DE60318558T2

DE60318558T2 - Verwendung von lactobacillus farciminis zur prophylaxe oder behandlung von verdauungserkrankungen

Info

Publication number: DE60318558T2
Application number: DE60318558T
Authority: DE
Inventors: Jean Fioramonti; Lionel Bueno; Vassilia Theodorou; Florence Lamine
Original assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Current assignee: Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Priority date: 2002-03-28
Filing date: 2003-03-21
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2023-03-22
Also published as: DK1487466T3; WO2003082307A1; DE60318558D1; FR2837711A1; EP1487466A1; US7294337B2; CA2480387C; AU2003227852A1; FR2837711B1; CA2480387A1; EP1487466B1; ATE383163T1; US7628991B2; ES2299698T3; US20080085268A1; US20050244389A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Milchsäurebakteriums Lactobacillus farciminis zur Verhinderung oder Behandlung von Verdauungskrankheiten („pathologies digestives"), insbesondere funktioneller und/oder entzündlicher Art.
Entzündliche Phänomene sind zu einem mehr oder weniger bedeutenden Grad bei zahlreichen Erkrankungen des Verdauungskanals und insbesondere des Intestinums involviert. Zu diesen Pathologien zählen insbesondere:

– entzündliche chronische intestinale Erkrankungen, die hauptsächlich Morbus Crohn und die hämorrhagische Rektokolitis umfassen, stellen eine Pathologie bzw. Erkrankung mit geringer Verbreitung, aber gleichzeitig in Steigerung begriffen, dar. Diese Krankheiten, die sehr behindernd sind, sind durch entzündliche Schübe variabler Schwere mit Phasen der Remission, die manchmal länger andauern, gekennzeichnet. Die gegenwärtige Therapie basiert vorwiegend auf der Verabreichung von Corticoiden, von 5-ASA (5-Aminosalicylsäure), auf chirurgischen Eingriffen in den schwersten Fällen. Behandlungen mit bestimmten Cytokinen sind vorgeschlagen worden, sind jedoch noch im Versuchsstadium und bleiben kostspielig;
– funktionelle Verdauungsstörungen (TFD), die eine Pathologie mit geringer Morbidität, jedoch hoher Verbreitung darstellen. Der Viszeralschmerz ist das Hauptsymptom, jedoch sind andere Verdauungssymptome (Diarrhöe, Konstipation bzw. Verstopfung oder ein Wechsel von beiden) oder Störungen abseits der Verdauung (Erschöpfung) häufig damit verbunden. Seine Physiopathologie bleibt ungenau (Änderungen der gastrointestinalen Motorik, Implikationen von psychosozialen Faktoren, Folgeerkrankungen der Entzündung des Verdauungstrakts oder des chirurgischen Eingriffs), jedoch ist die schmerzhafte Überempfindlichkeit gegenüber der Ausdehnung der Wand des Verdauungskanals („paroi digestive") ein Hauptmerkmal dieser Pathologie. Die Ursache dieser Überempfindlichkeit ist nicht bekannt, obgleich eine entzündliche Ursache aufgrund der Tatsache der Verlängerung der TFD während mehrerer Monate bei einem großen Anteil von Patienten, die von einer akuten Gastroenteritis befallen sind und durch den Beweis von entzündlichen Folgeerkrankungen (Hyperplasie von Mastzellen) in den Verdauungsschleimhäuten bzw. Schleimhäuten des Verdauungstrakts von Patienten, die TFD aufweisen, angenommen worden ist.

