HUT74413A - A novel tumor suppressor gene - Google Patents

Description

A találmány tárgyát a tumorszuppresszor gének (antionkogének) képezik, valamint a találmány tárgyát képezik általában a különböző humán rákmegbetegedések széles spektrumú tumorszuppresszor gén terápiájának termékei és módszerei. Pontosabban, a találmány tárgyát képezik a tumorsejtek kezelési módszerei, azaz (1) az alábbiakban H-NUC néven említett új fehérjét kódoló nukleinsav szekvenciát tartalmazó vektorok beadása vagy (2) a nukleinsav szekvencia által kódolt fehérje hatékony mennyiségének beadása.

A különböző rákok és tumorok a második leggyakoribb halálokok az Amerikai Egyesült Államok-ban,

450,000 halálesetet okozva

Minden három amerikai közül egyben rák fejlődik ki, és

hal meg [ Scientific American
Miközben	j elentős	előrelépő
környezeti	és örö	klődő okai
sításában,	a rák	halálozási
hogy a	rák,	valamint
rendellenességek	kezelésébei

z amerikai közül egy rákban Medicine, 12 I, 1 (1987)] , történt a rák valószínű közül néhánynak az azonostatisztikája azt mutatja, a rokon betegségek és jelentős javulásra van szükség.

Számos úgynevezett rák gént, azaz olyan géneket, amelyek a rák szerepet játszanak a rák kóroktanában, azonosítottak már a rák örökölhető formáival kapcsolatban, valamint nagyszámú jól tanulmányozott tumorsejtben. A rák gének tanulmányozása segített abban, hogy valamennyire megértsük a tumorigenezis folyamatát. Jóllehet még nagyon sokat kell tanulnunk a rák génekről, a jelenleg ismert rák gének hasznos modellként szolgálnak a tumorigenezis megértéséhez.

A rák géneket széles körben onkogének-re osztályozzák, amelyek, hogy ha aktiválódnak, elősegítik a tumorigenezist, valamint tumorszuppresszor gének-re osztályozzák, amelyek, ha tönkremennek, nem képesek elnyomni a tumorigenezist. Míg ezek az osztályozások hasznos eszközök a tumorigenezis megismerésében, az is lehetséges, hogy egy bizonyos gén eltérő szerepet játszik, attól függően, hogy a gén milyen allélformában van, valamint függ a szabályozó elemeitől, a genetikai háttértől valamint attól a szövetkörnyezettől, amelyben működik.

A rák egyik széles körben elfogadott munkahipotézise a következő: (1) A humán rákok közül a legtöbb genetikai betegség és (2) specifikus gének expressziójából és/vagy expressziójának hiányából származik (azaz normál sejtes növekedést biztosító szabályozó gének mutáns verziói vagy emlős sejtekben levő virális vagy egyéb idegen gének, amelyek egyéb csoportba tartozó, létfontosságú növekedés···· · · ·· • · · * · · · ·· · · · ··· ··· szabályozó gének nem megfelelő, nem megfelelő idejű vagy nem megfelelő helyen történő expresszióját okozzák).

A neoplázia biológiai alapjának egy leegyszerűsített megközelítése az, hogy az onkogéneknek két fő osztálya létezik. Az első osztály normális celluláris gének mutált, vagy egyéb módon aberrált alléljeit tartalmazza, amelyek a sejtes növekedés vagy replikáció szabályozásábán játszanak szerepet. Ezek a gének a celluláris protoonkogének. Ha elmutálnak, akkor új sejtfunkciókat kódolhatnak, amelyek elrontják a normális és replikációt. Ezeknek a változásoknak a az, hogy dominánsan expresszálódó tumor sej tnővekedést következménye fenotipus jön létre. Ebben a dominánsan expresszálódó onkogén modellben, amely azóta uralkodó nézet, amióta a neoplázia genetikai és mutációs alapjának a koncepciója felmerült, az az elképzelés, hogy egyetlen vad tipusú alléi állandó létezése nem elegendő ahhoz, hogy megelőzzük a neoplasztikus változásokat a sejt növekedési programjában vagy a sejt növekedési tulajdonságaiban. Ezeknek az onkogéneknek az aktiválásáért felelős genetikai eseményeket ennélfogva egytalálatos eseményeknek tekinthetjük.

A Burkitt limfómában a mye onkogén tumorigén aktivitásai nak aktiválása, a bcr-abl kiméra géntermék expressziója krónikus mielogén leukémiában szenvedő betegekben, a Hras és a K-ras onkogének aktiválódása más tumorokban, ez az a néhány bizonyíték arra, hogy ilyen transzformáló onkogének szerepet játszanak a klinikai humán rákban. A ···· ·· · · · · · · ··· dominánsan expresszálódó neoplasztikus betegség genetikai alapú terápiájának megközelítése valószínűleg a felelős gének specifikus kikapcsolását vagy expressziójának inaktiválását fogja tartalmazni.

A rákhoz kapcsolódó géneknek egy újonnan felfedezett családja az úgynevezett tumorszuppresszor gének, amelyeket néha antionkogéneknek, növekedés szuppresszoroknak vagy rák-szuppresszor géneknek is neveznek. A legfrissebb kutatások erősen azt sugallják, hogy a géneknek ebben az osztályában legvalószínűbb, hogy funkció-vésztő mutációk játszanak szerepet a humán rákok nagy százalékának kifejlődésében; több mint egy tucat jó humán tumorszuppresszor gén jelöltet azonosítottak számos humán rákban. A retinoblasztóma (rb), emlő-, vastagbél- és egyéb karcinóma (p53), Wilm féle tumorok (wt) és vastagbél karcinóma (dcc) patogenezisében szerepet játszó tumorszuppresszor géneket azonosították már és klónozták. A humán tumorigenezisben játszott szerepük néhány esetét már tudj ák.

A retinoblasztóma gén (RB) a tumorszuppresszor prototípusa. A gén mutációját számos különböző humán tumorban megtalálták [ Bookstein és Lee: Crit. Rév. Oncog. 2, 211-227 (1991); Goodrich és Lee: Biochem. Biophys.

Acta 1155, 43-61 (1993); Riley és mtsai: Annu. Rév.

Cell. Bioi. 10, 1-29 (1994)] . Ha a normál RB egyetlen másolatát újra visszajuttatjuk tumorsejtekbe, akkor ez elnyomja a sejteknek azt a képességét, hogy tumorokat

hozzanak létre meztelen	egerekben [ Huang	és	mtsai:
Science	242, 1563-1566 (1	988); Sümegi és mtsai:	: Cell
Growth	Differ. 1, 247-250	(1990); Bookstein	és	mtsai:
Science	247, 712-715 (1990)	ι ; Chen és mtsai:	Cell	Growth
Différ.	3, 119-125 (1992);	Goodrich és mtsai	: Can	. Rés .

52, 1968-1973 (1992); Takahashi és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 5257-5261 (1991)] . Emellett, ha foszforilezetlen Rb fehérjét mikroinjekciózunk a sejtciklus korai G1 fázisában levő sejtekbe, akkor ez blokkolja az S fázisba való lépést, sugallva ezzel, hogy az Rb fehérje alapvetően a sejtnövekedés szabályozási folyamataiban vesz részt [ Goodrich és mtsai: Cell 67, 293-302 (1991)] . Ezeket az eredményeket tovább hitelesítik a génsebészeti úton megváltoztatott egérvonalakban tett megfigyelések. Az Rb fehérje túlexpressziója egy humán RB transzgénről a szervezet szintjén a növekedés késleltetését eredményezi [ Bignon és mtsai: Genes Dev. j_, 1654-1662 (1993)] . Ezen túlmenően, ha egérembriókban teljesen kikapcsoljuk a funkcionális Rb expresszióját az RB gén homozigóta inaktiválásával, akkor a fejlődés idő előtt leáll, és az embriók a méhben elpusztulnak [ Lee és mtsai: Natúré 359, 288-294 (1992); Jacks és mtsai: Natúré 359, 295-300 (1992); Clarké és mtsai: Natúré 359, 328-330 (1992)] .

Ezek a kísérletek lényeges adatokat szolgáltatnak ahhoz, • · · · hogy megállapítsuk az Rb fehérje fontosságát a sejt in vivő növekedésében és differenciálódásában.

Az RB gén egy sejtmag fehérjét kódol, amely mind a szerin- mind a treonin-csoportokon foszforilezve van, sejtciklustól függő módon [ Lee és mtsai: Natúré 329, 642645 (1987); Buchkovich és mtsai: Cell 58, 1097-105 (1989); Chen és mtsai: Cell 58, 1193-1198 (1989); DeCaprio és mtsai: Cell 58, 1085-1095 (1989)] . A sejtciklus G1 fázisában, akkor, amikor a mikroinjekciós kísérletek tanúsága szerint a fehérje aktív, az Rb hipofoszforilezett állapotban van [ Goodrich és mtsai: Cell 67, 293302 (1991); Goodrich és Lee: Natúré 360, 177-179 (1992)] .

Hipofoszforilezett Rb létezik a G0 fázisban is. Úgy tűnik, hogy nagyon fontos szerepet játszik abban, hogy fenntartsa a sejteket ebben a nyugalmi állapotban, amelyben arra várnak, hogy külső jelekre reagáljanak és eldöntsék, hogy belépjenek a sejtciklusba vagy differenciálódjanak [Goodrich and Lee: Biochem. Biophys. Acta 1155, 43-61 (1993); Pardee, A.B.: Science 246, 603-608 (1989)] .

A késői Gl, S és M fázisban az Rb hiperf oszf ori-

leződik, valószínűleg	a kinázok CDK családjának tagjai
révén [ Lees és mtsai:	EMBO J. 10, 4279-4290 (1991); Lin
és mtsai: EMBO J. 10,	857-864 (1991); Hu és mtsai: Mól.

Cell. Biology 12, 971-980 (1992)] . Úgy tűnik, hogy az Rb bizonyos csoportjainak foszforileződése lehetővé teszi a

sejt számára, hogy

elkötelezze magát a szaporodás

• · ···· ·· ·· • · · · · · ···· ·· · · ····

mellett. Az

Rb feherje foszforilezesi mintázata korrelá-

cióban van a növekedést gátló funkciójával, ennélfogva az

a jelenleg	elfogadott hipotézis, hogy a foszforilezés
negatívan	szabályozza a fehérje növekedést elnyomó
funkciój át	[ Hollingswoth és mtsai: Curr. Opin. Génét.

Dev. 3, 55-62 (1993); Sherr, C.J.: Trend Cell. Bioi. 4_,

15-18 (1994)] . Az Rb fehérje defoszforilezése az M-fázis közepén játszódik le, és ennek eredménye a fehérje reak-

tiválása a	következő sejtciklus előtt. A bizonyítékok
erősen azt	sugallják, hogy az 1-es típusú fehérje

foszfatáz kritikus tényező ebben a defoszforilezésben [ Alberts és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 90, 388-392 (1993); Durfee és mtsai: Genes Dev. 7, 555-569 (1993)] .

Még nem sikerült teljesen kideríteni azt a molekuláris mechanizmust, amely révén az Rb részt vesz ezekben a celluláris aktivitásokban. A jelenleg elfogadott modell szerint az Rb számos különböző fehérjével lép kölcsönhatásba, és a funkcióját ezeken a komplexeken keresztül tudja ellátni. Ha az Rb fehérjének az a funkciója, hogy a

sejteket a

G0/G1 fázisban tartsa, akkor az Rb-nek meg

kell szereznie és inaktiválnia kell a másik fehérjé (ke)t, amely(ek) aktív(ak) és lényegesek ahhoz, hogy a G1 előrehaladjon [ Lee és mtsai: CSHSOB, LV1: 211-

217 (1991)]	. Ez a megszerzési hipotézis összhangban van
azokkal a	friss megfigyelésekkel, hogy egy fontos
növekedést	fokozó transzkripciós faktort, az E2F-l-et

• · · · · · · • « · · · · ···· ·« ·· ···· ···

szorosan	szabályozza az Rb, negatív módon	[ Helin	és
mtsai: Cell 70,	337-350 (1992); Kaelin és mtsai: Cell	70,
351-364 (	;1992);	Shan és mtsai:	Mól. Cell.	Biology	12,
5620-5631	(1992)	; Helin és mtsai:	Mól. Cell.	Biology	13,
6501-6508	(1993)	; Shan és mtsai:	Mól. Cell.	Biology	14,
229-309 (	1994)] .	Az alábbiakban	ismertetett	fehérje	r a

H-NUC, kötődik az Rb fehérjéhez, és igy részt vesz a mitózis szabályozásában.

A családi emlőrák génjét, a BRCA-l-et a 17 q21-22 kromoszómára térképezték, kapcsolási elemzés alapján. Az nem tiszta, hogy ez a gén tumorszuppresszorként vagy domináns onkogénként viselkedik. Azonban az emberi családi rák szindróma, azaz például a Li-Fraumeni szindróma, a p53, láthatóan úgy működik mint egy klasszikus tumorszuppresszor; hasonlóképpen, az RB gén elvesztése az öröklődő retinoblasztómához kötődik [ Knudson, 1993] .

A transzformáló onkogének és a tisztán recessziv tumorszuppresszor gének ezen két extrém képe között található számos egyéb mechanizmus, amelyek nyilvánvalóan részt vesznek a számos humán tumorra jellemző neoplasztikus változásokban. Több éve feltételezik, hogy a legtöbb emberi rák valószínűleg több interaktív genetikai defektusból származik, amelyek közül egyedül egy sem elegendő, viszont mindegyikre szükség van ahhoz, hogy a tumor kifejlődjön. Mind a celluláris protoonkogének mind a növekedés-szabályozó tumorszuppresszor gének igazi szerepéről az emlős sejtek neopláziájában azt gondolják,

hogy az említett két fajta gén közötti kölcsönhatások komplex csoportját képviselik.

A jelen találmány alapját tumorszuppresszor képességgel rendelkező új fehérjét (H-NUC) kódoló nukleinsav molekula képezi. A nukleinsav molekulát a 17-es kromoszóma q21-22-es régiójba térképezték. A H-NUC tulajdonságai (a teljes hosszúságú cDNS-ből származó aminosav szekvencia; a DNS-kötő és transzkripció aktiváló képesség; a kódoló szekvencia elvesztése vagy átrendeződése néhány emlőtumor sejtvonalban) mind összhangban vannak azzal, hogy a H-NUC egy sejtmag fehérje és tumorszuppresszor fehérje. Az újonnan felfedezett teljes hosszúságú cDNS egy új, 824 aminosavból álló fehérjét kódol. Az új fehérje tíz darab, 34 aminosavból álló ismétlődést tartalmaz, amely a TPR (tetratriko peptid) fehérjecsaládra jellemző.

Ismertetjük a nukleinsav és a H-NUC fehérje alkalmazásával működő diagnosztikai módszereket. A jelen találmány tárgyát képezi továbbá a vad típusú H-NUC tumorszuppresszor gén vagy fehérje beadása, a neoplasztikus fenotípus elnyomására, eltörlésére vagy visszafordítására már létrejött ráksejtekben, amelyek nem rendelkeznek endogén vad típusú H-NUC fehérjével. A neoplasztikus fenotípus elnyomása egyben elnyomja vagy eltörli az ilyen ráksejtek abnormális tömegét, azaz a tumorokat, amely egyben csökkentheti az ilyen tumoroknak állatokra gyakorolt terhelését, és ez egyben meghosszabbíthatja a kezelt • · · · • · · · · · · • · · · · · ···· ·· ·· ···· ··· állatok túlélését. A neoplasztikus tulajdonságok közé, amelyeket ellenőrzünk és visszafordítunk, tartozik a morfológia, a növekedés, és legjelentősebb módon azoknak a ráksejteknek a tumorigenicitása, amelyekből hiányzik a normál H-NUC fehérje. Tehát a tumorsejtek által okozott megterhelés csökkentése egy állatban a neoplasztikus fenotípus szuppressziójának a következménye, a vad típusú H-NUC tumorszuppresszor gén beadását követően. A neoplasztikus fenotípus kifejezés a sejt jellemzőiben beálló fenotípusos változásokra utal, azaz például· a morfológiában, a növekedési sebességben (azaz például a kettőződési időben), a telítési sűrűségben, a lágyagar telepképződésben és a tumorigén hatásban beálló változásra .

