IT201600108581A1 - NUOVE E PIU' POTENTI MOLECOLE PER IL TRATTAMENTO E LA DIAGNOSI DI TUMORI NEUROENDOCRINI (NETs) E DELLE CELLULE STAMINALI DEI NETs - Google Patents
NUOVE E PIU' POTENTI MOLECOLE PER IL TRATTAMENTO E LA DIAGNOSI DI TUMORI NEUROENDOCRINI (NETs) E DELLE CELLULE STAMINALI DEI NETsInfo
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Description
"NUOVE E PIÙ POTENTI MOLECOLE PER IL TRATTAMENTO E LA DIAGNOSI DI TUMORI NEUROENDOCRINI (NETs) E DELLE CELLULE STAMINALI DEI NETs"
CAMPO DI APPLICAZIONE
Le forme di realizzazione della presente divulgazione riguardano il campo farmaceutico, in particolare le medicine, i medicinali o i farmaci per il trattamento e la diagnosi terapeutica del cancro, in particolare dei Tumori Neuroendocrini (NETs) e delle cellule staminali NETs. In particolare, forme di realizzazione della presente divulgazione riguardano la fornitura di coniugati analoghi della dopamina per l’erogazione del farmaco glicinato della criptofìcina alle NETs. I profarmaci sono metabolizzati e attivati dagli enzimi endogeni per fornire farmaci attivi per il trattamento del cancro e la diagnosi di popolazioni di cellule del cancro e cellule del cancro staminali multi-resistenti ai farmaci.
STATO DELLA TECNICA
I Tumori Neuroendocrine (NETs) generalmente esprimo alti livelli del Recettore 2 della Dopamina (DR2). (Srirajaskanthan R et al., 2009; Grossrubatscher E et al., 2008; Diakatou E et al., 2015; Gatto F and Hofland LJ, 2011 ). Le Cellule Staminali del Cancro (CSCs) proliferano lentamente, sono multi-resistenti ai farmaci e sono una popolazione di cellule difficili da bersagliare tramite la chemioterapia convenzionale. Questi tipi di cellule possono causare la recidiva di tumori e metastasi dopo la chemioterapia convenzionale.
Perciò c’è una necessità di fornire nuove e più potenti molecole per il trattamento e la diagnosi del cancro, e in particolare dei Tumori Neuroendocrini (NETs) e delle cellule staminali dei NETs, che superino almeno uno degli svantaggi presenti nel campo.
I vari limiti e gli svantaggi delle convenzionali soluzioni e tecnologie saranno evidenti ad un esperto nel campo dopo aver revisionato il restante della presente domanda con riferimento ai disegni ed alle descrizioni delle forme di realizzazione che seguono, anche se si dovrebbe dare ad intendere che la relativa descrizione di ciò che è già noto nel campo non serve come un riconoscimento di anteriorità del soggetto descritto.
Per ovviare agli inconvenienti della tecnica nota e per ottenere questi ed ulteriori scopi e vantaggi, la Richiedente ha studiato, sperimentato e realizzato il presente trovato.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
Il presente trovato è espresso e caratterizzato nelle rivendicazioni indipendenti. Le rivendicazioni dipendenti espongono altre caratteristiche del trovato o varianti dell’idea di soluzione principale.
Secondo le forme di realizzazione, si fornisce un coniugato della criptoficina. In possibili forme di realizzazione, i coniugati della criptoficina sono criptoficine coniugate con un linker auto-immolativo ad un peptide, oppure medicinali con forme accettabili derivanti da loro.
Secondo ulteriori forme di realizzazione, le criptoficine hanno la formula (II):
(Π)
in cui:
G è (CI -CI 2) alchil, (C2-C12) alchenil, (C2-C12) alchinil, o Ar;
RI è un alogeno;
R2 è un estero glicinato (Gly) configurato per la coniugazione con un linker auto-immolativo ad un peptide;
R3 è (C1-C6) un alchil;
R7 ed R8, sono presi assieme per formare un anello di ciclopropil o ciclobutil;
R9 è un idrogeno, (C1-C6) alchil, (C2-C6) alchenil, (C2-C6) alchinil, -(CH2)m-(C3-C5)cicloalchil o benzil;
RIO, R4 sono un idrogeno o (C1-C6) alchil;
RI I è un idrogeno, (C1-C6) alchil, fenil o benzil;
R è un idrogeno o (C1-C6) alchil o CH2C6H3ClOCH3;
Y è CH, O, NR12, S, SO, S02,
RI 2 è un idrogeno o (Cl -C3) alchil;
R6 è (C1-C6) alchil, sostitutivo (Cl-C6)alchil, (C3-C8)cicloalchil, sostitutivo (C3-C8)cicloalchil, un eteroaromatico o gruppo sostitutivo eteroaromatico o un gruppo con formula (IA), (IB) O (IC).
Secondo ulteriori forme di realizzazione, R2 è Gly-Χ-α-β , in cui: X è scelto da un gruppo che consiste in H o O o C1-C12 alchil, a è un linker auto-immolativo,
β è un peptide.
Secondo ulteriori forme di realizzazione, il peptide è un neuropeptide. Secondo ancora ulteriori forme di realizzazione, il peptide è un neuropeptide legante ai Recettori 1-5 della Dopamina.
Secondo ulteriori forme di realizzazione, il peptide è un neuropeptide legante al Recettore 2 della Dopamina.
Secondo ancora ulteriori forme di realizzazione, il neuropeptide è la dopamina o analoghi della dopamina selezionati da un gruppo che consiste in:
Apomorfina, Bromocriptina, Cabergolina, Ciladopa, Diidroergocriptina, Quinagolide, Ropinirolo, Salvinorin A, Sumanirole. Secondo ancora ulteriori forme di realizzazione, la criptoficina può essere il Glicinato della criptoficina 55.
Secondo ulteriori forme di realizzazione, il linker auto-immolativo è un linker auto-immolativo idrofllico.
Secondo ulteriori forme di realizzazione, il linker auto-immolativo può essere 5-Nitruro-l-pentanone-PEG-Val-Cit-Pro-Gly.
Secondo ulteriori forme di realizzazione, detto coniugato ha la formula (III) della Figura 8 (a), dove la parte bersagliante è DRBP (Peptide Legante al Recettore della Dopamina).
Secondo ulteriori forme di realizzazione, il coniugato ha la formula (IV) della Figura 8 (b), dove la parte bersagliante è la Dopamina.
Ulteriori forme di realizzazione riguardano un coniugato secondo la presente divulgazione per uso in trattamenti terapeutici.
Ancora ulteriori forme di realizzazione riguardano un coniugato secondo la presente divulgazione nell’uso per il trattamento terapeutico del cancro.
Ancora ulteriori forme di realizzazione riguardano un coniugato secondo la presente divulgazione per uso nel trattamento terapeutico dei Tumori Neuroendocrini (NETs) e delle cellule staminali dei NETs.
Ulteriori forme di realizzazione riguardano un coniugato secondo la presente divulgazione per uso nella terapia diagnostica.