Unterschiedliche Forschergruppen haben die Wirksamkeit von probiotischen Mikroorganismen im Rahmen der Behandlung dieser Erkrankungen des Verdauungskanals beschrieben. Unter der Bezeichnung „Probiotika" fasst man lebende Mikroorganismen verschiedener Familien, Gattungen und Arten zusammen, die, wenn sie in hinreichender Menge eingenommen werden, eine positive Wirkung auf die Gesundheit ausüben, die über herkömmliche nahrungsbedingte Wirkungen hinausgeht.
Untersuchungen, die die Wirksamkeit von Probiotika bei der Behandlung von experimentellen Entzündungen des Verdauungstrakts zeigen, sind in der Folge mit Lactobacillus reuteri (Fabia et al., Scand. J. Gastroenterol., 28, 155–162, 1993; Holma et al., Scand. J. Gastroenterol., 36, 630–635, 2001) und Lactobacillus plantarum (Mao et al., Gastroenterology, 111, 334–344, 1996) durchgeführt worden. Vor kurzem hat eine Untersuchung am Menschen die Wirksamkeit von Saccharomyces boulardii bei der Verhinderung eines Rückfalls von Morbus Crohn gezeigt (Guslandi et al., Dig. Dis. Sci., 45, 1462–1464 2000). Andere Probiotika haben gleichermaßen eine Wirksamkeit bei der Behandlung von hämorrhagischer Rektokolitis gezeigt: Escherichia coli Nissle (Kruis et al., Aliment. Pharmacol. Ther., 11, 853–858, 1997; Rembacken et al., Lancet, 354, 635–639, 1999), eine Assoziation von Stämmen von Bifidobacterium, Lactobacillus und Streptococcus (Venturi et al., Aliment. Pharmacol. Ther., 13, 1103–1108, 1999) und eine Assoziation von Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Lactobacillus acidophilus (Ishikawa et al., Gastroenterology, 118, 4171, 2000).
Was funktionelle Verdauungsstörungen und das Reizdarmsyndrom anbelangt, so sind die Ergebnisse weniger aussagekräftig: Eine Untersuchung hat gezeigt, dass Saccharomyces boulardii die mit funktionellen Verdauungsstörungen zusammenhängende Diarrhöe verringert, die anderen Symptome aber nicht beeinflusst (Maupas et al., Med. Chir. Dig., 12, 77–79, 1983), und eine andere Studie beschreibt die Unwirksamkeit einer Assoziation von Stämmen von Lactobacillus und von Escherichia coli in der Behandlung von nicht-ulzerierender Dyspepsie (Hentschel et al., Gastroenterology, 112 Suppl. 1, A146, 1997); positive Wirkungen von Lactobacillus plantarum auf mehrere Symptome des Reizdarmsyndroms (Flatulenz, Abdominalschmerz) sind beobachtet worden, jedoch sind diese Wirkungen hinsichtlich des Kriteriums des Abdominalschmerzes ähnlich zu denen eines Placebos (Nobaek et al., Am. J. Gastroenterol., 95, 1231–1238, 2000); eine weitere Studie, die drei Symptome des Reizdarmsyndroms betrifft (Schmerz, „Toilettendrang", Blähungen) beschreibt das Fehlen einer Wirkung von Lactobacillus casei CG (O'Sullivan et al., Dig. Liver Dis., 32, 294–301, 2000).
Es scheint folglich, dass die Verwendung von probiotischen Mikroorganismen zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen des Verdauungskanals eine viel versprechende Herangehensweise darstellt, deren Wirksamkeit jedoch variabel zu sein scheint, zugleich in Abhängigkeit von der Art des eingesetzten Mikro organismuses und in Abhängigkeit von der Erkrankung oder dem pathologischen Syndrom, das betroffen ist. Es ist somit wünschenswert, andere Mikroorganismen zu identifizieren, die zu diesem Zweck verwendbar sind, um die Auswahl an therapeutischen Möglichkeiten zu vergrößern.
Die Erfinder haben nun entdeckt, dass Milchsäurebakterien der Art farciminis aus der Gattung Lactobacillus in vivo wirksam waren bezüglich der Entzündung des Verdauungskanals, insbesondere des Dickdarms, sowie hinsichtlich des Viszeralschmerzes. Die Erfinder haben festgestellt, dass die antiinflammatorische Aktivität von Lactobacillus farciminis an der Insitu-Produktion, unter dem digestiven Aspekt, von Stickstoffmonoxid (NO) durch dieses Bakterium liegt.
Lactobacillus farciminis gehört zur Gruppe I (strikt homofermentativ) der Gattung Lactobacillus. Sie wird häufig in verschiedenen Nahrungsmitteln, wie Fleischprodukten, insbesondere Würsten, und dem Sauerteig der Brotherstellung (De Roissard und Luquet, Bactéries lactiques, Bd. I: Aspects fondamentaux et technologiques, Lorica, 1998) angetroffen. Die Produktion von Stickstoffmonoxid in Kultur durch Lactobacillus farciminis ist von Wolf et al., Int. J. Food Microbiol., 10, 323–329, 1990 beschrieben worden.
Eine potentielle Rolle von Stickstoffmonoxid bei der Regulation von Verdauungsfunktionen und/oder beim Schutz der Verdauungsmucosa ist durch verschiedene Beobachtungen nahegelegt worden. Man weiß, dass bestimmte Zellen des Darmepithels Stickstoffmonoxid produzieren können, und zwar nach Induktion durch bestimmte proinflammatorische Cytokine und/oder durch Lipopolysaccharid (LPS)-Toxine von enteroinvasiven Bakterien (Witthoft et al., Am. J. Physiol., 275, G564–571, 1998). Das endogene Stickstoffmonoxid sei, aufgrund seiner antimikro biellen Eigenschaften, an der Abwehr von pathogenen Mikroorganismen beteiligt. Es würde gleichermaßen, wenn es in geringen Mengen produziert wird, am Schutz der Darmmucosa beteiligt sein. In bedeutenderen Mengen würde es jedoch zur Entwicklung und zur Aufrechterhaltung eines chronischen Entzündungszustandes beitragen (Alican und Kubes, Am. J. Physiol. 270, G225–237, 1996; Tepperman et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 271, 1477–1482, 1994).