A jelen találmány tárgyát képezik tehát a H-NUC-ot kódoló vektorok és a H-NUC fehérjék a tumorok vagy a rákok kezelésében való alkalmazás céljából, valamint eljárások vektorok és H-NUC fehérjék készítésére, amelyek használhatók a kezelési eljárásokban.

A találmány tárgyát képezik továbbá az emlősök, azaz például az emberek kezelését célzó eljárások, valamint az abnormálisán szaporodó sejtek, azaz például rák- vagy tumorsejtek kezelési eljárásai vagy a neoplasztikus fenotípus szuppressziója. Általánosságban a találmány tárgyát képezi az abnormálisán szaporodó sejtek kezelése, vagy olyan emlősök kezelése, amelyek abnormálisán szaporodó sejtekkel jellemezhető betegségben szenvednek, • · · · · · ···· ·· ·· ···· ··· bármely ismert módszerrel, amelyről ismert, hogy lehetővé teszi a gazdasejt kompatibilis H-NUC-ot kódoló vektornak vagy egy H-NUC fehérjének, hogy bejusson a kezelendő sejtekbe, és igy elérhető a szaporodás elnyomása.

Az egyik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás abnormálisán szaporodó sejtekkel jellemezhető betegség kezelésére, emlősben, úgy, hogy az abnormálisán szaporodó sejtekbe bejuttatjuk az expressziós vektort, és az abnormálisán szaporodó sejtekben expresszáljuk a H-NUC-ot, olyan mennyiségben,amely elegendő ahhoz, hogy elnyomjuk ezen sejtek szaporodását. Az expressziós vektort az abnormálisán szaporodó sejtekbe vírusfertőzéssel vagy transzdukcióval, liposzóma által közvetített transzfekcióval, polibrén által közvetített transzfekcióval, CaPO₄ által közvetített transzfekcióval és elektroporációval juttatjuk be. A kezelést szükség esetén megismételjük. Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy emlősben abnormálisán szaporodó sejtek kezelésére, oly módon, hogy egy H-NUC-ot kódoló expressziós vektort viszünk be az abnormálisán szaporodó sejtekbe, és a H-NUC-ot olyan mennyiségben expresszáljuk bennük, amely elég ahhoz, hogy elnyomjuk ezeknek a sejteknek a szaporodását. A kezelést szükség esetén megismételjük.

Egy alternatív megvalósítási mód szerint a találmány tárgyát egy olyan DNS molekula képezi, amely képes elnyomni egy abnormálisán szaporodó sejt növekedését. A

DNS molekula egy Rb-t kötő fehérjét kódol, amelyben van egy alszekvencia, amely legalább 60%-os homológiát mutat kilenc tetratrikopeptid ismétlődéssel a C-terminálison, azzal a feltétellel, hogy a DNS molekula ugyanakkor nem kódol Saccharomyces pombe élesztő NUC 2, Aspergillus nídulans bimA és CDC27 fehérjét is. Egy ilyen Rb-t kötő fehérjére példa a H-NUC fehérje, amelynek aminosav szekvenciája lényegében azonos a 2. számú szekvenciában találhatóval. Egy sokkal előnyösebb megvalósítási mód szerint a DNS molekula szekvenciája az 1. számú szekvencia, és egy expressziós vektor expresszálja. Az expressziós vektor lehet bármely gazdasejt-kompatibilis vektor. A vektor előnyösen az alábbi csoportból választható: retrovirális vektor, adenovirális vektor és egy herpeszvírus vektor.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya egy H-NUC fehérje, amelynek aminosav szekvenciája lényegében azonos a 2. számú szekvenciával, valamint ennek biológiailag aktív fragmensei.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy H-NUC fehérje előállítására, amely eljárás a következő lépésekből áll: egy H-NUC-ot kódoló gént tartalmazó kompatibilis vektort bejuttatunk egy gazdasejtba, majd a gazdasejttel expresszáltatjuk a H-NUC fehérj ét.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy emlősben levő abnormálisán szaporodó • · · · · · • · · · ·· ·» ···· ··« sejtek kezelésére, a következő lépésekben: a kezelésre szoruló állatból eltávolítunk egy szövetmintát, amely az abnormálisán szaporodó sejteket tartalmazza; a kezelésre szoruló szövetmintát egy H-NUC-ot kódoló expressziós vektor hatékony dózisával hozzuk érintkezésbe; a H-NUC-ot expresszáljuk az abnormálisán szaporodó sejtekben, olyan mennyiségben, amely elegendő ahhoz, hogy elnyomja az abnormálisán szaporodó sejtek szaporodását. A kezelést szükség szerint megismételjük; majd a kezelt szövetmintát visszavisszük az eredeti vagy egy másik állatba. Az ex vivő kezelt szövet előnyösen vér vagy csontvelő.

Egy másik megvalósítási mód szerint a találmány tárgya eljárás egy emlősben abnormálisán szaporodó sejtekkel jellemezhető betegség kezelésére, amely eljárás a következő lépéseket tartalmazza: a H-NUC fehérjét az abnormálisán szaporodó sejtekkel jellemzett betegségben szenvedő emlősnek adjuk be, úgy, hogy a H-NUC fehérjét olyan mennyiségben juttatjuk be az abnormálisán szaporodó sejtekbe, amely hatékonyan elnyomja az abnormálisán szaporodó sejtek szaporodását. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a H-NUC fehérjét liposzómákba zárjuk a kezelendő sejtekbe való bejuttatás céljára. A kezelést szükség esetén megismételjük.

A találmány tárgyát képezik továbbá a H-NUC génnel hibridizálódni képes oligonukleotid fragmensek, valamint az ilyen fragmenseket alkalmazó eljárások. Ezek az oligonukleotidok legalább 5 nukleotidot tartalmaznak, de azok • · ···· ·· · ·

az előnyösek, amelyek legalább 20-30 nukleotidot tartalmaznak. Ezeket az oligonukleotidokat adott esetben radioaktív izotópokkal jelezhetjük (azaz például trícium, z 35 foszfor es ken), vagy jelezhetjük enzimekkel (azaz például alkalikus foszfatáz és tormaperoxidáz), fluoreszcens vegyületekkel (azaz például fluoreszcein, etidium, terbium-kelát) vagy kemilumineszcens vegyületekkel (azaz például akridínium észterekkel, izoluminollal és hasonlókkal). Ezek, valamint egyéb jelzések, amelyeket például a szakirodalomban közölnek [ Non-isotopic DNA Probe Techniques, L.J. Kricka, szerk., Academic Press, New York (1992)], amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk, használhatók az ismertetett oligonukleotidokkal. Használhatók DNSpróba vizsgálatokban a szokványos formában, azaz Southern biot és Northern biot formájában. Ezeknek a szokványos formáknak a leírása megtalálható a szakirodalomban [Nucleic Acid Hybridisation - A Practical Approach, szerk.: B.D. Hames és J. Higgins, IRL Press, Washington D.C. (1985)], amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk. Ezek a próbák előnyösen képesek hibridizálódni a H-NUC énnel szigorú körülmények között. Az oligonukleotidok használhatók primerként is polimeráz láncreakciós technikákban, a leírások szerint [ többek között például: PCR Technology, szerk.: H.A. Ehrlich, Stockton Press, New York (1989)] .

···· · · · · · • · ··· · ♦ • « « · · · ···· · · ·· ·*· · ···

Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.

Az 1A. és 1B. ábrákon az látható, hogy az RB hasonló régióira van szükség ahhoz, hogy a H-NUC és a T antigén kötődjön egymáshoz. Az 1A. ábra sematikus ábrázolása a kötődő domének meghatározására használt Gall4-RB fúziónak. A Gal4 DNS-kötő domént (1-147-es aminosavak) fúzionáltatjuk a különböző RB mutánsokhoz. Az RB T/E1Akötő doménjei vonalkázott négyszögek formájában láthatók. A mutáció által érintett doméneket pontozott négyszögek formájában mutatjuk be. Az 1B. ábrán a H-NUC és az RB mutánsok kölcsönhatásának kimutatása látható in vivő. Az Y153-at ko-transzformáljuk a Gal4-RB mutánsok jelzett csoportjával, és vagy a Gal4-(H-NUC) expressziós klónnal (Gal4-(C-49)) vagy az YIpPTGlO-zel. A β-galaktozidáz aktivitás klórfenil-vörös-p-D-galaktopiranozid kolorimetriás vizsgálattal való meghatározását három párhuzamosban végezzük, Durfee és munkatársai leírása szerint [ Durfee és mtsai: Genes Devel. 7, 555-569 (1993)] , amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk.

A 2A. és 2B. ábrán az látható, hogy a H-NUC kötődik a foszforilezetlen RB-hez. A 2A. ábrán a GST és a leolvasási fázisban levő GST fúziók láthatók a H-NUC-ot kódoló cDNS-sel (GST-491) és az SV40 T antigén (GST-T) 273 N-terminális aminosavával, Escherichia coli-ban expresszálva. A GST-t és a GST fúziókat glutationSepharose gyöngyökhöz kötjük, majd alaposan mossuk. A mintákat az SDS-poliakrilamid gél Coomassie-blue-val való megfestésével értékeljük ki mennyiségileg, és ekvivalens mennyiségű fehérjét használunk minden egyes sávban. A 2B. ábrán látható kivonatokat WR2E3 sejtekből állítjuk elő, amelyeket a megkötött mintákkal kevertünk össze 30 percre, szobahőmérsékleten. Az alapos mosást követően a komplexeket SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztjuk és immunblottoláshoz transzferáljuk. A jelenlevő RB fehérje mennyiségét és foszforilezettségének mértékét WR2E3 sejtekben immunprecipitációval határozzuk meg, 11D7 anti-Rb monoklonális ellenanyagot használva. A biottot 11D7 anti-RB monoklonális ellenanyaggal mint próbával vizsgáljuk, majd fluorográfiával tesszük láthatóvá.

A 3. ábrán a teljes hosszúságú H-NUC cDNS és fehérje nukleotid szekvenciája (1. számú szekvencia) és a számított aminosav szekvencia (2. számú szekvencia) látható.

A 4A. és 4B. ábrákon látható, hogy a teljes hosszúságú H-NUC a fehérjék tetratrikopeptid ismétlődéses (TPR) családjának egy tagját kódolja. A 4A. ábrán látható a tíz darab 34 tagból álló polipeptid ismétlődéses egység helye a H-NUC-ban, a Schizosaccharomyces pombe nuc2+ és az Aspergillus nidulans bimA fehérjékben, a 4-30. számú szekvenciákban. A vázlat a tíz (0-9) 34-tagú polipeptid egység ismétlődés (TPR) helyét mutatja a nuc2+, H-NUC és bimA fehérjékben. A sűrűn rovátkázott négyszögekkel jelzett három polipeptid 3-as ismétlődő egységéből áll, • · jelzése 34v-ismétlődés, hiányzik a megőrződött motívum. A 4B. ábrán a 9 TPR egység-ismétlődés (1-9) aminosav szekvenciájának egymáshoz igazítása látható a nux2+, H-NUC és bimA fehérjékben 4-30. számú szekvenciák). A konzerválódott csoportokat bekereteztük. Mindhárom fehérjének a 6os TPR ismétlődő egysége egy glicincsoportot tartalmaz a 6-os pozícióban. A nuc2 β-os ismétlődésében levő Gly6-ról azt gondoljuk, hogy az esszenciális.

Az 5A. és 5B. ábrákon látható, hogy a H-NUC C-terminális TPR ismétlődései kötődnek az RB fehérjéhez. Az 5A. ábra sematikus ábrázolása a kötő domének meghatározására használt Gal4-H-NUC fúzióknak. A Gal4 transzaktivációs domént különböző H-NUC deléciós mutánsokhoz fúzionáltatjuk. A H-NUC TPR egység ismétlődéseit keresztvonalkázott négyszögek formájában ábrázoljuk. Az 5B. ábrán az RB és a H-NUC deléciós mutánsok in vivő kölcsönhatásainak kimutatása látható. Az Y153-at ko-transzformáljuk a Gal4H-NUC mutánsok jelzett csoportjával, valamint vagy a Gal4-RB2-vel vagy a Gal4-H209-cel. A β-galaktozidáz aktivitás CPRG mennyiségi meghatározását minden egyes transzformációnál három párhuzamosban végezzük el.

A 6A. és 6B. ábrákon látható mutáció a 640-es aminosav pozícióban levő esszenciális glicinben hőmérsékletérzékeny H-NUC mutánst hoz létre, amelynek eltűnik az RBhez való kötődése a non-permisszív hőmérsékleten. A 6A. ábrán láthatók a H-NUC aminosav helyettesítéseinek részletei (640D) (31-33. számú szekvenciák). A nuc2 • · esszenciális glicin (G) aminosavát (540-es aminosav) aszparaginsav (D) helyettesíti (34-35. aminosav szekvenciák) a hőmérséklet-érzékeny mutánsban. így a H-NUC 640es pozíciójában levő glicint aszparaginsavra változtatjuk (D) . A 6B. ábrán a kölcsönhatás látható az RB és a HNUC(640D) mutáns között 37 °C-on. Az Y153-at ko-transzfor máljuk a Gal4-RB2-vel és vagy a Gal4-H-NUC-cal vagy a Gal4-H-NUC(640D)-vei. A transzformánsokat folyadéktenyészetben szaporítjuk 28 °C-on, 24 óra hosszat. A éjszakán át szaporított élesztőtenyészeteket friss táptalajjal hígítjuk, majd 37 °C-on szaporítjuk. Az élesztőtenyészetből különböző időpontokban alikvot részeket veszünk ki, hogy meghatározzuk az élesztő növekedését és β-galaktozi dáz aktivitását. A β-galaktozidáz aktivitás CPRG meghatározását három párhuzamosban végezzük minden egyes transzformálásnál .

Α 7A. és 7B.

látható H-NUC ellen, sejtvonalakban. A 7A.

ábrákon az antiszérum termelődése valamint a H-NUC kimutatása humán ábrán a Gst-491 fúziós fehérjéket használjuk egerek immunizálására.

A preimmun szérumot (Ιimmunszérumot (2-es sáv), a

Gst fehérjével előinkubált immunszérumot sáv) , és a Gst-491 fehérj ével előinkubált immunszérumot (4-es használjuk az immunprecipitációhoz. ³⁵S-jelzett sejtlizá tumokat készítünk K-562 sejtekből. Az immunprecipitációhoz azonos mennyiségű sejtlizátumot használunk. A

kapott immunprecipitátumokat SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel választjuk szét. A 7B. ábrán ³⁵S-sel jelzett sejtlizátumokat állítunk elő CV-1 sejtekből. Azonos mennyiségű sejtlizátumot használunk az immunprecipitációhoz preimmun szérummal (1-es sáv) vagy immunszérummal (2-es és 3-as sáv). A kapott immunprecipitátumokat 200 μΐ 2%-os SDS-t tartalmazó oldatban forralva denaturáljuk (3-as sáv), majd 200 μΐ NETN pufferrel hígítjuk. Az immunprecipitátumokat SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel választjuk szét. A nyíllal jelzett 90 kDa méretű fehérjét specifikusan felismeri az immunszérum .

