TWI698187B

TWI698187B - 一種預防中風及改善中風嚴重度之組合物及其用途

Info

Publication number: TWI698187B
Application number: TW108118359A
Authority: TW
Inventors: 陳奕興; 蔡宛樺; 黃相碩; 王羿忻
Original assignee: 景岳生物科技股份有限公司
Priority date: 2019-05-28
Filing date: 2019-05-28
Publication date: 2020-07-11
Also published as: TW202042655A

Abstract

本發明提供一種預防中風及改善中風嚴重度之組合物，其包含有效量之羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、及副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-133；其中該羅伊氏乳桿菌GMNL-89之寄存編號為BCRC910340，該副乾酪乳桿菌GMNL-133寄存編號為BCRC910520。所述組合物可於正常人平日攝取，中風發作後持續投藥，具有改善中風後腦部梗塞、運動能力、腸道菌相之功效。

Description

一種預防中風及改善中風嚴重度之組合物及其用途

本發明係關於益生菌用於改善乳桿菌分離株，用於預防中風及改善中風嚴重度之技術領域。

腦血管疾病在全世界的前十大死因排名中一直名列前茅，腦中風損傷可能會影響全身，造成失能及死亡，為社會醫療資源及家庭經龐大負擔。腦血管疾病中以缺血性中風(ischemia stroke)的發病率最高，約占中風患者總比例80%，然而目前臨床上治療缺血性中風最主要的策略是利用血栓溶解術(thrombolytic therapy)等治療方式疏通缺血性中風病患的梗塞缺血區域，恢復血流，減少梗塞區域。但近年來發現，缺血組織恢復血流再灌注後，產生大量的自由基或活性氧，造成缺血的細胞損傷更加嚴重，導致缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury)，當中樞發生缺血再灌注損傷時，會產生氧化壓力，造成DNA損傷，脂質過氧化等傷害，會大量增加細胞激素(cytokines)和趨化因子(chemokines)造成大量白血球在梗塞受傷區域周圍浸潤，造成發炎反應，引起神經細胞的細胞凋亡，損害神經功能。

腸道中的微生物菌群會與中樞神經、自主神經系統及免疫系統產生交互作用，可以透過腸-腦軸(gut-brain axis)的三條途徑(免疫、神經內分泌和迷走神經)形成菌-腸-腦軸(microbiome-gut-brain axis)，對中樞神經系統產生重大的影響，也就是說若維持正常的腸道微生物菌群，可以維持腸道障蔽功能、增強腸道免疫力及降低過度發炎反應的發生。

腸道菌相對於中風及腦部損傷具高度關聯性，實驗結果發現在中大腦動脈結紮(middle cerebral artery occlusion，MCAO)老鼠模式下，會造成其腸道菌相失調、伴隨腸道障壁功能低下及腸道通透性增加之現象，這會使中風病程更惡化；而在中大腦動脈結紮老鼠模式下發現某些會造成腸道發炎反應的壞菌增加，例如：Bacteroides,Escherichia Shigella,Haemophilus,Eubacterium nodatum group,Collinsella,Enterococcus,Proteus,Alistipes,Klebsiella,Shuttleworthia及Faecalibacterium...等；此外，某些具有調節免疫反應及增強腸道上皮細胞屏障功能的好菌減少，例如：Alloprevotella,Ruminococcaceae,Oscillospira,Lachnospiraceae NK4B4 group,Akkermansia及Megasphaera..等。

預處理廣效性抗生素的小鼠可減少缺血性中風手術後之梗塞區域，抗生素小鼠會活化調節性T細胞(Treg)及降低IL-17+γδ T細胞增加，進而降低其下游相關趨化因子於腦部堆積，減緩了中風的嚴重程度；然而抗生素並無法當作保養身體或預防疾病使用，使用過多會導致許多副作用產生。因此，利用安全無副作用的益生菌以調節腸道菌相、維持腸道障壁及降低過度發炎反應，為未來於臨床上預防缺血性中風的較佳策略。