Was das exogene Stickstoffmonoxid (d. h. aus der Nahrung oder einer medikamentösen Verabreichung stammend) anbelangt, sind die beobachteten Wirkungen gleichermaßen widersprüchlich; eine vorrübergehende Schutzwirkung von NO-Donoren hinsichtlich Läsionen, die durch Ethanol an der Magenmucosa bzw. Magenschleimhaut induziert wurden, ist beobachtet worden (Mac Naughton et al., Life Sci., 45, 1869–1876, 1989), ebenso wie eine Schutzwirkung hinsichtlich Läsionen, die durch Salzsäure induziert wurden (Kitagawa et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 253, 1133–1137, 1990). Andere Arbeiten haben gezeigt, dass die lokale intraarterielle Perfusion von NO-Donoren variable Wirkungen hinsichtlich hämorrhagischer Veränderungen der Magenschleimhaut induzieren kann: Eine Schutzwirkung, ein Fehlen von Wirkung oder eine schädliche Wirkung können beobachtet werden, abhängig von der Natur des NO-Donors und der eingesetzten Dosis (Lopez-Belmonte et al., Br. J. Pharmacol., 108, 73–78, 1993).
Gegenwärtig kennt man einige probiotische Mikroorganismen, deren Wirkungen anscheinend zumindest teilweise auf einem Einfluss auf die endogene Produktion von NO basieren. Die PCT-Patentanmeldung WO 00/28943 zeigt, dass bestimmte Milchsäurebakterienstämme und insbesondere Stämme von Lactobacillus casei eine antientzündliche Wirkung haben können, indem sie die Produktion von Stickstoffmonoxid durch die Enterozyten, die durch proinflammatorische Cytokine stimuliert wer den, steigern und indem sie im Gegensatz dazu die Produktion von Stickstoffmonoxid durch die Enterozyten, die durch proinflammatorische Cytokine und bakterielle Lipopolysaccharide aktiviert werden, verringern. Korhonen et al. (Inflammation, 25, 223–232, 2001) zeigen, dass der Stamm GG von Lactobacillus rhamnosus, der hinsichtlich viraler oder durch Antibiotika induzierter Diarrhöen wirksam ist, die Produktion von Stickstoffmonoxid durch Darmepithelzellen oder Makrophagen, die durch proinflammatorische Cytokine aktiviert werden, steigern kann und sie weisen darauf hin, dass diese Wirkung auf die Produktion von NO an der Aktivität von Lactobacillus rhamnosus beteiligt sein könnte.
Die etwaigen probiotischen Wirkungen von Mikroorganismen, die direkt Produzenten von Stickstoffmonoxid sind, sind nur wenig untersucht worden. Die PCT-Patentanmeldung WO 98/27991 schlägt die Verwendung von Bakterien der Gattung Propionobacter, die Stickstoffmonoxid produzieren, zum Erhalt einer Zusammensetzung vor, die physiologisch bedeutsame Mengen an NO im Verdauungskanal produziert, und beschreibt eine Wirkung dieser Zusammensetzung auf die intestinale Motorik. Die Druckschrift nennt gleichermaßen Lactobacillus farciminis, jedoch um dessen Verwendung auf der Grundlage von experimentellen Versuchen in Kultur auszuschließen, wobei gefolgert wird, dass die durch L. farciminis produzierte Menge an NO zu gering ist, um bedeutsam zu sein.
Im Gegensatz zu dem, was in der PCT-Patentanmeldung WO 98/27991 angegeben wurde, haben die bezeichneten Erfinder nun bewiesen, dass L. farciminis im Verdauungskanal eine Menge an Stickstoffmonoxid produziert, die es ihm erlaubt, eine therapeutische Wirkung, insbesondere eine antientzündliche Wirkung, und eine Wirkung auf den Schmerz, der mit der Ausdehnung von Eingeweiden verbunden ist, auszuüben.
Die vorliegende Erfindung hat die Verwendung eines Milchsäurebakteriums der Art Lactobacillus farciminis zur Herstellung bzw. zum Erhalt einer Zusammensetzung, die zur Behandlung oder zur Verhinderung von Erkrankungen des Verdauungskanals bestimmt ist, zum Gegenstand.
Der Typstamm von L. farciminis, der im Rahmen der Versuche, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, verwendet wurde, ist an sich bekannt und über unterschiedliche Sammlungen zugänglich; Bezugnahmen auf ihn erfolgen zum Beispiel unter den folgenden Eingangsnummern: CIP-103136T, ATCC 29644, DSM 20184, JCM 1097, LMG 9200, NCDO 2330, NCIB 11717, IMET 11462. Zur Ausführung der vorliegenden Erfindung kann man gleichermaßen Stämme von L. farciminis verwenden, die ausgehend von Lebensmitteln, die dieses Bakterium enthalten, isoliert wurden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die genannte Zusammensetzung zur Behandlung von akuten oder chronischen entzündlichen Erkrankungen des Verdauungskanals und insbesondere des Intestinums bestimmt.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die besagte Zusammensetzung zur Behandlung oder zur Verhinderung von Viszeralschmerz bestimmt.
Als Beispiele für Erkrankungen, zu deren Behandlung die vorliegende Erfindung ausgeführt werden kann, kann man Colitis-Formen, Enteritis-Formen, Morbus Crohn, hämorrhagische Rektokolitis, funktionelle Verdauungsstörungen (Reizdarmsyndrom und nicht-ulzerierende Dyspepsie) usw. nennen.
Vorzugsweise ist die genannte Zusammensetzung zur Verabreichung auf dem oralen Weg bestimmt.
Sie kann einen Stamm oder mehrere Stämme von L. farciminis in jeglicher Formulierung umfassen, die es erlaubt, diese Bakterien lebensfähig zu konservieren, und zwar während der verschiedenen Etappen ihrer Konditionierung bzw. Aufbereitung und ihrer Lagerung und nach ihrer Einnahme bis zu ihrem Wirkort im Verdauungskanal.
Sie kann gleichermaßen andere Milchsäurebakterien umfassen, die probiotische Eigenschaften besitzen oder nicht, zum Beispiel Bakterien, wie Laktobazillen, Laktokokken, Streptokokken und Bifidobakterien, und/oder andere probiotische Mikroorganismen, wie Hefen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können die Zusammensetzungen, die L. farciminis umfassen, in Form von Nahrungsmitteln verabreicht werden. Es kann sich dabei zum Beispiel um fermentierte Produkte, wie Milch- bzw. Molkereiprodukte, handeln; in diesem Fall kann L. farciminis Teil der Starterkultur sein, die zur Herstellung dieser Produkte verwendet wird, oder kann diesen nach der Fermentation zugesetzt werden. Sie können gleichermaßen in Form von Nahrungsergänzungsmitteln, die in die Nahrung einzuarbeiten sind oder direkt einzunehmen sind, verabreicht werden. Vorteilhafterweise können sie in Form von Einzeldosen aufbereitet bzw. konditioniert werden, die die gewünschte Menge an L. farciminis einschließen.