A 8. ábrán látható, hogy a H-NUC fehérjének DNS-kötő aktivitása van. A K562 sejtek ³⁵S-sei metabolikusan jelzett fehérje-1izátumait kétszálú burjútimusz DNScellulóz oszlopon bocsátjuk át, majd növekvő koncentrációjó nátrium-kloriddal eluáljuk. Az eluátumokat vagy (A) 117 monoklonális ellenanyaggal immunprecipitáljuk az RB fehérje lokalizálására, vagy (B) a H-NUC-ot felismerő immunszérummal, a H-NUC lokalizálására. Az eluátumok alikvot részeit glutation sepharose gyöngyökkel való inkubálásra is használjuk.

A 9. ábrán látható, hogy a H-NUC a 17q21-22 kromoszómán található.

A 10A. és 10B. ábrán az emlőtumor sejt DNS Southern biot elemzése látható H-NUC DNS-t használva próbaként. A DNS-t extraháljuk a sejtvonalakból és EcoRI-gyel • * · · · · · • · · · ♦ * ···· ♦· · · ···· ·«· emésztjük. A 10A. ábrán látható, próbával vizsgált sejtvonalak blotjai mind normálisak. A 10B. ábrán a H-NUC gén homozigóta deléciója nyilvánvaló a T47D és MB157 sejtvonalakban. Heterozigóta deléció fordul elő az MB231, BTO578-7 és BT549 sejtvonalakban, amit a 14 kilobázis méretű EcoRI fragmenshez való csökkent hibridizáció jelleme z .

A 11. ábrán látható, hogy az AC-H-NUC in vitro T-47D emlőtumor sejtekben gátolja a a sejtnövekedést. A bal felső a 3 napig ACN-nel fertőzött (MOI 10) MDA-MB-231 sejteket mutatja, kristályibolyával festve. A jobb felső az ACN-nel fertőzött (MOI 10) T-47D sejteket mutatja. A bal alsó az AC-H-NUC-cal fertőzött (MOI 10) MDA-MB-231 sejteket mutatja. A jobb alsó az AC-H-NUC-cal fertőzött T-47D sejteket mutatja. A (+/-) olyan MDA-MB-231 sejteket mutat, amelyek a H-NUC-ra nézve heterozigóták. A (-/-)szál jelzett T-47D sejtek a H-NUC homozigóta delécióját mutatják [ Lee, W.H.] . Az AC-H-NUC egy rekombináns humán adenovirus, amely a H-NUC tumorszuppresszor gént a humán CMV promoter ellenőrzése alatt tartalmazza. Az ACN ugyanaz a rekombináns humán adenovirus vektor, de nem tartalmazza H-NUC tumorszuppresszor gént.

A 12. ábrán az látható, hogy az AC-H-NUC ín vitro elnyomja a T-47D tumorsejt növekedését. A T-47D (a H-NUC kivágva) és az MDA-MB-231 (a H-NUC-ra nézve heterozigóta) emlőrák sejteket 96-lukas lemezekre szélesztjük,, majd AC-H-NUC-cal vagy ACN-nel kezeljük 10-es és 100-as fertőzési multiplicitás mellett (négy párhuzamosban). A sejteket 5 napig hagyjuk növekedni, majd ³H-timidint viszünk be a sejt nukleinsavába, és ennek mennyiségét használjuk a szaporodás mértékének meghatározására. Az

AC-H-NUC-ra vonatkozó adatokat (átlag ± SD) az ACN kont-

roll átlagos szaporodása százalékában ábrázoljuk, a megfelelő MOI értéknél.

A 13. ábrán látható, hogy az AC-H-NUC elnyomja a T47D sejtek szaporodását meztelen egerekben. A T-47D humán emlőrák sejteket ex-vivo ACN-nel vagy AC-H-NUC-cal kezeljük, 30-as fertőzési multiplicitásnál (N=4/csoport). Körülbelül 10⁷ sejtet injekciózunk bőr alá meztelen egerek lágyékába, mindegyik állat ACN-nel kezelt sejteket kap az egyik ágyékába és AC-H-NUC-cal kezelt sejteket kap a kontralaterális ágyékába. A tumorok méretét tapintókörzővel mérjük, majd a tumortérfogatokat szférikus geometria feltételezésével becsüljük meg. Az átlagos (±SD) tumortérfogatokat az ACN és AC-cBTSG sejtekből származó tumorokkal szemben ábrázoljuk. A kezeletlen sejtekből származó bilaterális tumorok átlagos (±SD) térfogatát is ábrázoljuk összehasonlítás céljából.

A jelen találmány tárgya egy új, H-NUC	jelű emlős
fehérje. A H-NUC 824 aminosavat tartalmaz	(3 . ábra) ,
molekulasúlya körülbelül 95 kDa és kiderült	róla, hogy

kölcsönhatásba lép a foszforilezetlen, teljes hosszúságú retinoblasztóma (RB) fehérjével. Az is kiderült, hogy a

H-NUC származékok, azaz például a H-NUC fehérje csonki-

tott verziója, amely az utolsó hat TPR régiót (tetratrikopeptid, 34 aminosavból álló ismétlődések) tartalmazza a C-terminális régióban, azaz, másszóval az 559770-es aminosavakat tartalmazza, kötődik a vad típusú Rb fehérjéhez. A fehérjének azok a mutációi, amelyek következtében tönkremegy a retinoblasztóma-kötő funkciója, hozzájárulhatnak a hiperproliferatív patológiához, amely jellemző az RB-negatív sejtekre, azaz például az emlőrák sej tekre.

A H-NUC fehérje egy humán fehérje, ezért humán szövetből lehet tisztítani. A tisztított szakkifejezés, amikor a H-NUC fehérje vagy nukleinsav szekvencia állapotának leírására használjuk, akkor azt jelenti, hogy a fehérje, vagy a H-NUC-ot kódoló DNS mentes egyéb fehérjéktől és molekuláktól, amelyek egyébként normális körülmények között a H-NUC fehérjével vagy a H-NUC-ot kódoló DNS-sel kapcsolódnak, vagy azzal együtt fordulnak elő a természetes környezetében. A továbbiakban a természetes szakkifejezés a DNS-nek, fehérjének, polipeptidnek, ellenanyagnak vagy fragmensének arra a formájára vonatkozik, amely normális körülmények között a természetből izolálható, vagy amely nem tartalmaz szándékos aminosav változásokat, azaz például szubsztitúciót, deléciót vagy addíciót. A tisztított 95 kDa méretű H-NUC fehérje kinyerése az SDS gélekből elvégezhető a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel, azaz például először reagáltatva egy H-NUC-ot tartalmazó

sejtkivonatot anti-H-NUC ellenanyaggal, hogy kicsapjuk a H-NUC-ot, az alábbiakban részletesen ismertetett módon. Elválasztjuk a fehérje-ellenanyag komplexet, majd kinyerjük a 95 kDa méretű H-NUC fehérjét, Fischer és munkatársai módszerével eluálva az SDS gélből [ Fischer és mtsai: Techniques in Protein Chemistry, szerk.: T.E. Hugli, Academic Press, Inc., 36-41 (1989)], amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk.

A továbbiakban a hiperproliferatív sejtek szakkifejezés jelentése, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, olyan sejtek, amelyeknek megvan a képességük az autonóm növekedésre, azaz képesek létezni és reprodukálódni a normális szabályozási mechanizmusoktól függetlenül.

hiperproliferatív betegségeket kategorizálhatjuk patológiásnak, normál sejtektől, és betegséget jellemzik, és kategorizálhatjuk azaz amelyek eltérnek a jelentenek, vagy azokat nem-patológiásnak, azaz amelyek eltérnek a normál állapottól, de nem kötődnek kóros állapothoz. A patológiás hiperproliferatív sejtek az alábbi kóros állapotokra jellemzőek: tiroid hiperplázia - Grave féle betegség, pszoriázis, rosszindulatú prosztata hipertrófia, Li-Fraumeni szindróma, rákok, beleértve az emlőrákot, szarkómákat és egyéb neoplazmákat, hólyagrákot, vastagbél rákot, tüdőrákot, különböző leukémiákat és limfómákat. A nem-patológiás hiperproliferatív sejteket megtalálták például az emlővezeték epiteliális sejtjeiben a laktáció kifejlődése

során, valamint a sebgyógyuláshoz kapcsolódó sejtekben. A patológiás hiperproliferativ sejtek jellegzetes módon elveszítik a kontakt gátlás képességét, és csökken az a képességük, hogy szelektíven tapadjanak, ami magában foglalja a sejt felszíni tulajdonságainak megváltozását, valamint egy további . leépülést az intracelluláris kommunikációban. Ezek közé a változások közé tartozik például az osztódás serkentése, valamint a proteolítikus enzimek szekréciójának képessége. Emellett, az elvesztett H-NUC funkció újból történő bevitele vagy pótlása egy sejtbe a fehérje vagy a fehérjét kódoló nukleinsav bevitelével helyreállíthatja a sejt nem-hiperproliferatív állapotát. A sejtek rosszindulatú szaporodása így leállítható.

Amint az a szakterületen jártas szakember számára ismert, a fehérje szakkifejezés jelentése aminosavak lineáris polimere, amelyeket peptidkötésak kapcsolnak össze specifikus szekvenciába. A továbbiakban az aminosav szakkifejezés jelentése az aminosavnak vagy a D vagy az L sztereoizomere, hacsak külön másként nem jelezzük. A jelen találmány oltalmi körébe tartoznak a H-NUC származékok vagy ekvivalensek, azaz például a H-NUC csonkított fehérje, polipeptid vagy H-NUC peptidek, amelyek a tisztított H-NUC fehérje biológiai aktivitásával rendelkeznek. A H-NUC származékok szakkifejezés olyan vegyületekre vonatkozik, amelyek eltérnek a természetben előforduló fehérjék vagy polipeptidek lineáris ···· · · ·· · • · · ·· ··· • ··< · · ♦ · · · · • fc · ·· ···· ·· · szekvenciájától, aminosav eltéréseket tartalmaznak, azaz például szubsztitúciókat, deléciókat vagy inszerciókat, oly módon, hogy a kapott H-NUC származék megtartja a HNUC biológiai aktivitását. A biológiai aktivitás vagy biológiailag aktív szakkifejezés egyik jelentése az a képesség, hogy a fehérje kötődik a nem-foszforilezett pllO^RB retinoblasztóma fehérjéhez .

A H-NUC Rb-hez való kötődése eltűnik 37 °C-on, ha például az erősen konzerválódott glicint

640-es aminosav aszparaginsavra változtatjuk. Ezek a H-NUC származékok eltérhetnek a a természetes szekvenciáktól egy vagy több aminosav deléciója, rokon, azaz például hasonló töltéssel rendelkező aminosavval történő szubsztitúciója vagy inszerciója révén, illetve oldalláncok vagy funkciós cso portok helyettesítésével vagy módosításával.

Az is nyilvánvaló, hogy a H-NUC primer szekvenciájában csak korlátozott változtatások tehetők anélkül, hogy tönkretennénk biológiai funkcióját, és a teljes primer szekvenciának csak egy részére lehet szükség az aktivitás kifejtéséhez, amelynek egyik megnyilvánulási formája a pllO -hez való kapcsolódás. A pllO -et kódoló nukleinsav szekvenciát már publikálták [ Lee, W.H. és mtsai: Science 235, 1394-1399 (1987)], amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk. A biológiai funkció egy másik megnyilvánulása a H-NUC DNS-kötő képessége. A DNS-hez való kötődés képességét a szakterületen jártas szakember meg tudja határozni, a Lee, H.W.

és munkatársai által publikált módszerrel [ Lee, H.W. és mtsai: Natúré (London) 329, 642-645 (1987)] (a publikációt a továbbiakban referenciának tekintjük). Egy biológiailag aktív H-NUC származék az a fehérje, amely legalább 6 TPR régiót tartalmaz a H-NUC és a Gal4-C49 fúziós fehérje C-terminálisán, amelyeket az alábbiakban részletesen ismertetünk. A Gal4-C49 származék szekvenciáját a 3. ábrán láthatjuk az 559-es aminosavtól a szekvencia végéig (3. számú szekvencia). A TPR-t tartalmazó származék szekvenciája a 3. ábrán látható az 559-770-es aminosavak között. Ezen kívül, a 3. ábrán bemutatott aminosav szekvencia fragmensei, a korábban ismertetett Gal4-C49 fúziós fehérje vagy TPR származék mellett, amelyek megtartják a teljes fehérje funkcióját, szintén a H-NUC származék értelmezési tartományába esnek. Ezeket a H-NUC származékokat a 3. ábrán látható nukleinsav molekula restrikciós enzimes emésztésével valamint a kapott fragmensek rekombináns expresszálásával lehet előállítani. Az nyilvánvaló, hogy a primer aminosav szekvencia minimális módosításai olyan fehérjéket eredményeznek, amelyek lényegében ekvivalens vagy javított funkcióval rendelkeznek, a 3. ábrán bemutatott szekvenciáéval összehasonlítva. Ezek a módosítások lehetnek szándékosak, amilyenek például a helyspecifikus mutagenezissel előállított változtatások, vagy lehetnek véletlenszerűek, amilyenek például az azokban a gazdaszervezetekben létrejövő mutációk, amelyek H-NUC-ot termelnek.

• · ··· · · • » · · · · ··· ·· · · · · · · ···

A gátlóan aktív szakkifejezés is a H-NUC fehérje fragmenseit és mutánsait jelenti (muteinek ), amelyek domináns negatív módon hatnak, és így gátolják a fehérje normális funkcióját, ezzel gátolják a H-NUC biológiai szerepét, ami nem más, mint a gazdasejt osztódásának és/vagy a gazdasejt szaporodásának befolyásolása. Ezeket a fehérjéket és fragmenseket a szakterületen jártas szakember számára ismert kémiai módszerekkel hozhatjuk létre. A muteinek és a gátlóan aktív fragmensek terápiásán jól használhatók a sejtek hiperproliferizációjának elősegítésére, és diagnosztikai reagensek, azaz például ellenanyagok előállítására.

Ezek az ágensek jól használhatók egy sejt növekedésének vagy szaporodásának gátlására, a sejtet in vitro vagy in vivő érintkezésbe hozva az ágenssel, az alábbiakban ismertetett módszerek alkalmazásával. Ennek megfelelően a jelen találmány tárgya eljárás egy sejt növekedésének vagy szaporodásának gátlására, amely sejt egy hiperproliferatív sejt, mint például egy emlőrák sejt, a sejtet az ágenssel érintkezésbe hozva. A találmány tárgyát képezik a hiperproliferatív növekedéssel jellemzett kóros állapotok, mint például az emlőrák, kezelésére szolgáló eljárások, egy megfelelő alanynak hatékony koncentrációban beadva ezeket az ágenseket, oly módon, hogy a sejtek szaporodása gátlódik. Ennek a módszernek alkalmas alanyai, anélkül, hogy ezekre • · · · · ·· ·· ···· ·· korlátoznánk magunkat, a gerincesek, majmok, rágcsálók és humán betegek.

A jelen találmány tárgyát képezik az előzőkben ismertetett bármelyik hatóanyag készítményt és egy vagy több gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyászati készítmények. A gyógyászatilag elfogadható készítmények jól ismertek a szakirodalomban, ide tartoznak a vizes oldatok, mint például a fiziológiásán puffereit sóoldat vagy egyéb oldószerek vagy hordozók, mint például a glikolok, glicerin, növényi olajok (például olívaolaj) vagy injekciózható szerves észterek. Egy gyógyászatilag elfogadható hordozó használható a HNUC vagy származékai egy sejtbe való beadására in vitro vagy egy alanyba való in vivő beadásra.