此外，有研究發現在利用雙側頸總動脈結紮手術並再灌注傷害的動物模式，發現給予Clostridium butyricum(1x10⁹CFU/kg)，能夠減少因大腦缺血再灌注損傷引起的氧化壓力及細胞凋亡，達到神經保護的效果。然而雙側頸總動脈結紮並非臨床上缺血性中風發生的主因，臨床上大多數的缺血性中風都是發生在中大腦動脈或是其分支的缺血，但目前並沒有研究評估給予功能性益生菌在缺血性中風發生時的保護作用與腸道菌相的相關性。

本發明是利用中大腦動脈結紮(MCAO)老鼠模式模擬缺血性中風發生時，評估功能性益生菌是否有預防及保護作用和其與腸道菌相的相關性。由於目前益生菌在於預防中風及改善中風後症狀之間研究並不廣泛，而亟待加以尋找有效改善之益生菌。

本發明的目的在於提供一種益生菌用於製備預防中風及改善中風嚴重度醫藥組合物之用途，包含向一對象經口投予一每日有效劑量4×10⁸~4×10¹⁰個菌落形成單位(colony forming unit；CFU)該益生菌達11天，其中該對象是中風病人，其中該益生菌選自於由羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-133所組成的群組；其中該羅伊氏乳桿菌GMNL-89之寄存編號為BCRC910340，該副乾酪乳桿菌GMNL-133寄存編號為BCRC910520。

為達成前述發明目的，其中該改善中風是改善缺血性中風。

為達成前述發明目的，其中該改善中風嚴重度是減少中風造成的腦部梗塞區域。

為達成前述發明目的，其中該改善中風嚴重度是改善中風後病人的復原狀況。

為達成前述發明目的，其中該病人的復原狀況是運動能力。

本發明的又一目的在於提供一種益生菌用於製備改善中風後腸道菌相醫藥組合物之用途，包含向一對象經口投予一每日有效劑量4×10⁸~4×10¹⁰個菌落形成單位(colony forming unit；CFU)該益生菌達11天，其中該對象是中風病人，其中該益生菌選自於由羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-133所組成的群組；其中該羅伊氏乳桿菌GMNL-89之寄存編號為BCRC910340，該副乾酪乳桿菌GMNL-133寄存編號為BCRC910520。

為達成前述發明目的，其中該改善中風後腸道菌相是好菌豐富度增加。

為達成前述發明目的，其中該好菌是瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)或顫螺菌屬(Oscillospira)。

綜上所述，本發明益生菌組合物可以使中風後個體腦梗塞區域減少、運動能力恢復、且腸道菌相改善好菌增加，而達成預防中風及改善中風嚴重度的功效。

S01~S06:實驗流程

圖1A是實驗流程。

圖1B是實驗流程及手術模式圖。

圖2是不同益生菌對於缺血性中風造成的腦部梗塞區域之影響。

圖3是不同益生菌對於缺血性中風所造成的運動功能障礙之影響-握力試驗(Grip test)。

圖4是是不同益生菌組別缺血性中風老鼠之菌相豐富度分析(菌門層次)。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

本文所述組合物係可包含，但不限於：食品、飲品、健康食品、動物飲水添加物、動物飼料添加物、動物用及人類用醫療組合物、食品添加物、飲料添加物等適用本發明之應用形式。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之藥物、生物材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

本發明使用的羅伊氏乳桿菌GMNL-89寄存於新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2006年11月14日、寄存編號為BCRC910340；且寄存於中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2007年11月19日、寄存編號為CCTCC M207154。

本發明使用的副乾酪乳桿菌GMNL-133寄存新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2010年7月5日、寄存編號為BCRC910520；且寄存中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2011年9月26日、寄存編號為CCTCC M2011331。