Zur Ausführung der vorliegenden Erfindung wird L. farciminis vorzugsweise in einem Umfang von wenigstens 10⁶ KbE (koloniebildende Einheiten)/Tag, vorteilhafterweise wenigstens 10⁸ KbE/Tag und in besonders bevorzugter Weise wenigstens 10¹⁰ KbE/Tag in einer oder mehreren Einnahmen verabreicht.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der Ergänzung der Beschreibung, die folgen wird, besser verstanden werden, wobei sich diese auf nicht-einschränkende Beispiele bezieht, die die Eigenschaften eines Stammes von Lactobacillus farciminis hinsichtlich einer den Dickdarm betreffenden Entzündung und der Viszeralschmerzen bei der Ausdehnung erläutern.
BEISPIEL 1: WIRKUNG EINER BEHANDLUNG MIT LACTOBACILLUS FARCIMINIS AUF EINE DEN DICKDARM BETREFFENDE ENTZÜNDUNG, DIE DURCH TNBS/ETHANOL INDUZIERT WURDE: ROLLE VON STICKSTOFFMONOXID (NO)
Eine den Dickdarm betreffende Entzündung (oder Kolitis) kann experimentell mit Hilfe von Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), die das gängigste und am besten validierte Modell einer experimentellen Dickdarmentzündung darstellt (Morris et al., Gastroenterology, 96, 795–803, 1989), induziert werden.
Diese Kolitis ist gekennzeichnet durch eine Erhöhung der Aktivität von Myeloperoxidase (MPO), ein Marker für den Grad der Infiltration von polynukleären Neutrophilen in die Dickdarmmucosa, wie auch durch die Erhöhung der makroskopischen Läsionsbewertung (SLM), wobei die Schwere und das Ausmaß makroskopischer aufgetretener Läsionen erfasst werden, das Vorhandensein und die Schwere von Adhäsionen bzw. Adhärenzen („adherences") und das Vorhandensein oder nicht von Diarrhöe im Dickdarm bzw. Kolon.
Die Wirkungen einer Behandlung mit einem Stickstoffmonoxid-Donor, Natriumnitroprussid (SNP), oder mit L. farciminis auf eine mit TNBS induzierte Kolitis bei der Ratte sind verglichen worden. Außerdem ist die effektive Rolle des exogenen Stickstoffmonoxids in diesen Wirkungen bewertet worden, indem ein NO-Fänger, Hämoglobin (Hb), eingesetzt wurde.
Zur Untersuchung der Wirkungen von SNP wurden sieben Gruppen von WISTAR-Ratten mit einem Gewicht von 200–250 Gramm unter Anästhesie mit einem intrakolischen Katheter (+2 cm vom Übergang von Blinddarm zu Dickdarm) versehen, der auf der Höhe des dorsoskapulären Bereichs nach außen geführt wurde. Am Tag +5 („J + 5") erhielten die Ratten eine intrakolische Instillation von 80 mg/kg/Tag TNBS/Ethanol (Gruppen 4–7) oder einer 0,9%-igen NaCl-Lösung (Gruppen 1–3). Vier Stunden nach der Instillation werden die Ratten mit einer Durchflussrate von 250 μl/Stunde perfundiert mit 1 mg/kg/Tag SNP (Gruppen 2 und 5) oder mit 200 mg/kg/Tag Hb (Gruppen 3 und 7) oder einem Gemisch von SNP + Hb (Gruppe 6) oder einer 0,9%-igen NaCl-Lösung (Gruppen 1 und 4) während vier Tagen.
Zur Untersuchung der Wirkungen von L. farciminis erhalten fünf Gruppen von zehn männlichen WISTAR-Ratten mit einem Gewicht von 200–250 Gramm auf oralem Wege 10¹² KbE/Tag an L. farciminis (Gruppen 2, 4, 5) oder eine 0,9%-ige NaCl-Lösung (Gruppen 1, 3) während 19 Tagen. Am Tag +10 werden die Ratten mit einen intrakolischen Katheter ausgestattet, wie es vorstehend beschrieben ist. Am Tag +15 erhalten die Ratten auf intrakolischem Wege 80 mg/kg TNBS/Ethanol (Gruppen 3–5) oder 0,9%-ige NaCl-Lösung (Gruppen 1, 2). Vier Stunden nach der Instillation erhalten die Ratten eine intrakolische Perfusion von Hb mit 200 mg/kg/Tag (Gruppe 5) oder einer 0,9%-igen NaCl-Lösung (Gruppen 1–4) während vier Tagen.
Am Tag +19 werden alle Ratten getötet und die Intensität der Entzündung der Dickdarmwand wird anhand der Aktivität der Myeloperoxidase (MPO) und der makroskopischen Läsionsbewertung (SLM) an isolierten Dickdarmproben charakterisiert.
I – Aktivität der Myeloperoxidase (MPO)
Die Aktivität der Myeloperoxidase (MPO) wird an isolierten Dickdarmproben gemäß dem von Bradley et al. (J. Invest. Dermatol., 78, 206–209, 1982) beschriebenen Protokoll bestimmt.
Das Protokoll kann wie folgt zusammengefasst werden:
Dickdarmabschnitte (1 cm lang) werden in Phosphatpuffer (50 mM, pH 6) eingetaucht. Nach mechanischer Lyse auf Eis mit Hilfe eines Homogenisators vom Typ POLYTRON werden drei Zyklen von Gefrieren (flüssiger Stickstoff, 1 min) und Auftauen (Wasserbad, 37°C, 10 min) durchgeführt. Nach Zentrifugation (10.000 UpM, 15 min, 4°C) wird das Sediment in 0,5%-igem Hexadecyltrimethylammoniumbromid (HTAB) aufgenommen. Die Proben werden anschließend (ultra-)schallbehandelt, bevor sie einer erneuten Zentrifugation unterworfen werden. Der Überstand wird zur Bestimmung der MPO-Aktivität und der Gesamtproteine abgenommen.
Die MPO-Aktivität wird mittels Spektralphotometrie bestimmt. Die Probe wird mit Phosphatpuffer, der O-Dianisidin-Dihydrochlorid (0,167 mg/ml) und 0,0005% Wasserstoffperoxid enthält, versetzt. Die Absorptionsänderungen (450 nm, 25°C) werden mittels kinetischer Spektralphotometrie über zwei Minuten bestimmt, und zwar nach der Bilanzgleichung der von MPO katalysierten Enzymreaktion: H₂O₂ + Cl^– = H₂O + HOCl (Bildung einer orangefarbenen Farbe), wobei die Angabe in MPO-Einheiten erfolgt.
Eine MPO-Aktivitätseinheit ist definiert als die Menge an MPO, die 1 μmol Wasserstoffperoxid pro Minute pro Milliliter bei 25°C abbaut. Die Konzentration an Proteinen (Gramm/ml) wird mit Hilfe im Handel erhältlichen Kits (Detergent Compatible Assay, Bio Rad, Ivry/Seine, Frankreich) bestimmt. Die MPO-Aktivität wird in Form von MPO-Einheiten pro Gramm Proteine (U MPO/g Proteine) angegeben.
1) Behandlung mit SNP
Die Ergebnisse sind in 1 wiedergegeben.
Legende zu 1:
Auf der Abszisse