Egy gyógyászatilag elfogadható hordozó tartalmazhat egy fiziológiásán elfogadható vegyületet, amely például úgy hat, hogy stabilizálja a fehérjét vagy polipeptidet, illetve fokozza vagy csökkenti az ágens abszorpcióját. Egy fiziológiásán elfogadható vegyület lehet például szénhidrát, azaz glükóz, szacharóz vagy dextrán, antioxidáns, azaz például aszkorbinsav vagy glutation, kelátképző ágens, alacsony molekulasúlyú fehérje vagy egyéb stabilizálószer vagy töltőanyag. Az egyéb, fiziológiásán elfogadható vegyületek közé tartoznak például a nedvesítő szerek, emulgeáló szerek, diszpergáló szerek vagy konzerváló szerek, amelyek különösen hasznosak a mikroorganizmusok növekedésének vagy működésének megelő-

zésében. Jól ismertek a különböző konzerváló szerek, mint például a fenol és az aszkorbinsav. A szakterületen jártas szakember tudja, hogy egy gyógyászatilag elfogadható hordozó, beleértve egy fiziológiásán elfogadható vegyületet, megválasztása függ például a polipeptid beadásának módjáról, valamint az adott polipeptid fizikai-kémiai jellemzőitől. Például egy fiziológiásán elfogadható vegyület, azaz az alumínium-monosztearát vagy a zselatin különösen hasznos késleltető ágens, amely meghosszabbítja egy betegnek beadott gyógyászati készítmény abszorpcióját. A hordozók, stabilizálószerek vagy adjuvánsok további példái megtalálhatók a szakkönyvekben [Martin, Remington, s Pharma Sci. 15; Mack Publ. Co. , Easton (1975)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A gyógyászati készítményt bevihetjük például, ha szükséges, liposzómákba, mikrogömbökbe vagy egyéb polimer hordozókba [ Gregoriadis: Liposome Technology 1_, CRC Press, Boca Raton, Florida (1984)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A liposzómák például, amelyek foszfolipideket vagy egyéb lipideket tartalmaznak, nem-toxikus, fiziológiásán elfogadható és metabolizálható hordozók, amelyeket viszonylag egyszerűen elő lehet állítani és be lehet adni a betegnek.

A tisztított H-NUC (fehérje) vagy H-NUC (nukleinsav) gyógyászati készítmények jól használhatók a sejt növekedésének, azaz például emlőráknak a gátlására, ha a sejtet

tisztított H-NUC-cal vagy annak egy aktív fragmensével vagy ezeket a polipeptideket illetve fehérjéket tartalmazó készítményével hozzuk érintkezésbe.

A jelen találmány céljára az érintkeztetést végrehajthatjuk in vitro, ex vivő vagy in vivő. Amikor a sejteket in vitro gátoljuk, akkor az érintkeztetést úgy hajtjuk végre, hogy a jelen találmány szerinti nukleinsav vagy fehérje készítményt összekeverjük a sejt tápta lajával, majd ezzel közvetlenül hozzáadjuk fehérjét a táptalajhoz zásának módszerei jól tápláljuk a sejteket, vagy a nukleinsav készítményt vagy

A hatékony mennyiség meghatáro ismertek a szakterületen jártas szakember számára.

Ez a módszer jól használható abnormálisán szaporodó sejtekhez kapcsolódó kóros állapotok kezelésére vagy megelőzésére egy alanyban in vivő. Tehát, ha az érintkeztetést in vivő végezzük, akkor a jelen találmány szerinti készítmény hatékony mennyiségét adjuk be az alanynak, olyan mennyiséget, amely hatékonyan gátolja a sejtek szaporodását a betegben. A jelen találmány szerint az alany szakkifejezés jelentése bármely gerinces, azaz például állat, emlős, humán vagy patkány. Ez a módszer különösen jól használható emlőrák megelőzésére olyan betegben, aki nem termel H-NUC fehérjét .

Egy gyógyszer beadási módszerei jól ismertek a szakterületen, ide tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az orális, intravénás, intramuszkuláris vagy intraperitoneális beadási mód. A beadást végezhetjük folyamatosan vagy szakaszosan, csakúgy, mint más rekombináns

·····« • · l · * · » · ' · · · · ···· ·· · · ···· · és ez az alanytól függ, terápiás fehérjék esetében [ Landmann és mtsai: J. Interferon Rés. 12(2),

103-111

462-467 (1991); Lantz és mtsai: Cytokine 2_(6), 402-406

Demetri és mtsai:

J. Clin. Oncol. 7(10), 1545-1553

LeMaistre és jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a nukleotid szekvenciák, amelyek tisztított emlős H-NUC fehérjét, H-NUC származékokat, muteineket, azok aktív fragmenseit és anti-H-NUC ellenanyagot kódolnak. A továbbiakban a nukleinsav szakkifejezés jelentése egyszálú és kétszálú DNS, cDNS é s mRN S.

Az egyik megvalósítási mód szerint a H-NUC fehérjét és fragmenseit kódoló nukleinsav molekula szekvenciája, vagy annak részei a 3. ábrán láthatók. A jelen találmány oltalmi körébe tartoznak még az olyan nukleinsav molekulák, amelyek szigorú körülmények között hibridizálódnak a nukleinsav molekulához, vagy annak komplementeréhez, például amelynek a szekvenciája ábrán látható. Az ilyen hibridizálódó nukleinsav molekulákat vagy próbákat elő lehet például állítani a 3. ábra szerinti nukleinsav molekula nick-transzlációjával, amely esetben a hibridizálódó nukleinsav molekulák lehetnek a molekula random fragmensei, amelynek a szekvenciáját a 3. ábrán mutatjuk • ·

be. Az ilyen fragmensek előállítási módszereit a szakkönyvek ismertetik [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], amely szakkönyvet a továbbiakban referenciának tekintünk. Hibridizációs próbának a legalább 10 nukleotidból álló nukleinsav fragmensek használhatók. Az izolált nukleinsav fragmensek is jól használhatók új peptidek előállítására. Ezek a peptidek viszont jól használhatók immunogének, poliklonális és monoklonális ellenanyagok előállítására. A próbák és immunogének előállítási módszerei és alkalmazása jól ismert a szakterületen.

A nukleotid szekvenciák arra is jól használhatók, hogy gátoljuk a sejt szaporodását és osztódását. A nukleinsav molekulát beépítjük a sejtbe, a sejtet olyan körülmények között szaporítjuk, hogy a nukleinsavról HNUC fehérje keletkezzen, olyan hatékony koncentrációban, hogy a sejt növekedése gátolva legyen. A jelen találmány céljára a nukleinsavat beépíthetjük liposzómákba vay lipidált DNS-be, vagy egyéb génhordozókba, mint például virális vektorokba [ Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)], amely szakkönyvet a továbbiakban referenciának tekintünk. Mutáns H-NUC termeléssel rendelkező emlőrák sejt olyan sejt, amely számára hasznos ez a módszer.

A humán betegség géntranszferrel való kezelése mára

• · · ·

elméletből	gyakorlattá vált.	Az első	humár	i génterápia
1990. szeptemberében kezdődött	, tárgya	az adenozin-dez-
amináz (ADA) gén bejuttatása egy olyan	beteg	limfocitái-
ba, aki egyébként ennek az enzimnek egy letális hibáját
hordozta,	ami immunhiányt er	edményez.	Ennek az első
kísérletnek	az eredményei	nagyon	báto	rítóak, és
segítették	további klinikai	kísérletek	beindulását
[Culver, K.	W., Anderson, W.F.,	Blaese,	R.M.	: Hűm. Gene
Ther. 2 107	(1991)] .
A mai	napig az emberben	j óváhagyott	géntranszfer

kísérletek legnagyobb része retrovírus vektorokat használ a gén transzdukciójára. Ebben a szövegkörnyezetben a retrovirális vektorok olyan retrovírusok, amelyekből az összes virális gént eltávolították vagy megváltoztatták, és így nem képződik virális fehérje a vektorral fertőzött sejtekben. A virális replikációs funkciókat retrovírus pakoló sejtek használatával biztosítják, amelyek az összes virális fehérjét előállítják, de nem termelnek fertőzőképes vírust. A retrovirális vektor DNS bejuttatása a pakoló sejtekbe olyan virionok képződését eredményezi, amelyek hordozzák a vektor RNS-t és képesek megfertőzni a célsejteket, de a fertőzés után a vírus nem terjed tovább. Azért, hogy ezt az eljárást megkülönböztessük a természetes vírusfertőzéstől, ahol a vírus tovább replikálódik és elterjed, gyakran inkább a transzdukció szakkifejezést használják a fertőzés helyett.

Csak az illusztrálás céljára, egy nukleinsav bejuttatására szolgáló rendszer egy replikáció inkompetens retrovirális vektor. A továbbiakban a retrovirális szakkifejezés jelentése, anélkül, hogy erre korlátoznánk magunkat, egy olyan vektor, vagy bejuttató eszköz, amelynek megvan a képessége, hogy szelektíven megcélozza és bejuttassa a nukleinsavat az osztódó sejtekbe. A továbbiakban a replikáció inkompetens szakkifejezés jelentését úgy határozzuk meg, mint az arra való képtelenséget, hogy virális fehérjéket termeljen, ezzel kizárva a vektor elterjedését a fertőzött gazdasejtben.

A replikáció-inkompetens retrovirális vektor egy másik példája az LNL6 [Miller, A.D. és mtsai: BioTechniques 7, 980-990 (1989) ] , amely publikációt a továbbiakban referenciának tekintünk. A replikáció-inkompetens markerek retrovírusok alkalmazási módszere genetikai retrovírus által közvetített géntranszferére jól

National

Correll,

Academy

Bordignon,

C. és

Academy of és mtsai:

Sciences,

P.H. és mtsai: Proceedings of Sciences, USA

86, 8912 of the mtsai:

Proceedings of the

National

Sciences, USA

Proceedings of the

USA (1991);

(1989); Culver, K.

National Academy of

Rill, D.R. és mtsai:

Blood 79(10), amely publikációkat a továbbiakban referenciának tekintünk.

klinikai vizsgálatok kimutatták, hogy vagy nincs, vagy csak nagyon • ·· · ·♦· • · ·· kevés káros mellékhatás kíséri használatát [Anderson: Science 256 a virális vektorok

808-13 (1992)] .

A retrovirális vektorok legnagyobb előnye a génterápiában a replikálódó sejtekbe való géntranszfer nagy hatékonysága, az átvitt gének pontos beépülése a sejt DNS-ébe, és az, hogy a szekvenciák nem terjednek tovább a gén transzdukciója után [Miller, A.D.: Natúré 357, 455-460 (1992)] .

A replikáció-kompetens (segítő) vírus előállításának potenciálja a retrovirális vektorok előállítás során még gondot okoz, jóllehet gyakorlati célokra ezt a problémát már megoldották. Eddig az összes, FDA által jóváhagyott retrovirális vektort a PA317 amfotróp retrovírus pakoló sejtekkel állították elő [Miller, A.D. és Buttimore, C.:

Mól. Cell. Biology 6, 2895-2902 (1986)] . Ha a PA317 sejtekben olyan vektorokat használunk, amelyeknek nincs, vagy csak nagyon kevés átlapoló szekvenciájuk van a vírusokkal, akkor ez eliminálja a helper vírus termelődését, még a nagyon szigorú vizsgálatok szerint is, ami lehetővé teszi az ilyen események amplifikálódását [ Lynch, C.M. és Miller, A.D.: J. Viral. 65, 3887-3890 (1991)] . Más pakoló sejtvonalak is hozzáférhe tők. Például a sejtvonalak, amelyeket arra terveztek, hogy a különböző retrovirális kódoló régiókat különböző plazmidokra szeparálják, csökkenthetik annak a valószínűségét, hogy rekombinációval helper vírus keletkezik. Az ilyen pakoló sejtvonalakkal előállított vektorok hatékony

rendszert szolgálhatnak a humán génterápiához is [ Miller, A.D.: Natúré 357, 455-460 (1992)].

Nem-retrovirális vektorok alkalmazását is fontolóra vették a génterápiában. Az egyik ilyen alternatíva az adenovírus [ Rosenfeld, M.A. és mtsai: Cell 68, 143-155 (1992); Jaffe és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 89, 6482-6486 (1992)] . Az adenovírus vektorok legnagyobb előnye az a képességük, hogy nagy DNS darabokat képesek hordozni (36 kilobázisos genom), magas a titerük (10ⁿ/ml), képesek a szöveteket in situ megfertőzni, különösen a tüdőben. Ennek a vektornak a legmeglepőbb felhasználása eddig az volt, hogy intratracheális becsepegtetéssel eljuttatott egy humán cisztás fibrózis transzmembrán konduktancia regulátor (CFTR) gént gyapotpatkányok légúti epitéliumába [Rosenfeld, M.A. és mtsai: Cell 63, 143-155 (1992)] . A herpeszvírusok hasonlóképpen értékesnek bizonyulhatnak a humán génterápiában [Wolfe, J.H. és mtsai: Natúré Genetics jL, 379-384 (1992)] . Természetesen bármelyik alkalmas virális vektor használható a jelen találmány szerinti génterápiában.

Egy másik, az FDA által az emberek számára jóváhagyott géntranszfer módszer a liposzómába zárt plazmid DNS átvitele közvetlenül humán sejtekbe, in situ [ Nabel, E.G. és mtsai: Science 249, 1285-1288 (1990)] . A plazmid DNS-ről könnyen igazolható, hogy alkalmazható a humán génterápiában, mivel, a retrovirális vektorokkal ellentétben, homogenitásig tisztítható. A liposzóma által közvetített DNS transzfer mellett számos egyéb fizikai DNS transzfer módszerről derült ki, hogy ígéretesen alkalmazható a génterápiában (ilyen például a DNS-nek a sejteken levő receptorokra való irányzása a plazmid DNS-t fehérjékkel képzett komplexekbe vive) [ Wu, G.Y. és mtsai: Journal of Biological Chemistry 266, 14338-14342 (1991); Curiel, D.T. és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 8850-8854 (1991)] .

A jelen találmány szerinti H-NUC-ot kódoló gént a szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerrel helyezhetjük el egy expressziós vektorban, azaz például egy plazmid vektorban vagy egy virális expressziós vektorban. Egy plazmid expressziós vektort a tumorsejtbe kalcium-foszfát transzfekcióval, liposzómával (azaz például LIPOFECTIN-nel) közvetített transzfekcióval, DEAE Dextrán által közvetített transzfekcióval, polibrénnel közvetített transzfekcióval, elektroporációval és egyéb DNS-bejuttatási módszerrel juttathatunk be.

Egy virális expressziós vektort a megcélzott sejtbe fertőzéssel vagy transzdukcióval juttathatunk be expresszálható formában. Egy ilyen virális vektor lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: egy retrovírus, egy adenovírus, egy herpeszvírus és egy avipox vírus. Ha a H-NUC-ot expresszáljuk bármelyik abnormálisán szaporodó sejtben, akkor a sejt replikációs ciklusa leáll, ennek következménye a szeneszcencia és a sejtpusztulás, ami végül az abnormális szövet, azaz a tumor vagy rák tömegének csökkenését eredményezi. A génkonstrukciót a megcélzott sejtbe bejuttatni, és a H-NUC-ot a sejtben sejtszaporodást gátló mennyiségben expresszáltatni képes vektort bármelyik hatékony módszer alkalmazásával bejuttathatjuk a szervezetbe.

Egy fiziológiásán elfogadható oldatot például, amely

az aktív vektorok hatékony koncentrációját	tartalmazza,
alkalmazhatjuk topikálisan, intraokulárisan,	parenteráli-
san, orálisan, intranazálisan, intravénásán,	intramuszku-

lárisan, szubkután vagy bármely egyéb hatékony módon. Pontosabban, a vektort egy tűvel közvetlenül injekciózhatjuk a megcélzott rákba vagy tumorszövetbe, olyan mennyiségben, amely hatásos a tumorsejtek vagy a megcélzott szövet kezelésében.