實驗方法

中風實驗動物模式：實驗流程如圖1A、圖1B(上方)所示，實驗使用的是雄性C57BL/6小鼠(8-12 weeks；22-28g)，實驗動物購買自樂斯科生物科技股份有限公司，飼養動物的環境控制在室溫(24±1℃)，溼度為55±5%，並維持各十二小時之白日黑夜光照周期，實驗動物允許自由的進食及飲水。

小鼠進行中大腦動脈結紮手術前先投予抗生素sulfamethoxazole(0.8mg/ml)及trimethoprim(0.16mg/ml)10天，再飲用純水2天，爾後將所有實驗的動物分為不同組別：Vehicle組：管餵水；GMNL-662：每公斤小鼠管餵8.2x10⁷CFU(低劑量)或8.2x10⁸CFU(高劑量)；GMNL-89：每公斤小鼠管餵8.2x10⁷CFU(低劑量)或8.2x10⁸CFU(高劑量)；GMNL-133：每公斤小鼠管餵8.2x10⁷CFU(低劑量)或8.2x10⁸CFU(高劑量)；GMNL-89+GMNL-133(1：1)：每公斤小鼠管餵8.2x10⁷CFU(GMNL-89與GMNL-133各一半，低劑量)或8.2x10⁸CFU(GMNL-89與GMNL-133各一半，高劑量)。

乳酸菌之製備是將菌株凍乾粉末溶於無菌水中，混和均勻，利用管餵的方式投與，每日餵食一次，先連續餵食4天，第5天餵食製劑後進行中大腦動脈結紮手術，再餵食益生菌6天，小鼠進行中大腦動脈結紮手術後評估七天，動物共連續餵食11日水或乳酸菌水溶液。

結紮右側中大腦動脈(middle cerebral artery,MCA)造成右側大腦皮質的缺血，實驗步驟如圖1B(下方)示意圖所示，先以2% isoflurane 麻醉，再將頸部及頭部的毛髮剃除。從頸中線劃開，並在氣管兩旁尋得左右二側頸總動脈(common carotid artery,CCA)，分離出CCA後，再將C57BL/6小鼠側擺，從其右側的眼角(canthux)至耳翼(pinna)間切開，分開肌肉，以骨鑽在顴骨(zygoma bone)和鱗狀骨(squamosal bone)的接合處鑽一小孔，形成一直徑約為3mm之骨窗後，以手術顯微鏡下，用細鑷子將硬膜撥開，即可看到右側中大腦動脈，利用雙極電刀電燒MCA阻塞血流，電燒後再將CCA利用血管夾阻斷血流20分鐘，造成小鼠局部中樞缺血損傷，而後再將血管夾鬆開，進行血液再灌注，並以4/0縫合線將其傷口縫合，手術過程中將小鼠置於電熱毯上維持體溫恆定，術後亦將小鼠置於電熱毯上等待老鼠甦醒，避免小鼠失溫。

腦梗塞損傷區域評估：手術後第7天，動物麻醉後予以斷頭犧牲，取出腦部，以PBS清洗後，先檢查腦外觀是否出血或感染，當實驗動物發生腦血管部位異常或中大腦動脈解剖位置異常，該實驗動物予以排除不計。再將小鼠的腦組織放入冷的生理溶液中10分鐘，然後置於腦組織切片模具中切成厚度為1mm的腦切片，在避光環境下，浸潤在37℃，2% 2,3,5 triphenyltetrazolium chloride(TTC)中進行染色30分鐘後，再將腦組織以10% formalehyde固定24小時後，將其掃描後，以影像處理系統(Image J software,National Institutes of Health(NIH),USA)計算腦梗塞損傷區域。乳白區域或壞死液化區域(缺陷區域)均屬於腦梗塞損傷區域。

