HUT72068A - Synthetic peptide derivatives and the salts thereof - Google Patents

Synthetic peptide derivatives and the salts thereof Download PDF

Info

Publication number
HUT72068A
HUT72068A HU9502018A HU9502018A HUT72068A HU T72068 A HUT72068 A HU T72068A HU 9502018 A HU9502018 A HU 9502018A HU 9502018 A HU9502018 A HU 9502018A HU T72068 A HUT72068 A HU T72068A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
peptide
bmp
amino acid
pharmaceutically acceptable
acid sequence
Prior art date
Application number
HU9502018A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9502018D0 (en
Inventor
Gerhard Breipohl
Takashi Kurita
Tomoaki Matsumoto
Reiko Kikuno
Yoko Otawara-Hamamoto
Original Assignee
Hoechst Japan
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Japan filed Critical Hoechst Japan
Publication of HU9502018D0 publication Critical patent/HU9502018D0/hu
Publication of HUT72068A publication Critical patent/HUT72068A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/51—Bone morphogenetic factor; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone-inducing factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

A találmány farmakológiai aktivitással rendelkező új szintetikus peptid-származékokra és sóikra vonatkozik. A találmány szerinti szintetikus peptid-származékok és sóik csontalakfejlődési protein antagonista-szerű aktivitással rendelkeznek. A csontalakfejlődési protein antagonista aktivitással rendelkező vegyületek rendellenes elhelyezkedésű meszesedéssel, rendellenes elhelyezkedésű csontképződéssel vagy meszesedéssel, például idegi csontszövetképződéssel, poszt-operatív stressz által kiváltott rendellenes elhelyezkedésű csontképződéssel, trauma okozta, csontosodással járó izomgyulladással, oxigénellátási hiány okozta csontképződéssel, csonteredetű tumorral, a hátsó hosszanti szalag csontszövetképződésével (OPLL) és artériás sclerosissal járó különféle csontmetabolizmus zavarok kezelésére és megelőzésére alkalmazhatók.
A csontalakfejlődési protein (BMP) egy csontalakfejlődési aktivitással rendelkező protein a mésztelenített csontszövetben. Noha a BMP izolálásán 1970-es évek óta erőteljesen munkálkodtak, ezidáig nem sikerült egyetlen proteinként izolálni azt. A BMP genetikus klónozását Wozney oldotta meg 1989-ben molekuláris biológiai módszerrel, ismeretlen peptidekből származó aminosav-szekvenciák alkalmazásával, amelyeket a BMP aktivitással rendelkező frakció enzimes kezelésével választottak el. A gént azonnal állati eredetű sejttenyészetbe vitték be, és az expresszált protein aktivitását in vivő meghatározták, és bizonyították a proteinben lévő BMP aktivitást [Wang E. és munkatársai, Proc. Natl. Acat. Sci., USA, 87, 2220-2224 (1990)]. A hasonló aktivitású proteinek további klónozásával, a homológia segítségével ezidáig több proteint azonosítottak, amelyeket
-3 ΒΜΡ-2 - ΒΜΡ-9-nek neveztek el. Ezek a proteinek a TGF-β gén főcsaládba tartoznak, és kimutatták, hogy in vivő alapvetően rendellenes elhelyezkedésű csontképződést kiváltó aktivitással rendelkeznek. A BMP által kiváltott csontosodás belsőleg porcos, és úgy tűnik, hogy a BMP embrionális szakaszban a hosszúcsont-képződést reprodukálja. Ezért magát a BMP-t gyógyszerként a csonthiány kompenzálását célzó kezelésben lehet alkalmazni.