Ancora ulteriori forme di realizzazione riguardano un coniugato secondo la presente divulgazione per uso nel trattamento diagnostico dei Tumori Neuroendocrini (NETs) e delle cellule staminali dei NETs.
Secondo a possibili forme di realizzazione, il coniugato comprende un peptide legante al recettore 2 della dopamina accoppiata per via di un agente chelante oppure covalentemente ad un radionucleotide selezionato da un gruppo che include 18F, 64Cu, 68Ga, 66Ga, 60Cu, 61 Cu, 62Cu, 89Zr, 1241, 76Br, 86Y e 94mTc.
Secondo a possibili forme di realizzazione, l’agente chelante può essere selezionato da un gruppo che include DOTA, NOTA, CB-TE2A o NODAGA.
Secondo a possibili forme di realizzazione, il coniugato può essere somministrato in una quantità diagnosticamente efficiente, come una dose di 100-500 MBq, seguito da una scansione PET o MRI 1⁄2 - 24 h dopo che il coniugato è stato somministrato, e quantificato tramite SUV max e/o SUV media.
Ulteriori forme di realizzazione riguardano un composto farmaceutico che consiste in un coniugato secondo la presente divulgazione da solo oppure come ingrediente attivo in una miscela.
Queste ed altre caratteristiche, aspetti e vantaggi della presente divulgazione saranno più comprensibili in riferimento alla seguente descrizione, disegni e rivendicazioni allegati. I disegni, che sono incorporati e costituiscono una parte di questa specificazione, illustrano le forme di realizzazione del presente soggetto in materia ed, assieme alla descrizione, servono a spiegare i principi della divulgazione.
I vari aspetti e le caratteristiche descritte nella presente divulgazione possono essere applicate, individualmente, quando è possibile. Questi individuali aspetti, per esempio gli aspetti e le caratteristiche descritte negli allegati dipendenti delle rivendicazioni, possono essere oggetto di domande divisionali di brevetto.
Si osserva che qualsiasi cosa ritrovata di cui si abbia conoscenza durante il processo di brevettazione si comprende che non si può rivendicare oppure farlo soggetto di divulgazione.
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI
Queste ed altre caratteristiche del presente trovato appariranno chiare dalla seguente descrizione di forme di realizzazione, fomite a titolo esemplificativo, non limitativo, con riferimento agli annessi disegni in cui:
- la flg. 1 mostra la sintesi retrosintetica di C52;
- la fig. 2 mostra la sintesi enantioselettiva di C52;
- la fig. 3 mostra: la sintesi dell’Unità A a partire da (R)-(-)-acido mandelico (a); la sintesi dell’Unità A a partire dall’ 1,3 propandiolo (b); - la FIG. 4 mostra la sintesi chemoenzimatica di C52;
- la FIG. 5 mostra l’itinerario 1 di sintesi del linker auto-immolativo idrofilico;
- la FIG. 6 mostra l’itinerario 2 di sintesi utilizzando Fmoc ammino acidi; - la FIG. 7 mostra l’effetto di dose-risposta di C55 e C55G sulle cellule di cancro e sulle cellule staminali derivanti dai NETs;
- la FIG. 8 mostra la struttura dei PDCs con parte bersagliante di DRBP (a) o Dopamina (b).
DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE
Riferimenti saranno fatti ora in dettaglio alle varie forme di realizzazione dell’invenzione, uno o più esempi dei quali sono illustrati nei disegni. Nella seguente descrizione dei disegni, lo stesso riferimento ai numeri si riferisce alle stesse componenti. Generalmente, sono descritte solo le differenze rispetto alle individuali forme di realizzazione. Ogni esempio è fornito in modo da spiegare l’invenzione e non è da intendersi come una limitazione dell’invenzione. Per esempio, le caratteristiche illustrate o descritte come parte di una forma di realizzazione possono essere usate sopra a oppure in congiunzione con altre forme di realizzazione per il rendimento di ancora altre forme di realizzazione. È da intendere che la presente invenzione include queste modifiche e variazioni.
Prima di descrivere queste forme di realizzazione, deve essere chiarito che la presente descrizione non è limitata nella sua applicazione ai dettagli della costruzione o alla disposizione dei suoi componenti come descritti nella seguente descrizione usando i disegni allegati. La presente descrizione può fornire altre forme di realizzazione e può essere ottenuta o eseguita in vari altri modi. Si vuole anche chiarire che la fraseologia e la terminologia qui usate sono solo a scopo descrittivo, e non possono essere considerate limitative.
Tutte le percentuali e i rapporti indicati si riferiscono al peso totale della composizione (per esempio indicati come % w/w), salvo che altrimenti indicato. Tutte le misurazioni sono fatte, salvo che altrimenti indicato, a 25°C ed a pressione atmosferica. Tutte le temperature, salvo che altrimenti indicato, sono espresse in gradi Centigradi.
Dove gli intervalli dei valori sono fomiti, si comprendere che ogni valore intermedio, fino al decimo dell’unità del limite inferiore salvo che il contesto chiaramente indichi altro, tra il limite superiore ed inferiore di quell’intervallo ed ogni altro dichiarato valore intermedio nello stesso intervallo, è annoverato dall’invenzione. I limiti superiori ed inferiori di questi intervalli più piccoli possono essere indipendentemente inclusi in intervalli più piccoli e sono annoverati nell’invenzione, sottoposto all’esclusione di ogni specifico limite nell’intervallo. Dove l’intervallo dichiarato include uno o entrambi i limiti, gli intervalli che escludono uno o entrambi di questi limiti inclusi sono anch’essi inclusi nell’invenzione. Inoltre, tutto questi intervalli sono da intendere in modo che la somma dei valori compresi in essi, nella composizione finale, da 100%, in particolare considerando che una persona esperta saprà come scegliere i valori di questi intervalli in modo tale che la somma non ecceda il 100%.
Come agli esperti nel campo diventerà evidente leggendo la seguente divulgazione, ogni individuale forma di realizzazione descritta e quivi illustrata ha delle componenti discrete e caratteristiche che possono essere facilmente separate da oppure combinate con le caratteristiche di ognuna delle varie forme di realizzazione senza discostarsi dallo scopo e dallo spirito della presente invenzione. In aggiunta, diventerà facilmente evidente ad un esperto nel campo in luce degli insegnamenti quivi presenti che certi cambiamenti e modifiche possono esservi fatti senza discostarsi dallo spirito e dallo scopo delle rivendicazioni allegate. Ogni metodo illustrato può essere svolto nell’ordine degli eventi o in qualsiasi altro ordine che sia logicamente possibile.
La presente divulgazione generalmente si riferisce ai Farmaci Coniugati Peptidici (PDCs), che sono una classe di terapeutici che combinano la specificità e la maggiore penetrazione tessutale dei peptidi con la potenza delle molecole citotossiche. I PDCs sfruttano le caratteristiche di entrambe le componenti ed allargano significativamente l’indice terapeutico delle molecole citotossiche minimizzando l’esposizione sistemica ed associata tossicità mentre, allo stesso tempo, massimizzano l’erogazione degli agenti citotossici alle lesioni bersagliate, perciò aumentando l’efficacia del trattamento.