動物行為評估：行為評估之測驗的時間點皆定在中風前一天，及中風後第三、六天。利用Grip Test測驗可測試小鼠利用其前爪抓住金屬條並保持懸掛的抓握反射能力及平衡感。測驗的模式是先拾取小鼠的尾巴，並將小鼠的前爪懸掛於桌子上方20cm處的50cm長的金屬條中間，測驗時間為30秒，表1為Grip Test測驗之評分標準。

菌相分析：將實驗終點時老鼠新鮮糞便收集，抽取糞便DNA後，利用Illumina MiSeq System Sequencing(2 x 301bp paired-end)進行16S rRNA之V3-V4區域序列，經由比對資料，即可分析不同組別之糞便菌相變化(包含菌門到菌種層次)。主要分析菌相的四個組別為：造症組(vehicle)、管餵GMNL-89(8.2x10⁸CFU/kg)、GMNL-133(8.2x10⁸CFU/kg)及GMNL-89+GMNL-133(8.2x10⁸CFU/kg)三個高劑量組。

數據統計：數據以mean±SEM表示，梗塞區域(Infarct zone)的改善及行為功能障礙是否改善皆是以one-way analysis of variance(ANOVA)統計分析後再以Student's t-test來分析Vehicle組與不同濃度的益生菌組別之間的差異是否有意義。統計結果皆以p<0.05視為有意義的差異(*)。

實驗結果：

實驗進行如圖1A、圖1B所示流程，給予抗生素水10天後休息2日；接著管餵5天不同劑量之單株益生菌及益生菌組合物後，進行中風造症，中風後繼續管餵益生菌至11天，期間利用握力試驗(Grip test)觀察老鼠之運動能力，且於第12天犧牲老鼠觀察腦部梗塞區域。腦部梗塞結果是以圖2腦部切片中白色及缺陷均納入梗塞區域之計算，結果如表2所示，缺陷為梗塞後液化結果；運動能力則以握力試驗評估，結果如圖3所示；不同益生菌分組對於缺血性中風造成的腦部梗塞區域及運動能力之影響說明如下。

植物乳桿菌(L.plantarum)GMNL-662組：管餵高劑量或低劑量之植物乳桿菌(L.plantarum)GMNL-662均無法顯著減少老鼠梗塞區域(表2)，改善中風老鼠運動能力之效果較差(圖3)。

羅伊氏乳桿菌(L.reuteri)GMNL-89組：管餵低劑量(8.2×10⁷CFU/kg mice)羅伊氏乳桿菌GMNL-89無法降低腦部梗塞區域(表2)；而管餵高劑量(8.2x10⁸CFU/kg mice)之羅伊氏乳桿菌GMNL-89可以顯著減少老鼠腦部梗塞區域(表2，*：P<0.05，與vehicle相比)，運動能力恢復也較佳(圖3)。

副乾酪乳桿菌(L.paracasei)GMNL-133組：管餵低劑量(8.2x10⁷CFU/kg mice)、高劑量(8.2x10⁸CFU/kg mice)之副乾酪乳桿菌GMNL-133可明顯減少老鼠梗塞區域(表2)；管餵高劑量之副乾酪乳桿菌GMNL-133對於改善中風老鼠之運動能力效果較佳(圖3)。

羅伊氏乳桿菌GMNL-89及副乾酪乳桿菌GMNL-133組：以羅伊氏乳桿菌GMNL-89及副乾酪乳桿菌GMNL-133之複合菌株組合進行後續保護中風試驗。結果發現高劑量(8.2x10⁸CFU/kg mice)、低劑量(8.2x10⁷CFU/kg mice)之GMNL-89及GMNL-133複合菌株(1：1)，對減少老鼠梗塞區域及改善中風老鼠之運動能力上，在與相同劑量之單隻菌相比，保護效果都是較佳(表2、圖3)；表示此複合菌株組合的使用具有加成的效果，對於保護大腦對抗缺血再灌流損傷之效果最佳。