A BMP gének felismerése után előállították a BMP elleni specifikus antitesteket is, és kimutatták, hogy a BMP-k a rendellenes elhelyezkedésű meszesedés, rendellenes elhelyezkedésű csontosodás és hasonló betegségek kritikus szakaszában is szerepet játszanak, amelyeket ezidáig nem lehetett kezelni. így lehetőség nyílt a BMP-k és ezen betegségek között bizonyos összefüggések felismerésére. Jelenleg nyilvánvaló, hogy a BMP jelen van vagy szerepet játszik olyan betegségekben, mint például az idegi csontszövetképződés, rendellenes elhelyezkedésű csontosodás operációt követő stresz miatt, a traumás csontképző izomgyulladás, oxigénellátási hiány miatti csontosodás, csonteredetű tumor, és a nehezen kezelhetőként számontartott különféle betegségek, például a hátsó hosszanti szalag csontosodása (OPLL) [Spiné, 17-3S, S33 (1992)], és az arteriális sclerosis meszesedési szakasza [J. Clin. Invest., 91, 1800, (1993)]. Ezenkívül az ál-rosszindulatú, heterotópiás csontosodás (PHO) szimptómái, az ál-rosszindulatú csonttumor, a myosistis ossificans circumscripta és az izom kemény szövetében az anyag jelenléte. Noha a fenti betegségek okai ezidáig részleteiben még nem ismertek, úgy tűnik, hogy a BMP a kemény szövet
-4kapcsolatos jelenlétével a betegek izmában. Feltételezik, hogy ha a BMP jelen van olyan szövetekben, amelyekben nem kellene jelen lennie, úgy hat az autocrine-re és a csontra, mint ha elmeszesedett szövet képződött volna.
Az OPLL kezelésére még nem ismert hatékony módszer. Ha a szorongásos, idegi szimptóma komoly, amputálást végeznek. Azonban a prognózis nem olyan jó. Az artériák elmeszesedésére sincsen még kezelési eljárás. Úgy tűnik, hogy a BMP jelenlétének szuppressziója a fő kezelési módok egyike lehet ilyen betegségek esetén. Másik kezelési módként BMP antagonisták adagolása is hatásosnak tűnik.
A fentiek miatt nagy szükség volt hatásos módszerre a fent ismertetett, csontszerű szövetképződéssel járó betegségek kezelésére. Feltételezhető, hogy a BMP receptorok, BMP elleni semlegesítő antitestek és a BMP-t kötő helyzetnek megfelelő peptid BMP antagonista-szerű aktivitással rendelkeznek.
A BMP szerkezet-hatás összefüggéseit intenzíven tanulmányozták. Azonban ezidáig nem volt ismert, hogy az érett BMP-2 melyik régiója van kapcsolatban a receptor-kötődéssel, sem az, hogy a BMP-2 melyik fragmentuma képes annak receptoraihoz kötődni.
A receptorokhoz BMP antagonistaként kapcsolódni képes peptid tervezése céljából meghatároztuk a BMP-2 háromdimenziós szerkezetét, a TGF-p2 alapján, amely a ΒΜΡ-2-vel homológ protein, és ezután meghatároztuk a BMP-2 receptor-kötő régióját.
Feltételeztük, hogy a BMP hatásos proteinje egy dimer, és azt, hogy a protein, például a BMP receptor-kötő régiója való színüleg a protein-molekula külső, hozzáférhető régiójában helyezkedik el. Abban az esetben, ha a BMP-2 egy dimert képez, várható, hogy a receptor-kötő régió két szomszédos peptid-doménből alakul ki (a BMP-2 érett formájában a pozíciószám a 22-es helyzetű aszparagintól a 38-as helyzetű tirozinig és a öles helyzetű alanintól a 77-es helyzetű alaninig az egyes molekulákon). E feltételezés alapján terveztünk egy olyan peptidszármazékot, amely tartalmazza a fenti két pepiidet egy kötőcsoporthoz kötve, amely képes a fenti két pepiidhez kapcsolódni, és megfelelő távolságot tart a két peptid között ahhoz, hogy azok a receptorok-hoz kötődni tudjanak. Megfelelő kötőcsoportok a kétértékű szerves csoportok, amelyek karboxilcsoportot tartalmaznak mindkét végükön, és a BMP-2 meghatározott térszerkezetéhez hasonló peptid-származékokhoz kapcsolódnak.
A találmány szerinti szintetikus peptid-származékok a P’-R’-P2 általános képlettel jellemezhetők, a képletben
P1 jelentése
Asp-Phe-Ser-Asp-Val-Gly-Trp-Asn-Asp-Trp-Ile-Wal-Ala-Pro-Gly-Tyr (1) aminosav-szekvenciájú peptid vagy annak analógja;
P2 jelentése
Ala-Ile-Val-Gln-Thr-Leu-Val-Asn-Ser-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Lys-Ala (2) aminosav-szekvenciájú peptid vagy annak analógja;
R jelentése kötőcsoport, amely a P és P peptidek N-terminális végeihez kapcsolódik.