In particolare, forme di realizzazione quivi descritte riguardano criptoficine coniugate con un linker auto-immolativo ad un peptide, oppure medicinali con forme accettabili derivanti da loro.
Secondo la presente divulgazione questi coniugati delle criptoficine sono stati ritrovati utili nel trattamento terapeutico e/o diagnosi di Tumori Neuroendocrini (NETs) e delle cellule staminali dei NETs.
Le criptoficine sono una famiglia di cianobatteri peptidolidi derivati dai licheni, scoperti per la prima volta nel 1990 dal Nostoc sp. ATCC53789 e Nostoc sp. GSV224, con proprietà di stabilizzazione dei microtubuli (Trimurtulu, G. et al. 1994). Le criptoficine possono efficacemente influire sulla vitalità delle cellule tumorali multi-resistenti ai farmaci ed a lenta proliferazione, (vedere US8952147 e WO20000034252A2). Dopo che la pronunciata neurotossicità di C52 in studi clinici ha precluso il suo sviluppo, nuovi analoghi della criptoficina sono stati perseguiti come candidati nella ricerca di migliori profili terapeutici. Il C55 si ottiene aprendo un anello di ossido di etilene nel C52 introducendo un atomo di aiogenico (US8952147). Paragonando alla sua controparte di C55, il glicinato di C55 può vantarsi di una maggiore stabilità in un ambiente acquoso in un intervallo fisiologico di pH per periodi più lunghi di tempo indicando un maggiore tempo di dimezzamento sotto condizioni fisiologiche (US8952147).
Secondo possibili implementazioni, le criptoficine che possono essere usate nelle forme di realizzazione quivi descritte sono di formula (II):
(Π)
G
in cui:
G è (CI -CI 2) alchil, (C2-C12) alchenil, (C2-C12) alchinil, o Ar;
RI è un alogeno;
R2 è un estere glicinato (Gly) configurato per la coniugazione con un linker auto-immolativo ad un peptide;
R3 è (C1-C6) alchil;
R7 ed R8, sono presi assieme per formare un anello di ciclopropil o ciclobutil;
R9 è un idrogeno, (C1-C6) alchil, (C2-C6) alchenil, (C2-C6) alchinil, - (CH2)m-(C3-C5) cicloalchil o benzil;
RIO, R4 è un idrogeno o (C1-C6) alchil;
RI I è un idrogeno, (C1-C6) alchil, fenil o benzil;
R è un idrogeno o (C1-C6) alchil o CH2C6H3C10CH3;
Y è CH, O, NR12, S, SO, SO2,
RI 2 è un idrogeno o (C1-C3) alchil;
R6 è (C1-C6) alchil, sostitutivo (Cl-C6)alchil, (C3-C8)cicloalchil, sostitutivo (C3-C8)cicloalchil, un eteroaromatico o gruppo sostitutivo eteroaromatico o un gruppo con formula (IA), (IB) O (IC).
Secondo forme di realizzazione, R2 è Gly-Χ-α-β, dove:
X è scelto da un gruppo che consiste in H o O o C1-C12 alchil;
a è un linker auto-immolativo;
β è un peptide.
Secondo forme di realizzazione, il peptide è un neuropeptide.
Secondo forme di realizzazione, combinabile con tutte le forme di realizzazione quivi descritte, il neuropeptide è dopamina o analoghi della dopamina selezionati da un gruppo che consiste in: Apomorfma, Bromocriptina, Cabergolina, Ciladopa, Diidroergocriptina, Quinagolide, Ropinirolo, Salvinorin A, Sumanirole.
Perciò, possibili implementazioni della presente divulgazione riguardano la dopamina o i coniugati della dopamina per l’erogazione di farmaci glicinati della criptoficina alle NETs.
La dopamina è un neuropeptide che intemalizza tramite la regione N-terminale del DR2 (Cho DI. et. al., 2012). I peptidi hanno una maggiore penetrazione dei tessuti rispetto agli anticorpi.
Vantaggiosamente, le forme di realizzazione quivi descritte definiscono la struttura del coniugato come un composto o una molecola in cui il peptide può agire come un trasportatore delle criptoficine ed il linker connete il trasportatore alle criptoficine. Il trasportatore soto forma di peptide può fornire un’alta penetrazione nei tessuti per l’erogazione del farmaco soto forma di criptoficine.
Secondo forme di realizzazione, i farmaci coniugati che si basano sulla dopamina col carico utile Cry55Gly, coniugati con un linker autoimmolativo scisso dalla catepsina B e D, proteasi presenti solo all’interno dell’ambiente cellulare, forniscono una nuova terapia contro il cancro per il tratamento delle NETs con alti livelli di DR2.
Secondo forme di realizzazione, il linker può avere la carateristica di andare incontro ad una spontanea decomposizione chimica (autoimmolativo) solo quando ha intemalizzato nelle cellule bersagliate. In aggiunta, la progetazione di linker chimici che si legano a questi blocchi di legame devono essere stabili nella circolazione sanguigna per limitare danni ai tessuti sani. La decomposizione o il decadimento dei PDCs può rilasciare il farmaco citotossico prima dell’erogazione ai siti bersaglio. Tutavia, quando i PDCs raggiungono i siti bersaglio, devono rilasciare con efficienza il farmaco citotossico nella sua forma ativa. I linker enzimi-labili adotano un approccio alternativo agli altri tipi di linker disponibili, basato sulla diversa atività delle proteasi dentro e fuori dalle cellule, per conseguire un controllato rilascio del farmaco. Le proteasi non sono normalmente ative fuori dalle cellule per le condizioni favorevoli di pH e la presenza nel siero d’inibitori della proteasi. Il farmaco può essere specificatamente scisso tramite l’azione di proteasi lisosomiali presenti nelle cellule, ed ad alti livelli in alcuni tipi di tumori. Secondo forme di realizzazione, i linker idrofilici auto-immolativi forniscono una maggiore solubilità e stabilità e minore aggregazione dei farmaci citotossici rispetto ai linker idrofobici coniugati.
Metodi e procedure per la produzione dei glicinati delle criptoficine che possono essere usati in forme di realizzazione della presente divulgazione saranno descritti in maggior dettaglio qui sotto. Riferimenti saranno fatti ad esempi non limitativi ai glicinati della criptoficina 52 e della criptoficina 55.
PRODUZIONE DI GLICINATI DELLA CRIPTOFICINA 52 E CRIPTOFICINA 55.
Sintesi Chimica e Non-Chimica di C52
La sintesi della criptoficina può essere conseguita tramite strategie chimiche e non-chimiche (biologiche e biochimiche). I due percorsi saranno qui descritti come parti costitutive della presente divulgazione. Approccio chimico
Per l’approccio retrosintetico (chimico) di C52 la procedura è semplice, provvedendo le quattro convenienti subunità, in altre parole i frammenti da A a D come descritti usando la Figura 1. I frammenti B, C e D sono convenientemente ed efficientemente sintetizzati da composti disponibili sul mercato come la D-tirosina, (S)-(-)-leucina, ed il cinoacetatoetilico, rispettivamente, in da 2 a 6 passi. Invece la sintesi del frammento A è piuttosto impegnativa (WO20000034252A2).
