scarsa ; discreta +; abbondante+++);

- la valutazione della popolazione micetica;

- la valutazione della eventuale presenza di ?clue cells?;

- la determinazione dello score ricavato dal rapporto tra i diversi morfotipi batterici (Lacticaseibacillus spp, Gardnerella vaginalis, Mobiluncus spp, anaerobi).

I campioni di essudato vaginale sono stati successivamente sottoposti ad esame colturale, impiegando terreni specifici e selettivi per la ricerca dei principali gruppi microbici di origine vaginale: Gardnerella vaginalis; Staphylococcus spp.; Candida spp; Escherichia coli; Enterococcus spp.; Streptococcus spp; Lacticaseibacillus spp..

In una prima fase di detto studio clinico (fase preliminare), sono stati esaminati i seguenti gruppi di pazienti:

- 10 pazienti non trattate con il ceppo TOM 22.8 (controllo),

- 10 pazienti trattate con il ceppo TOM 22.8 per via topica, e

- 10 pazienti trattate con il ceppo TOM 22.8 per via orale.

I risultati preliminari ottenuti da detta prima fase dello studio clinico (Tabella 19) hanno evidenziato un significativo miglioramento dei sintomi clinici e un decremento degli indici riconducibili allo stato di disbiosi nelle pazienti trattate con il ceppo TOM 22.8 rispetto alle pazienti non trattate.

In particolare, durante l?intero periodo di somministrazione ? stata riscontrata una riduzione del Nugent score, dello Whiff odor (whiff-amine test % di positivit?) e del pH vaginale che ? rientrato nel valore fisiologico (pH 4.5), come riportato in Tabella 19.

Sotto l?aspetto microbiologico ? stata riscontrata una significativa riduzione delle specie microbiche associate a disbiosi batteriche, quali Gardnerella vaginalis, E. coli, Streptococcus spp., un concomitante incremento della popolazione lattobacillare, nonch? una significativa riduzione dell?infezione micotica. In dettaglio, come si evince dalla Figura 2 (valori di conta microbica espressi in log cfu/ml di essudato vaginale al momento dell?arruolamento (T0), dopo 10 gg (T1) e dopo un mese dal trattamento orale o topico con il ceppo TOM22.8), nelle 20 donne trattate con il ceppo TOM 22.8 per via orale o topica, dopo 10 giorni di trattamento (T1) ? stato osservato un decremento pari a 4 unit? logaritmiche (log) di Candida glabrata; 3 unit? log di Gardnerella vaginalis e di Candida albicans; pari a 2 unit? log di Escherichia coli e di Candida krusei; 1 unit? log di Enterococcus spp, ed un incremento pari a 3 unit? log della popolazione lattobacillare. I risultati ottenuti dopo 1 mese dalla fine della terapia (T2) hanno evidenziato valori di conta pressoch? sovrapponibili a quelli ottenuti a fine trattamento (T1), con eccezione della conta lattobacillare che ha presentato un ulteriore incremento pari a 1-2 unit? logaritmiche.

Tabella 19. N: pazienti trattate; N*: pazienti controllo.

In Tabella 20 sono riportati i valori di conta microbica espressi in log cfu/ml di essudato vaginale al momento dell?arruolamento (T0), dopo 10 gg di trattamento orale (OS) con il ceppo TOM22.8 (T1) e dopo 1 mese dalla fine del trattamento (T2).

In Tabella 21 sono riportati i valori di conta microbica espressi in log cfu/ml di essudato vaginale al momento dell?arruolamento (T0), dopo 10 gg (T1) di trattamento topico con il ceppo TOM22.8 e dopo 1 mese (T2) dalla fine del trattamento.

Infine, in Tabella 22 sono riportati i valori di conta microbica espressi in log cfu/ml di essudato vaginale dei soggetti allocati nel gruppo di controllo (wait and see).

Tabella 20. Significativit? statistica: *P < 0.05.

Tabella 21. Significativit? statistica: *P < 0.05.

Tabella 22. Significativit? statistica: *P < 0.05.

Claims (10)

RIVENDICAZIONI

1. Un ceppo batterico appartenente alla specie Lacticaseibacillus rhamnosus identificato come Lacticaseibacillus rhamnosus TOM 22.8 e depositato presso il

con numero di deposito DSM 33500.

2. Una composizione comprendente o, alternativamente, consistente di detto ceppo batterico secondo la rivendicazione 1 e almeno un additivo e/o eccipiente di grado farmaceutico o alimentare.

3. La composizione secondo la rivendicazione 2, in cui detta composizione comprende inoltre almeno un prebiotico; preferibilmente detto almeno un prebiotico ? scelto tra: inulina, frutto-oligosaccaride (FOS), galatto-oligosaccaride (GOS), xilitolo-oligosaccaride (XOS), gomma di guar e loro miscele; pi? preferibilmente inulina.

4. La composizione secondo la rivendicazione 2 o 3, in cui detta composizione ? formulata per uso orale; preferibilmente in forma solida.

5. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-4, in cui detta composizione ? formulata per uso topico; preferibilmente per uso topico vaginale o genitale.

6. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-5 o, alternativamente, il ceppo batterico secondo la rivendicazione 1 per uso come medicamento.

7. La composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 2-5 o, alternativamente, il ceppo batterico secondo la rivendicazione 1 per uso in un metodo di trattamento, preventivo o curativo, di una infezione e/o infiammazione genitourinaria, e di disturbi o sintomi associati, in un soggetto maschio o femmina avente necessit?; preferibilmente in un soggetto femmina.

8. La composizione per uso secondo la rivendicazione 7 o, alternativamente, il ceppo batterico per uso secondo la rivendicazione 7, in cui detta infezione e/o infiammazione genitourinaria, preferibilmente del tratto genitale, e i disturbi o sintomi associati sono selezionati tra: vaginite batterica e/o micotica, candidosi vaginale (o vulvovaginale), vaginosi batterica, vaginite atrofica, infezioni batteriche e/o micotiche dei genitali maschili, balanite, postite e balanopostite, dolore e/o prurito alla zona genitali, disuria, stranguria, secrezioni vaginali maleodoranti, secchezza vaginale, e dispareunia; in cui detta infezione o infiammazione ? acuta o cronica.

9. La composizione per uso secondo la rivendicazione 7 o 8 o, alternativamente, il ceppo batterico per uso secondo la rivendicazione 7 o 8, in cui detta infezione e/o infiammazione genitourinaria ? una infezione e/o infiammazione vaginale di origine batterica e/o micotica; preferibilmente scelta tra vaginite batterica e/o micotica, candidosi vaginale e vaginosi batterica.

10. La composizione per uso secondo la rivendicazione 7 o, alternativamente, il ceppo batterico per uso secondo la rivendicazione 7, in cui detta infezione e/o infiammazione genitourinaria, preferibilmente del tratto urinario, e i disturbi o sintomi associati sono selezionati tra: infezioni batteriche e/o micotiche del tratto urinario (UTI) o del basso tratto urinario, cistiti, uretriti, prostatiti, infezioni del basso tratto urinario in soggetti portatori di cateteri vescicali, disuria e minzione dolorosa; in cui detta infezione o infiammazione ? acuta o cronica.