• · • · ·
-6Bármilyen R1 kötőcsoport alkalmazható, feltéve, hogy az
2 nem zavarja a P és P peptid-szegmensek aktivitását.
Megfelelő kötőcsoportok a maleinimido-alapú (I) általános képletű kötőcsoportok vagy a diszulfid-alapú (II) általános képletű kötőcsoportok, amelyekben
R jelentése egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkiléncsoport, 6-9 szénatomos cikloalkil-alkilén-csoport vagy 7-9 szénatomos fenil-alkilén-csoport, és
R3 jelentése előnyösen CH3CO-NH- vagy hidrogénatom, alkilcsoport, arilcsoport, alkanoil-amino-csoport vagy ariloil-amino-csoport.
Az R1 kötőcsoport jelentésére megadott fenti képletekben az 1-6 szénatomos alkiléncsoport például metilén-, etilén-, propilén- vagy butiléncsoport lehet, a 6-9 szénatomos cikloalkil-alkilén-csoport például ciklohexil-metilén-4-il- vagy ciklohexil-etilén-3-il-csoport, a 7-9 szénatomos fenil-alkilén-csoport például fenil-metilén- vagy fenil-etilén-csoport lehet. Még előnyösebben R jelentése metiléncsoport vagy metilén-4-ciklohexil-csoport.
A találmány szerinti előnyös kötőcsoportok például a (III) vagy (IV) képletű csoportok.
A P és P peptidek analógjai azok, amelyek szekvenciájukban aminosav-módosításokat, azaz szubsztitúciót, deléciót vagy extenziót tartalmaznak egy vagy több aminosav-maradékban. Ezért a fenti analógok közé tartoznak azok is, amelyek a protein részeként tartalmazzák a találmány szerinti szintetikus peptid-származék aminosav-szekvenciáját. Ezenkívül ezen analógok közé tartoznak azok a proteinek is, amelyek a találmány szerinti szintetikus peptid-származék lényegi tulajdonságának megtartá-7 sához elegendő esszenciális aminosav-szekvenciával rendelkeznek. Az ilyen proteinek például legalább a fenti szintetikus peptid-származék aminosav-szekvenciájának alapvető régióját tartalmazzák, előnyösen legalább 85%-ban, vagy legalább 90%-ban.
A találmány szerinti analógok közé tartoznak a mutánsok is, amelyek aminosav-szekvenciájuk módosításai révén jobb tulajdonságokkal rendelkeznek.
A találmány szerinti szintetikus peptid-származékok analógjai közé tartoznak azok a proteinek is, amelyek egyéb proteinekkel vannak fuzionálva. Ezért a találmány fuzionált proteinekre is vonatkozik.
Ezenkívül a fenti analógok közé tartoznak azok a proteinek is, amelyek a BMP csoport vagy a TGF-β csoport aminosav-szekvenciáját tartalmazzák. így például a P1 peptid analógjának egy előnyös példája az 1. ábrán látható, míg a P peptid analógjaira előnyös példákat a 2. ábra mutat.
A fenti peptidek a BMP-2 receptorok kötő-régiójának felelnek meg, és várhatólag olyan aktivitással rendelkeznek, mint a ΒΜΡ-2-ből származó P1 peptid és P2 peptid.
A fenti szintetikus peptidek aminosav-maradékai D-formában, L-formában, vagy - ha nem jelöljük - racemát formában lehet-nek.
A találmány a fenti aminosav-szekvenciával rendelkező új szintetikus peptid-származékokra, analógjaikra, és gyógyászatilag elfogadható sóikra vonatkozik.