Unità A-D possono essere fatte secondo la Figura 1.
La sintesi enantioselettiva di LY355703 (una versione di C52) può essere fatta tramite metodologie convergenti che involvono l’assemblaggio di tre frammenti, come descritto usando la Figura 2: fenile esammide (frammento 1), fosfonato di D-Tirosina (frammento 2), ed il derivativo protetto dell’ammino acido β (frammento 3). La sintesi del frammento 1 richiede l’efficiente e stereogenicamente controllata costruzione tramite scissione dell’anello sostitutivo del tedraidrofurano tramite lo ione intermedio dell’ossido di acilecarbene di entrambi centri stereogenici a C-3 e C-4. Entrambi i centri stereogenici derivano dal 4-fenil-butirro-lattone otticamente attivo, enantioselettivamente sintetizzato tramite riduzione di Corey-Bekshi-Shibata. La subunità chiave della tirosina octodienamide è generata tramite l’olefinazione di Hamer Emmans tra l’aldeide 3 ed il fosfonato 4 (vedi Figura 2. Schema 1). I corrispondenti precursori aciclici protetti C52 sono generati tramite l’esterificazione con l’acido 5. Gli anelli macrociclici di sedici atomi sono poi generati tramite la rimozione dei relativi gruppi protettori, seguiti dall’ammidazione ciclica dei risultanti ammino acidi (Ghosh A. et. al, 2003). La sintesi dei derivativi del fosfonato possono essere fatti in due passi. (Ghosh A. et. al, 2003) (vedi Figura 2. Schema 2).
Ad esempio, le condizioni sperimentali sono qui sotto fomite per lo Schema 1 e lo Schema 2.
Nello Schema 1: a (a) (R)-Oxazaborolidine 7 (8 mol %), BH3· THF, poi AcOH, toluene, riflusso; (b) LiHMDS, Mei, -78 °C; (c) DIBAL-H, CH2C12, -78 °C; (d) Ph3P=CHCO2Et, CH2C12, 40 °C; (e) KHMDS, THF, -78 °C; (f) AC20, ZnCl2(catalitico, 6 mol %), 120 °C.
Nello Schema 2: a (a) (Et0)2P(0)CH2C02H, DCC, THF, 23 °C, 1 h; (b) K.C1, Oxone, aq. MeCN, 23°C; (c) NaH, THF, poi 3, 0 fino 23 °C; (d) EDCI, DMAP, CH2C12; (e) H2, 10% Pd-C; (f) 5, 2,4,6-Cl3C6H2COCl, Et3N, poi 15, 23 °C; (g) CF3CO2H, 23 °C, 2 h; (h) FDPP, DMF, iPr2NEt, 23 °C; (i) m-CPBA, CH2C12, da 0 fino a 23 °C, 12 h (70%, 2:1 miscela). Alternativamente l’Unità A può essere fatta secondo i seguenti metodi:
- in un’alternativa forma di realizzazione (vedi Figura 3 a), l’unità A può essere fatta partendo da (R)-(-)-acido mandelico. Le reazioni di borazione crotilica asimmetrica e di borazione allilica sono eseguite usando reagenti di boro enantiomericalmente puri, che sono sintetizzati direttamente da accessibili (+)-3 -carene chirali. (WO20000034252A2). Lo schema in Figura 3a mostra come fare l’Unità A secondo quest’alternativa. In Figura 3 a, G è (Ci-C[2) alchil, (C2-Ci2) alchenil, (C2-C[2) alchinil o Ar; e R3 è (CrC6) alchil; R<pl>è tritìi o un adeguato gruppo silile protettore; LG è un adeguato gruppo idrossi attivante; R<p2>è un idrogeno o un adeguato gruppo protettore carbossilico; ed R<p3>ed R<p4>sono ognuno isocaranyl o isopinocampheyl;
-in un’altra alternativa forma di realizzazione (vedi Figura 3b), l’unità A può essere anche fatta partendo da 1,3 propandiolo, attraverso la formazione di un intermedio (intermedio 8 in Figura 3b) che è comune all’unità A ed agli analoghi, permettendo la diversificazione come un alternativo passo terminale. (Bolduc K.L. et. al., 2012). Le seguenti tre semplici procedure possono essere utilizzate per produrre alcol monosililato (intermedio 4) da 1,3 propandiolo (intermedio 3) ad alti rendimenti per la presente divulgazione:
i) Procedura A. Idrato di sodio (0.27 g, 5.6 mmol) è sospeso nel THF (11 mL) dopo essere stato lavato con l’esano. Il diolo (5.6 mmol) è aggiunto nella miscela a temperatura ambiente e mescolato per 45 minuti formando una grande quantità di precipitato bianco opaco. Il cloruro di tert-butildimetilsilico è poi aggiunto, ed una vigorosa mescolazione è applicata continuamente per 45 minuti. La miscela è poi versata in etere (100 mL), lavato con 10% K2CO3(30 mL) e salamoia (30mL), asciutto (Na2SO4) e concentrato sotto vuoto. Cromatografia Flash è utilizzata per purificare il risultante olio utilizzando miscele di acetato/esano etilico come eluente. (McDougal P. et al., 1986).
ii) Procedura B. La stessa procedura come in A è seguita eccetto che il diolo ed NaH sono riscaldati assieme a 55° C per 18 h prima di aggiungere cloruro tert-butildimetilsilico a RT°. Tutto il resto è fatto secondo la procedura A. (McDougal P. et al., 1986).
iii) Procedura C. Al diolo (4.81 mmol) in cloruro di metilene (lOmL) sono sequenzialmente aggiunti trietilammide (0.7 g, 6.9 mmol), 4- (dimetilammino) piridina (DMAP, 100 mg), e cloruro tertbutildimetilsilico (4.81 mmol) a RT°. La miscela è vigorosamente mescolata per 4 h e poi versata in etere (100 mL), lavata in 10% NaHSO4acquoso (2 X 30 mL) e poi 10% K2CO3acquoso (30 mL), asciugato (Na2SO4), e concentrato sotto vuoto. La purificazione è fatta secondo la procedura in A. (McDougal P. et al., 1986).
Usando l’isolato di π-iridio allilico ortho-ciclo metallizzato precatalizzatore derivato da [Ir(cod)Cl]2, 4-cino-3-acidonitrobenzoico, (R )-SEGPHOS5 ed acetato allilico, a -(trimetilsilil) acetato allilico accoppiato a composti carbonilici dal livello di ossidazione dell’aldeide o dell’alcol, rispettivamente, con livelli eccezionali di regio-, antidiastereo- ed enantioselettività. (Gao X. et al., 2011). Usando questi metodi il complesso 5 è formato dal complesso 4. Il complesso 5 nella presenza di acetato a- metil allilico ha permesso l’atteso alcol crotilico 6 in 6:1 dr che è sufficientemente puro per procedere senza purificazione. Precipitazione col pentano e filtrazione permettono il recupero del catalista, mentre il filtrato contenente 6 è concentrato e trattato con TBAF per liberare il diolo crotilico 7 a buona resa dal 4. Avendo il 7 in mano, una sequenza one-pot di ossidazione/olefinazione è impiegata per influire la conversione chemoselettiva dell’alcol primario in estere insaturo 8 (>20:1 E /Z ). L’alchene terminale su 8 è poi impiegato come maniglia per generare analoghi dell’unità A.