Egy másik módszer szerint egy testüregben, azaz például a szemekben,. az emésztőrendszerben, a húgy- és ivarszervi rendszerben (például húgyhólyagrák), a tüdő•és hörgőrendszerben valamint a hasonlókban jelenlevő rák vagy tumor kaphat egy fiziológiásán elfogadható készítményt (azaz például oldatot, úgymint sóoldatot vagy foszfátpuffért, egy szuszpenziót vagy egy emulziót, amely a vektortól eltekintve steril) , amely a vektorok hatékony koncentrációját tartalmazza, egy tűvel való direkt injekcióval, vagy katéterrel, vagy valamilyen egyéb bejuttató csővel, amit a tumorral sújtott üreges szervbe helyeztünk.

Bármely hatékony képalkotó módszer, azaz például a

Röntgen sugárzás, az ultrahang vagy a száloptikás vizualizáció használható a célszövet lokalizálására és a tű vagy katétercső irányítására.

Egy másik alternatíva, ha az aktív vektorok hatékony koncentrációját tartalmazó, fiziológiásán elfogadható oldatot szisztémásán adjuk be a vérkeringésbe az olyan rák vagy a tumor kezelésére, ami nem érhető el közvetlenül, vagy anatómiailag izolálva van.

Egy további lehetőség, hogy a megcélzott tumor- vagy ráksejteket úgy kezeljük, hogy a H-NUC fehérjét bármely ismert módszerrel bejuttatjuk a sejtekbe. Például a liposzórnák mesterséges membránrészecskék, amelyekkel gyógyszereket, fehérjéket és plazmidvektorokat lehet bejuttatni mind ín vitro mind in vivő [ Mannino, R.J. és mtsai: Biotechniques 6, 682-690 (1988)] a megcélzott sejtekbe [Newton, A.C. és Huestis, W.H.: Biochemistry 27, 4655-4659 (1988); Tanswell, A.K. és mtsai: Biochimica et

Biophysica Acta 1044, 269-274 (1990); Ceccoll, J. és mtsai: Journal of Investigative Dermatology 93, 190-194 (1989)] . A H-NUC fehérje tehát nagy hatékonysággal kapszulázható liposzóma részecskékbe, és emlős sejtekbe bejuttatható, mint in vitro mind in vivő.

A liposzómába zárt H-NUC fehérjét beadhatjuk topikálisan, intraokulárisan parenterálisan, intranazálisan, intratracheálisan, intrabronchiálisan, intramus zkulárisan, szubkután, vagy bármely egyéb hatékony módon, olyan dózisban, amely hatékony az abnormálisán szaporodó sejtek vagy célszövet kezelésében. A liposzómákat bármely fiziológiásán elfogadható készítményben beadhatjuk, amely a kapszulába zárt H-NUC fehérje hatékony koncentrációját tartalmazza.

Más vektorok is alkalmasak a jelen találmányban való alkalmazásra, és annak alapján választhatók ki, hogy a HNUC gént kódoló nukleinsavat hatékonyan juttatják be a sejtekbe. A nukleinsav lehet DNS, cDNS vagy RNS.

Egy másik megvalósítási mód szerint egy, a jelen találmány szerinti izolált nukleinsav molekulát működőképesen egy RNS transzkripciót vezérlő promoterhez kapcsoljuk. Ezek a nukleinsav molekulák jól használhatók a H-NUC fehérjék és polipeptidek rekombináns módszerekkel való előállítására, vagy a génterápiában vektorként alkalmazva.

A találmány tárgya továbbá egy vektor, amely tartalmaz egy, az előzőkben ismertetett izolált nukleinsav molekulát. A megfelelő vektorok lehetnek például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, kozmád vagy virális vektorok. A megfelelő vektorok megtalálhatók a szakkönyvekben [ Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] valamint a szakirodalomban [ Zhu és mtsai: Science 261, 209-211 (1993)] , amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk. Ha beépítjük egy megfelelő gazdasejtbe, azaz például egy prokarióta vagy eukarióta sejtbe, akkor a H-NUC rekombináns módszerekkel előállítható. A megfelelő gazdasejtek lehetnek emlős sejtek, rovarsejtek, élesztő sejtek és baktériumsejtek [ Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] .

A jelen találmány tárgyát képezi a rekombináns H-NUC vagy származékainak előállítása, az előzőkben ismertetett gazdasejteket megfelelő körülmények között szaporítva, oly módon, hogy a H-NUC-ot vagy fragmensét kódoló nukleinsavat expresszáljuk. A megfelelő körülményeket a

szakterületen	j ártas	szakember	számára	jól	ismert
módszerekkel	határozhatjuk meg	[ Sambrook	és	mtsai:
Molecular Cloning: A	Laboratory	Manual;	Cold	Spring

Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az ílymódon előállított fehérjék és polipeptidek is a jelen találmány tárgyát képezik.

A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy ellenanyag, amely képes specifikus komplexet képezni a H-NUC fehérjével vagy annak fragmensével. Az ellenanyag szakkifejezés vonatkozik mind a poliklonális ellenanyagokra mind a monoklonális ellenanyagokra. Az ellenanyagok lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, egér, patkány, nyúl vagy humán monoklonális ellenanyagok.

A továbbiakban az ellenanyag vagy poliklonális ellenanyag szakkifejezés jelentése egy olyan fehérje, amelyet egy antigénnel vagy receptorral való immunizálásra adott válaszként kapunk. A monoklonális ellenanyag szakkifejezés jelentése egy egyetlen sejtklónból származó immunglobulin. A kiónból származó összes monoklonális ellenanyag kémiailag és szerkezetileg azonos, és egyetlen antigén determinánsra specifikus.

A poliklonális ellenanyagok és monoklonális ellenanyagok laboratóriumi előállítási módszerei ismertek a szakterületen [ Harlow és Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A jelen találmány szerinti monoklonális ellenanyagokat biológiai úton állíthatjuk elő H-NUC-ot vagy annak egy fragmensét bejuttatva egy állatba, azaz például egy egérbe vagy nyúlba. Az állatban ellenanyagot termelő sejteket izoláljuk, majd mielóma sejtekkel vagy heteromielóma sejtekkel fúzionáltatjuk, hibrid sejtek vagy hibridómák előállítása céljából. Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyát képezik a monoklonális ellenanyagokat termelő hibridóma sejtek is. Az ílymódon előállított monoklonális ellenanyagok közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiakban ismertetett monoklonális ellenanyagok.

Tehát a H-NUC fehérjét vagy származékait, és jól ismert módszereket alkalmazva, a szakterületen jártas szakember elő tudja állítani és át tudja vizsgálni a jelen találmány szerinti hibridóma sejteket és ellenanyagokat, olyan ellenanyagok keresése céljából, amelyek képesek megkötni a H-NUC-ot.

A jelen találmány tárgyát képezik az előzőkben ismertetett poliklonális- és monoklonális ellenanyagok biológiailag aktív fragmensei is. Ezeknek az ellenanyag fragmensek-nek valamennyire megmarad az a képességük, hogy szelektíven kötődnek az antigénjükhöz vagy immunogénjükhöz. Ilyen ellenanyag fragmensek lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiak:

(1) Fab, az a fragmens, amely tartalmazza egy ellenanyag molekulának papain enzimmel való emésztéssel kapott, egyértékű antigén-kötő fragmensét, ami tartalmazza az érintetlen könnyű láncot és a nehéz lánc egy részét;

(2) Fab' , az a fragmens, amely tartalmazza egy ellenanyag molekulának pepszines kezeléssel majd redukcióval kapott fragmensét, ami tartalmazza az érintetlen könnyű láncot és a nehéz lánc egy részét; egy ellenanyag molekulából két Fab' fragmenst kapunk;

(3) (Fab' )₂, az ellenanyagnak az a fragmense, amit pepszines kezeléssel kapunk, de utána nem végzünk redukciót; a (Fab' )₂ két Fab' fragmens dimerje, amelyeket két diszulfid híd tart össze;

(4) Fv, amely definíció szerint egy génsebészeti úton előállított fragmens, tartalmazza a könnyű lánc va- riábilis régióját és a nehéz lánc variábilis régióját, két láncként expresszálva; és (5) SCA, amely definíció szerint egy génsebészeti úton előállítót molekula, tartalmazza a könnyű lánc variábilis régióját, a nehéz lánc variábilis régióját, egy megfelelő polipeptid linker molekulával genetikailag fuzionált egyláncú molekulává összekapcsolva.

Ezeknek a fragmenseknek az előállítási módszerei jól ismertek a szakirodalomban [Harlow és Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.

A biológiailag aktív ellenanyag fragmens szakkifejezés vonatkozik az ellenanyagok CDR régióira is.

A jelen találmány tárgyát képezik az ellenanyagokkal vagy azok biológiailag aktív fragmenseivel specifikusan reagáló anti-idiotípusos peptidek. A továbbiakban az anti-idiotípusos peptidek szakkifejezés jelentése egy fajból származó tisztított ellenanyagok, amelyeket egy távoli fajba injekcióznak, és az idegen antigénként ismeri fel őket, majd erős humorális immunválaszt fejt ki ellenük. Az általános módszer ismertetése megtalálható a szakirodalomban [ Harlow és Lane:

Antibodies:

Laboratory Manual,

Cold Spring Harbor Laboratory,

New

York (1988)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.

• · · ·

A jelen találmány tárgyát képezik azok a fehérjék és polipeptidek, amelyeket rekombináns módszerekkel állítottak elő, biokémiailag szintetizáltak, kémiailag szintetizáltak vagy kémiailag módosítottak és megtartják a H-NUC-hoz vagy fragmenseihez való kötődés képességét, ugyanúgy, mint a megfelelő természetes poliklonális vagy monoklonális ellenanyag. Az egy antigénhez vagy immunogénhez való kötődés képességét a szakterületen ismert módszerekkel határozzuk meg [Harlow és Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.

Az egyik megvalósítási mód szerint egy ellenanyagot vagy nukleinsavat kötünk egy kimutatható ágenshez, amely jól használható a H-NUC fehérje és fragmensei kimutatására egy mintában, standard immunkémiai módszerek alkalmazásával [Harlow és Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk, vagy [Principies and Practice of Immunoassays , szerk.: C.J. Price és D.J. Newman, Stockton Press, New York (1991)] amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.

Egy másik megvalósítási mód szerint az ellenanyagot azért adjuk be, hogy kötődjön a H-NUC-hoz és változtassa meg a működését a sejten belül. Az ellenanyagot a szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerrel • · • · adjuk be, hatékony koncentrációban, oly módon, hogy a H46

NUC működése	helyreálljon. Az ellenanyag terápiásán is
használható,	hogy gátolja a sejtek növekedését vagy
szaporodását,	a H-NUC-hoz kötődve, amely elvesztette azt
a képességét,	hogy kötődjön a retinoblasztóma fehérjéhez.

Ez az ellenanyag kötődik a H-NUC-hoz, ezzel arra készteti, hogy újra felvegye az aktív konfigurációt biztosító háromdimenziós szerkezetét. Másszóval, az ágens helyreállítja a H-NUC természetes biológiai aktivitását.

A jelen találmány szerinti ellenanyagok és nuklein savak jól használhatók a H-NUC fehérje jelenlétének vagy hiányának kimutatására, illetve egy megváltozott H-NUC génnek a kimutatására egy betegből vett sejtben vagy mintában. ílymódon az emlőrák, vagy az emlőrákra való hajlam diagnosztizálható.

Az előzőkben azonosított fehérjék, polipeptidek, nukleinsavak, ellenanyagok és ezek fragmensei jól használhatók a gyógyászatban alkalmazható készítmények előállítására, az előzőkben ismertetett módon.

A találmányt az alábbiakban részletesebben ismertetjük, az alábbi példák alapján. Ezekkel a példákkal csak illusztráljuk a találmányt, de nem korlátozzuk az oltalmi körét.

Az élesztő két-hibrid rendszer alkalmazásával 25 kiónt izoláltunk, amelyek kölcsönhatásba lépnek az RB Cterminális régiójával (p56-RB). Ezek közül a kiónok közül az egyik a C49-es [Durfee és mtsai: Genes Dev. 7, 555-569 • · · · (1993)] . Az RB-fehérje C-terminális részében van két nem*· egybefüggő dómén, amelyek ahhoz szükségesek, hogy számos DNS vírus onkoproteinjeihez kötődjenek, valamint van egy C-terminális régió,amely a DNS-kötő aktivitáshoz kapcsolódik. Az egyik RB-hez kötődő fehérjét úgy jellemezték, mint amelynek a primer szekvenciája és a bioké miai tulajdonságai hasonlóak a

Saccharomyces pombe élesztő nuc2 fehérjéjéhez, valamint a gombák Aspergillus nemzetségének bimA fehérjéjéhez. Ez utóbbi két génnek mutációja az alacsonyabbrendő eukarióta sej tekben sejteket leállítja a metafázisban, ezzel rámutatva fehérjék fontos szerepére mitózis normális folyamatában. Ez a két fehérje ismétlődő, 34-tagú aminosav motívumokat tartalmaz, ezek az úgynevezett TRP motívumok. Ezeknek az ismétlődéseknek a funkciója nem ismert, de azt gondolják róluk, hogy amfipatikus alfahéixeket képeznek, amelyek elvileg képesek a közvetlen fehérje-fehérje kölcsönhatásra. Az itt ismertetett fehérje az első izolált és leírt humán TRP fehérje.

A cDNS könyvtárak átvizsgálása és szekvencia elemzése

A teljes hosszúságú H-NUC cDNS-ek izolálásához a C49-nek, amelynek izolálását Durfee és munkatársai közölték [ Durfee és mtsai: Genes Dev. Ί_, 555-569 (1993)] , egy 1,5 kilobázis méretű BglII fragmensét nick transzlációval jelezzük, majd ezt használjuk humán fibroblaszt cDNS könyvtár tarfolt hibridizációval való • · · ·

	48	• · · · · • · · · · • · · · ···· ·· *·	• · · · • · • « • · · · · · ·
átvizsgálására. A cDNS	inszerteket	a pBSK+	vektor
(Stratagene, San Diego,	CA) EcoRI	hasítási	helyére

klónoztuk, a DNS szekvenálás megkönnyítésére. A szekvenálást didezoxi-NTP-k és a Sequenase 2.0 kit alkalmazásával végezzük, a gyártó (US Biochemicals) előírásai szerint. A szekvencia elemzést és a homológra keresést DNASTAR programmal végezzük (DNASTAR, Inc., Madison, WI).

GST fúziók készítés, fehérje készítés és in vitro kötés

A GST-49 készítéséhez a C-49 plazmidot BglII restrikciós enzimmel emésztjük, majd az 1,3 kilobázis méretű inszert fragmenst a pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, N.J.) BamHI hasítási helyére klónozzuk. A GST-T úgy állítjuk elő, hogy az Y62-25-2-t Hindin restrikciós enzimmel emésztjük, tompavégűre alakítjuk Klenow enzimmel, majd a 823 bázispár méretű fragmenst szubklónozzuk a Smal restrikciós enzimmel· emésztett pGEX3X plazmidba. A GST fúziós fehérjék expresszióját 0,1 mmol/1 IPTG-vel indukáljuk Escherichia coli-ban [ Smith és Johnson: Gene 67, 31-40 (1988)] . A sejteket 10,000/perc fordulatszámmal centrifugáljuk 5 percig, majd a kapott üledéket Lysis 250 pufferben szuszpendáljuk (250 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 EDTA, 50 mmol/1 TRIS (pH=8,0), 0,1% NP40, mmol/1 fenilmetilszulfonil-fluorid (PMSF), 8 pg leupeptin, 8 pg antipain). 4 mg lizozimet adunk hozzá, majd a sejteket 30 percig 4 °C-on tartjuk, és a sejteket • » • · · ultrahangos besugárzással feltárjuk. A sejttörmeléket centrifugálással eltávolítjuk (10,000/perc, 30 perc), majd a felülúszót hozzáadjuk glutationnal borított gyöngyökhöz.

Az in vitro kötési vizsgálatot az alábbiak szerint végezzük el. 2xl0⁶ 2E3 sejtből készítünk kivonatot [ Chen és mtsai: Cell Growth Differ. 3, 119-125 (1992)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk, majd 30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk 2-3 pg GST-t vagy GST fúziós fehérjét tartalmazó gyöngyökkel Lysis 150 pufferben (50 mmol/1 TRIS pH=7,4, 150 mmol/1 nátrium-klorid, mmol/1 EDTA, 0,1% NP40, 50 mmol/1 NAF, 1 mmol/1 PMSF, 1 pg leupeptin per ml, 1 pg antipain per ml). A komplexeket alaposan mossuk Lysis 150 pufferrel, felvivő pufferben forraljuk, majd 7,5%-os SDS-PAGE géleken futtatjuk. A géleket immobilon membránokra visszük át, majd egy antiRB monoklonális ellenanyaggal, a llD7-tel immunblottoljuk. Alkalikus foszfatázzal konjugált szekunder ellenanyag hozzáadása után a megkötött RB fehérjét 5-bróm-4klór-3-indolil-foszfát, toluidinium és nitroblue tetrazólium hozzáadásával tesszük láthatóvá (BCIP, NBT; Promega, Madison, WI).

Ellenanyag termelés és fehérje azonosítás

A szakterületen jártas szakember számára jól ismert módszerek alkalmazásával anti-H-NUC ellenanyagokat állítunk elő [ Harlow és Lane: Antibodies: A Laboratory • · · · · · · • · · · · · ·«·· ·· ·· ···· ···

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Röviden, körülbelül 100 gg GST-491 fúziós fehérjét használunk egerek immunizálására, háromszori ráerősítéssel. Szérumokat gyűjtünk az immunizált egerekből·, és közvetlenül· ezt használjuk az immunprecipitációs kísérletekben. Az egyes sejtvonalakból· körülbelül lxlO⁷ sejtet

5 metabolikusan jelzünk S-metioninnal 2 óra hosszat, majd ezt követően jéghideg Lysis 250 pufferben lizáltatjuk. A tisztított lizátumot különböző ellenanyagokkal inkubáljuk 1 óra hosszat 4 °C-on, majd protein A Sepharose gyöngyöket adunk hozzá és újabb 30 percig inkubáljuk 4 °C-on. Lízis pufferrel való alapos mosás után a gyöngyöket SDS-PAGE mintapufferben forraljuk, majd az immunprecipitátumokat 7,5%-os SDS-PAGE-val választjuk el. A kettős immunprecipitációhoz a kapott immunkomplexeket 200 μΐ I-es disszociációs pufferben forraljuk (20 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 50 mmol/1 nátrium-klorid, 1% SDS és 5 mmol/1 DTT), a fehérjék denaturálására. A denaturált fehérjéket 200 μΐ II-es disszociációs pufferben (20 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,4, 50 mmol/1 nátrium-klorid, 1% NP40 és 1% nátrium-dezoxikolát), majd újra immunprecipitájuk ellenanyagokkal.

Sejtfrakcionálási eljárások

A membrán, sejtmag és citoplazmatikus frakciók elválasztására szolgáló eljárásokat Lee, H.-W. és munka-

társai publikációjából vettük [Lee és mtsai: Natúré 329, 642-645 (1987)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Ezután mindhárom frakcióban az előzőkben ismertetett módon immunprecipitációval megvizsgáljuk, hogy mennyi az RB fehérje és H-NUC tartalmuk, majd az egyes frakciók alikvot részeit is glutation gyöngyökkel inkubáljuk, hogy igazoljuk az egyes frakciók összetételét.

DNS-kötési vizsgálat

Körülbelül lxlO⁷ K562 humán krónikus mielogén leukémia sejtet (ATCC) jelzünk ³⁵S-metioninnal, majd Lysis 250 pufferben lizáltatjuk. A lizátumokat centrifugálással derítjük, majd 2 térfogat felvivő pufferben (10 mmol/1 KH₂PO₄ pH=6,2, 1 mmol/1 MgCl₂, 0,5% NP40, 1 mmol/1 DTT, 10% glicerin) hígítjuk. A hígított kivonatot azután DNScellulóz oszlopra visszük fel (természetes borjútimusz DNS, Pharmacia, Piscataway, NJ), amit azután egy óra hosszat 40 °C-on inkubálunk enyhe rázatás közben. Az oszlopot azután 5 ágytérfogatnyi felvivő pufferrel mossuk, utána ugyanezzel a pufferrel eluáljuk, amely növekvő koncentrációban tartalmaz nátrium-kloridot. A frakciókat immunprecipitációval elemezzük, vagy anti-RB ellenanyagot vagy anti-H-NUC ellenanyagot használva, az előzőkben ismertetett módon. Az egyes frakciók alikvot részeit is inkubáljuk glutation gyöngyökkel, a glutation transzferáz kimutatására.

H-NUC élesztő expressziós plazmid; deléciós mutánsok

A H-NUC cDNS-ből származó DNS fragmenseket pSE1107ben szubklónozzuk [ Durfee és mtsai: Genes Dev. Ί_, 555-569 (1993)] . A 491-es klón az eredeti klón, amelyet élesztő két-hibrid szűrővizsgálattal izoláltunk. A H-NUC-ot úgy állítjuk elő, hogy egy 3,3 kilobázis méretű Xhol fragmenst építünk be egy módosított pSE1107 plazmidba, egy leolvasási fázisban levő fúziós fehérje előállítása céljából. Az RV tartalmazza az N-terminális XhoI-EcoRV fragmenst. A BR208, BR207, B5 és B6 a Squ3A részleges emésztési termékek. Az ezekből a konstrukciókból· származó Gal4 fúziós fehérje a következő aminosavakat tartalmazza: 1-824: H-NUC ; 559-824: 491; -1-663: RV; 699-824: BR2-8;

797-824: BR2-7; 559-796: B5 és 597-796: B6. A hőmérséklet-érzékeny mutánst úgy állítjuk elő, hogy a H-NUC Nsil fragmensét az illesztett primerekkel helyettesítjük. A primerek az alábbiak:

1. primer: TGGTATGACCTAGGAATGATTTATTACAAGCAAGAAAAATTCAGCCTTGCAGAAATG CA

2. primer: TTTCTGCAAGGCTGAATTTTTCTTGCTTGTAATAAATCATTCCTGGTCATACCATGC A

Mindegyik konstrukciót DNS szekvencia elemzéssel ellenőrizzük.

Élesztő transzformáció és a β-galaktozidáz aktivitás

• · « mennyiségi meghatározása

Az élesztő transzformálását az előzőkben ismertetett

LiOAc módszerrel végezzük [ Durfee és mtsai: Genes Dev. 7, 555-569 (1993)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Transzformálás után a sejteket szintetikus dropout táptalajra szélesztjük, amelyben nincs triptofán és leucin, hogy ki tudjuk mutatni a plazmidok jelenlétét. 2-3 napos, 30 °C-n végzett növesztés után az egyes transzformációkból származó izolált telepeket a megfelelő szelekciós táptalajba oltjuk. 2,5 ml-es tenyészeteket szaporítunk a megfelelő szelekciós táptalajon, OD₆₀₀=1, 0-1,2 érték eléréséig. A sejteket azután preparáljuk, és leírt módon permeabilizáljuk [ Guarente, L.: Methods in Enzymology 101, 181-191 (1983)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. A mennyiségi meghatározáshoz klórfenil-vörös-p-D-galaktopi ranozidot használunk (CPRG; Boehringer Mannheim), standard körülmények között [ Durfee és mtsai: Genes Dev.

Ί_, 555-569 (1993)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk.

A H-NUC kötődik a foszforilezetlen RB-hez az SV40 T-antigénhez hasonló régióban

Az RB fehérjéből deléciós mutánsok egy csoportját állítjuk elő. Ezeket a mutánsokat eredetileg a T-kötő

dómén felvázolására használtuk, majd a Gal-4 DNS-kötő domént tartalmazó plazmidokba szubklónozzuk; pASl, az előzőkben ismertetett módon [Durfee és mtsai: Genes Dev. 7, 555-569 (1993)], amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Ezekből a DNS konstrukciókból kettőt, egy Gal-4 aktivációs domén-C-49 fúziót expresszáló plazmidot (az eredeti klónozott C-49), és az YI pPTGlO-et, egy indikátor plazmidot, amely β-galaktozidázt tartalmaz, használunk az Y153 élesztőtörzs ko-transzformálására [ Durfee és mtsai: Genes Dev. Ί_, 555-569 (1993)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az egyes RB fúziós fehérjék expressziós szintjét Western biot elemzéssel mérjük [ Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Ez a szint 2-3szoros eltérésen belül maradt. A kapott transzformánsoknak azután az előzőkben ismertetett módon megvizsgáljuk a β-galaktozidáz aktivitását. Amint az az 1. ábrán látható, a C-49 fúziós fehérjének a Gal-4-RB-hez való kötődését az RB fehérje számos ugyanolyan mutációja eltünteti, beleértve a 706-os Cys-nek Phe-re való pontmutációját, ami eliminálja az SV40 T-antigén kötődését. Van egy kivétel: a C-49 nem képes az Ssp mutánshoz kötődni, amelyről hiányzik az Rb fehérje 160 C-terminális aminosava, míg a T-antigén tud kötődni, jóllehet csökkent affinitással. Az Ml deléció (a 612-63255 * «· · · · • · · · · •· ·· ···· ··· es aminosavak), amely a két kötődő szubdomén közötti linker régió egy részét deletálja, az egyetlen olyan mutáns, amely képes mind a H-NUC mind a T-antigén megkötésére. Világos, hogy az RB fehérjének egy hasonló, de nem azonos régiójára van szükség a T-antigén és a C-49 megkötéséhez.

Ezután a C-49 fúziós fehérjének a pllO^RB-hez való in vitro kötődését vizsgáljuk. A pllO aminosav szekvenciáját a szakirodalomban már leírták [ Lee, H.W. és mtsai: Natúré (London) 329, 642-645 (1987)] (a publikációt a továbbiakban referenciának tekintjük). Az 1,3 kilobázis méretű cDNS kiónt (3. ábra) glutation S-transzferáz (GST) fúziós fehérje formájában expresszáljuk Escherichia coliban [ Smith és Johnson: Gene 67, 31-40 (1988)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Az azonos mennyiségű GST-C-49 fehérjét és két további kontrollt, azaz csak GST-t és a GST-T antigént (2A. ábra) tartalmazó glutation gyöngyöket humán retinoblasztóma sejtvonalból (WERI RB27) készült teljes sejt kivonatokkal inkubáljuk, amelyeket az RB génnel állítunk helyre [Chen és mtsai: Cell Growth Differ. 3, 119-125 (1992)] . Standard tenyésztési körülmények között ezek a WERI (RB+) sejtek az RB fehérje eltérő izoformáit expresszálják, amelyek két eltérő foszforilezettségi állapotot képviselnek, ami a 2B. ábrán látható (2. sáv). Az alapos mosást követően a gyöngyökhöz kötődő fehérjéket SDS-PAGEval és Western blottal elemezzük, a szakkönyvekben ismer-

tetett módszerrel [ Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)] . A közölt biottot anti-RB ellenanyaggal vizsgáljuk meg [ Shan és mtsai: Mól. Cell. Biology 12, 5620-5631 (1992)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk. Ilyen körülmények között a H-NUC csak a foszforilezetlen pllO -t képes a Gst-T-hez hasonló affinitással megkötni, amely pozitív kontrollként szolgál. Csak a GST semmilyen RB fehérjét nem képes megkötni (lásd 1A. ábra, 2-4-es sávok). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a H-NUC fehérje csak a foszforilezetlen, természetes, teljes hosszúságú RB fehérjével képes komplexet képezni.

Teljes hosszúságú cDNS és szekvenciája

Az új fehérje alaposabb jellemzéséhez az 1,3 kilobázis méretű cDNS-t használjuk próbaként egy humán fibroblaszt cDNS könyvtár átvizsgálására. A tucatnyi izolált klónból a leghosszabb cDNS klón (körülbelül 3,3 kilobázis) DNS szekvenciáját teljesen meghatározzuk. A nyitott leolvasási keret egy 824 aminosavból álló fehérjét kódol (3. ábra). A fehérje 35%-os összes homológiát mutat a két ismert fehérjével, a Saccharomyces pombe élesztő nuc2 és az Aspergillus nidulans bimA fehérjével. Mindkét alacsonyabbrendű eukarióta fehérjéről köztudott, hogy a mitózisban játszik szerepet, mivel ennek a két génnek a hőmérséklet-érzékeny mutánsai

leállítják a sejteket a metaf ázisban. A Nuc2 és bimA fehérjék tíz darab 34 aminosavból álló ismétlődést tartalmaznak, amelyek úgy szerveződtek, hogy az egyik az Nterminális régiónál van, a másik kilenc pedig a C-terminális régióban csoportosul, amint az a 4. ábrán látható. Hasonló ismétlődési elrendeződés megtalálható az új RBhez kötődő fehérjében. Ha a három fehérjének csak a kilenc ismétlődő régióját hasonlítjuk össze, akkor a szekvencia azonosság 60% (4B. ábra). Azonban a nuc2 és a bimA első és második ismétlődése közötti szekvenciák nagyon kis homológiával rendelkeznek. Ez a gyenge homológia igaz a C-49-klónból származó fehérjére is. A szekvencia homológia alapján az izolált klón valószínűleg az élesztő Nuc2 és az Aspergillus bimA humán homológja. Ennek következtében a C-49 klón a H-NUC jelzést kapta.

A H-NUC C-terminális ismétlődései kötődnek az RB fehérjéhez

Ez a H-NUC fehérje nem tartalmazza sem az ismert LX-C-X-E motívumot, amelyet a T-antigén és az adenovírus

E1A használ az RB megkötésére, sem az

E2F 18 aminosavból álló szekvenciáját,amelyről igazolták, hogy lényeges az

RB megkötése szempontjából. Ez megfigyelés azt sugallja, hogy a H-NUC fehérje egy eltérő motívumot használhat az RB megkötésére. Egy ilyen megkötő motívum meghatározásához deléciós sorozatmutánsokat készítettünk, amelyek közül mindegyik a H-NUC cDNS más régióját tártál« ···« mázzá, és a Gal-4 fehérjét expresszáltuk, az 5. ábrán látható módon. Egy In vivő kötési vizsgálatot, az előzőkben ismertetett élesztő két-hibrid rendszert [ Durfee és mtsai: Genes Dev. Ί_, 555-569 (1993)] használtuk a fehérje kötő motívumot tartalmazó régiója meghatározására. A teljes hosszúságú fehérje és az eredeti klón (amely hat ismétlődést tartalmaz) egyformán jól kötődik az RB-hez. Az első ismétlődést tartalmazó Nterminális régió azonban nem képes kölcsönhatásba lépni az RB-vel. Ezek az adatok azt sugallják, hogy a H-NUC új módon kötődik az RB-hez, valószínűleg úgy, hogy a fehérjének egy nagyobb, specifikus szekunder struktúrával rendelkező régióját használja.

A 640-es Gly aminosav Asp-re cserélése hőmérsékletérzékeny H-NUC mutánst hoz létre, amelynek a nempermisszív hőmérsékleteken eltűnik az RB-kötési képessége

Annak megerősítésére, hogy a H-NUC RB-hez való kötődése fiziológiásán szignifikáns, a 640-es pozícióban (Gly) egyetlen pontmutációt hozunk létre (Asp-re) a H-NUC fehérje helyspecifikus mutagenezisével. A nuc2-ben a Gly504 Asp-re való hasonló változtatása felelős a hőmérséklet-érzékeny fenotípusért, amely leállítja a Saccharomyces pombe élesztő metafázisban való előrehaladását [ Hirano, T., Y. Hiraoka és M. Yanagida: J. Cell. Bioi. 106, 1171-1183 (1988)] . Mivel a Gly csoport megőrződik a H-NUC fehérjében, valamint az élesztő homológban, a Gly·· ···· ·· ··

Asp mutációval azt lehet megvizsgálni, hogy a H-NUC fehérje defektív-e az RB-hez való kötődésben a nempermisszív hőmérsékleteken. Amint az a 6. ábrán látható, a Gly-640 mutációt tartalmazó H-NUC fehérje nem képes kölcsönhatásba lépni az RB-vel, ha az élesztő 37 °C-on nő (nem-permissziv hőmérséklet), kötődésének képességét, ha (permisszív hőmérséklet). Ez kapcsolat van a feltételezett let-érzékeny (ts) fenotípusa között.

A H-NUC ellenanyag készítése sítása

Ennek az új H-NUC

Western biotokban való egér ellenanyagokat

Escherichia coli-han

Gene 67, 31-40

12, 5620-5631 referenciaként megtisztítjuk, • · ··· · · • * a · · · *··· ·· ·· ···· ··· de megtartja az RB-hez való az élesztő 22 °C-on nő az adat azt sugallja, hogy metafázis leállás hőmérsékés az RB-kötő tulajdonság és a H-NUC fehérje azonofehérjének fehérje gélekben és azonosítására készítettünk.

expresszáljuk [

Shan és mtsai:

a fehérje elleni

Gst-C-4 9-et

Smith

Mól.

és Johnson:

Cell. Biology amely publikációkat a kezelünk, majd és antigénként válasz kiváltására egerekben. A ellenanyagot azután kinyerjük.

továbbiakban hozzáférhető, metabolikusan glutation használjuk poliklonális

Miután az gyöngyökkel ellenanyag anti-H-NUC ellenanyag egy eritroleukémia sejtvonalat

S-metionmnal jelzünk, máj d ebből készítünk sejtlizátumokat, ezeket poliklonális ellena·· ···· ·· · · nyaggal immunprecipitáljuk, az előzőkben ismertetett módon. Amint az a 6A. ábráról látható, egy specifikus, körülbelül 95 kDa molekulasúlyú fehérje immunprecipi tálódik az immunszérummal (2-es sáv), de nem válik ki a preimmun szérummal. A komplex szétesik gélekben. Csak egy 95 kDa méretű fehérje látható, mivel a K562 fehérjét specifikusan jeleztük a ³⁵S-metioninnal. Ezt a 95 kDa-os fehérjét akkor is kimutatjuk, ha a GST fehérjét használjuk versengésre az immunprecipitációban, demonstrálva, hogy a poliklonális ellenanyag nem ismeri fel a GST-t egyedül. Másrészt az eredeti antigén képes versengeni az endogén celluláris fehérjével, és a 95 kDa os esik kimutathatatlanná válik (3. és 4. sáv) . Ennek az ellenanyagnak a specifitását tovább igazolja, ha a primer immunprecipitátumokat denaturáljuk és újra immunprecipitáljuk. Amint az a 6B. ábrán (3-as sáv) látható, a 95 kDa-os fehérje az egyetlen kimutatott esik, és a háttér tiszta. Minden immunológiai bizonyíték azt sugallja, hogy a 95 kDa-os fehérje a H-NUC géntermék.

A H-NUC fehérjének DNS-kötő aktivitása van

3 5

Körülbelül 1x10 sejtet jelzünk S-metioninnal, majd

Lysis 250 pufferben lizáltatjuk (250 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 EDTA, 50 mmol/1 TRIS (pH=8,0), 0,1% NP40, 1 mmol/1 fenilmetilszulfonil-fluorid (PMSF), 8 μg leupeptin, 8 μg antipain). A lizátumokat centrifugálással derítjük, majd 2 térfogat felvivő pufferrel hígítjuk (10 mmol/1 KH₂PO₄ pH=6,2, 1 mmol/1 MgCl₂,

0,5% NP40, 1 mmol/1 DTT, 10%

A hígított kivonatot azután DNS-cellulóz oszlopra visszük fel (természetes borjútimusz DNS,

Pharmacia,

Piscataway,

NJ), az előzőkben ismertetett módon, amit azután egy óra hosszat 40 °C-on inkubálunk enyhe rázatás közben. Az oszlopot azután 5 ágytérfogatnyi felvivő pufferrel mossuk, utána ugyanezzel a pufferrel eluálj uk, amely növekvő koncentrációban tartalmaz nátrium-kloridot.

Minden egyes eluens frakcióit immunprecipitációval elemezzük (az előzőkben ismertetett módon) retinoblasztó ma fehérje elleni ellenanyaggal (11D7, 7A. ábra), H-NUC elleni ellenanyaggal (7B. ábra) vagy GST gyöngyök elleni ellenanyaggal (7C. ábra). Az egyes frakciók alikvot részeit glutation gyöngyökkel is inkubáljuk, a glutation transzferáz kimutatására. Az RB-fehérjének DNS-kötő aktivitása van, ez szolgál pozitív kontrollként. A H-NUC fehérjének hasonló DNS-kötő aktivitása van, míg a glutation-transzferáznak egyedül nincs ilyen aktivitása. A szekvencia homológia amellett szól, hogy a H-NUC DNSkötő régiója a TRP régión kívül található.

A H-NUC a 17q21-22 kromoszómára térképezhető

A ³H-jelzett, 3,3 kilobázis méretű H-NUC cDNS próba humán kromoszómákhoz való in situ hibridizálásával a 17es kromoszóma specifikus jelölődését lehetett kimutatni a q21-22 régióban, amint az a 9. ábrán látható. A 150 • · ·· • · ···· ·« • « · · · • · · · · • · · · ···· ·· ·· értékelt sejt 320 szemcséjéből 42 (13,1%) található a

17q21-22 régióban. Egyéb pont nem jelölődött jobban mint a háttér. Mivel a használt próba egy része a pszeudogénjével homológ szekvenciát tartalmaz, ezért mindegyik sejtben ki lehetett mutatni az akrocentrikus kromoszómák rövid karjához való többszörös hibridizációt, ezért ezeket kizártuk a további elemzésből. Hasonló térképezési eredményeket kaptunk a szomatikus sejt-hibrid módszerrel, amellyel a H-NUC szintén a 17-es kromoszómára térképeződik. A H-NUC lokalizációja érdekes, mivel a családi emlőrák génje is ugyanebbe a régióba térképeződik.

A H-NUC tumorszuppresszor aktivitása

A H-NUC tumorszuppresszor aktivitását mind in vitro sejttenyésztési körülmények között, mind meztelen egér állatmodellekben megvizsgáltuk. A H-NUC tumorszuppresszor aktivitásának megbecslésére használt sejtvonalak: az MDAMB-231, amely a H-NUC egyetlen funkcionális alléljét használja, és a T-47D, amely a H-NUC lókusz homozigóta mutánsa.

Röviden, a H-NUC-nak ez előzőkben említett sejtvonalak szaporodására gyakorolt hatását vizsgáltuk, a H-NUC expressziója után, amelyre adenovirális expressziós vektort használtunk. Az ACN egy kontroll adenovirális vektor, amelyből hiányzik a cDNS inszert, míg az AC-H-NUC egy olyan adenovirális vektor, amely H-NUC-ot expresszál a humán CMV promoterrel meghajtva.

H-NUC-ot tartalmazó adenovirális vektor '· ·· • < ··· « • · ·

Az adenovirális expressziós vektor készítéséhez egy 2520 bázispár méretű fragmenst használunk, amely tartalmazza a H-NUC teljes hosszúságú cDNS-ét (ezt a fragmenst PCR-rel amplifikáltuk Quick Clone kétszálú placenta cDNSről (Clontech)). A H-NUC amplifikálására használt primerek egy KpnI hasítási helyet adnak a fragmens 5' végéhez és egy Xhol hasítási helyet adnak a 3' véghez, hogy ezzel lehetővé váljon a pBluescript II KS+ többszörös klónozó helyére való irányított klónozás (5' oligonukleotid: 5'CGCGGTA' CATGACGGTGCTGCAGGAA 3'; 3' oligonukleotid: 5' ATCGGCTCGAGCAGAAGTTAAAATTCATC 3'). A PCR ciklusok az alábbiak: 1 ciklus 94 °C 1 perc; 30 ciklus 94 °C, 1 perc; 53 °C 1,5 perc, 72 °C 2 perc; és 1 ciklus 72 °C 7 perc. A kiónokat azon az alapon választjuk ki, hogy képesek-e egy 95 kDa-os fehérjét termelni a TnT-kapcsolt retikulocita lizátum rendszerben (Promega). A pBluescript vektorban levő T3 promoter lehetővé teszi a H-NUC kódoló szekvencia transzkripcióját és transzlációját nyúl retikulocitákkal.

TnT retikulocita °C-on inkubáljuk.

Egy M-U mini-lizátum reakcióelegyhez, majd A reakcióelegyből 10

DNS-t adunk egy óra hosszat 30 μΐ-t felvivő pufferrel keverünk össze,majd (Novex) futtatjuk 1,5 óra mellett. A gélt leszárítjuk,

10%-os poliakrilamid gélen hosszat 165 V feszültség majd éjszakán át egy filmre • · ···· ·· ·· · • · ·· ·· · · · • · ·· · · · • · · 4 · · ···· «· ·· «··· ··· exponáljuk. Négy, teljes hosszúságú fehérjét termelő kiónt szekvenálunk. A H-NUC inszertet kinyerjük a vektorból, KpnI és Hindii restrikciós enzimekkel való emésztés után, majd szubklónozzuk a pAdCMVb vektor KpnlBglII hasítási helyére (a BglII véget feltöltjük, tompavég kialakítása céljából). Mind a négy klón tartalmaz valamennyi mutációt, ezért a helyes vad típusú szekvenciát tartalmazó kiónt állítunk elő, két klónból származó fragmens ligálásával.

A rekombináns adenovírus készítéséhez az előzőkben ismertetett plazmidokat Nrul restrikciós enzimmel 1inearizáljuk, majd ko-transzfektáljuk a Clal restrikciós enzimmel emésztett dl309 mutánsok nagy fragmensével [ Jones és Shenk: Cell 17, 683-689 (1979)] , amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk, CaPO₄ transzfekciós kitet alkalmazva (Stratagene). A virális tarfoltokat izoláljuk és a rekombinánsokat mind restrikciós enzimes emésztéssel mind PCR-rel azonosítjuk, a HNUC cDNS szekvenciával szembeni primereket alkalmazva. A rekombináns vírust tovább tisztítjuk határhigífással, majd a vírusrészecskéket megtisztítjuk és standard módszerekkel titráljuk [Graham és van dér Erb: Virology 52, 456-457 (1973); Graham és Prevec: Manipulation of adenovírus vectors; Methods in Molecular Biology Ί_·. Gene Transfer and Expression protocols; szerk.: Murray E.J.;

The Humana Press Inc., Clifton N.J. 7, 109-128 (1991)], ·· ···» ·· ·· · •4 »····*· • * ··· · · ♦ · ♦ · · · ···· ·· ·· ···· »·· amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk.

Annak biztosítására, hogy az előzőkben ismertetett H-NUC vektor a megfelelő méretű fehérjét expresszálja, T47 D sejteket fertőzünk vagy a kontrollal vagy a H-NUC tartalmú rekombináns adenovírussal 24 óra hosszat, a vírus/sejt tarfoltképző egységeinek növekvő fertőzési multiplicitása (MOI) mellett. A sejteket azután egyszer mossuk PBS-sel, majd lízis pufferben gyűjtjük össze (50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=7,5, 250 mmol/1 nátrium-klorid, 0,1%

NP40, 50 mmol/1 nátrium-fluorid, 5 mmol/1 EDTA, 10 pg/ml aprotinin, 10 μρ/πιΐ leupeptin és 1 mmol/1 PMSF) . A sejtfehérjéket 10%-os SDS-PAGE-val választjuk szét, majd nitrocellulózra visszük át. A membránokat anti-H-NUC ellenanyaggal inkubáljuk, majd birka anti-egér IgG-vel, amelyet tormaperoxidázzal konjugáltunk. A H-NUC fehérje pontos expresszióját kemilumineszcenciával tesszük láthatóvá (ECL kit, Amersham) Kodak XAR-5 filmen.

In vitro

Az MDA-MB-231 és T-47D emlőtumor sejtvonalakat lxlO⁶ sejt/100 mm-es lemez sűrűségben beoltjuk Kaighn féle F12/DME táptalajba (Irvine Scientific), amit 10% FBS-sel és 0,2 NE inzulinnal (Sigma) egészítettünk ki a T-47D sejtek miatt. A lemezeket éjszakán át inkubáljuk 37 °C-on, 7% CO₂ tartalmú atmoszférában. A következő napon a sejteket újra tápláljuk 10 ml növesztő táptalajjal, majd ·· ·«·· ·· ·· * · ·«····· • · ··· « · • · * · · » ··· · ·· ·· ···· ·· · vagy az ACN kontroll virális lizátummal (MOI 10) vagy az AC-H-NUC virális lizátummal (MOI 10) fertőzzük, majd 37 °C-on inkubáljuk. 3 nap elteltével a táptalajt eltávolítjuk és a sejteket 1:5 arányú ecetsav-metanol oldattal fixáljuk. A sejteket 20% metanol-0,5% kristályibolya oldattal festjük 30 percig, majd csapvízzel öblítjük a fölösleges festék eltávolítása céljából.

Ha a T-47D sejteket AC-H-NUC-cal fertőzzük, akkor ennek eredménye az, hogy ezeknek a sejteknek a növekedését az expresszált H-NUC fehérje gátolja (11. ábra). Az AC-H-NUC-cal fertőzött, kristályibolyával festett T-47D sejtek vizuális megfigyelése során kevesebb sejtet látunk (körülbelül 50%), ha az ACN kontroll sejtekhez hasonlítjuk. Emellett a T-47D sejtek morfológiája is megváltozott. A sejtek látszólag sűrűbbek lettek, elvesztették a normális növekedési jellemzőiket. Nem volt látható változás, amikor a T-47D sejteket kontroll ACN vírussal fertőztük. Ezzel szemben a heterozigóta sejtek, az MDAMB-231 látszólag nem változtak sem az ACN sem az AC-H-NUC hatására, in vitro.

A timidin beépülés mérését is felhasználjuk a H-NUC sejtszaporodásra gyakorolt hatásának becslésére. Röviden, körülbelül 3xl0³ MDA-MB-231 és T-47D sejtet viszünk egy 96-lukas lemez (Costar) minden egyes lukába, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, 5%-os CO₂ atmoszférában. Az ACN és a AC-H-NUC sorozathigítását DME:F12/15% FBS/1% glutamin összetételű oldatban végezzük, majd a sejteket ···· · ·· ···· ·· • · · · · ♦ · ··· • · · · ···· ·· ··

10-es és 100-as fertőzési multiplicitással (MOI) fertőzzük (minden egyes MOI-t négy párhuzamos lukban végzünk) minden egyes adenovírussal. A sejtek táptalajának felét a fertőzés után 24 órával kicseréljük, majd utána 48 óránként cseréljük, egészen a kinyerésig. 18 órával a begyűjtés előtt 1 μόί ³H-timidint (Amersham) adunk az egyes lukakhoz. A sejteket üvegszálás szűrőlapokra gyűjtjük a fertőzés után 5 nappal, majd a sejt nukleinsavába beépült ³H-timidint folyadék szcintillációval mutatjuk ki (TopCount, Packard Instruments). Minden egyes MOI-nál a sejtek szaporodását a kezeletlen kontroll sejtek átlagos szaporodásának százalékában fejezzük ki.