A találmány szerinti szintetikus peptid-származékok BMP-2 antagonista-szerű aktivitását tenyésztett MC3T3-E1 sejtekben • · · • · ·
-8vizsgáltuk, amelyek oszteoblasztszerű tulajdonságokkal rendelkező egér koponyatető sejtekből származnak [Kodama H. és munkatársai, Jpn. J. OraL Bioi., 23, 899 (1981)]. A tenyésztett MC3T3-E1 sejteket Takuwa és munkatársai módszere szerint állítottuk elő [Takuwa Y. és munkatársai, Biochem. Biophys. Rés. Comuni., 174, 96-101 (1991)], a szérummentes a-MEM tápközegben szérum albumin jelenlétében tenyésztett sejtekből 5x104 sejt/cm2-t kezeltünk a találmány szerinti szintetikus peptidek különböző koncentrációival és rekombináns humán BMP-2-vel (rh-BMP-2) 2 napon keresztül, és kolorimetriásan p-nitrofenil-foszfáton megvizsgáltuk a sejtekben a lúgos foszfatáz (ALPáz) aktivitást. Az ALPáz-t gyakran alkalmazzák indikátor enzimként az oszteoblasztok és kondrociták differenciálódásának és érésének vizsgálatára [Pfeilschifter J. és munkatársai, Endocrinology 121, 212-218 (1987); Rodan G. A. és munkatársai, Calcium regulating hormones and boné metabolism, Elsevir Science Publishers B.V., 183-196 (1992)].
A találmány szerinti szintetikus peptid-származékok 2xl0’9 - 2xl0'6 mol/1 koncentrációban dózisfüggő módon gátolták az ALPáz aktivitást oszteoblasztszerű tulajdonsággal rendelkező MC3T3-E1 sejtekben, amely aktivitást a humán rekombináns BMP-2 (rh-BMP-2) serkenti.
A találmány szerinti szintetikus peptid-származékok, analógjaik, és gyógyászatilag elfogadható sóik hatékony gyógyszert jelentenek az OPLL és az artériás sclerosis szimptómáinak gátlására, és a BMP-expresszálta csont- és porctumor vagy egyéb csontmetabolizmus betegségek kezelésére. Ezek intravénásán és • · « ···
-9intramuszkulárisan adagolhatok. Az adagolásra megfelel az intravénás injekció és intravénás infúzió is.
Gyógyászati adagolásra a találmány szerinti szintetikus peptid-származékokat gyógyászati készítmények formájában alkalmazzuk, amelyek a fenti peptid-származékot gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagokkal, például adagolásra alkalmas szerves vagy szervetlen, szilárd vagy cseppfolyós segédanyagokkal elegyítve tartalmazzák.
A találmány szerinti vegyületeket például por készítményekké formálhatjuk, amelyek injektálásra alkalmasak. Ebben az esetben a hatóanyaghoz egy vagy több vízben oldódó segédanyagot, például mannitot, cukrot, tejcukrot, maltózt, glükózt és fruk-tózt adhatunk, és vízben oldhatjuk. Az elegyet fiolákba vagy ampullákba helyezzük, majd fagyasztjuk, szárítjuk, és lezárjuk, ily módon injekciós készítményt kapunk.
A napi klinikai adag felnőtt egyedek esetén különböző faktoroktól, például a kezelendő alanyag korától, testtömegétől, állapotától, stb. függ, rendszerint 1-500 mg a fenti peptidszármazékokból.
Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat.
Az 1. ábrán látható a találmány szerinti P1 peptid analógjainak néhány példája, az aminosavak egybetűs szimbólumával. Az egyes peptidek bal oldalán látható az adott aminosav-szekvenciával rendelkező protein neve, és a peptid két oldalán látható számok a proteinben lévő aminosavak pozícióját jelölik. A szimbólum a peptid-láncban a megfelelő aminosav hiányát jelenti, ha a P1 peptid konszenzus szekvenciájával hasonlítjuk össze.
• ·
- 10• ·· · f
Kz 2. ábrán látható a találmány szerinti P peptid analógjainak néhány példája, az aminosavak egybetűs szimbólumával. Az egyes peptidek bal oldalán látható az adott aminosav-szekvenciával rendelkező protein neve, és a peptid két oldalán látható számok a proteinben lévő aminosavak pozícióját jelölik. A szimbólum a peptid-láncban a megfelelő aminosav hiányát jelenti, ha a P peptid konszenzus szekvenciájával hasonlítjuk össze.
A találmányt részleteiben - a korlátozás szándéka nélkül az alábbi példákkal kívánjuk szemléltetni.
1. példa
Peptid-származékok szintézise
A találmány szerinti peptid-származékokat szilárd fázisú módszerrel szintetizáltuk 430 A peptid-szintetizátor (Applied Biosystems Co. Ltd.) alkalmazásával. Az összes reagenst és puffért az Applied Biosystems Co.-tól szereztük be, kivéve a szilárd fázisú gyantaként alkalmazott p-metil-benzhidril-amin-gyantát, amely a Kokusan Chemical Co. terméke.