La completa descrizione della sintesi dell’ intermedio 8 è descritta utilizzando lo schema in Figura 3b.
Dall’intermedio 8 l’Unità A può essere sintetizzata tramite l’approccio di Heck, l’approccio di cross metatesi delle olefini e l’approccio crociato di accoppiamento Suzuki-Miyaura (Bolduc K.L. et. al., 2012).
Approccio Non Chimico:
Gli approcci non chimici per la sintesi di C52 sono ora descritti come anch’esse parti costitutive dell’attuale forma di realizzazione:
i) La sintesi chemoenzimatica delle criptoficine può essere conseguita tramite la clonazione, espressione ed uso del dominio Tioesterasi della Criptoficina (CrpTE) in combinazione con la sintesi chimica dei substrati tioesteri di seco-criptoficina e seco-arenastatina N-acetilcisteammina (NAC). (Beck Z. et al., 2005).
Strategia per la clonazione di CrpTE. DNA codificante Crp TE è stabilito ai 3’ -finale del 3’ -terminale del quadro di lettura terminale (ORF) ed è necessario per la biosintesi della spina dorsale della criptoficina. Il primer senso 5'-ATTT ATC AT ATGGGTTCCG ATTCCGG AGCCG A-3 ' è stabilito immediatamente al 3’ del DNA predetto di codificare una proteina capace di essere fosfopantetheinylata in una regione priva di struttura secondaria. Il primer antisenso 5’-AA ATAAGGATCCTC ATC ATTTTTCC AATTGATGGGT-3 ' si appaia al 3’-finale dell’ORF contenente un sito di scissione BamHI. Il DNA codificante Finterò presunto cluster biosintetico di geni della criptoficina può essere messo su cosmide pDAM163. Il DNA del pDAM163 può essere estratto usando un kit per l’estrazione di larghi costrutti di DNA della Qiagen da un 500mL di coltura cresciuta durante la notte a 25 °C in mezzo LB contenente 50 pg/mL ampicillina. I PCR sono eseguiti con 0.1 pL di pDAM163 DNA dall’estratto, 1 p M primer senso, 1 p M primer antisenso, 1À~ ExTaq buffer (Takara), 1 pL di ExTaq polimerasi (Takara), ed 1 p M dNTP (Takara) in un volume finale con l’acqua di 50 pL. Il programma PCR consiste in 30 cicli delle seguenti condizioni di amplificazione: denaturazione per 1 minuto a 95 °C, appaiamento per 1 minuto a 50 °C, ed estensione per 1.5 minuti a 72 °C. I frammenti di PCR corrispondenti alle desiderate lunghezze sono separati tramite elettroforesi su gel di agarosio 1% e purificati dal gel usando un kit di estrazione Qiagen. I frammenti di PCR sono clonati in vettori pGEM T-Easy (usando quello della Promega ad esempio) usando clonazione T-overhang con kit pGEM T-Easy (Promega). I cloni sono trasformati in cellule competenti XL-1 Blue usando protocolli di shock da calore come descritti nel kit pGEM T-Easy. I costrutti contenenti le inserzioni sono identificati usando screening blu/bianco secondo il protocollo del kit pGEM T-Easy. Cinque cloni contenenti le inserzioni sono ri-piastrati, e metà delle colonie sono soggettate a PCR per verificare le inserzioni delle desiderate grandezze del DNA usando le stesse condizioni di PCR elencate sopra, con l’eccezione di un 5 minuti di incubazione di ogni clone a 96 °C prima dei cicli di amplificazione. Uno dei cloni contenente la desiderata dimensione d’inserzione di DNA è fatto crescere in una coltura di 2 mL durante la notte in mezzo LB contenente ampicillina (Prodotti di Ricerca Intemazionale Corp.) (50 μ g/mL). Il DNA è purificato usando miniprep kit della Qiagen. Il DNA dai sequenziamenti è ligato in siti Ndel e BamHI in pET28b (Novagen) e trasformato in cellule BL21 elettrocompetenti usando elettroporazione (come una possibile alternativa di trasfezione). Tutte le cellule sono piastrate con piastre contenenti kanamicina (Prodotti di Ricerca Intemazionale Corp.) (50 μ g/mL) ed incubate O/N a 37 °C. La desiderata inserzione di DNA è verificata in dieci colonie selezionate per questo scopo usando i primer ed i protocolli sovra elencati. (Beck Z. et al., 2005).
Espressione e purificazione di CrpTE. Un clone col desiderato sito d’inserzione, come confermato tramite elettroforesi su gel di agarosio, è fatto crescere O/N in 25 mL di brodo 2YT contenente 50 pg/mL kanamicina a 37 °C. Cinque millimetri della coltura O/N sono usati per inoculare 1 L del terreno di 2YT contenente 50 pg/mL kanamicina e cresciuto a 37 °C. La coltura è indotta ad un OD595 di 0.7 con 0.2 mM IPTG e cresciuta durante la notte a 30 °C. Le cellule sono raccolte a 5000 g per 30 minuti. Il pellet è poi risospeso in 20 mL di 0.1 M buffer di fosfato di sodio a pH 8 contenente imidazolo 20 mM e NaCl 300 mM; 4 mg di lisosomi e 2 g di saccarosio sono poi aggiunti alla sospensione delle cellule ed incubate a temperatura ambiente per 30 minuti finché la viscosità della soluzione sale. La soluzione è poi posta in ghiaccio e sottoposta a sonicazione (5 À~ 20 s). La sospensione è poi fatta centrifugare a 17000 g per 1 h a 4 °C. Il supematante è poi collezionato ed incubato con 7 mL di Ni agarosio Qiagen durante la notte a 4 °C. L’agarosio è poi caricato in una colonna e lavato con 10 volumi di colonne di buffer 0.1 M di fosfato di sodio (pH 8) contenente imidazolo 20 mM e NaCl 300 mM. Poi, la colonna è lavata con 10 volumi di colonna con buffer da lavaggio contenente imidazolo 50 mM. La proteina è eluita con buffer da lavaggio contenente imidazolo 100 mM. Il kit Bradford per il saggio Bio Rad può essere usato per misurare la concentrazione proteica. I campioni sono fatti correre su un gel dai 4 a 20 % SDS- PAGE per controllare la purezza. (Beck Z. et al., 2005). Lo schema in Figura 4 mostra come avviene la sintesi chemoenzimatica delle criptoficine. ii) Biosintesi del C52 nutrendo (supplementando direttamente) gemdimetil β-alanina alle Nostoc sp ATCC53789 ed alle strettamente imparentate Nostoc sp GSV224, come dimostrato conseguibile da Magarvey et al., 2006.
iii) Il linker sulfonamide di Kenner a fermo di sicurezza può essere usato per sintetizzare le criptoficine. N-alchilazione del linker a fermo di sicurezza porta ad un legame ammidico labile che può essere facilmente spiazzato da un attacco nucleofilico con gli alcol, ammidi e tioli per formare rispettivamente esteri, ammidi e tioesteri. La serina nucleofilica di CrpTE può direttamente spiazzare la criptoficina dal supporto a fase solida dopo la sintesi. Serve utilizzare una resina poli (etilenglicolo) poli (N,N- dimetilacrilamide) (PEGA) con bassi livelli di sostituzione per permetter al CrpTE di avere abbastanza accesso al substrato del supporto solido. (Seufert W. et al., 2007).
LINKER AUTO-IMMOLATIVI
In possibili forme di realizzazione, nel coniugato delle criptoficine secondo la presente divulgazione, il linker auto-immolativo può essere qualsiasi delle strutture dei linker descritti qui sotto ed ottenuto come descritto con maggior dettaglio qui sotto.
I composti come quivi descritti possono essere purificati tramite qualsiasi modo conosciuto nel campo, incluse modalità di cromatografia, come cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), preparativo di cromatografia in strato sottile, colonna cromatografica flash e cromatografia con scambio ionico. Ogni fase stazionaria adatta può essere usata, includendo fasi normali ed inverse come anche le resine ioniche.
Durante ognuno dei processi per preparare i composti soggetto, potrebbe essere necessario e/o desiderabile proteggere i gruppi reattivi o sensitivi su ognuna delle molecole concernenti usando metodi conosciuti nel campo.
Ora saranno quivi descritti esemplari di entità chimiche utili in metodi delle forme di realizzazione con riferimento ad un illustrativo schema di sintesi per la loro generica preparazione ed un esempio specifico che seguirà sarà utilizzato per spiegare la procedura e non limitare l’invenzione. Gli artigiani possono adeguatamente selezionare materiali di partenza in modo tale che ultimamente i sostituenti desiderati possono essere portati a termine secondo lo schema di reazione. Alternativamente, può essere necessario o desiderabile impiegare, al posto dei sostituenti ultimamente desiderabili, un adeguato gruppo che possa portare a termine lo schema della reazione e rimpiazzare appropriatamente con i sostituenti desiderati. Ulteriormente, lo schema può essere eseguito in ogni ordine compatibile con il funzionamento e la peculiarità dei gruppi laterali. Ognuna delle reazioni illustrate è preferibilmente conseguita ad una temperatura sopra ai 0 °C fino alla temperatura di riflusso del solvente organico usato.
Approccio 1 di sintesi del linker auto-immolativo idrofilico
Le Figure 5a e 5b sono usate per descrivere l’approccio 1 per la sintesi di linker auto-immolativi idrofilici che possono essere usati nelle forme di realizzazione quivi descritte.
La Figure 5a rappresenta l’approccio 1 per la sintesi dei linker autoimmolativi, mentre la Figura 5b rappresenta un esempio della sintesi di un linker auto-immolativo idrofilico.
Per l’approccio 1 le variabili sono definite in riferimento alla Formula (I) (vedi e.g. US9098614B2)
Formula (I)
dove:
• D è la parte farmaceutica C55G;
• T è la parte bersagliante corrispondente alla Dopamina o Analoghi della Dopamina;
• X è un linker idrofilico auto-immolativo;
LI è un legame, un secondo linker auto-immolativo, o linker autoimmolativo a ciclizzazione;
• L2 è un legame o un secondo linker auto-immolativo;
o dove se LI è un secondo linker auto-immolativo o un linker autoimmolativo a ciclizzazione, allora L2 è un legame;
o dove se L2 è un secondo linker auto-immolativo, allora LI è un legame;
• L3 è un linker peptidico;
• L4 è un legame o un distanziatore; e
• A è un’unità acyl.
I coniugati delle presenti forme di realizzazione possono essere costruite attaccando il C55G (parte farmaceutica) alla dopamina o agli analoghi della dopamina (peptide come parte bersagliante) tramite un linker costituito da un distanziatore idrofilico auto-immolativo.
Sintesi rappresentative per la porzione del linker dei composti della Formula (I) tramite approccio 1 sono ora descritte usando Figure 5a e 5b, ed il particolare esempio che seguirà sarà usato per spiegare e non limitare la presente divulgazione.
Per la sintesi del Composto C della Figura 5a, acido Nitrofenilglicolico è convertito nel corrispondente acido di cloruro usando un reagente clorurante, come il SOCl2, PC13, o PC15. L’acido di cloruro è poi fatto reagire con 1 -metilpiperazina per dare l’intermedio chetoammide. Alternativamente, l’acido 4-nitrofenilglicolico può essere accoppiato all’ 1 -metilpiperazina per dare un intermedio chetoammide. Alternativamente, l’acido 4-nitrofenilglicolico può essere accoppiato all’l -metilpiperazina con l’uso di un agente accoppiante, come il EDCI. L’intermedio chetoammide contiene un gruppo chetonico, che è poi ridotto con un agente riducente, come DIBAL-H, BH3, LÌA1H4-A1C13, LiAlH4-BF3-Et20, o boroidruro di sodio, per produrre il Composto C.
Il gruppo di nitrato del Composto C è ridotto per rendere un gruppo di anilina nel Composto I tramite la catalitica idrogenazione con catalisti, come palladio, nichel o platino. Come adeguati catalisti per l’idrogenazione Pd/C e Raney nichel possono per esempio essere usati. Il Composto I fornisce la porzione idrofilica del linker autoimmolativo nei composti della presente forma di realizzazione. I gruppi amminici del Composto I possono reagire col Composto W attraverso condizioni standard di accoppiamento del peptide per produrre il Composto X. I reagenti come EDCI/HOBt, PyBOP, HATU o BEM (Han S. et al. 2004) in presenza di una base come DIEA o altre basi, famigliari ad un esperto nel campo, ed in un appropriato solvente.
II gruppo idrossile del Composto X è convertito in un carbonato attivo usando 4-nitrofenilcloroformiato. Col Composto Y, la reazione con un farmaco con un gruppo aminico può produrre il Composto Z.
In certe forme di realizzazione la porzione -L3-L2- del linker è attaccata al Composto I. Poi la porzione -A-L4- è attaccata.
Un processo per la preparazione del composto delle presenti forme di realizzazione include preparare una soluzione del peptide in un buffer e trattarlo con una soluzione di agente riducente, come TCEP. La quantità di tioli liberi è determinata. Quando la quantità di tioli liberi raggiunge una quantità predeterminata, il peptide parzialmente ridotto è alchilato con la porzione farmaco-linker.
La presente divulgazione fornisce un processo per la preparazione dei composti ed intermedi in Figura 5. I composti I-Z rappresentati in Figura 5 hanno piene valenze o sono adeguatamente custoditi con gruppi protettori opzionali o gruppi uscenti quando è appropriato.
Approccio Alternativo per la Sintesi dei Linker Auto-Immolativi Tramite Ammino Acidi Fmoc (Approccio 2)
Le forme di realizzazione dei linker presentati nella divulgazione, ad esempio 5-Nitruro-l-pentanone-PEG-Val-Cit-Pro-Gly, possono essere sintetizzate anche tramite Sintesi di Peptidi a Fase Solida usando ammino acidi 9-fluorenilmetossicarbonil (Fmoc) come in Figura 6 (Fields G and Noble RL, 2009).
L’ammino acido Fmoc iniziale è prima legato (caricamento) al supporto insolubile per via di un linker acido labile (di solito piperidina). Il secondo ammino acido Fmoc è poi accoppiato come una specie preattivata (in altre parole estere o anidride simmetrica) o senza preattivazione (in situ), dove possono essere utilizzati diversi attivatori. Dopo che la desiderata sequenza peptidica è stata ottenuta, il supporto peptidico e la catena laterale stabile basica che bloccano i gruppi sono scissi tramite acido (di solito TFA) (Fields G and Noble RJL, 2009).
Attraverso gli ammino acidi Fmoc, la sintesi di entrambi i linker autoimmolativi, che sono fatti di catene peptidiche di diverse lunghezze, e la parte bersagliante del peptide, dopamina o analoghi della dopamina, possono essere sintetizzati. Una parte bersagliante può essere ottenuta da Sigma Aldrich, ad esempio, e poi legata al linker auto-immolativo tramite l’accoppiamento o click reazione come si conosce nel campo. Il gruppo ammide della dopamina per esempio può essere coniugato usando Na2HPO4, aggiunto per 4 giorni con il linker C55G (click reazione).
Secondo le forme di realizzazione, i coniugati delle criptoficine possono avere formula (III) della Figura 8 (a), dove la parte bersagliante DRBP è il Peptide Legante al Recettore della Dopamina, dove il linker auto-immolativo può essere uno di quelli descritti sopra e la criptoficina può essere qualsiasi delle criptoficine descritte sopra.
Secondo successive forme di realizzazione, i coniugati delle criptoficine possono avere formula (IV) della Figura 8 (b), dove la parte bersagliante è la dopamina.
DIAGNOSI
Forme di realizzazione della presente divulgazione riguardano anche la diagnosi delle NETs delle cellule staminali dei NETs usando scansione PET o MRI basato sui recettori d’interesse nei coniugati quivi descritti (per esempio recetore 2 della dopamina 2, DR2). Perciò DR2 imaging basate su DR2 su scansione PET ed MRI sono anch’esse incluse nella presente divulgazione. Si crede che questa tecnica permeta di determinare con maggiore accuratezza dove le cellule NET, ed anche le cellule staminali dei NET, sono localizzate, siccome quest’ ultime cellule si replicano lentamente e quindi hanno un metabolismo del glucosio lento.
In particolare, è possibile radiomarcare i recetori d’interesse, ad esempio recetore DR2, nei coniugati della presente divulgazione allo scopo d’imaging tramite PET o MRI.
La radiomarcatura dei recetori d’interesse, per esempio peptidi del recetore DR2, può essere fatta tramite l’accoppiamento dei peptidi riconoscenti il recetori al radionuclide per via di un agente chelante o covalentemente.
Secondo ad altre possibili forme di realizzazione, l’accoppiamento dell’agente chelante al peptide tipicamente radiomarca i peptidi selezionati per l’uso diagnostico in coniugati secondo alle presenti forme di realizzazione. L’agente chelante è capace di legarsi a selezionati radionuclidi (vedi per esempio US20 160263260). L’agente chelante ed il radionuclide possono accoppiarsi al peptide in modo da non interferire od avversamente influenzare le proprietà di legame o specificità dei peptidi. Vari agenti chelanti possono essere usati per radiomarcare i peptidi. L’agente chelante può essere accoppiato al peptide tramite metodologia standard conosciuta nel campo e può essere aggiunta in ogni luogo sul peptide provvisto che l’atività biologica del peptide non sia avversamente influenzata. Preferibilmente, il gruppo chelante può essere covalentemente accoppiato alla parte terminale amminica dell’ animino acido del peptide. Il gruppo chelante può vantaggiosamente essere attaccato al peptide durante la fase solida di sintesi del peptide o aggiunto durante la fase di elaborazione chimica dopo che il peptide è stato ottenuto.
Secondo forme di realizzazione, combinabile con tutte le forme di realizzazione quivi descritte, preferibilmente i gruppi chelanti possono essere selezionati da un gruppo che include DOTA, NOTA, NODAGA o CB-TE2A.
Secondo a possibili forme di realizzazione, i coniugati peptido/chelanti della divulgazione possono essere marcati tramite la reazione del coniugato con radionuclidi, per esempio come un sale metallico, preferibilmente solubile in acqua. La reazione può essere svolta tramite metodi conosciuti nel campo.
Secondo a possibili forme di realizzazione, combinabili con tutte le forme di realizzazione quivi descritte, il coniugato secondo la presente divulgazione può consistere in un peptide legante al recettore 2 della dopamina accoppiato per via di un agente chelante o covalentemente ad un radionuclide selezionato da un gruppo consistente di 18F, 64Cu, 68Ga, 66Ga, 60Cu, 61 Cu, 62Cu, 89Zr, 1241, 76Br, 86Y, and 94mTc. I coniugati della presente divulgazione possono essere preparati per fornire una dose radioattiva di circa 100-500 MBq (in umani) agli individui. I coniugati possono essere somministrati per via endovenosa. L’imaging (in altre parole scansioni PET ed MRI) dei siti biologici possono essere fatti nei 30-60 minuti post- iniezione. Ogni metodo convenzionale d’imaging per lo scopo diagnostico può essere utilizzato. Per esempio, secondo specifiche forme di realizzazione, combinabili con tutte le forme di realizzazione quivi descritte, il coniugato della presente divulgazione può essere somministrato in una quantità efficiente per la diagnosi, come una dose di 100-500 MBq seguito da una scansione PET o MRI 1⁄2-24 h dopo che il coniugato è stato somministrato, e quantificato tramite SUVmax ed/or SUVmedia ad esempio.
DATI SPERIMENTALI II C55 ed il C55G trattano efficientemente le NETs multi-resistenti ai farmaci ed a lenta proliferazione.
I risultati che il presente inventore ha personalmente prodotto in ricerca di laboratorio corroborano quello che è già conosciuto sulla potenza delle C55 e C55G sulle linee cellulari multi-resistenti ai farmaci.
II presente inventore l’ha fornito sulle NETs, come le cellule staminali del cancro polmonari (LCSCR4 ed LCSC16) come sulle linee cellulari commercialmente disponibili pancreatiche NETs provenienti dal ratto AR42J e le linee cellulari disponibili umane del seno MCF7 in Figura 7 e nella seguente Tabella 1.