= nicht behandelte Ratten (Gruppe 1)
= mit SNP behandelte Ratten (Gruppe 2)
= mit Hb behandelte Ratten (Gruppe 3)
= mit TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 4)
= mit TNBS/Ethanol + SNP behandelte Ratten (Gruppe 5)
= mit TNBS/Ethanol + SNP + Hb behandelte Ratten (Gruppe 6)
= mit TNBS/Ethanol + Hb behandelte Ratten (Gruppe 7)

Auf der Ordonate = MPO-Aktivität (U MPO/g Proteine)

*: signifikant verschieden (P < 0,01) von der Kontrollgruppe (Gruppe 1)
+: signifikant verschieden (P < 0,01) von der TNBS/Ethanol-Gruppe (Gruppe 4)

Die MPO-Aktivität (in) der Dickdarmwand bei den Kontrollratten (Gruppe 1) und denen, die mit SNP (Gruppe 2) oder Hb (Gruppe 3) behandelt wurden, beträgt bei fehlender Instillation von TNBS/Ethanol jeweils 263 ± 103; 351 ± 88; 426 ± 117 U MPO/g Proteine. Diese Werte sind untereinander nicht signifikant verschieden. Die Instillation von TNBS/Ethanol (Gruppe 4) steigert die MPO-Aktivität auf signifikante Weise im Verhältnis zu Kontrollratten (5346 ± 714 U MPO/g Proteine). Die Perfusion von SNP bei den Ratten, denen TNBS/Ethanol instilliert wurde (Gruppe 5), verringert die MPO-Aktivität (2619 ± 447 U MPO/g Proteine) signifikant im Verhältnis zu Ratten, die lediglich eine Instillation von TNBS/Ethanol erhal ten hatten. Die gleichzeitige Perfusion von SNP und Hb bei Ratten, denen TNBS/Ethanol instilliert wurde (Gruppe 6), hebt die durch SNP induzierte Verringerung der MPO-Aktivität (4710 ± 645 U MPO/g Proteine) auf, wobei kein signifikanter Unterschied im Verhältnis zu Ratten auftritt, denen TNBS/Ethanol instilliert wurde (Gruppe 4; 5346 ± 714 U MPO/g Proteine).
2) Behandlung mit L. farciminis
Die Ergebnisse sind in 2 dargelegt.
Legende zu 2:
Auf der Abszisse

= nicht behandelte Ratten (Gruppe 1)
= mit L. farciminis behandelte Ratten (Gruppe 2)
= mit TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 3)
= mit L. farciminis + TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 4)
= mit L. farciminis + TNBS/Ethanol + Hb behandelte Ratten (Gruppe 5)

Auf der Ordonate = MPO-Aktivität (U MPO/g Proteine)

*: signifikant verschieden (P < 0,01) von der Kontrollgruppe (Gruppe 1)
+: signifikant verschieden (P < 0,01) von der TNBS/Ethanol-Gruppe (Gruppe 3)