Kötőként N-(9-fluorenil-metoxi-karbonil)-{[5-(karboxiláto-etil)-2,4-dimetil-oxi-fenil]-4’-metoxi-fenil}-metil-amint alkalmaztunk, a fent említett gyantához kötve (0,52 mmol/g). Az egyes aminosavak (1 mmol/g) α-amino-csoportját Fmoc-csoporttal (9-fluorenil-oxi-karbonil-csoporttal) védtük. Az Fmoc-Trp (Boc)-OH-t a Nova Biochem. Inc.-tői, az SMCC-t [szukcinimidil-4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-l-karboxilátot] a Pias Inc.-tői, és a 4-(metil-merkapto)-fenolt az Aldrich Chemicals Inc.-tői szereztük be.
- 11 • · · · · • · ··« ··· ··· • · · · · • · ··· ·«· · ·
A Lys ε-amino-csoportját Boc-csoporttal (terc-butil-oxi-karbonil-csoporttal), a Ser β-hidroxi-csoportját, a Thr β-hidroxi-csoportját, a Tyr p-benzil-hidroxi-csoportját és az Asp β-karboxil-csoportját terc-butil-csoporttal, az Asn β-amido-csoportját, a Gin γ-amido-csoportját és a Cys β-merkapto-csoportját tritilcsoporttal védtük.
1) (2) szekvenciájú P fragmens szintézise
A peptidet a 17-es helyzetű C-terminális alanintól kiindulva szintetizáltuk peptid szintetizátorban. 110 mg peptid-gyantát 1 ml N-metil-pirrolidonban (NMP) szuszpendálunk, és hozzáadunk 50 mg SMCC-t 0,3 ml NMP-ben oldva, amellyel a peptid N-terminálisára bevisszük a 4-(N-maleimido-metil)-ciklohexán-1-karbonil-csoportot. Az elegyet szobahőmérsékleten 15 órán keresztül keverjük. Ezután 109,9 mg peptid-gyantát 2 ml koktéllal kezelünk, amely 80 mg 4-(metil-merkapto)-fenolt (MMP), 0,2 ml metanolt, 1,8 ml trifluor-ecetsavat (TFA) és 0,1 ml trietil-szilánt tartalmaz, és az elegyet szobahőmérsékleten 2 órán keresztül keverjük. A peptidet (terc-butil)-metil-éterrel kicsapjuk. Ezután 10%-os ecetsavban oldjuk, ODS oszlopon keresztül analitikai HPLC-vel ellenőrizzük eluálódási helyzetét, és szokásos preparatív HPLC-vel tisztítjuk.
Az analitikai HPLC körülményei az alábbiak. HPLC: Hitachi L-6200 rendszer, detektor: Hitachi L-4000, oszlop: Vydac Protein & Peptide CI8 (4,6 mm átmérő x 25 cm hosszúság), mozgó fázis 0 -> 75% acetonitril/0,1 % TFA, 45 perces grádiens, átfolyási sebesség: 1 ml/perc, oszlophőmérséklet: szobahőmérséklet, detektálás hullámhossza: 214 nm.
- 12A preparatív HPLC körülményei az alábbiak. HPLC: Waters 600E rendszer, detektor: Waters 484, oszlop: Vydac Protein & Peptide C18 (20 mm átmérő x 25 cm hosszúság), mozgó fázis 0 -> 75% acetonitril/0,1% TFA, 45 perces grádiens, átfolyási sebesség: 15 ml/perc, oszlophőmérséklet: szobahőmérséklet, detektálás hullámhossza: 230 nm.
2) (1) aminosav-szekvenciájú P1 fragmens szintézise
A peptidet a 17-es helyzetű C-terminális aszparagintól kiindulva szintetizáljuk peptid-szintetizátorban. Miután a ciszteint a peptid N-terminális végéhez kapcsoltuk, a Cys aminocsoportját 20% ecetsavanhidriddel acetilezzük diklór-metánban. Ezután 300 mg peptid-gyantát szobahőmérsékleten 2 órán keresztül kezelünk egy 9 ml TFA-ból, 400 mg MMP-ből, 1 ml metanolból és 0,1 ml trietil-szilánból álló koktéllal, majd (terc-butil)-metil-éterrel kicsapjuk.