La Figura 7 mostra l’effetto di dose-risposta di C55 e C55G sul cancro e sulle cellule staminali del cancro derivanti dalle NETs. Il trattamento delle cellule staminali del cancro delle NETs (LCSCR4 ed LCSC16) o delle linee cellulari del cancro (MCF7 ed AR42J) con C55, C55G. L’Octreotide è stato usato come un controllo negativo mostrando che questo composto non ha un effetto sulle cellule quando usato ad alte concentrazioni. Le cellule sono trattate con i diversi composti in diluizioni seriali ed incubate per 120 h. La Tabella 1 qui sotto sintetizza il IC50 molto basso (significativo dell’alta potenza) dei composti C55 e C55G nelle cellule. Gli IC50 sono derivati dalle curve illustrate in Figura 7.
La Tabella 1 qui sotto riassume la forte abilità di C55 e C55G d’intaccare la vitalità delle cellule staminali del cancro umano NETs (cellule staminali del cancro dei polmoni di origine neuroendocrina, di preciso le LCSCR4 ed LCSC16) ed altre linee cellulari del cancro secondo una dose-risposta avente IC50 molto bassi.
Tabella 1 _
Linee Cellulari Cry55 _ Cry55-Gly
Nomenclatura IC50 (nM) IC50 (nM)
AR42J _ U0 _ 1.23
LCSC16 _ 0T0 _ 0.19
MCF7 _ 006 _ 0,04
LCSCR4 _ 012 _ 0.07
Il saggio di vitalità cellulare
Il saggio di vitalità cellulare è stato eseguito trattando le colture con i farmaci in una diluizione seriale 1 :3 ed il numero totale delle cellule vive è stato determinato un luminometro (DTX 880, 1489), usato per il rivelamento di chemiluminescenza dato dagli ATP delle cellule vive in grado di reagire con un singolo reagente del saggio di vitalità secondo istruzioni del fabbricante (CellTiter GLO, Promega). I composti usati sono C55, C55G ed il controllo Octreotide alle corrispondenti massime concentrazioni di 10 nM, 10 nM e 10 μΜ. Le cellule sono state fatte crescere in condizioni di coltura convenzionali con i farmaci aggiunti in diluizioni seriali per 120 h prima di eseguire il saggio di vitalità.
Mentre quanto precedentemente stabilito è diretto alle forme di realizzazione dell’invenzione, altre e successive forme di realizzazione dell’invenzione possono essere concepite senza scostarsi dallo scopo principale di base, e lo scopo di ciò è determinato dalle rivendicazioni che seguono.
RIFERIMENTI NON-BREVETTUALI
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10. Gao, X., Zhang, Y. J. & Krische, M. J. Iridium-catalyzed antidiastereo- and enantioselective carbonyl (Trifluoromethyl)allylation from thè alcohol or aldehyde oxidation level. Angew. Chemie - Ini. Ed. 50, 4173-4175 (2011).
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13. Seufert, W., Beck, Z. Q. & Sherman, D. H. Enzymatic release and macrolactonization of cryptophycins from a safety-catch solid support. Angew. Chemie - Ini. Ed. 46, 9298-9300 (2007).
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Claims (16)
- RIVENDICAZIONI 1. Coniugato delle criptoficine a dei peptidi tramite un linker autoimmolativo, oppure medicinali con forme accettabili derivanti da loro.
- 2. Il coniugato della rivendicazione 1, in cui le criptoficine hanno formula (II): (Π) R7 RS in cui: G è (CI -CI 2) alchil, (C2-C12) alchenil, (C2-C12) alchinil, o Ar; RI è un alogeno; R2 è un estere glicinato (Gly) configurato per coniugazione con un linker auto-immolativo ad un peptide; R3 è (C1-C6) alchil; R7 ed R8, sono presi assieme per formare un anello di ciclopropil o ciclobutil; R9 è un idrogeno, (C1-C6) alchil, (C2-C6) alchenil, (C2-C6) alchinil, (CH2)m-(C3-C5) cicloalchil o benzil; RIO, R4 è un idrogeno o (C1-C6) alchil; RI I è un idrogeno, (C1-C6) alchil, fenil o benzil; R è un idrogeno o (C1-C6) alchil o CH2C6H3ClOCH3; Y è CH, O, NR12, S, SO, S02, RI 2 è un idrogeno o (C1-C3) alchil; R6 è (C1-C6) alchil, sostitutivo (Cl-C6)alchil, (C3-C8)cicloalchil, sostitutivo (C3-C8)cicloalchil, un eteroaromatico o gruppo sostitutivo eteroaromatico o un gruppo con formula (IA), (IB) O (IC).
- 3. Il coniugato della rivendicazione 2, in cui R2 è Gly-Χ-α-β, dove: X è selezionato da un gruppo consistente di H oppure O oppure CI -CI 2 alchil; a è un linker auto-immolativo; β è un peptide;
- 4. Il coniugato delle rivendicazioni 1, 2 o 3, in cui il peptide è un neuropeptide che si lega al recettore 2 della dopamina.
- 5. Il coniugato della rivendicazione 4, in cui il neuropeptide è la dopamina o analoghi della dopamina selezionati da un gruppo che consiste in: Apomorfma, Bromocriptina, Cabergolina, Ciladopa, Diidroergocriptina, Quinagolide, Ropinirolo, Salvinorin A, Sumanirole.
- 6. Il coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui il linker auto-immolativo è un linker auto-immolativo idrofllico.
- 7. Il coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5, in cui il linker auto-immolativo è 5-Nitruro-l-pentanone-PEG-Val-Cit-Pro-Gly.
- 8. Il coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui il detto coniugato ha formula (III) dove la parte bersagliante è DRBP (Peptide Legante al Recettore della Dopamina).
- 9. Il coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 7, in cui il detto coniugato ha la formula (IV) dove la parte bersagliante è la Dopamina.
- 10. Il coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 per uso nel trattamento terapeutico del cancro.
- 11. Il coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 9 per uso nel trattamento terapeutico dei tumori neuroendocrini (NETs) e delle cellule staminali NETs.
- 12. Il coniugato secondo ognuna delle rivendicazioni da 1 a 9 per uso nella diagnosi terapeutica del cancro.
- 13. Il coniugato per uso secondo la rivendicazione 12, comprendente un peptide legante al recettore 2 della dopamina accoppiato per via di un agente chelante o covalentemente ad un radionuclide selezionato da un gruppo che include 18F, 64Cu, 68Ga, 66Ga, 60Cu, 61 Cu, 62Cu, 89Zr, 1241, 76Br, 86Y e 94mTc.
- 14. Il coniugato per uso secondo la rivendicazione 13, dove l’agente chelante è selezionato da un gruppo che include DOTA, NOTA, CB-TE2A o NODAGA.
- 15. Il coniugato per uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 12, 13 o 14, dove il coniugato è somministrato in una quantità diagnosticamente efficiente, come una dose di 100-500 MBq, seguito da una scansione PET o MRI 1⁄2-24 h dopo che il coniugato è stato somministrato, e quantificato tramite SUV max e/o SUV media.
- 16. Il composto farmaceutico consistente in un coniugato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 15 da solo o come ingrediente attivo in una miscela.
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