Die nicht behandelten Kontrollratten (Gruppe 1) weisen eine MPO-Aktivität von 237 ± 53 U MPO/g Proteine auf.
Die Instillation von TNBS/Ethanol induziert eine Dickdarmentzündung, die durch eine Steigerung der MPO-Aktivität gekennzeichnet ist (Gruppe 3; 3400 ± 395 U MPO/g Proteine). Die Behandlung mit L. farciminis hat keine Wirkung auf die MPO- Aktivität bei Ratten, denen die Kochsalzlösung instilliert wurde (Gruppe 2; 256 ± 31 U MPO/g Proteine). Bei den Ratten, denen TNBS/Ethanol instilliert wurde, verringert die Behandlung mit L. farciminis im Gegensatz dazu die MPO-Aktivität auf signifikante Weise (Gruppe 4; 905 ± 211 U MPO/g Proteine).
Die Perfusion mit Hämoglobin hebt die Verringerung der Entzündung durch L. farciminis bei den Ratten auf, denen TNBS/Ethanol instilliert wurde (Gruppe 5; 2246 ± 566 U MPO/g Proteine).
II – Makroskopische Läsionsbewertung (SLM)

Die makroskopische Läsionsbewertung (SLM) wird anhand von isolierten Dickdarmproben, wie von Wallace et al. (Gastroenterology, 102, 18–27, 1992) beschrieben, gemäß der unten stehenden Bewertungstabelle bestimmt:

Parameter	Bewertung
Ulzeration
normales Erscheinungsbild	0
fokale Hyperämie ohne Ulzeration	1
Ulzeration ohne Hyperämie oder Verdickung der
Mucosa	2
Ulzeration an einer Entzündungsstelle	3
Ulzeration an zwei oder mehr Stellen	4
mehrere Entzündungsstellen auf mehr als 1 cm	5
Entzündungsbereich > 2 cm, die Bewertung wird bei jedem ulzerierten cm um 1 erhöht	6–10
Adhäsion
keine Adhärenz	0
leichte Adhärenz	1
starke Adhärenz	2
Diarrhöe
nein	0
ja	1
Gesamtbewertung

1) Behandlung mit SNP
Die Ergebnisse sind in 3 dargelegt.
Legende zu 3:
Auf der Abszisse

= mit TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 4)
= mit TNBS/Ethanol + SNP behandelte Ratten (Gruppe 5)
= mit TNBS/Ethanol + SNP + Hb behandelte Ratten (Gruppe 6)
= mit TNBS/Ethanol + Hb behandelte Ratten (Gruppe 7)

Auf der Ordonate = makroskopische Läsionsbewertung

*: signifikant verschieden (P < 0,01) von der Kontrollgruppe (Gruppen 1–3)

Vier Tage nach der Instillation von TNBS/Ethanol ist die Dickdarmmucosa gekennzeichnet durch einen erhebliche Ulzeration, assoziiert mit einer gleichmäßigen Entzündung und einer Wanddicke, entsprechend einer SLM von 6,9 ± 1,7 (Gruppe 4). Die tägliche Behandlung mit SNP verringert das Ausmaß der Dickdarmläsion auf signifikante Weise, wobei die SLM auf 2,5 ± 0,6 (Gruppe 5) verringert wird, während die tägliche Behandlung mit SNP + Hb und Hb alleine mit SLM-Werten von 5,0 ± 1,1 (Gruppe 6) bzw. 5,8 ± 1,3 (Gruppe 7) keine Auswirkung auf diesen Parameter hat.
2) Behandlung mit Lactobacillus farciminis
Die Ergebnisse sind in 4 dargelegt.
Legende zu 4:
Auf der Abszisse

= mit TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 3)
= mit L. farciminis + TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 4)
= mit L. farciminis + TNBS/Ethanol + Hb behandelte Ratten (Gruppe 5)

Auf der Ordonate = makroskopische Läsionsbewertungen

*: signifikant verschieden (P < 0,01) von der Kontrollgruppe (Gruppen 1 und 2)

Verglichen mit Kontrollratten, die als frei von makroskopischen Läsionen angesehen wurden (Gruppen 1 und 2), induziert TNBS/Ethanol eine Dickdarmentzündung, die durch makroskopische Läsionen gekennzeichnet ist (Gruppe 3; 5,7 ± 0,7). Bei den Ratten, denen TNBS/Ethanol instilliert wurde, verringert die Behandlung mit L. farciminis die Läsionsbewertung auf hochsignifikante Weise (Gruppe 4; 2,6 ± 0,4). Diese Wirkung tritt nicht auf, wenn die Behandlung mit L. farciminis begleitet wird von einer intrakolischen Perfusion von Hb (Gruppe 5; 4,6 ± 0,5).
III – Schlussfolgerung
Die orale Verabreichung von L. farciminis verringert die Aktivität von Myeloperoxidase und die Läsionsbewertung auf eine Weise, die einer Behandlung mit SNP ähnelt, bei Ratten, die mit TNBS/Ethanol behandelt wurden.
Diese entzündungshemmenden Wirkungen werden von der Verabreichung einer intrakolischen Perfusion von Hämoglobin aufgehoben, was zeigt, dass sie die Produktion von NO ins Spiel bringen.
BEISPIEL 2: HEILSAME WIRKUNG VON LACTOBACILLUS FARCIMINIS AUF EINE DICKDARMENTZÜNDUNG DURCH TNBS/ETHANOL
Die Wirkungen einer Heilbehandlung mit L. farciminis, beginnend im Moment der Induktion einer Dickdarmentzündung durch TNBS/Ethanol, sind untersucht worden.
Vier Gruppen von zehn männlichen WISTAR-Ratten mit einem Gewicht von 200–250 Gramm werden unter Anästhesie mit einem intrakolischen Katheter ausgestattet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Am Tag +5 erhalten die Ratten auf intrakolischem Wege eine Instillation von 80 mg/kg TNBS/Ethanol (Gruppen 1 und 2) oder einer 0,9%-igen NaCl-Lösung (Gruppen 3 und 4).
Die Behandlung mit L. farciminis beginnt vier Stunden nach der Induktion der Entzündung. Die Ratten erhalten auf oralem Weg 10¹² KbE/Tag Lactobacillus farciminis (Gruppen 1 und 3) oder eine 0,9%-ige NaCl-Lösung (Gruppen 2 und 4) während vier Tagen.
Am Tag +4 werden die Ratten getötet und die Intensität der Entzündung der Dickdarmwand wird anhand der Aktivität von Myeloperoxidase (MPO) an isolierten Dickdarmproben charakterisiert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt.
Legende zu 5:
Auf der Abszisse

= nicht behandelte Ratten (Gruppe 4)
= mit L. farciminis behandelte Ratten (Gruppe 3)
= mit TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 2)
= mit L. farciminis + TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 1)

Auf der Ordonate = MPO-Aktivität (U MPO/g Proteine)

*: signifikant verschieden (P < 0,01) von der Kontrollgruppe (Gruppe 4)
+: signifikant verschieden (P < 0,01) von der TNBS/Ethanol-Gruppe (Gruppe 2)

Die Aktivität der Myeloperoxidase wird bei den mit TNBS/Ethanol behandelten Ratten (Gruppe 2; 8184 ± 1946 U MPO/g Proteine) stark erhöht im Verhältnis zu Kontrollratten, die nicht behandelt wurden (Gruppe 4; 76 ± 16 U MPO/g Proteine). Die Behandlung mit L. farciminis steigert die MPO-Aktivität bei Ratten, denen eine Kochsalzlösung instilliert wurde, nicht (Gruppe 3; 128 ± 48 U MPO/g Proteine). Im Gegensatz dazu verringert die Behandlung mit L. farciminis von Ratten, denen TNBS/Ethanol instilliert wurde (Gruppe 1; 584 ± 299 U MPO/g Proteine), die Aktivität der Myeloperoxidase auf hochsignifikante Weise.
BEISPIEL 3: WIRKUNG EINER BEHANDLUNG MIT LACTOBACILLUS FARCIMINIS AUF DEN SCHMERZ BEI KOLOREKTALER AUSDEHNUNG BZW. KOLOREKTALER DISTENSION
Die Wirkungen einer Behandlung mit L. farciminis hinsichtlich des Viszeralschmerzes, der durch eine kolorektale Ausdehnung induziert wird, sind untersucht worden. Diese Untersuchung ist durchgeführt worden an gesunden Ratten (Grundzustände) oder Ratten im Zustand der Hyperalgesie, induziert durch eine Dickdarmentzündung (Entzündungszustände), oder von Spannungsstress (Stresszustände). Der Schmerz bei der Ausdehnung manifestiert sich durch die Steigerung der Anzahl von Kontraktionen der Abdominalmuskeln (Morteau et al., Dig. Dis. Sci., 39, 1239–1248, 1994).
Während 21 Tagen erhielten sieben Gruppen von zehn männlichen WISTAR-Ratten mit einem Gewicht von 200–250 Gramm auf oralem Weg 10¹² KbE/Tag an Lactobacillus farciminis (Gruppen 2, 4 und 7) oder eine 0,9%-ige NaCl-Lösung (Gruppen 1, 3, 5 und 6).
Am Tag +7 werden die Ratten unter Anästhesie mit einem intrakolischen Katheter (+2 cm von Übergang Blinddarm zu Dickdarm) ausgestattet und drei Gruppen von drei Elektroden aus NiCr werden auf jeder Seite des Musculus obliquus externus abdominis gerade oberhalb des Leistenbandes implantiert. Der Katheter und die Elektroden sind von außen auf der Höhe der dorsoskapulären Region zugänglich und sind durch ein Glasröhrchen, das auf der Haut fixiert ist, geschützt.
I – Wirkung einer Behandlung mit L. farciminis in Grundzuständen
Am Tag +15 wird eine kolorektale Ausdehnung mit Hilfe eines auf dem rektalen Weg eingeführten Ballons, 5 cm vom Anus und am Schwanz des Tieres fixiert, realisiert. Der Ballon wird allmählich von 0 bis 60 mm Hg in Schritten von 15 mm Hg aufgeblasen, wobei jeder Schritt fünf Minuten dauert. Die Kontraktionen des Abdominalmuskels werden mit einem Elektroenzephalographen aufgezeichnet, um die viszerale Empfindlichkeit sichtbar zu machen. Die Ergebnisse sind in 6 dargelegt.
Legende zu 6:
Auf der Abszisse = Druck der Ausdehnung (mm Hg)
Auf der Ordonate = Zahl abdominaler Krämpfe/5 min

*: signifikant verschieden (P < 0,05) von der Kontrollgruppe (Gruppe 1)

Eingesetzte Gruppen von Ratten:

♦ = nicht behandelte Ratten (Gruppe 1)
☐ = mit L. farciminis behandelte Ratten (Gruppe 2)

Die allmähliche bzw. progressive kolorektale Ausdehnung steigert die Anzahl der Kontraktionen des Abdominalmuskels als Funktion des Volumens der Ausdehnung, ob die Ratten mit L. farciminis (Gruppe 2) behandelt wurden oder nicht (Gruppe 1).
Unabhängig vom Volumen der Ausdehnung ist jedoch die Anzahl der Kontraktionen des Abdominalmuskels bei den Ratten, die mit L. farciminis behandelt wurden (Gruppe 2) verringert im Verhältnis zu Ratten, die nicht behandelt wurden (Gruppe 1).
II – Wirkung einer Behandlung mit L. farciminis in Entzündungszuständen
Am Tag +17 erhielten die Ratten die intrakolische Instillation von 80 mg/kg TNBS/Ethanol (Gruppen 3 und 4) oder einer 0,9%-igen NaCl-Lösung (Gruppe 1).
Am Tag +21, d. h. vier Tage nach der intrakolischen Instillation, wird ein neuer Durchgang von kolorektalen Ausdehnungen realisiert, wie es oben beschrieben ist. Die Kontraktionen des Abdominalmuskels werden mit einem Elektroenzephalographen aufgezeichnet, um die viszerale Empfindlichkeit sichtbar zu machen. Die Ergebnisse sind in 7 dargelegt.
Legende zu 7:
Auf der Abszisse = Druck der Ausdehnung (mm Hg)
Auf der Ordonate = Anzahl von Abdominalkrämpfen/5 min

*: signifikant verschieden (P < 0,05) von der Kontrollgruppe (Gruppen 1 und 3)

Gruppen eingesetzter Ratten:

♦ = nicht behandelte Ratten (Gruppe 1)
☐ = mit TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 3)
= mit L. farciminis + TNBS/Ethanol behandelte Ratten (Gruppe 4)

Die Anzahl der Kontraktionen des Abdominalmuskels ist auf signifikante Weise vier Tage nach der Instillation von TNBS/Ethanol bei den nicht mit L. farciminis behandelten Ratten (Gruppe 3) im Verhältnis zu Kontrollratten (Gruppe 1) erhöht. Die Anzahl der Kontraktionen des Abdominalmuskels ist auf signifikante Weise vier Tage nach der Instillation von TNBS/Ethanol bei Ratten, die mit L. farciminis behandelt wurden (Gruppe 4), verringert, im Verhältnis zu Ratten, die TNBS/Ethanol erhalten hatten, aber nicht mit L. farciminis behandelt wurden (Gruppe 3), und sie ist nicht signifikant verschieden von der von Kontrollratten (Gruppe 1).
III – Wirkung einer Behandlung mit L. farciminis unter Stresszuständen
Am Tag +15 werden die Ratten einem Spannungsstress unterworfen (Gruppen 6 und 7). Unter leichter Anästhesie mit Ether wird der Torax und werden die vorderen Gliedmaßen der Ratten mit Klebeband umfangen, so dass ihre Bewegungen eingeschränkt sind. Sie werden während zwei Stunden in dieser Position gehalten. Die Kontrolltiere wurden nur einer Anästhesie mit Ether unterworfen (Gruppe 5).
20 Minuten nach dem Spannungsstress wird ein Durchgang von kolorektalen Ausdehnungen realisiert, wie es oben beschrieben ist. Die Kontraktionen des Abdominalmuskels werden mit einem Elektroenzephalographen aufgezeichnet, um die viszerale Empfindlichkeit sichtbar zu machen. Die Ergebnisse sind in 8 dargelegt.
Legende zu 8:
Auf der Abszisse = Druck der Ausdehnung (mm Hg)
Auf der Ordonate = Anzahl von abdominalen Krämpfen/5 min

*: signifikant verschieden (P < 0,05) von der Kontrollgruppe (Gruppe 5)

Gruppen verwendeter Ratten:

♦ = nicht behandelte und nicht gestresste Kontrolratten (Gruppe 5)
☐ = nicht behandelte und gestresste Ratten (Gruppe 6)
= mit L. farciminis behandelte und gestresste Ratten (Gruppe 7)

Die Anzahl an abdominalen Kontraktionen, die kolorektalen Ausdehnungen von 45 und 60 mm Hg entspricht, ist nach Stress bei den nicht mit L. farciminis behandelten Ratten (Gruppe 6) auf signifikante Weise erhöht, im Verhältnis zu Kontrollratten (Gruppe 5). Bei Drücken von 45 und 60 mm Hg ist die Anzahl an abdominalen Kontraktionen bei den mit L. farciminis behandelten und gestressten Ratten (Gruppe 7) signifikant verringert im Verhältnis zu Tieren, die nicht behandelt und gestresst wurden (Gruppe 6), und sie ist nicht signifikant verschieden von der von Kontrolltieren, die nicht behandelt und nicht gestresst wurden (Gruppe 5).
IV – Schlussfolgerung
Diese Ergebnisse zeigen, dass eine Behandlung mit L. farciminis in Grundzuständen oder Zuständen einer Hyperalgesie, die durch eine Dickdarmentzündung induziert wurde, oder von Spannungsstress die Anzahl an Kontraktionen der Abdominalmuskel verringert, was auf eine Verringerung des Eingeweideschmerzes hinweist.

Claims

Verwendung von Milchsäurebakterien der Art Lactobacillus farciminis zur Herstellung einer Zusammensetzung, die zur Behandlung oder Verhinderung einer Erkrankung des Verdauungskanals bestimmt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkrankung eine akute oder chronische entzündliche Erkrankung des Intestinums ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Erkrankung durch viszerale Schmerzen manifestiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in Form eines Nahrungsmittels oder eines Nahrungsergänzungsmittels ist.
Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen des Verdauungskanals, dadurch gekennzeichnet, dass sie Milchsäurebakterien der Art L. farciminis umfasst.