A peptidet ezután 10%-os ecetsavban oldjuk, és a P2 fragmensre ismertetett eljárással kezeljük HPLC-vel.
3) Peptid-származék szintézise
2,5 mg (1,25 pmol) P2 fragmenset - amelynek N-terminálisát SMCC-vel védtük - 0,3 ml dimetil-formamidban (DMF), 0,3 ml acetonitrilben, és 0,1 ml 10%-os ecetsavban oldunk. Ezután 5,0 mg (2,40 pmol) P1 fragmenset adunk hozzá 0,9 ml DMF-ben, és az oldathoz 2 pmol EDTA-t adunk. Ezután az oldathoz hozzáadunk 5,0 mg (2,50 mmol) P2 fragmenset 0,5 ml DMF-ben, 0,3 ml acetonitrilt és 0,2 ml 10%-os ecetsavat, és a reakciót analitikai HPLC-vel ellenőrizzük. Ezt követően az oldatot hagyományos preparatív HPLC-vel tisztítottuk. 1,5 mg (0,37 pmol) • · tisztított szintetikus peptid-származékot kapunk végül, a hozam 15%.
A kapott szintetikus peptid-származék szerkezete a (III) képletnek felel meg aminosav-analízise és tömegspektroszkópiás analízise alapján.
4) Aminosav-analízis
A szintetikus peptid-származékot 6 n sósavval hidrolizáljuk (4% tioglikolsav hozzáadásával, 110 °C-on 24 órán keresztül), majd összetételét Hitachi aminosav-analizátorral (Hitachi L8500) vizsgáljuk. Az eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük.
Aminosav Mért értékek Talált szám
Alá 3 (3)
Asx 5,22 (6)
Thr 0,96 (1)
Ser 2,61 P)
Glx 1,02 (1)
Gly 1,90 (2)
Val 4,15 (5)
Ile 2,31 (3)
Leu 1,00 (1)
Tyr 0,89 (1)
Phe 0,90 (0
Trp 1,03 (1)
Lys 1,93 (2)
Pro 2,74 (3)
• · 9 · · ·
- 14• · · · • V·· ·«· ·
5) Tömegspektroszkópiás analízis
A szintetikus peptid-származék móltömegét tömegspektroszkópiás analízissel határoztuk meg (Takara Shuzo Co., Ltd.), a mért érték 4083,24 ±0,3, az elméleti érték 4083,65.
2. példa
BMP-gátló aktivitás vizsgálata
Az 1. példa szerint előállított találmány szerinti szintetikus peptid-származék BMP-2 antagonista-szerű aktivitását tenyésztett MC3T3-E1 sejteken vizsgáltuk, amelyeket Kodama és munkatársai állítottak elő egér koponyatetőből oszteoblasztszerű tulajdonságuk alapján. A tenyésztett MC3T3-E1 sejteket Takuwa és munkatársai módszere szerint állítottuk elő, a szérummentes α-MEM tenyésztőközegben 0,3% marhaszérum albumin jelenlétében tenyésztett sejtekből 5xl04 sejt/cm2-t a találmány szerinti peptid-származék különböző koncentrációival és rekombináns humán ΒΜΡ-2-vel (rh-BMP-2) kezeltük 2 napon keresztül, és p-nitro-fenil-foszfáton kolorimetriásan meghatároztuk az ALPáz aktivitást.
A 2. táblázatból látható, hogy 5 ng/ml rh-BMP-2 az ALPáz aktivitást háromszorosára emelte MC3T3-E1 sejtekben a kontroll csoporthoz képest. A találmány szerinti szintetikus peptid-származék MC3T3-E1 sejtekben az rh-BMP-2 által serkentett ALPáz aktivitást 2xl0’9 - 2xl0'6 mol/1 koncentrációban dózistól függő módon gátolta.
Ί. táblázat
Hozzáadott vegyület ALPáz aktivitás (pmol/perc)
Kontroll 305±36
rh-BMP-2 (5 ng/ml) 892±52
rh-BMP-2 (5 ng/ml) + szintetikus peptid-származék (2x10'10 mol/1) 876±120
rh-BMP-2 (5 ng/ml) + szintetikus peptid-származék (2x10'9 mol/1) 632+71
rh-BMP-2 (5 ng/ml) + szintetikus peptid-származék (2x10’ mol/1) 486±36
rh-BMP-2 (5 ng/ml) + szintetikus peptid-származék (2x10’7 mol/1) 302±54
rh-BMP-2 (5 ng/ml) + szintetikus peptid-származék (2x10'6 mol/1) 269 (n=l)
Átlagérték ± standard eltérés, n = 4.