不同益生菌分組對於缺血性中風造成的腸道菌相之影響說明如下。

而在腸道菌相的分析結果發現，在造症組老鼠糞便中為擬桿菌門(Bacteroidetes豐富度：76.46%)較高及厚壁菌門(Firmicutes豐富度：23.27%)較少的狀態；而管餵GMNL-89、GMNL-133或複合菌株(GMNL-89+GMNL-133)則能相對降低擬桿菌門且增加厚壁菌門(Firmicutes)(圖4)

由菌門分析結果發現GMNL-89組、GMNL-133組及複合菌株(GMNL-89+GMNL-133)對腸道菌相的調節不完全相同(圖4)；若分析乳桿菌屬(Lactobacillus)豐富度發現，GMNL-89組較高(0.26%)，GMNL-133組則較低(0.18%)，但跟造症組比(0.06%)均有明顯增加的情形(表3)；過去研究發現於缺血性中風發生時相關好菌豐富度降低，而從本實驗菌相分析結果發現，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)及顫螺菌屬(Oscillospira)兩隻好菌，在造症組豐富度是明顯低於三組益生菌組的(表3)，表示管餵GMNL-89、GMNL-133或GMNL-89+GMNL-133可能會經由這兩隻好菌達到保護中風傷害的效果；而分析相關壞菌則無太大變化，可能與實驗前飲用抗生素水有關；由這些結果推論，羅伊氏乳桿菌GMNL-89及副乾酪乳桿菌GMNL-133經調節腸道好菌增加，穩定腸道免疫反應，抑制過度發炎反應因子產生，達到保護缺血性中風症狀的效果。

綜上所述，本發明益生菌組合物可以預防中風及使中風後個體健康狀況改善，包括：1)減少腦部梗塞區域、2)運動能力(如握力)恢復、3)腸道菌相改善，包括好菌瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、顫螺菌屬(Oscillospira)增加；而達成預防中風及改善中風嚴重度的功效。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

【生物材料寄存】

國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】

1.羅伊氏乳桿菌GMNL-89：新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2006年11月14日、寄存編號為BCRC910340。

2.副乾酪乳桿菌GMNL-133：新竹食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心、寄存日期為2010年7月5日、寄存編號為BCRC910520。

國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】

1.羅伊氏乳桿菌GMNL-89：中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2007年11月19日、寄存編號為CCTCC M207154。

2.副乾酪乳桿菌GMNL-133：中國典型培養物保藏中心、寄存日期為2011年9月26日、寄存編號為CCTCC M2011331。

Claims

一種益生菌用於製備預防中風及改善中風嚴重度醫藥組合物之用途，包含向一對象經口投予一每日有效劑量4×10⁸~4×10¹⁰個菌落形成單位(colony forming unit；CFU)體重該益生菌達11天，其中該對象是中風病人，該益生菌選自於由羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-133所組成的群組；其中該羅伊氏乳桿菌GMNL-89之寄存編號為BCRC910340，該副乾酪乳桿菌GMNL-133寄存編號為BCRC910520。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該改善中風是改善缺血性中風。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該改善中風是改善中風造成的腦部梗塞。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該改善中風是改善中風後病人的復原狀況。
如申請專利範圍第4項所述之用途，其中該病人的復原狀況是運動能力。
一種益生菌用於製備改善中風後腸道菌相醫藥組合物之用途，包含向一對象經口投予一每日有效劑量4×10⁸~4×10¹⁰個菌落形成單位(colony forming unit；CFU)該益生菌達11天，該對象是中風病人，該益生菌選自於由羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)GMNL-89、副乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)GMNL-133所組成的群組；其中該羅伊氏乳桿菌GMNL-89之寄存編號為BCRC910340，該副乾酪乳桿菌GMNL-133寄存編號為BCRC910520。
如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該改善中風後腸道菌相是好菌豐富度增加。
如申請專利範圍第6項所述之用途，其中該好菌是瘤胃球菌科 (Ruminococcaceae)或顫螺菌屬(Oscillospira)。