A kapott eredmények azt mutatják, hogy az MDA-MB-231 sejtek szaporodása (ezek a sejtek heterozigóták a H-NUCra nézve) hasonló mind az ACN-nel mind az AC-H-NUC-cal való kezelés után (lásd 12. ábra) . Ezzel szemben, az ACH-BUC-ra adott specifikus válasz figyelhető meg a T-47D sejteknél (ezekből a H-NUC ki van vágva), amely fokozódott magasabb MOI-nál. Ezek az adatok azt igazolják, hogy a H-NUC génnek adenovírus által közvetített transzferé szaporodás-ellenes hatással van a H-NUC szempontjából megváltoztatott sejtekre.

In vivő génterápia

A H-NUC expressziónak a tumorigenitásra gyakorolt hatása megbecsléséhez az előzőkben említett tumor sejtvonalakat vizsgáltuk meg, hogy képesek-e tumorokat • · · · · · • · • · · · · · • · · · · ···· ·· · · ···· létrehozni meztelen egér modellekben. Körülbelül 2xl0⁷ T47D sejtet szélesztünk T225 lombikokba, majd a sejteket szacharóz pufferrel kezeljük, amely ACN-t vagy AC-H-NUCot tartalmaz 3-as vagy 10-es MOI mellett. Az éjszakán át való fertőzés után a sejteket kinyerjük, majd körülbelül 10⁷ sejtet injekciózunk szubkután BALB/c meztelen egerek bal és jobb ágyékába (4 per csoport), amelyek előzőleg 17β -ösztradiol szemcséket kaptak szubkután. Az egyik ágyékot ACN-nel kezelt sejtekkel injekciózzuk, míg a kontralaterális ágyékot AC-H-NUC sejtekkel injekciózzuk., mindegyik egér egyben saját maga kontrollja. A kezeletlen sejtekből bilaterális injekciókat kapott állatok további kontrollt jelentenek a tumornövekedés szempontjából. A tumorok méretét (hossz, szélesség, magasság) valamint a testsúlyokat hetente kétszer mérjük. Mindegyik állatnál megbecsüljük a tumor térfogatát, szférikus geometriát feltételezve, amelynek sugara egyenlő a mért tumordimenziók átlaga felével.

Ennek a kísérletnek az eredményeit a 13. ábrán mutatjuk be. Ezek az eredmények jelentős csökkenést mutatnak a tumornövekedés szempontjából a H-NUC-ot expresszáló sejteknél. Röviden, huszonegy nappal a sejtek beoltása után a tumorok mindegyik állatnál mérhetők mindkét oldalon. Az AC-H-NUC-cal (MOI=30) kezelt sejtekből származó tumorok kisebbek mint a kontralaterális tumorok, amelyek ACN-nel kezelt (MOI=30) sejtekből származnak, 4 egérből 4-nél. Az AC-H-NUC-cal kezelt

sejteknél (MOI=30) az átlagos tumorméret kisebb maradt mint az ACN-nel kezelt sejteknél (MOI=30), a 21 napos periódus során (lásd 3. ábra). Ezek az adatok tovább igazolják az ismertetett H-NUC fehérje tumorszuppresszor aktivitását.

H-NUC in vivő tumorszuppresszió

T47-D humán emlőtumor sejteket injekciózunk szubkután nőstény BALB/c atimuszos meztelen egerekbe. A tumorokat 32 napig hagyjuk fejlődni. Ennél a pontnál vagy az ACN (kontroll) vagy az AC-H-NUC (ez tartalmazza a HNUC gént) adenovírus vektorból egyetlen injekciót injekciózunk a tumort körülvevő peritumorális térbe. A tumorokat azután kivágjuk, az adenovírus injekciót követő

2. vagy a 7. napon, majd mindegyik tumorból poli-A+ RNS-t izolálunk. Ezután reverz transzkriptáz-PCR-t alkalmazunk, H-NUC specifikus primerekkel, hogy kimutassuk a H-NUC RNS-t a kezelt tumorokban. Az aktin primerekkel végzett amplifikálás szolgál kontrollként az RT-PCR reakcióban, míg a rekombináns-(H-NUC) szekvenciát tartalmazó plazmid szolgál pozitív kontrollként a rekombináns-(H-NUC) specifikus sávhoz.

Egy külön kísérletben T-47D sejteket injekciózunk az egerek jobb ágyékába,majd a tumorokat hagyjuk nőni 2 hétig. Az egerek hetente kétszer peritumorális injekciót kapnak pufferből vagy a rekombináns vírusból, összesen nyolc dózist. A tumornövekedést követjük a kezelés során ·«·· · · ·· • · ······ • · · · · · • · · · · ··*· ·· ·· ···· · az ACN-t és puffért kapott kontroll állatokban, valamint az AC-H-NUC-ot kapott állatokban. A testsúlyt és a túlélési időt is követjük.

Az exogén H-NUC túlélése az emlőtumor sejtvonal T-47D sejtjeiben.

A T-47D emlőtumor sejtvonal emlőtumor sejtjei, amelyek nem tartalmaznak endogén H-NUC-ot, ennek a génnek a homozigóta mutációja következtében, tiszta hátteret biztosítanak a H-NUC funkcionális vizsgálatához. A T-47D sejteket vagy AC-H-NUC vagy a kontroll ACN vektor összehasonlítható titerével fertőzzük. A legtöbb telepet egyenként szaporítjuk tömeges tenyészetekké.

A fertőzött sejteket metabolikusan jelezzük ³⁵S-sel és sejtlizátumok készítésére használjuk, a termelt fehérje mennyiségének kiértékelésére. Az AC-H-NUC-cal fertőzött tenyészeteket a kontroll sejtekhez hasonlítjuk, a morfológia, a növekedés sebessége (azaz a kettőződési idő) , a telítési sűrűség, a lágyagar telepképződés valamint a meztelen egerekben való tumorképződés szempontjából .

Jóllehet a találmányt a jelenleg előnyösnek tartott megvalósítási módok alapján ismertettük, az nyilvánvaló, hogy különböző módosítások tehetők benne, anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől. Ennek megfelelően a találmányt csak az igénypontok korlátozzák.

Az alábbiakban ismertetjük a szekvenciák listáját.

• · ···· ·· ·· • · · · · · · • · · · · · ···· ·· ·· ··«·

A szekvenciák jegyzéke

1. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 3320 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (ix) Tulajdonságok:

(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 101..2527 (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia

2. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 824 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatipus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia

3. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 212 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő « · · · (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia

4. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia

5. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia

6. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő

(D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia

7. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 7. számú szekvencia

8. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatipus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia

9. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 9. számú szekvencia

10. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 10. számú szekvencia

11. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 11. számú szekvencia

12. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő • · • · (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 12. számú szekvencia

13. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltipus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 13. számú szekvencia

14. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 14. számú szekvencia

15. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (xi) A szekvencia leírása: 15. számú szekvencia

16. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 66 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatipus: peptid (ix) Tulajdonság:

(A) Név/kulcs: Peptid (B) Lokalizáció: 34 (D) Egyéb információ: /jelzés= Xaa /megjegyzés= Xaa = (ix) A szekvencia leírása: 16. számú szekvencia

17. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 88 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 17. számú szekvencia • ·

18. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 56 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 18. számú szekvencia

19. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 19. számú szekvencia

20. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 20. számú szekvencia • · • · · · • · ······ • · ··· · • · · · · ···· ·· ·· ···· ·

21. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 21. számú szekvencia

22. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 22. számú szekvencia

23. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 23. számú szekvencia

24. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 24. számú szekvencia

25. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 25. számú szekvencia

26. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 26. számú szekvencia • · · · · · • · · · · «··· ·· · · ···· ·

27. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 27. számú szekvencia

28. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltipus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 28. számú szekvencia

29. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltipus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatipus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 29. számú szekvencia • · · · · · ···· · · ·· ···· ···

30. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 34 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 30. számú szekvencia

31. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 27 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltipus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 31. számú szekvencia

32. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 27 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatipus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 32. számú szekvencia • ·· · • · • · · · · • · · · • · · · ·· ··

33. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 27 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 33. számú szekvencia

34. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 3320 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: cDNS (ix) Tulajdonság:

(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 101..2527 (ix) A szekvencia leírása: 34. számú szekvencia

35. számú szekvenciavázlat (i) A szekvencia jellemzői:

(A) Hosszúság: 824 aminosav (B) Típus: aminosav (C) Száltípus: mindkettő (D) Topológia: lineáris

(ii) Molekulatípus: peptid (ix) A szekvencia leírása: 35. számú szekvencia

1. Egy Rb-kötő fehérjét kódoló izolált és tisztított DNS szekvencia, amely tartalmaz egy olyan szubszekvenciát, amely legalább 60%-os homológiát mutat a

C-terminálison található kilenc tetratrikopeptid ismétlődéssel, azzal a feltétellel, hogy a szekvencia sem

Claims (26)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK a Saccharomyces pombe élesztő nuc2 fehérjéjét, sem az

   Aspergillus nidulans bimA fehérjéjét, sem a Saccharomyces cerevisiae élesztő CDC27 fehérjéjét nem kódolja.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti Rb-kötő fehérjét kódoló izolált és tisztított DNS szekvencia, amely DNS szekvencia legalább 60%-os homológiát mutat az 1.számú szekvencia 465-770-es aminosavaival.

   Az 1.

   igénypont szerinti izolált és tisztított

   DNS szekvencia, amely az

   1.számú szekvencia

   465-770-es aminosavait kódolja.

   Az 1.

   igénypont szerinti izolált és tisztított

   DNS szekvencia, amely a H-NUC-ot kódolja lényegében az 1.

   számú szekvenciában bemutatott szekvencia szerint.
3. 5. Rekombináns vektor, amely az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti izolált, tisztított DNS-t tartalmazza.
4. 6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns vektor, amely vektor kozmid, plazmid, vagy egy vírusból származik.
5. 7. Az 1., 2., 3. vagy 4. igénypont szerinti DNS molekulát tartalmazó expressziós vektor amely képes az említett DNS molekulát egy emlős gazdasejtbe bejuttatni, majd ott a fehérjét expresszáltatni.

   8 A 7. igénypont szerinti expressziós vektor, amely expresszi ós vektor lehet plazmid vagy egy virális vektor • 9 A 8. igénypont szerinti expressziós vektor, amely említett virális vektor lehet egy retrovirális vektor vagy egy adenovirális vektor. 10. A 9. igénypont szerinti expressziós vektor,

   amely expressziós vektor az AC-H-NUC.
6. 11. Gazda-vektor rendszer a H-NUC fehérje biológiai aktivitásával rendelkező polipeptid vagy fehérje, vagy biológialag aktív származéka előállítására, amely tartalmazza a 7., 8., 9. vagy 10. igénypont szerinti vektort egy megfelelő gazdasejtben.
7. 12. A 11. igénypont szerinti gazda-vektor rendszer, amelyben a gazdasejt egy prokarióta sejt.
8. 13. A 11. igénypont szerinti gazda-vektor rendszer, amelyben a gazdasejt egy eukarióta sejt.
9. 14. A 7. igénypont szerinti vektort és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmazó gyógyászati készítmény.
10. 15. A 8. igénypont szerinti vektort és egy fiziológiásán elfogadható hordozót tartalmazó gyógyászati készítmény.
11. 16. Az AC-H-NUC vektort és egy gyógyászatilag elfogadható hordozót tartalmazó gyógyászati készítmény.

    • » · · • · · · · ·· · · ·· · · ·»·· ·
12. 17. DNS próba, amely legalább 27, az 1. igénypont szerinti DNS szekvenciával komplementer nukleotidot tartalmaz .
13. 18. A 17. igénypont szerinti DNS próba, amelyben a nukleotidok komplementerek az 1. számú szekvencia DNS szekvenciáj ával.
14. 19. Egy izolált és tisztított emlős szekvencia, amely kötődik az Rb fehérjéhez, és tartalmaz egy aminosav szekvenciát, amely a C-terminálison található tetratrikopeptid ismétlődésből legalább hatot tartalmaz, azzal a feltétellel, hogy a fehérje sem a Saccharomyces pombe élesztő nuc2 fehérjéje, sem az Aspergillus nidulans bimA fehérjéje, sem a Saccharomyces cerevisiae élesztő CDC27 fehérjéje.
15. 20. A 19. igénypont szerinti izolált és tisztított emlős fehérje, amely a C-terminálisán kilenc tetratrikopeptid ismétlődést tartalmazó aminosav szekvenciával rendelkezik.
16. 21. A 20. igénypont szerinti izolált és tisztított emlős fehérje, amely a H-NUC, aminosav szekvenciája pedig a 2. számú szekvenciával egyezik meg.
17. 22. Eljárás a 19. igénypont szerinti fehérje előállítására, azzal jellemezve hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

    a. a 19. igénypont szerinti fehérjét kódoló gént tartalmazó kompatibilis expressziós vektort egy gazdasejtbe juttatjuk be;

    b. az említett gazdasejtben az említett fehérjét expresszáljuk.

    • · 4··· 444 » • · ·· ·· ·« • · ··· · • · ·«4 ··*· ·♦ 44 ·*··4
18. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejt lehet prokarióta gazdasejt vagy eukarióta gazdasejt.
19. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve, hogy az említett gazdasejt egy eukarióta gazdasejt, amely egy emlős gazdasejt, és az említett expressziós vektor kompatibilis az említett emlős gazdasej ttel.
20. 25. Eljárás egy endogén H-NUC fehérjével nem rendelkező ráksej t neoplasztikus fenőtípusának elnyomására, azzal jellemezve, hogy az ilyen ráksejtbe hatékony mennyiséget juttatunk be az 1., igénypont szerinti DNS-ből.
21. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jelle mezve, hogy a H-NUC gént rekombináns vektorral juttatjuk be.
22. 27. Eljárás egy endogén H-NUC fehérjével nem rendelkező ráksej t neoplasztikus fenotípusának elnyomására, azzal jellemezve, hogy az ilyen ráksejtbe hatékony mennyiséget juttatunk be a

    19-21. igénypont szerinti
23. 28 .

    Egy Rb-kötő fehérjéhez kötődő ellenanyag, amely fehérj e a C-terminálisán egy olyan szubszekvenciát tartalmaz, amelyben legalább van, azzal a feltétellel, hogy a az említett fehérje nem

    Saccharomyces pombe élesztő nuc2 fehérje, Aspergillus ·· ···· ·· niger bimA fehérje, és nem

    Saccharomyces cerevisiae CDC27 fehérje.
24. 29. A

    28. igénypont szerinti ellenanyag, azzal jellemezve, hogy kötődik számú szekvenciának megfelelő aminosav s zekvenciával fehérj éhez.
25. 30. Hibridóma, amely a 2.

    számú szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával fehérjét megkötő monoklonális ellenanyagot termel.
26. 31. Eljárás a H-NUC fehérje hiányának kimutatására tumorsejtekben, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:

    a. a tumorból szöveti szekciókat készítünk;

    b. a 26. vagy 27. igénypont szerinti ellenanyagot érintkezésbe hozzuk az említett szöveti szekciókkal; és

    c. kimutatjuk az említett ellenanyag kötődés meglétét vagy hiányát az említett szöveti szekciókhoz.