A találmány szerinti peptid-származékok gyógyszerként alkalmazhatók rendellenes helyzetű csontosodás és arteriális sclerosis tünetei kifejlődésének gátlására. A találmány szerinti peptid-származékokat BMP-expresszálta csont- és porctumor kezelésére, és a szalagok és csontok körüli lágy szövetek elmeszesedésének megelőzésére is alkalmazhatjuk. Ha az abnormális csontátalakulás, például a Paget-féle betegség már kifejlődött, a találmány szerinti peptidek az oszteoblasztok funkciójának degradálásával képesek meggátolni a szimptómák kifejlődését. A találmány szerinti peptidek ezenkívül alkalmazhatók a BMP-ből • · · · V * · ··» ··· ··» • · · · ♦ » · ·« · ····«* ·
- 16kifejlesztett peptidek vagy kis molekulatömegű kémiai gyógyszerek szűrővizsgálatára is, hogy azok milyen mértékben képesek versenyezni a BMP-vel a receptorokhoz való kötődésben.

Claims (5)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1.
    általános képletű peptid-származékok - kéletben P1 (1) p2 jelentése
    Asp-Phe-Ser-Asp-Val-Gly-Trp-Asn-Asp-Trp-Ile-Wal-Ala-Pro-Gly-Tyr aminosav-szekvenciájú peptid vagy annak analógja; jelentése
    Ala-Ile-Val-Gln-Thr-Leu-Val-Asn-Ser-Val-Asn-Ser-Lys-Ile-Pro-Lys-Ala (2) aminosav-szekvenciájú peptid vagy annak analógja; jelentése kötőcsoport, amely a P és P peptidek N-terminális végeihez kapcsolódik vagy gyógyászatilag elfogadható sóik.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti peptid-származékok vagy gyógyászatilag elfogadható sóik, amelyekben az R1 kötőcsoport (I) vagy (II) általános képletű csoportot - a képletben jelentése egymástól függetlenül 1-6 szénatomos alkiléncsoport, 6-9 szénatomos cikloalkil-alkilén-csoport, 7-9 szénatomos fenil-alkilén-csoport, és jelentése CH3CO-NH- vagy hidrogénatom, alkilcsoport, arilcsoport, alkanoil-amino-csoport vagy aroil-amino-csoport 1 2 amelynek tulajdonságai nem zavarják a P és P peptid
    R1 egy
    R2
    R3 jelent, aktivitását.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti peptid-származékok vagy
    1 2 gyógyászatilag elfogadható sóik, amelyekben P és/vagy P aminosav-szekvenciája a gerinces állatok, különösen az ember csontalakfejlődési proteinje aminosav-szekvenciájának alapvető részét tartalmazza.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti peptid-származékok vagy gyógyászatilag elfogadható sóik, amelyekben P1 és/vagy P aminosav-szekvenciája a gerinces állatok, különösen az ember csontalakfejlődési protein-2-je (BMP-2) aminosav-szekcenciájának alapvető részét tartalmazza.
  5. 5. Gyógyászati készítmények csontalakfejlődési proteinek (BMP) antagonizálására, amelyek az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti pepiidet vagy annak egy gyógyászatilag elfogadható sóját és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaznak.
HU9502018A 1994-07-04 1995-07-03 Synthetic peptide derivatives and the salts thereof HUT72068A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP18420394 1994-07-04

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9502018D0 HU9502018D0 (en) 1995-09-28
HUT72068A true HUT72068A (en) 1996-03-28

Family

ID=16149169

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9502018A HUT72068A (en) 1994-07-04 1995-07-03 Synthetic peptide derivatives and the salts thereof

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5908828A (hu)
EP (1) EP0691349A3 (hu)
KR (1) KR960004366A (hu)
AU (1) AU695241B2 (hu)
CA (1) CA2153109A1 (hu)
FI (1) FI953269A (hu)
HU (1) HUT72068A (hu)
NO (1) NO952635L (hu)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19548476A1 (de) * 1995-12-22 1997-06-26 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Zielgerichtete Verbindungen mit knorpel- und/oder knocheninduzierender Aktivität
JP2000119192A (ja) * 1998-10-09 2000-04-25 Aventis Pharma Ltd 骨誘導因子アンタゴニスト活性を有する成熟型蛋白質
DE10026713A1 (de) * 2000-05-30 2001-12-06 Walter Sebald Mutein einer Kette eines Proteins aus der Superfamilie des Wachstumsfaktors TGF-beta
GB2369973B (en) * 2000-12-06 2002-12-04 Open Business Exchange Ltd Communication Router
JP2009539767A (ja) * 2006-06-02 2009-11-19 ワイス 精製および治療方法のためのＴＧＦ−βスーパーファミリータンパク質およびペプチドの使用
US7754689B2 (en) 2006-06-02 2010-07-13 Wyeth Llc Finger-1 peptide analogs of the TGF-β superfamily
CN101827564A (zh) * 2007-09-04 2010-09-08 阿费内基有限公司 用于将生长因子递送至纤维结缔组织的方法和组合物
US9040046B2 (en) 2011-01-31 2015-05-26 Kai Xu Sodium pump antibody agonists and methods of treating heart disease using the same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5284756A (en) * 1988-10-11 1994-02-08 Lynn Grinna Heterodimeric osteogenic factor
WO1993009229A1 (en) * 1991-11-04 1993-05-13 Genetics Institute, Inc. Recombinant bone morphogenetic protein heterodimers, compositions and methods of use
EP0626451A3 (en) * 1993-05-27 1997-11-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Heterodimers of a TGF-beta superfamily

Also Published As

Publication number Publication date
FI953269A0 (fi) 1995-06-30
US5908828A (en) 1999-06-01
EP0691349A3 (en) 1997-09-10
KR960004366A (ko) 1996-02-23
NO952635L (no) 1996-01-05
CA2153109A1 (en) 1996-01-05
NO952635D0 (no) 1995-07-03
FI953269A (fi) 1996-01-05
HU9502018D0 (en) 1995-09-28
AU695241B2 (en) 1998-08-13
AU2337595A (en) 1996-01-18
EP0691349A2 (en) 1996-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4519324B2 (ja) 共有結合で架橋されたインスリンダイマー
EP1124846B1 (en) Nucleotide and protein sequences of nogo genes and methods based thereon
JP3445269B2 (ja) インスリン様成長因子およびアナログの適用による網膜ニューロン障害の治療
JP2010508012A (ja) 生物活性ペプチド及びその使用方法
WO1990014838A1 (en) Treating disorders by application of insulin-like growth factors and analogs
JPH0674279B2 (ja) 成長ホルモン放出性因子類似体及びその製造方法
IL98638A (en) Analogs of the factor that releases human growth hormone, their preparation and pharmaceutical preparations that contain them
KR20120082909A (ko) 합성 마이오스타틴 펩티드 길항제
KR100629013B1 (ko) Ｉｇｆ-ⅰ 및 -ⅱ를 억제하는 ｇｈ-ｒｈ의 길항 유사체
US6020311A (en) GRF analogs with increased biological potency
EP0574530A1 (en) Endothelin antagonists
JPH0273100A (ja) 医薬用化合物
AU695315B2 (en) Analogues of hGH-RH (1-29)NH2 having antagonistic activity
HUT72068A (en) Synthetic peptide derivatives and the salts thereof
US7132397B1 (en) Bone morphogenetic protein antagonist based on the mature protein
KR101108354B1 (ko) Ｐｔｈ 수용체 조절제로서의 페길화된 ｐｔｈ 및 그의 용도
HU205771B (en) Process for producing irreversible peptide ligands for bombesin receptors and process for producing pharmaceutical compositions comprising such peptides as active ingredient
EP0842193B1 (en) Somatostatin-analogous cyclic peptides with inhibitory activity on growth hormone
EP0298732B1 (en) Therapeutic somatostatin analogues
AU759409B2 (en) Preventives and/or remedies for obesity
AU630715B2 (en) Irreversible bombesin antagonists
US20040077531A1 (en) Use of galanin-like peptide
JPH08176191A (ja) 合成ペプチド誘導体または、その塩
IE914408A1 (en) Short peptides with insulin activity
US6949513B2 (en) Polypeptides of covalently linked synthetic bioactive peptide analog(s) for treatment of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal