HUT67739A

HUT67739A - Production of proteins using fb2 protein

Info

Publication number: HUT67739A
Application number: HU9401604A
Authority: HU
Inventors: Gerardus Julianus Mari Martens; Bhabatosh Chaudhuri; Christine Stephan
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1991-11-29
Filing date: 1992-11-27
Publication date: 1995-04-28
Also published as: ATE174629T1; WO1993011248A1; AU675919B2; FI942442A; US5804417A; EP0614490A1; CA2123567A1; EP0614490B1; JPH07501448A; HU9401604D0; US5708140A; AU2946192A; NL9102009A; FI942442A0; DE69227921D1

Description

A találmány a génsebészet területére vonatkozik, speciálisan pedig a 7B2 kísérőként való alkalmazásával foglalkozik in vivő vagy in vitro körülmények között. A találmány ennek megfelelően eljárást mutat be valamely kívánt fehéije előállítására in vivő 7B2-t kifejezni, valamint az említett kívánt fehérjét kifejezni és kiválasztani képes rekombináns sejtek segítségével. A találmány egy más szempontja szerint egy in vitro eljárás a fehéije dezaggregálására vagy aggregálódásának megakadályozására a fehéije 7B2-vel való kezelésével.

Az alábbiakban bemutatjuk a technika állását

A szekréciós fehérjék szállítására sokféle mechanizmus létezik az eukarióta sejtekben. Mindegyik szekréciós sejt képes szekréciós fehéijék kiválasztására fehéijeszintézis útján az endoplazmatikus retikulumban (ER), amelyen keresztül a fehérjék a Golgi készülékbe kerülnek, majd innen az úgynevezett szállító szemcsékbe. A szállító szemcse membránja egyesül a plazma membránnal, majd a szekréciós fehéijék exocitózis útján elhagyhatják a sejtet. Mialatt a szekréciós fehéijék készülnek, rögtön ki is bocsátódnak, tehát a fehéijekibocsátásnak nincs szabályozó mechanizmusa. Ez a fehéije szállítás következésképpen kijelöli a kiválasztódás konstitutív útvonalát is és jelen van minden eukarióta sejtben, ide értve az élesztőt is. A prokarióta sejteknek szintén van egy nem szabályozott, tehát konstitutív fehéijekiválasztási útvonala.

Különböző szekréciós fehéijék kibocsátásáról úgy tudjuk, hogy magasabb fejlettségű eukarióta sejtek egy szűk csoportjában szabályozva vannak. Ezek közé a sejtek közé tartoznak neuronok és endokrin sejtek, tehát a bioaktív fehéijék prekurzorait előállító sejtek. Ezekben a sejtekben a szintézis az ER-ben történik, a szállítás az ER felől a Golgi felé folyik, ahogyan a konstitutív sejtekben is, de utána a Golgitól továbbmegy a szekréciós szemcsék felé. Ezekben a szekréciós szemcsékben a környezet megfelel a prekurzorok speciális poszt-transzlációs módosulatai számára. A fehéije szállítás ezen útját nevezzük szabályozott úrnak. A bioaktív fehéijék exocitózisa csak akkor következik be, ha a sejtet megfelelő külső inger éri. Az ilyen típusú sejtet szabályozott szekréciós sejtnek nevezzük.

Valamely sejt által termelt fehérjék helyes hajtogatását molekuláris kísérő fehéijék biztosítják, amelyek nélkülözhetetlenek a sejt helyes működéséhez, mivel biztosítják, hogy a sejt által termelt fehéijék a kellő módon legyenek hajtogatva. A helyes hajtogatás szükséges ahhoz, hogy a fehéijék a sejten belül a kellő irányba szállítódjanak. így a kísérők nemcsak a helyes fehéije hajtogatáshoz szükségesek, hanem a helyes fehéijeszáUításhoz is. A speciális kísérő fehéijéket például a sejt citoplazmából a sejt organellumokba - mint amilyen a mitokondrium, a kloroplaszt, a sejtmag és az ER - történő szállításnál írták le. E fehéijék közül soknak a termelése olyan sejtekben indukálódik, amelyek hősokknak vannak kitéve, ezért a kísérő fehéijéket gyakran hősokk-fehéijék-nek nevezzük.

A rekombináns bio aktív fehéijék termelése a rekombináns DNS technológia területén elért fejlődés révén vált lehetővé, ezt a gyakorlatban azonban gyakran nem sikerül végrehajtani, mivel az előállítandó heterológ fehéijék gyakori hajtogatása és/vagy szekréciója nem a helyes módon történik vagy nem hatékony. Ilyen probléma általában akkor merül fel, amikor a heterológ fehéijék intenzív kifejeződése olyan sejtben történik, amely nem rendelkezik kellő képességgel a helyes hajtogatáshoz, valamint egy olyan fehéije tetszés szerinti szekréciójához, amely nagy mennyiségben termelődik. A probléma abból adódik, hogy a rekombináns fehérjék olyan nagy mennyiségben termelődnek prokarióta vagy eukarióta sejtekben, hogy a sejtben lévő hajtogató fehéijék tevékenysége nem kielégítő ilyen nagy mennyiségű idegen fehéije hajtogatásához. További problémát jelent, ha rekombináns fehéijét kívánunk előállítani és kiválasztani, de a gazdasejt csak egy nem kielégítő mértékű fehéij eszállító utat tartalmaz. Ezen felül, ha olyan előfehéijéket, mint a neuropeptidek prohormonjai vagy prekurzorai, kívánunk előállítani magasabb fejlettségű eukariótákban úgy, hogy az előfehéijéket a sejten belül kívánjuk bioaktív fehéijévé alakítani, problémák merülnek fel, ha olyan sejteket használunk, amelyek nem tartalmaznak szabályozott szekréciós utat, vagy ilyen utat csak nem kielégítő mértékben tartalmaznak. Az ilyen fehéijék ennek következtében nem mennek át a kellő poszttranszlációs módosulásokon, amelyek ahhoz szükségesek, hogy teljes mértékben biológiailag aktív fehéreként működhessenek. Ez a helyzet különösen olyan rekombináns fehérjék esetében, amelyek a természetben termelődnek és szabályozott fehéije transzporton keresztül bocsátódnak ki.

» ·

További probléma, hogy a fehérjék gyakran hajlamosak aggregálódni oldatban. Az aggregátumok képződése ezután a biológiailag aktív fehérjék aktivitásának csökkenését okozza, illetve megakadályozza a nem hajtogatott vagy rosszul hajtogatott fehérjék helyes hajtogatását in vitro újrahajtogató eljárások során.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmány tárgyát.

A jelen találmány megoldást ad az ilyen problémákra, amennyiben eljárást nyújt a 7B2 alkalmazására kísérőként in vitro vagy in vivő. A 7B2 kísérőként való alkalmazása lehetővé teszi transzformált gazdasejtekben a fehérjék kellő mértékű termelését, amennyiben a 7B2 a kívánt fehérével együtt fejeződik ki úgy, hogy az utóbbi a gazdasejtben in vivő kezelhető, vagy a fehérjét a 7B2-vel együtt kezelhetjük in vitro.

A 7B2 csak a természetben van jelen és olyan szabályozott sejtekben aktív, mint a neuronok és az endokrin sejtek. A korábbbi szakirodalmakban a 7B2-t úgy igák le, mint lehetséges GTPkötő fehérjét, amely sok más kis GTP-kötő fehéréhez hasonlóan a sejten belül két organellum membrán fúziójában, vagy valamely organellum membrán sejtmembránnal való fúziójában lehet érdekelt.

A jelen találmány azon a meglepő tényen alapul, hogy a 7B2-nek kísérő funkciója van, amely in vitro vagy in vivő használható. In vitro a fehérjék, előnyösen monomer fehérjék dezaggregációjára vagy aggregálódásának megelőzésére, in vivő pedig a rekombináns fehérje gazdasejtből való hatékony termelésére, amennyiben a 7B2 és a rekombináns fehérje együtt fejeződik ki a sejtben.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt,

A jelen találmány fehérjeelőállítási eljárásra vonatkozik, amelyet azzal jellemezhetünk, hogy a fehérjét in vivő vagy in vitro 7B2-vel kezeljük. Ennek megfelelően a találmány egy fehérjeelőállítási módszert foglal magában gazdasejt, előnyösen eukarióta gazdasejt segítségével. Ezt a gazdasejtet olyan polipeptidet kódoló genetikai információval transzformáljuk, amely egy bioaktív fehérje vagy annak prekurzora aminosavszekvenciáját ·

tartalmazza. A gazdasejtnek képesnek kell lennie kifejezni ezt a polipeptidet vagy prekurzort. Az eljárást az jellemzi, hogy a sejtet olyan genetikai információval is transzformáljuk, amely lehetővé teszi, hogy a 7B2 az említett polipeptiddel vagy prekurzorral in vivő úgy kezeljük, hogy a polipeptid vagy prekurzor dezaggregálódását vagy megfelelő hajtogatással elősegítsük, vagy hogy a polipeptid vagy prekurzor -kívánt esetben a sejt stimulálásával jobb kibocsátásra nagyobb mennyiségben választódjék ki, mint amikor 7B2 nincs jelen.

A találmány egy előnyös kiviteli módja eljárás, amelyben olyan eukarióta gazdasejtet alkalmazunk, amelyben a fehérjeszekréció egy szabályozott útja található. Még inkább előnyös neuronális vagy endokrin sejt alkalmazása. Szintén előnyös egy olyan eljárás, amelyben a polipeptidet vagy prekurzort in vivő úgy kezeljük, hogy a polipeptid, miután a sejtet kvánt esetben stimuláltuk felszabadításra, kiválasztódjék. Még előnyösebb kiviteli módban a kiválasztott polipeptid bioaktív fehérje.

Egy másik előnyös kivitek módja eljárás, amelyben élesztősejtet alkalmazunk gazdasejtként. Még előnyösebben az élesztősejtet olyan DNS szekvenciával transzformáljuk, amely egy bioaktív fehérje aminosav-szekvenciájával rendelkező polipeptidet képes kifejezni. Egy még előnyösebb kivitek módban ilyen pohpeptidet választunk ki. Egy még előnyösebb kivitek módban a kiválasztott pokpeptid az IGF-1 aminosav-szekvenciával rendelkezik.

A jelen találmány egy eljárását alkalmazhatjuk olyan pokpeptid előállítására, amely egy olyan bioaktív fehérje aminosav szekvenciájával rendelkezik. Ilyenek pl. a peptid hormonok, neuropeptidek, növekedési faktorok és koaguláló faktorok, előnyösen peptid hormonok vagy neuropeptidek.

A 7B2 jelentését a későbbiekben adjuk meg. Egy igen előnyös kivitek módban a 7B2 humán eredetű.

A találmány vonatkozik ezenkívül egy olyan transzformált gazdasejtre, amely alkalmazható a jelen találmányban. E szerint a találmány magában foglal egy transzformált gazdasejtet, előnyösen eukarióta gazdasejtet. Ez a gazdasejt olyan pohpeptidet kódoló genetikai információval van transzformálva, amely egy bio aktív fehérje vagy ennek prekurzora • · · • · aminosavszekvenciáját tartalmazza. A gazdasejtnek képesnek kell lennie kifejezni ezt a polipeptidet vagy prekurzort. Az eljárást az jellemzi, hogy a sejt olyan genetikai információval van transzformálva, amely lehetővé teszi, hogy a 7B2 az említett polipeptiddel vagy prekurzorral együtt fejeződjék ki, és a polipeptidet vagy prekurzort in vivő úgy kezeljük, hogy a polipeptid vagy prekurzor dezaggregálódását vagy megfelelő hajtogatását elősegítsük, és/vagy hogy a polipeptid vagy prekurzor - kívánt esetekben a sejt stimulálásával jobb kibocsátásra - nagyobb mennyiségben választódjék ki, mint amikor 7B2 nincs jelen.

Előnyös gazdasejt egy transzformált eukarióta sejt, amely szabályozott fehérjekiválasztási úttal rendelkezik, előnyösebben neuronális vagy endokrin sejt. Előnyös gazdasejt egy transzformált élesztősejt is.

Egy találmány szerinti transzformált sejtet előnyösen úgy jellemezhetünk, hogy genetikai információval transzformált, amely képessé teszi humán 7B2 kifejezésére.

Egy találmány szerinti transzformált sejt szintén előnyösen jellemezhető azzal, hogy olyan DNS-sel transzformált, amely valamely bioaktív fehéijét kódol. Ezek lehetnek peptid hormonok, neuropeptidek, növekedési faktorok és koaguláló faktorok, előnyösebben peptid hormonok vagy neuropeptidek. A sejtek lehetnek transzformálva olyan DNS-sel, amely egy ilyen bioaktív fehérje prekurzorát kódolja.

Egy találmány szerinti transzformált sejt, különösen egy transzformált élesztősejt legelőnyösebben úgy jellemezhető, hogy IGF-l-t kódoló DNS-sel transzformált.

A találmány előnyösen vonatkozik még fehéije in vitro dezaggregációjára vagy aggregációjának megelőzésére szolgáló eljárásra, amelyet azzal jellemezhetünk, hogy a fehéije vagy aggregátumai 7B2-vel kezeltek.

A találmány vonatkozik 7B2 előállítására szolgáló eljárásra is transzformált sejtben, előnyösen E.coli-ban vagy élesztősejtben.

• 4

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmányt

A jelen találmány fehérje-előállítási eljárásra vonatkozik, amely azzal jellemezhető, hogy a fehégét 7B2-vel kezeljük in vitro vagy in vivő. Ezen belül a találmány vonatkozik (a) rekombináns fehége előállításának javítására szolgáló eljárásra in vivő, valamint (b) fehérje, előnyösen monomer fehége dezaggregációjára, vagy aggregációjának megelőzésére szolgáló eljárásra, 7B2 alkalmazásával in vitro.

A 7B2 jelen van a szabályozott sejtek, mint például neuronok és endokrin sejtek szabályozott kiválasztási folyamatában, ennek következtében feltehetőleg speciális kölcsönhatásban van az ilyen sejtek által termelt bioaktív fehégék , mint például neuropeptidek vagy peptid hormonok prekurzoraival. Jellemző a kiválasztott bioaktív fehégék, mint például a neuropeptidek vagy peptid hormonok előállítására, hogy a sejten belül elkülönülnek a többi (konstitutív) kiválasztott fehégétől és olyan folyamaton mennek keresztül, amely végül a szabályozott szemcsékhez vezet. A 7B2-re szükség van ehhez az elkülönülési folyamathoz és úgy tűnik, hogy a 7B2 kísérő fehége, amely a kísérők azon csoportjához tartozik, amely felelős a kiválasztott fehégék szabályszerű szállításáért az ER-től a Golgi készüléken keresztül a sejt kiválasztó szemcséiig, valamint a 7B2 szükséges a fehége szállítás szabályozott útjának megfelelő működéséhez a szabályozott sejteken, mint például a neuronális és endokrin sejteken belül. A 7B2 fajlagosan köti bioaktív fehégék prekurzorait és elszállítja őket a fehégeszállítás szabályozott folyamatába. Ilyen kísérőt eddig még nem írtak le. Ezen felül a 7B2 az egyetlen kísérő funkcióval rendelkező fehége, amely egyben kiválasztott fehége (ezáltal képes elhagyni a sejtet).

A jelen találmány első szempontja így azon az új és meglepő felfedezésen alapul, hogy az ismert 7B2 fehége a molekuláris kísérő fehérjék közé tartozik és nyilvánvalóan szerepet játszik bizonyos kiválasztott fehégék szállításában az ER-től a Golgi készüléken keresztül a sejt kiválasztó szemcséiig. A helyes útvonal követése különösen nagy jelentőségű a bioaktív fehégék prekurzorai számára, mivel ezeknek meg kell érkezniük a sejten belül a megfelelő mikrokömyezetbe (tehát a szabályozott útvonal kiválasztó szemcséibe), hogy a speciális poszttranszlációs módosulásokon a megfelelő módon menjenek keresztül. A találmány egy következő szempontja, hogy a 7B2 kísérő funkciója nemcsak szabályozott kiválasztó • · · · • · • · · • · • 4 · «

• ·· • ♦ ···· ·♦ ··· folyamattal rendelkező sejten belüli fehérjék javított termelésében alkalmazható. A 7B2 szubsztrátjaiként szolgáló fehéqék könnyebben állíthatók elő szabályozott kiválasztó folyamattal nem rendelkező prokarióta vagy eukarióta sejtekben is, mivel a 7B2 segíti az említett fehéqék dezaggregációját vagy hajtogatását. Ezáltal a 7B2-vel együtt kifejeződés elősegíti a sejten belüli fehéqék, valamint konstitutív és szabályozott folyamatokban kiválasztott fehéqék termelését. A találmány egy további szempontjában a 7B2 kísérő funkciója alkalmazható in vitro a helyes hajtogatás, valamint előnyösen a fehérjék dezaggregációja, vagy az aggregáció megelőzése elősegítésére.

In vivő alkalmazásban a 7B2-t kódoló DNS a gazdasejtben a kívánt fehérjét kódoló génnel együtt fejeződik ki. Alkalmas gazdasejt például egy prokarióta sejt, mint az E.coli vagy egy eukarióta sejt, előnyösen élesztősejt vagy előnyösen egy szabályozott fehérje kiválasztási folyamattal rendelkező sejt, például neuronális vagy endokrin sejt. A kívánt fehérje 7B2-vel együtt való kifejeződése különösen előnyös, mivel a 7B2 segít megelőzni vagy csökkenteni a hajtogatási problémákat a túltermelő sejtekben; másszóval azokban az esetekben, amikor sejt önmaga nem rendelkezik elegendő kapacitással a (túl)termelt fehérje megfelelő módon való hajtogatásához, például prokarióta sejtben, mint az E.coli, vagy előnyösen élesztősejtben, vagy még előnyösebben olyan sejtben, amelyben a sejt szabályozott útvonallal rendelkezik a szabályozott szemcsékhez való helyes szállításhoz.

Azokat a fehérjéket, amelyek alkalmasak arra, hogy a 7B2 működés alanyaivá váljanak in vivő vagy in vitro, a következőkben írjuk le.

A találmány 7B2 funkciójához kötötten olyan fehéqék találhatók, amelyek a 7B2-töl természetes úton is függenek a megfelelő szállítás érdekében; ilyenek pl. a bioaktív fehérjék, mint például a peptid hormonok és neuropeptidek prekurzorai. Olyan fehérjékről van szó, amelyek szállítódnak, majd elhagyják a sejtet a fehérjeszállítás szabályozott útvonalán keresztül, amely idegsejtekben és endokrin sejtekben van jelen. A 7B2 in vivő vagy in vitro működéséhez alifás alfa-hélixszel rendelkező fehéqék is alkalmas szubsztrátok, például azok, amelyek aminosav száma 10 és 15 között van. Azokban az esetekben, amikor a szerkezet a prekurzor feldolgozása során nem törik szét és ezáltal jelen van a végtermékben, tehát a a ·

bioaktív fehéqében is, a fehérje a 7B2 alkalmas szubsztrátja. A 7B2 in vivő vagy in vitro működéséhez alkalmas szubsztrátok azok a fehéqék is, amelyek oldatban hajlamosak az aggregálódásra.

Lehetséges, hogy a bioaktív fehéqék prekurzorai, mint például a neuropeptidek vagy peptid hormonok speciális doménnel rendelkeznek szerkezetükön belül, amelyet a 7B2 felismer és amelyek részt vesznek a kölcsönhatásban. A prohormonok [tehát olyan nagy fehéqék, amelyek biológiai úton aktív fehéqékké hasíthatok a sejt kiválasztó szemcséin belül, ilyen például a proopiomelanokortin (POMC), amely különböző bioaktív fehéqékké hasítható, például mint az adrenokortikotróp hormon (ACTH), az opiát-szerű B-endorfin peptid és a melanofórastimuláló hormon (MSH)J, szerkezetén belül konszenzus szekvenciát találunk amely jelzőként alkalmazható a kiválasztó fehéqék kiválasztásában a szabályozott kibocsátási útvonalhoz, valamint 7B2-vel való kölcsönhatáshoz (Egy motívumot találtunk proproteinekben és prohormonokban, amely a kiválasztó vezikulumok felé irányítja őket, Biochem. Biophys, Rés. Commun. 174, 586-592, 1991).

A prekurzorok a jelen találmány szövegösszefüggésében olyan proproteineket jelentenek, amelyek biológiailag aktív fehéqékké hasadnak szét; ilyen például a POMC prohormon.

Az új felfedezés, miszerint a 7B2 kísérőként működik, jól alkalmazható, amikor a fehéqék hajtogatása és/vagy kiválasztása nem megfelelő, vagy nem elég hatékonyan vesz részt heterológ fehéqék termelésében rekombináns gazdasejtben. A 7B2 együtt kifejeződése a 7B2 szubsztrát fehéqék in vivő hajtogatási problémái számának csökkenését eredményezi mind prokarióta, mind eukarióta sejtekben. A 7B2 in vivő alkalmazása eukarióta sejtekben előnyös. Különösen előnyös egy 7B2 gén és egy bioaktív fehéqe vagy prekurzorát kódoló gén együttes kifejeződése valamely élesztősejtben, vagy egy egy 7B2 gén és egy bioaktív fehéqe prekurzorát kódoló gén együttes kifejezése valamely, szabályozott fehéqeszállítással rendelkező eukarióta sejtben.

Amennyiben egy fejlettebb eukarióta sejtben történő kifejeződésről van szó, a kívánt végtermékeket, például a bioaktív fehéqéket előnyösen a természetes prekurzor sejten belüli • · előállításával és feldolgozásával állítjuk elő. Ezáltal a találmány egy előnyös kivitek módjában prekurzort állítunk elő és dolgozunk fel megfelelő módon egy rekombináns fejlettebb eukarióta sejtben, ahol a 7B2-nek a bioaktív fehéije prekurzorával együtt való kifejeződése biztosítja, hogy a fehéije a szabályozott kiválasztási útvonalat követi. Egy másik előnyös kivitek módban élesztősejtet használunk, és a bioaktív fehéije előákítására szolgáló eljárások közé tartozik vagy olyan prekurzorok előákítása, amelyek in vitro feldolgozhatok vagy egy fehéije közvetlen termelése, amely a kívánt bioaktív fehéije aminosav szekvenciájával rendelkezik, ez pedig kívánt esetben in vitro újra hajtogatható a bioaktív forma előákítása érdekében.

A következőkben olyan géneket mutatunk be példaként, amelyek termékei a 7B2 szubsztrátjaiként alkalmazhatók a jelen találmányban:

A neuropeptid géncsaládok tagjainak termékei, például az opioid család, különösen az enkefalin gén termékei, a dinorfin gén vagy a pro-opiomelanokortin gén, a hátsó hipofízis termékcsalád, különösen vazopresszin gén vagy az oxitocin gén termékei, a cck/gasztrin család, különösen a gasztrin gén vagy a kolecisztokinin gén termékei, a szomatosztatin család, különösen szomatosztatin gén, a neuropeptid Y gén, a peptid YY gén vagy a pankreász polipeptid gén termékei, a kalcitonin gén család, különösen kalcitonin I gén, a kalcitonin II gén vagy a szigetecske amiloid polipeptid gén termékei, a nátriumürítő faktor géncsalád, különösen a szívpitvari nátriumürítő faktor gén, az agyi nátriumürítő faktor gén vagy C-típusú nátriumürítő faktor gén termékei, a bombezin géncsalád, különösen a gasztrin kibocsátó gén vagy a neuromedin B gén termékei, az endotelin géncsalád, különösen az endotelin 1,2 vagy 3 gén termékei, a szekretin géncsalád, különösen a szekretin gén, a glukagon gén, a vazoaktív intesztinális peptid gén termékei, a gasztrikus inhibitor peptid gén, a növekedési hormon kibocsátó gén vagy a hipofízis adenilát cikláz aktiváló peptid gén termékei, a kinin géncsalád, különösen a tahikinin A vagy B gén, a K-kininogén gén, a neurotenzin gén vagy az angiotenzinogén gén termékei. Más gének termékei, amelyek a jelen találmány szerint állíthatók elő, az inzulin-szerű géncsalád tagjai, különösen az IGF-1 gén, az IGF-2 gén, a relaxin gén vagy az inzulin gén, vagy különböző más gének, különösen a motilin gén, a galanin gén, a kortikotropin kibocsátó gén, a triotropin kibocsátó faktor gén, a gonadotropin kibocsátó ·«· ···· 99 • · « ··• >

♦ * ·· >· · · · «· _t faktor gén vagy a melaninkoncentráló hormon gén tagjai. Előnyös termékek az inzulin-szerű géncsalád tagjai, előnyösen az IGF-1 vagy az IGF-2, még előnyösebben az IGF-1. Szintén előnyösek a prolaktin gén és a POMC gén termékei, még előnyösebben a prolaktin illetve az ACTH. Jelen találmány alkalmazható növekedési faktorok (például TGF, NGF és hasonlók),koagulációs faktorok és más vérfehérjék (például VHI faktor, tPA, van Willebrands faktor és hasonlók) termelésére is.

Magasabbrendű eukarióta sejtek a jelen találmánnyal kapcsolatban állati vagy növényi sejtek, előnyösen állati sejtek, még előnyösebben szabályozott fehérje szállítási útvonallal rendelkező sejtek, még előnyösebben endokrin vagy neuronális sejtek lehetnek, beleértve az endokrin vagy neuronális tumor sejtekből származó sejtvonalakat is.

A 7B2 megnevezés jelen találmánnyal kapcsolatban legelőnyösebben humán 7B2-t jelent, ahogyan azt az EP-A 0 315 254 számú európai szabadalmi közrebocsátási irat leírja. A 7B2 megnevezés ugyanakkor nem korlátozódik a humán molekulára, hanem magában foglalja más szervezetek megfelelő fehérjéit is. A humán 7B2 mellett az egér, a szarvasmarha, a pisztráng és Xenopus laevis béka 7B2 fehérje struktúráit írták le, és ezek használhatók a jelen találmányban. Más megfelelő 7B2 fehérjék azonosíthatók az aminosav szekvencia és az ismert 7B2 fehérjék szekvenciájának összehasonlításával, mivel különösen a 7B2 NH2 terminális része erősen konzervált és mivel minden 7B2 fehérje tartalmaz további konvertált szekvenciákat, amelyek hasonlóságot mutatnak minden fajban. A 7B2 kifejezés magában foglalja a természetben előforduló 7B2 fehérjék azon származékait, amelyek 7B2 aktivitással bírnak. Ilyen származékok lehetnek fúziós fehérjék, konjugátumok és különösen fragmentumok, például azok amelyek megfelelnek a humán 7B2 első 137, 149 vagy 170 aminosavjának, előnyösebben az említett humán fragmentumok.

Meglepő, hogy a 7B2 nemcsak olyan sejtekben működik, amelyek szabályozott fehérje előállítási és kiválasztási útvonallal rendelkeznek, hanem prokarióta sejtekből és más eukarióta sejtekből, mint például szabályozott kiválasztási folyamattal nem rendelkező, vagy gomba sejtekből, különösen élesztősejtekből származó heterológ fehérje elkészítésében is működik. Prekurzort kódoló gének, vagy akár fehérje szekvenciákat kódoló gének termékei, ahogyan a természetben egy bioaktív fehérje prekurzorának feldolgozása során megjelennek, tehát a prekurzorok köztes vagy végtermékei a természetben előforduló kiválasztó folyamatokban, nagyobb mennyiségben termelhetők ilyen sejtekben, amennyiben a 7B2-vel együtt fejeződnek ki. A helyes hajtogatásra gyakorolt előnyös hatás hasznos az intracellulárisan tárolt fehérjék termelésénél, különösen ha prokarióta sejtet, például E, coli-t használunk. Még nagyobb előnnyel jár a 7B2 alkalmazása a kiválasztott fehérjék, tehát azon fehérjék, amelyek a sejtben preproteinként termelődnek és jelző szekvenciájuk van, termelésében. A jelen találmánnyal kapcsolatban látható, hogy minden fehérje, amelyet majdan kiválaszt a sejt, funkcionális kapcsolatban termelődik egy jelző szekvenciával, amely lehasad a sejten belül. A prekurzor kifejezés ugyanakkor a jelen találmány vonatkozásában nem azt jelenti jelző szekvenciával rendelkező fehérje (például preprotein), hanem pro-proteint jelent, amely biológiailag aktív fehérjévé dolgozódik fel, ilyen pl. a prohormon POMC. Az mRNS transzlációja után ezek a pro-proteinek kapcsolódhatnak egy jelző szekvenciához is, amennyiben a pro-protein természetes feldolgozási termékét vagy a proproteint magát kívánjuk kiválasztani. Amennyiben egy kiválasztott terméket kívánunk előállítani, a 7B2-nek is kell egy jelző szekvencia, hogy ugyanazon az útvonalon lehessen szállítani, mint a szubsztrát fehérjét.

A jelen találmány ennek megfelelően egy fehérje előállítására vonatkozik, azzal jellemezhetően, hogy a fehérjét in vivő vagy in vitro 7B2-vel kezeljük. így a jelen találmány eljárást tartalmaz fehérje előállítására gazdasejt, előnyösen eukarióta gazdasejt segítségével. Ezt a gazdasejtet olyan polipeptidet kódoló genetikai információval transzformáljuk, amely egy bioaktív fehérje vagy annak prekurzora aminosavszekvenciáját tartalmazza. A gazdasejtnek képesnek kell lennie kifejezni ezt a polipeptidet vagy prekurzort. Az eljárást az jellemzi, hogy a sejtet olyan genetikai információval is transzformáljuk, amely lehetővé teszi, hogy a 7B2 az említett polipeptiddel vagy prekurzorral in vivő úgy kezeljük, hogy a polipeptid vagy prekurzor dezaggregálódását vagy megfelelő hajtogatással elősegítsük, vagy hogy a polipeptid vagy prekurzor -kívánt esetben a sejt stimulálásával jobb kibocsátásra - nagyobb mennyiségben választódjék ki, mint amikor 7B2 nincs jelen.

A találmány ennek megfelelően eljárást nyújt bioaktív fehérje előállítására rekombináns eukarióta sejt, előnyösen magasabbrendű eukarióta sejt segítségével, még előnyösebben olyan sejt segítségével, amely szabályozott fehéijekiválasztási útvonallal rendelkezik. Ezek olyan genetikai információval vannak ellátva, amely kívánt bioaktív fehérje, vagy előnyösen egy bioaktív fehérje prekurzor aminosav szekvenciájával rendelkező fehérjét kódol, ezenkívül olyan genetikai információval is el van látva, amely 7B2-t kódol. A sejt képes az említett fehérjét vagy prekurzort a 7B2-vel együtt kifejezni és az említett fehérjét vagy prekurzort olyan módon kezelni, hogy a kívánt bioaktív fehérje - kívánt esetben a sejt kibocsátásra való stimulációja után - kiválasztódjon.

A találmány egy rekombináns eukarióta sejtet, előnyösen magasabbrendű eukarióta sejtet is nyújt, még előnyösebben olyan sejtet, amely szabályozott fehérjekiválasztási útvonallal rendelkezik. Ez olyan genetikai információvan ellátva, amely a kívánt bioaktív fehérje, vagy előnyösen a bioaktív fehérje prekurzorának aminosav szekvenciájával rendelkező fehérjét kódol. Ezenkívül olyan genetikai információval is el van látva, amely 7B2-t kódol, és képes az említett fehérjét vagy prekurzort a 7B2-vel együtt kifejezni, és az említett fehérjét vagy prekurzort olyan módon kezeli, hogy a kívánt bioaktív fehérje - kívánt esetben a sejt kibocsátásra való stimulációja után - kiválasztódjon.

Kívánatos lehet, hogy a bioaktív fehérje sejt általi kiválasztását stimuláljuk. Az, hogy milyen anyagokat használunk a stimulációhoz, bizonyos mértékig az előállításhoz használt sejt típusától függ. Meglehetősen általánosan használható anyag a szekréció stimulálására, különösen a szabályozott típusú eukarióta sejtek esetében, a cAMP, vagy annak származéka, mint például a 8-Br-cAMP.

A taláhnány eljárást szolgáltat még olyan fehérje előállítására, amely egy bioaktív fehéije prekurzorának aminosav szekvenciájával, vagy előnyösen maga a bioaktív fehérje aminosav szekvenciájával rendelkezik, prokarióta vagy eukarióta sejtben, előnyösen élesztősejtben, amelyet olyan genetikai információval van ellátva, hogy egy bioaktív fehéije kívánt prekurzora, vagy előnyösen maga a bioaktív fehérje aminosav szekvenciájával rendelkező fehérjét kódol. Ezenkívül a sejt olyan genetikai információval is el van látva, amely 7B2-t kódol, és a sejt képes az említett fehérjét vagy prekurzort és a 7B2-t együtt kifejezni. A bioaktív fehéije vagy prekurzorának aminosav szekvenciájával rendelkező fehéije a sejten belül úgy kezelődik, hogy elősegítse a dezaggregációt vagy helyes hajtogatást, vagy előnyösen és még előnyösebben az élesztősejtekkel kapcsolatban úgy, hogy kiválasztódjék és visszanyerhető legyen a felülúszóból.

A találmány nyújt még egy rekombináns prokarióta vagy eukarióta sejtet, előnyösen élesztősejtet, amely olyan genetikai információval van ellátva, amely egy bioaktív fehéije kívánt prekurzora, vagy előnyösen maga a bioaktív fehéije aminosav szekvenciájával rendelkező fehérjét kódol. El van látva olyan genetikai információval is, amely a 7B2-t kódolja. A sejt képes az említett fehérjét vagy prekurzort és a 7B2-t együtt kifejezni. A bioaktív fehéije vagy prekurzorának aminosav szekvenciájával rendelkező fehéije a sejten belül úgy kezelődik, hogy a dezaggregáció vagy helyes hajtogatás elő legyen segítve, vagy előnyösen és még előnyösebben az élesztősejtekkel kapcsolatban úgy, hogy kiválasztódjék és visszanyerhető legyen a felülúszóból.

A találmány szerinti eljárás, amely tartalmazza a 7B2 és a heterológ fehéije együtt kifejeződését genetikailag manipulált, szabályozott típusú eukarióta gazdasejtben önmagában ismert eljárás keretében végezhető el, például a rubisco nevű növényi kísérőre leírt eljárás szerint. Hasonlóan a találmány szerinti eljárás, amely tartalmazza egy 7B2 gén és egy bioaktív fehéijét vagy prekurzorát kódoló gén együtt kifejeződését genetikailag manipulált élesztősejtben, önmagában ismert eljárás keretében végezhető el. Mindkét esetben a sejt tartalmaz egy kifejező kazettát a 7B2 kifejezésére és egy kifejező kazettát egy fehéije részére, amelyet az előzőekben írtunk le, és amelyet elő kívánunk állítani. A kifejező kazetta kifejezés egy DNS szekvenciát jelent, amely képes egy polipeptidet kifejezni és tartalmaz egy promotert, ha szükséges, egy jelző szekvenciát, továbbá egy strukturgént, ha szükséges, egy transzkripciós terminátort és kívánt esetben egy transzkripciós erősítőt, riboszóma kötő helyet és/vagy további szabályozó szekvenciákat.

A 7B2 vagy a kívánt fehérje vagy annak prekurzora kifejezésére alkalmas vektorok megalkotásához alkamas eszközök a szakterületen ismert és rendelkezésre álló vektorok és szabályozó szekvenciák. A kifejező vektorok a megszokott technikákkal állíthatók elő. Az • · · · alkalmas vektorokat és szabályozó szekvenciákat a következőkben példákban mutatjuk be a 7B2 termelésére szolgáló 7B2 gén kifejezésénél. Ugyanezen vektorok és szabályozó szekvenciák hasonló módon alkalmazhatók a 7B2 és a kívánt rekombináns fehérje együtt kifejezésére is.

A találmány vonatkozik a 7B2 termelésére önmagában fehérjék in vitro kezelésében való alkalmazásra a fehége dezaggregációjának vagy aggregációja megelőzésének érdekében. A 7B2-t olyan eljárással állítjuk elő, amely egy gazdasejt, előnyösen egy E.coli sejt vagy egy élesztősejt transzformálását foglalja magában olyan hibrid vektorral, amely tartalmaz egy 7B2 előállítására szolgáló kifejező kazettát.

A promoter szekvenciák széles skálája alkalmazható, a gazdasejt természetétől függően. A promoterrre példák a λ Pl, λ Pr, E.coli lac, trp, tac, élesztő TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03-, PH05-, vagy glikolitikus promoterek, mint például az enoláz, gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz, 3-foszfoglicerát kináz (PGK), hexokináz, piruvát dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glukóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglukóz izomeráz és glukokináz gének promotere, vagy eukarióta vírusokból nyert promoterek, pl. SV40, Rous sarcoma vírus, adenovírus 2, szarvasmarha papilloma vírus, papovavírus, citomegalovírusból nyert promoterek vagy emlőssejtből nyert promoterek, mint pl. az aktin, kollagén , miozin vagy β-globin gén promoterei. Az eukarióta promoterek kombinálhatok erősítő szekvenciákkal, mint például az élesztő upstream aktiváló szekvenciák (UAS), vagy vírus vagy sejt erősítőkkel, mint amilyen a cytomegalovírus IE erősítők, S V40 erősítők, immunoglobulin gén erősítők vagy mások.

Az erősítők transzkripció-stimuláló DNS szekvenciák, pl. olyanok, amelyek vírusból származnak, mint amilyen a Simian vírus, a polióma vírus, a szarvasmarha papilloma vírus vagy a Moloney szarkóma vírus, vagy pedig genom eredetűek. Egy erősítő szekvencia származhat a Physarum polycephalum extrakromoszómális riboszóma DNS-éből (PCT/EP 8500278) vagy lehet az upstream aktiváló oldal a PH05 savas foszfatáz génnek (EP Appl. No. 86 111 820.6), vagy a PH05, trp, PH05-GAPDH hibridből (EP Appl. No. 86 111 820.6), vagy a hasonló promotorból.

• « · · • ·

A jelző szekvenciák lehet például egy, a polipeptid szekréciót vezérlő preszekvencia vagy kiválasztó vezető vagy ehhez hasonló. Az élesztősejtben végbemenő kiválasztáshoz alkalmas jelző szekvencia lehet például az SUC2 jelző szekvencia vagy az élesztő alfa-faktor jelző szekvenciája. További jelző szekvenciák ismertek a szakirodalombók pl. azok, amelyeket von Heijne, G. írt le a Nucleic Acid Rés.-ben, 14, 4683 (1986).

A találmány egy előnyös kiviteli módjában a 7B2 gén funkcionálisan kötött az élesztőben funkcionális jelző szekvenciához, például a az SUC2 jelző szekvenciához, vagy a homológ 7B2 szekvenciához. Szintén előnyös egy konstitutív élesztő promoter alkalmazása. A 7B2 kifejező kazetta egy élesztő vektorhoz kötött, az élesztősejteta vektor transzformálja. A 7B2 a felülúszóba választódik ki és a hagyományos eljárásokkal vonható ki, ha szükséges.

A találmány egy másik előnyös kiviteli módjában egy 7B2 gén, vagy még előnyösebben egy heterológ fehérjéhez, előnyösen E.coli fehérjéhez, még előnyösebben a 7B2 izolációját pl. úgy elősegítő fehéréhez, hogy affinitás kromatográfiában használatos ligandhoz fejez ki affinitást, kapcsolt 7B2 kódoló szekvenciát tartalmazó fúziós gén fejeződik ki egy prokarióta sejtben, előnyösen E.coli-ban. valamely promoter ellenőrzése alatt, amely funkcionális az említett sejtben, és a 7B2-t a sejtből kinyeljük. Előnyös, ha a fúziós fehérjét elhasítjuk egy enzimmel úgy, hogy a 7B2 kiszabaduljon a fúziós fehérjéből.

A találmány vonatkozik még egy hibrid vektorra a 7B2 kifejezéséhez élesztő vagy prokarióta sejtben; az említett hibrid vektor tartalmaz egy kifejező kazettát a 7B2 gén kifejezésére.

A jelen találmányban használható hibrid vektorok bármely, a génsebészet területén alkalmazott vektorból nyerhetők, úgy mint vírusokból, fágokból, kozmidokból, plazmidokból vagy kromoszomális DNS-ből, mint amilyen például az SV40, Herpes-vírusok, Papilloma vírusok, Retrovírusok, Baculovírusok, lambda fágok, mint pl. NM 989 vagy EMBL4, vagy M13 fágok, mint például BamHI emésztéssel linearizált M13mp8 fág DNS, bakteriális plazmidok, pl. pBR322, pUC18, vagy élesztő plazmidok, mint például 2μ plazmid, vagy segítő vírus, fág vagy plazmid jelenlétében lévő defektív vírus, fág vagy plazmid, amely segíti a vírus, fág vagy plazmid replikációját, pl. M13(+)KS vektor M14K07 segítő fág jelenlétében, származékai.

«

A találmány hibrid vektorai biztosítják a kívánt DNS replikációját és kívánt esetben kifejeződését alkalmas gazdasejtben, vagy úgy mint extrakromoszomális elem, vagy a gazdakromoszómába való integráció útján. Sokféle lehetséges vektorrendszer áll rendelkezésre a találmány szerinti klónozott DNS integrációjára és kifejezésére. Elvben minden vektor, amely replikái, vagy replikái és kifejez egy kívánt polipeptid gént és egy találmány szerinti kifejező kazettában található a kiválasztott gazdasejtben, alkalmas. A vektort a transzformációra kiszemelt gazdasejt függvényében választjuk ki. Elvben a találmány szerinti hibrid vektorok tartalmazzák a kívánt kifejező kazettát, amint azt korábban említettük, egy replikációs origót vagy egy önmagától replikálódó szekvenciát, domináns marker szekvenciákat, kívánt esetben kifejezést ellenőrző kontroll szekvenciákat, amelyek nélkülözhetetlenek a kívánt DNS transzkripciójához és transzlációjához, és kívánt esetben a kívánt termék kiválasztásához és kívánt esetben további restrikciós helyeket.

A replikációs origót vagy egy önmagától replikálódó szekvenciát (DNS darab, amely átviszi az önmagától való replikálódás képességét extrakromoszomális részekbe) vagy a vektor olyan megszerkesztése biztosítja, hogy exogén origót tartalmazzon, amely például Simian vírusból (SV 40), vagy más vírusforrásból származik, vagy a gazdasejt kromoszómális mechanizmusa.

Egy találmány szerinti hibrid vektor tartalmazhat szelektív markereket a transzformálandó, szelektálandó vagy klónozandó gazdaszervezettől függően. Bármely marker gén használható, amely lehetővé teszi a transzformánsok szelektálását a marker fenotípusos kifejeződésének megfelelően. Megfelelő markerek különösen azok, amelyek antibiotikus rezisztenciát fejeznek ki, pl. tetraciklinnel vagy ampicillinnel szemben, vagy auxotróf gomba mutánsok esetében olyan gének, amelyek a gazda hiányosságainak pótlására szolgálnak. A megfelelő gének például rezisztenciát adnak át ciklohemixid antibiotikumokba, vagy prototrófíát biztosítanak egy auxotrofíkus élesztő mutánsban, ilyenek például az ura3, leu2, his3 vagy trpl gének. Szintén lehetséges markerekként alkalmazni struktúrális géneket, amelyek önmagától replikálódó szegmensekhez kapcsolódnak, feltéve, hogy a transzformálandó gazda auxotróf a marker által kifejezett termékre nézve.

• · • 4

A találmány vonatkozik továbbá egy transzformált gazdasejtre a találmány szerinti rekombináns DNS molekulák erősítésére, vagy különösen egy kifejező kazetta kifejezésére, amelyet valamely találmány szerinti DNS molekula tartalmaz, vagy 7B2 és a kívánt fehéije együtt kifejezése céljából, vagy a 7B2 önmagában való termelésére.

Az alkalmas, különösen a találmány szerinti rekombináns DNS molekulák erősítésére vonatkozóan alkalmas gazdaszervezetekre példák az olyan mikroorganizmusok, amelyeknek nincs restrikciós enzimjük, vagy modifikációs enzimjük, vagy csak kevés van belőlük, mint amilyenek például bizonyos baktériumok, különösen az Escherichia coli különböző törzsei, például az E.coli X1776, E.coli Y1090, E.coli W3110, E.coli HB101/LM1035, E.coli JA221, E.coli DH5alfa, vagy előnyösen E.coli DH5alfaF', JM109, MH1 vagy HB101, vagy az E.coli K12 törzs, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus. Pseudomonas. Haemophylus, Streptococcus és mások, valamint élesztők, például Saccharomyces cerevisiae, mint amilyen a S.cerevisiae GRF 18. További alkalmas gazdasejtek fejlettebb szervezetek sejtjei, különösen folytonossá lett humán vagy állati sejtvonalak, pl. L132 humán embrionális tüdő fibroblasztok, Bowes humán rosszindulatú melanóma sejtek, HeLa sejtek, COS-7 afrikai zöld majom SV40 vírussal transzformált vesesejtjei, vagy kínai hörcsög petesejtjei (CHO). Különös jelentőséggel bírnak a 7B2 és a bioaktív fehéije prekurzorának együtt kifejezésével előállított bioaktív fehéije előállítása szempontjából azok a sejtvonalak, amelyek neuronális vagy endokrin tumor sejtekből származnak.

A találmány vonatkozik az ilyen transzformánsok előállítására szolgáló eljárásra is, amely áll egy alkalmas gazdasejt transzformáló körülmények közötti kezeléséből a jelen találmány szerinti rekombináns DNS molekulával, különösen valamely találmány szerinti hibrid vektorral, kívánt esetben egy szelekciós marker génnel együtt, valamint tetszés szerint szelektálva a transzformánsokat.

A mikroorganizmusok transzformációját a szakirodalomban leírtaknak megfelelően hagyományos eljárásokkal végezzük, pl. S.cerevisiae-nél (A.Hinnen és társai., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 75, 1929, 1978), B.subtilis-nél (Anagnostopoulos és társai,

J.Bacteriol.81, 741, 1961), és E.coh-nál (M.Mandel és társai, J.Mol.Biol. 53, 159, 1970).

* · · « * «

Ennek megfelelően az E.coli sejtek transzformációs eljárása tartalmazza például a sejtek Ca^⁺előkezelését, hogy ezáltal lehetővé tegyük a DNS felvételt, valamint a hibrid vektorral való inkubációt. A transzformált sejt ezt követő szelekciója megvalósítható például a a sejt átvitelével egy szelektív növesztő tápközegbe, amely lehetővé teszi a transzformált sejtek elválasztását a szülő sejtektől, a vektor DNS marker szekvenciája természetétől függően· Előnyösen olyan növesztő tápközeget használunk, amely nem engedi növekedni azon sejteket, amelyek nem tartalmazzák a vektort. Az élesztő transzformációja áll például a sejtfal glukozidázokkal való enzimatikus eltávolításából, a kapott szferoplasztok vektorral való kezeléséből polietilén glikol és Ca^⁺ ionok jelenlétében, majd a sejtfal regenerációjából a szferoplasztok agarba való ágyazása által. A regeneráló agart előnyösen úgy készítjük, hogy lehetővé tegye a transzformált sejtek regenerációját és szelekcióját a fent leírtaknak megfelelően, egy időben.

A magasabbrendú eukarióta eredetű sejtek, mint például emlős sejtvonalak transzformációja előnyösen transzfekcióval történik. A transzfekciót hagyományos módszerekkel végezzük, mint például kalcium foszfátos kicsapatás, mikroinjektálás, protoplaszt fúzió, elektroporáció, tehát a DNS bevezetése rövid elektromos impulzus segítségével, amely átmenetileg megnöveli a sejtmembrán permeabilitását, vagy segítő vegyületek, például dietil-amino-etil-dextrán, dimetil szulfoxid, glicerin vagy polietilén glikol és hasonlók jelenlétében. A transzfekciós eljárás után a transzfektált sejtet azonosítjuk és szelektáljuk, például a szelekciós marker természetének megfelelően választott szelektív közegben való tenyésztéssel, amilyenek például a standard tenyészközegek, mint a Dulbecco-féle módosított Eagle közeg (DMEM), a minimális esszenciális tápközeg, az RPMI 1640 tápközeg és hasonlók, amelyek tartalmazzák pl. a megfelelő antibiotikumot.

A transzformált gazdasejteket a szakterületen ismert eljárásokkal tenyésztjük folyékony tápközegben, amely asszimilálható szénforrásokat tartalmaz, mint például szénhidrátokat, mint a glükóz vagy laktóz, nitrogént, például aminosavakat, peptideket, fehéreket, vagy ezek lebontási termékeit, mint például peptonokat, ammóniumsókat vagy hasonlókat, és szervetlen sókat, például nátrium, kálium, magnézium és kalcium szulfátjait, foszfátjait és/vagy • · 4 · · · 4 « k « « 4 •· »44 «4 karbonátjait. A közegek tartalmaznak még például növekedés-serkentő anyagokat, valamint nyomelemeket, például cinket, mangánt és hasonlókat.

A tápközeget előnyösen úgy választjuk, hogy szelekciós nyomást fejtsen ki és akadályozza meg azon sejtek növekedését, amelyek nem transzformálódtak vagy elvesztették a hibrid vektort, így például antibiotikumot adunk a közeghez, ha a hibrid vektor antibiotikum rezisztencia gént, mint markert tartalmaz. Ha például olyan gazdasejtet alkalmazunk, amely létfontosságú aminosavban auxotróf, míg a hibrid vektor olyan gént tartalmaz, amely egy enzimet kódol, amely kijavítja a gazdaszervezet hibáit, az említett aminosavból hiányos minimális tápközeget alkalmazunk a transzformált sejt tenyésztésére.

Magasabbrendű eukarióta eredetű sejteket, mint például emlős sejteket tenyésztünk a szövettenyészetnek megfelelő körülmények között, kereskedelemben beszerezhető tápközeg, például Dulbecco-féle módosított Eagle tápközeg (DMEM), minimum essential közeg, RPMI 1640 tápközeg és hasonlók alkalmazásával, ahogy fentebb említettük, tetszés szerint kiegészítve növekedés-serkentő anyagokkal és/vagy emlős szérumokkal. A szövettenyészeten folyó sejttenyésztés technológiája jól ismert a szakterületen, ide tartoznak a homogén szuszpenziós tenyészetek, pl. levegőemelő reaktorban, vagy állandó keverésű reaktorban, vagy immobilizált, vagy befogott tenyészetek, mint pl. üreges szálakban, mikrokapszulákban, agaróz mikrogyöngyökön, porózus üvegágyakon, kerámia gyertyákon vagy más mikrohordozókon.

A tenyésztést a szakterületen ismert módon végezzük. A tenyésztés körülményeit, mint a közeg hőmérsékletét, pH értékét és a fermentációs időt úgy választjuk meg, hogy a találmány szerinti polipeptid vagy származéka maximális titerjét kapjuk.

Annak érdekében, hogy lehetővé tegyük a transzformált sejtek különválogatását a nem transzformált sejtektől, a találmány szerinti DNS molekulák egy szelekciós markert hordoznak, vagy pedig a sejteket egy ilyen markert tartalmazó vektorral együtt transzformáljuk. Mivel más rendszerekben az ilyen szelekciós marker kifejezhető struktúrális gén, ennek polipeptidje (egy enzim) rezisztenciát nyújt az olyan vegyületek ellen, amelyek toxikusak a fogadó szervezetre,

4*4«

4 vagy kiegészíti az olyan mutáns enzimrendszerét, amelyben az ilyen létfontosságú polipeptidböl hiány van.

A 7B2 in vivő előnyein túl, meglepő módon dezaggregáló ágensként is szolgál in vitro, tehát képes a fehéije, előnyösen monomer fehéije inaktív oldott aggregátumait biológiailag aktív fehérjékké transzformálni, illetve megakadályozni a fehéije, előnyösen monomer fehérje aggregációját inaktív aggregátumokká.

A találmány így eljárást nyújt fehéije, előnyösen monomer fehéije dezaggregációjára vagy aggregációjának megelőzésére, ami áll a fehérje inaktív aggregátumainak, ide értve oldható inaktív aggregátumokat is, 7B2-vel való kezeléséből dezaggregált fehéijék, előnyösen monomer fehéijék előállítása céljából. All az eljárás még a dezaggregált fehéijék, előnyösen monomer fehéijék 7B2-vel való kezeléséből, ezek aggregációjának megelőzése céljából. A fehéijék dezaggregációja vagy aggregációjának megelőzése fontos, mivel az aggregáció inaktiválja a biológiailag aktív fehéijéket, illetve mivel a dezaggregált fehéijék újrahajtogatódhatnak aktív fehéijékké, míg az aggregátumok nem hajtogathatok újra.

A találmány szerinti ezen eljárás különösen jól jellemezhető azzal, hogy a fehéijét, előnyösen monomer fehéijét 7B2-vel kezeljük az aggregáció megelőzése érdekében, vagy azzal, hogy a fehéije, előnyösen monomer fehéije aggregátumait 7B2-vel kezeljük a fehéije dezaggregációja érdekében. A kezelés alkalmas puffer oldatokban végezhető, pl. foszfát vagy trisz pufferben, vagy például akár olyan sejtek felülúszóiban, amelyek kiválasztották a fehéijét. Dezaggregáció céljából a kezelendő fehéijét és a 7B2-t összekeverjük és néhány perctől néhány óráig terjedő időtartamban inkubáljuk, például 30 perc és 1 óra között, 4°C és 30°C közötti hőmérsékleten, kívánt esetben ATP jelenlétében, amely alkalmazása esetén előnyösen 1 és 10 mM közötti koncentrációban alkalmazandó. Az aggregáció megelőzésére a 7B2-t és az aggregációjában megakadályozandó fehérjét összekeveijük és a fehérjét 7B2 jelenlétében a szokott körülmények között tartjuk. A 7B2 adható még például élesztősejt-tenyészethez is, amely kiválasztja a fehérjét, amelynek nem szabad aggregálódnia.

·· « · ·« ·

In vitro alkalmazás céljára a 7B2-t genetikai úton állítjuk elő pro- vagy eukarióta sejtekben, például E.coli-ban vagy élesztősejtekben, a sejtekből izolálva, vagy, amennyiben az elkészült 7B2 kiválasztódik, a felülúszóból izolálva, és hozzáadjuk a fehérjéhez, amelyet dezaggregálni kívánunk, vagy amelynek aggregációját meg kívánjuk előzni.

A jelen találmány legelőnyösebb kiviteli módjait a kiviteli példákban írjuk le. A találmány ugyanakkor a példákban leírt egyes kiviteli módok lehetséges variánsait és megfelelőit is.

A példák illusztrálni hivatottak a találmányt. A találmány oltalmi körét ugyanakkor nem korlátozzák.

Az alábbiakban röviden ismertetjük az ábrákat

Az 1. ábra mutatja be a pGEX-2T-7B2 klón megalkotását. A pGEX-2T vektor MCS-ében lévő BamEH helyet Klenow polimeráz alkalmazásával töltjük be, majd a h7B2-cDNS (a pAB 1-ből) egy EcoRV-EcoRI fragmentumát a Smal/EcoRI helyekbe klónozzuk. A fúziós fehérje aminosav szekvenciájában az Sj26 és 7B2 között lévő átmeneti területen trombin felismerő hely van.

A 2. ábra mutatja be a pGEX-KG prokarióta kifejezési vektor megalkotását, amelyet a pGEX2T vektorból kapunk egy, többszörös klónozó helyeket bíró kapcsoló EcoRI helybe való beiktatásával.

Kivitek példák

1. példa: Rekombináns humán 7B2 előállítása E.coh-ban (pGEX-2T/7B2 klón)

A pGEX-2T prokarióta kifejező vektor (Amrad Corporation Limited, Melbourne, Victoria, Ausztráha) hordozza a Schistosoma japonicum glutation S-transzferáz (GST) génjét, egy tacpromoterhez képest lefelé. Annak érdekében, hogy ezt a vektort alkalmassá tegyük a 7B2, mint a GST-vel való fúziós vektor kifejezésére Escherichia cok-ban, egy leolvasókeretet elcsúszást kék a sokszoros klónozó helybe juttatnunk a GST gén 3' végénél. Ennek érdekében a pGEX2T vektort BamHI-vel emésztjük és a bemélyedő 3' végeket a DNS polimeráz I Klenow • · < ·* ··«« ·· • « · 9 »· • 4 ♦ · · ··· · • · · · · 44 ·« ···· ·* ··· ·· 23 fragmentumával töltjük be. A kapott tompa végek ligálása egy módosított pGEX-2T vektort eredményez 4 hozzáadott bázispárral, amelyek alternatív leolvasókeretet képeznek. Ezt a vektort Smal-vel és EcoRI-vel emésztjük és egy 1.0 kb-s EcoRV-EcoRI cDNS fragmentumot - amely a humán 7B2 14-185 aminosavait kódolja (a 7B2 szekvenciát lásd EP-A-0 315 254) ligálunk a módosított vektor Sma/EcoRI helyeibe. A kapott plazmidot Escherichia coli törzs JM101 hsdS recA-ba transzformáljuk, amely így tartalmazza a pGEX-2T/7B2 kiónt.

pGEX-2T/7B2 plazmidot (pGEX-2T/7B2 klón) tartalmazó, egy éjszakán át tenyésztett baktérium tenyészetet 20-szorosan hígítunk 200 ml, ampicillint (70 pg/ml) is tartalmazó LB tápközegben és egy órán keresztül 37 °C-on növesztjük. A fúziós fehérje kifejezésének indukálására IPTG-t (izopropil β-D-tiogalaktopiranozid; Sigma) adunk 0.5 mM végső koncentrációig, majd a tenyészetet további 3 órán keresztül növesztjük. A sejteket centrifugálással nyerjük ki (5 perc, 5000 fordulat/perc), majd ultrahanggal lizáljuk (10-szer, mindegyik 20 mp) 3 ml lizáló pufferban, amely 50 mM Tris-t, pH 7.5; 50 mM NaCl-t; 1% (térfogat/térfogat) Triton Χ-100-at; 250 mM guanidin hidrokloridot; 1 mM etilén-diamin-tetraacetátot (EDTA), 10 mM ditiotreitol-t (DTT) és 1 mM fenil-metil-szulfonil-fluoridot (PMSF) tartalmaz. A lizátumot 5000 fordulat/perc fordulatszámmal, 10 percen keresztül 4 °C-on centrifugáljuk és a fúziós fehérjét a felülúszóból izoláljuk affinitás kromatográfiával, glutation agarózzal (Sigma, G4510). Ehhez a felülúszót 500 ml 50%-os (térfogat/térfogat) glutation agarózzal keveijük össze, amely a lízis pufferben egyenlítődik ki. A keverék 20 perces inkubálása után, a minta állandó, 4 °C-on való kevertetése mellett, a keveréket centrifugáljuk (30 perc, 5000 fordulat/perc), a gyöngyöket háromszor mossuk 3 ml lizáló pufferral és ötször 30 ml trombin hasító pufferral (50 mM Tris, pH 5,5; 150 mM NaCl; 2,5 mM CaC12). Az utolsó mosás után a gyöngyöket 2 pg trombint (humán plazmából nyert, liofilizált por; Sigma, T6759) tartalmazó 500 μΐ trombin hasító pufferban szuszpendáljuk és a keveréket 10 percig szobahőmérsékleten rázzuk. A hasító reakciót PMSF (1 mM végső koncentráció) hozzáadásával és a minta jégre való helyezésével állítjuk meg.

A kapott 7B2-ben nincs meg a felnőtt humán 7B2 jelző peptidje és első 13 aminosava, viszont néggyel több N-terminális aminosavat tartalmaz.

Ml ·· «« · » ···« * · · 4 4 · • <44 4·· • 4 · ·· • »4·· ··**4

A trombin eltávolítása érdekében 200 μΐ 50%-os (térfogat/térfogat) p-aminobenzamidin-agaróz (Sigma A 7155) szuszpenziót adunk a felülúszóhoz, hogy eltávolítsuk a fúziós fehérje esetleges maradékait. 10 perc inkubáció (4 °C) után eltávolítjuk az agaróz gyöngyöket és a tisztított 7B2-t -80 °C-on tároljuk vagy liofilizálás után -20 °C-on tároljuk. A kinyert tisztított (tisztaság>95%) rekombináns 7B2 mennyisége 0.5 pg/μΐ. Hasonló eredményeket kapunk, amikor a pGEX-2T/7B2 konstrukciót más E.coli törzsekbe, mint RR1, HB101, C600 vagy DH5alfa transzformáljuk.

A fehéije mintákat 12,5% SDS-poliakrilamid gél elektroforézis (SDS-PAGE) segítségével analizáljuk (Laemmli, 1970), amelyet vagy a gél festése követ 0,2% Coomassie Brilliant Blue R250 oldattal (50% metanol, 7,5% ecetsav) vagy pedig Western foltképzést alkalmazunk. A Western folt analízishez a fehéijék szétválasztása után az SDS-gélt foltképző pufferban (150 mM glicin, 20 mM tris, 20% metanol) 15 percig kiegyensúlyozzuk. A fehéijék elektroforetikus átvitelét nitrocellulózba foltképző pufferban visszük végbe 16 órán keresztül 100 mA-n. A foltokat foszfáttal pufferolt fiziológiás sóoldatban (PBS, 50 mM NaHPC>4, pH 7,3; 120 mM NaCl) öblítjük le és egy órán keresztül blokkoló pufferban (3% tyúktojás albumin (CEA), 1% normál kecskeszérum (NGS) és 3% triton PBS-ben) blokkoljuk. Az antitest inkubációt szobahőmérsékleten végezzük a MON-102 és MON-104 (tenyészet felülúszók) anti-7B2 monoklonális antitestek alkalmazásával [van Duijnhoven, H.L.P. és társai, J. Immunoi. Methods, 142:187-198(1991)], majd 1:500 arányban, blokkoló pufferban felhígítjuk. Két óra múlva a meg nem kötött anyagot a folt 3-szori öblítő pufferral (PBS 0,5% CEA-val, 0,2% NGS-sel és 0,3% tritonnal) való öblítésével eltávolítjuk. A nitrocellulóz szűrőt ezután 2 órán keresztül ebben a pufferban inkubáljuk, amely peroxidázzal jelzett kecske-anti-egér antitesteket (GAM/PO, 1:1000) is tartalmaz.

···« ·4 ·· ···· ·· ····«« · · « · ♦ ♦ ♦·· ··· • * · · · « · ·· ··»· ·-« · ♦· ··

2,példa: Rekombináns 7B2 gének előállítása eukarióta sejtekben való kifejezés céliából

2a példa: Amino-terminális 7B2 jelző peptidet és a teljes humán fehérjét kódoló 7B2 gén előállítása

A fenti gén élesztő kifejező vektorban való kényelmes klónozása céljából polimeráz láncreakciót (PCR) végzünk a teljes humán cDNS-en, amely PEC7B2 plazmidban van kódolva [Martens, FEBS Letts., 234:160-164 (1988); a humán 7B2 cDNS-ének DNS szekvenciáját az EP-A-0 315 254 írja le], két dezoxi-oligoribonukleotid, mint primer alkalmazásával (lásd SEQ ID NO: 1 és 2). A humán cDNS-t 30 ciklus PCR segítségével erősítjük. Egy 54 bázispár hosszúságú 7B2 jelző szekvenciát (SEQ ID No:3) tartalmazó EcoRI-Sphl fragmentumot, a 7B2 gén 555 bázispár hosszúságú kódoló régióját, valamint egy stop kodont (SEQ ID No:4) Egálunk a pUC19 plazmidba [Boehringer Mannheim GmbH, Németország], amelyet teljesen emésztünk EcoRI-vel és SphI-vel. A ligációs keverék egy alikvotját kalciummal kezelt, transzformáció-kompetens E.coli HB101 sejtekhez [Invitrogen, San Diego, USA] adjuk. Hat ampicillin-rezisztens E.coli transzformánst tenyésztünk 100 mg/1 ampicillin jelenlétében. Plazmid DNS-t állítunk elő és elemezzük EcoRI/SphI-vel, EcoRI/Pstlvel, SacI/KpnI-vel, EcoRI/BamHI-vel és Xbal/HindlII-vel való emésztéssel. Egy, a várt restrikciós fragmentumokkal rendelkező kiónt kiválasztunk és pUC19/EcoRI-SphI/7B2ss-7B2nek nevezzük el [ahol a 7B2ss jelzi a humán 7B2 18 aminosavból álló jelző szekvenciáját],

2b példa: Csonkított 7B2 gén előállítása, amely a humán fehége amino-terminális 7B2 jelző peptidjét és első 137 aminosavját kódolja

A fenti gén előállítása céljából PCR-t végzünk a teljes humán cDNS-en (mint a 2a példában) két dezoxi-oligoribonukleotid alkalmazásával (lásd SEQ ID No:l és 5) primerként. A humán cDNS-t a 2a példában leírtaknak megfelelően erősítjük. Egy, a 18 aminosavas 7B2 jelző peptidet (lásd a 2a példát), a humán 7B2 137 aminosavját és egy stop kodont kódoló mintegy 480 bázispár hosszúságú EcoRI-Sphl fragmentumot ligálunk a pUC19 plazmidhoz, mint a 2a példában. Plazmid DNS-t készítünk a transzformánsokból, és elemezzük EcoRI/SphI-vel, EcoRI/Pstl-vel, SacI/KpnI-vel és Xbal/HindlII-vel végzett emésztéssel. Egy, a várt restrikciós *♦·> ·« ·· ···· ·· • 9 ·« «9 · · • · · 9 »99 999 *’·· *”* **·* ··* fragmentumokkal rendelkező kiónt kiválasztunk és pUC19ZEcoRI-SphI/7B2ss-7BA 1-nek nevezzük el.

2c példa: Csonkított 7B2 gén előállítása, amely a humán fehérje amino-termjnális 7B2 jelző peptidiét és első 149 aminosaviát kódolja

A fenti gén előállítása céljából PCR-t végzünk a teljes humán cDNS-en (mint a 2a példában) két deoxi-oligoribonukleotid alkalmazásával (lásd SEQ ID No: 1 és 6). A humán a cDNS-t a 2a példában leírtaknak megfelelően erősítjük. Egy, a 18 aminosavas 7B2 jelző peptidet (lásd a 2a példát), a humán 7B2 149 aminosavját és egy stop kodont kódoló mintegy 515 bázispár hosszúságú EcoRI-Sphl fragmentumot ligálunk a pUC19 plazmidhoz, amelyet EcoRI-vel és HindIII-al teljesen emésztünk. Plazmid DNS-t készítünk a transzformánsokból és elemezzük EcoRI/HindlII-al, EcoRI/Pstl-vel, SacI/KpnI-vel és Xbal/HrndlII-vel végzett emésztéssel. Egy, a várt restrikciós fragmentumokkal rendelkező kiónt kiválasztunk és pUC19/EcoRIHrndHI/7B2ss-7B2A2-nek nevezzük el.

2d példa: Csonkított 7B2 gén előállítása, amely a humán fehérje amino-terminális 7B2 jelző peptidiét és első 170 aminosaviát kódolja

A fenti gén előállítása céljából PCR-t végzünk a teljes humán cDNS-en (mint a 2a példában) két deoxi-oligoribonukleotid alkalmazásával (lásd SEQ ID No: 1 és 7). A humán a cDNS-t a 2a példában leírtaknak megfelelően erősítjük. Egy, a 18 aminosavas 7B2 jelző peptidet (lásd a 2a példát), a humán 7B2 170 aminosavját és egy stop kodont kódoló mintegy 580 bázispár hosszúságú EcoRI-Sphl fragmentumot ligálunk a pUC19 plazmidhoz, mint a 2c példában. Plazmid DNS-t készítünk a transzformánsokból és elemezzük EcoRI/HindlII-al, EcoRI/Pstlvel, SacI/KpnI-vel és Xbal/HindlII-vel végzett emésztéssel. Egy, a várt restrikciós fragmentumokkal rendelkező egy kiónt kiválasztunk és pUC19/EcoRI-HindIII/7B2ss-7B2A3nak nevezzük el.

• «

3. példa: 7B2 előállítása élesztőseitekben

3a példa: Az élesztő SUC2 gén-bői származó amino-terminális ielzőpeptidet és a teljes humán 7B2-t kódoló gén megalkotása

A pUC19/BamHI-XhoI/GAPDH-IT plazmid tartalmazza a S.cerevisiae GAPDH gén 400 bázispár hosszúságú promoter régióját, valamint a S.cerevisiae SUC2 gén [a továbbiakban invertáz jelző szekvenciának vagy csak Invss-nek (SEQ ID No:8) hívjuk] kémiailag szintetizált jelző szekvenciájának 57 bázispáiját. A promoter és a jelző egy EcoRI hellyel kapcsolódik egymáshoz. A plazmidot Xhol-vel teljesen emésztjük és a ragadós véget T4‘ polimerázzal töltjük be. Ncol kapcsolókat adunk a tompa végű DNS-hez. BamHI-gyel és Ncol-gyel végzett emésztés után egy mintegy 465 bp-s BamHI-NcoI fragmentumot izolálunk.

A PEC7B2 plazmidot (lásd a 2a példa) teljesen emésztjük EcoRI-gyel és a tapadós végeket T4 polimerázzal. Ncol kapcsolókat adunk a tompa végű DNS-hez. Sacl-gyel és Ncol-gyel történő emésztés után egy, a 7B2 gén 5' végét tartalmazó mintegy 270 bázispár hosszúságú NcoI-SacI fragmentumot izolálunk.

Az izolált mintegy 465 bázispár hosszúságú BamHI-NcoI és a mintegy 270 bázispár hosszúságú NcoI-SacI fragmentumokat a pUC19 plazmidba szubklónozzuk, amelyet BamHISacl-vel teljesen emésztünk. Az E.coli HB101-be való transzformáció után 6 transzformánsból nyert DNS-t BamHI/SacI-el és BamEH/HindlII-al elemzünk. Egy helyes klónt pUC19/BamHISacI/GAPDH-Invss-7B2-nek nevezünk (nem egzakt konstrukció). Ebben a konstrukcióban az invertáz jelző szekvencia kódoló régiója nincs egy keretben a 7B2-ével.

Az invertáz jelző szekvenciát a 7B2 kódoló régióval egy keretben tartalmazó egzakt konstrukciót PCR-rel álltjuk elő, három dezoxi-oligoribonukleotid primer (lásd SEQ ID No:9, 10 és 11) alkalmazásával. A helyre irányuló deléciós mutagenezis létrehozásához alkalmazott templát a pUC19/BamHI-SacI/GAPDH-Invss-7B2 (nem egzakt konstrukció). A SEQ ID No:9 és 10 primereket a PCR első fordulójában alkalmazzuk, hogy mintegy 180 bázispár hosszúságú, az invertáz jelző szekvencia egy részét a 7B2 génnel egy keretben kódoló fragmentumot kapjunk. A PCR második fordulójában a mintegy 180 bázispár hosszúságú, a • ·

PCR első fordulójában kapott denaturált fragmentumot és a SEQ ID No: 11 primeijét alkalmazzuk, hogy mintegy 220 bázispár hosszúságú EcoRI-SacI fragmentumot kapjunk, amely a teljes invertáz jelző szekvenciát a 7B2 gén egy részével (a gén 5' vége) egy keretben kódolja. Ezt a fragmentumot pUC 19-be szubklónozzuk, majd teljesen emésztjük EcoRI-el és Sacl-el. Hat E.coli HB101 transzformánsból DNS-t kapunk. Az elemzés megmutatja, hogy mindegyik klón helyes. Ezen kiónok egyikét pUC19/EcoRI-SacI/Invss-7B2Sac-nak nevezzük (egzakt konstrukció).

Mintegy 220 bázispár hosszúságú, a teljes invertáz jelző szekvenciát a 7B2 egy részével egy keretben kódoló EcoRI-SacI fragmentumot izolálunk a pUC19/EcoRI-SacI/Invss-7B2Sac (egzakt konstrukció) plazmidból.

Egy mintegy 410 bázispár hosszúságú, a 7B2 3' szegmentumát és egy stop kodont kódoló SacI-HindHI fragmentummot izolálunk a pUC19/EcoRI-SphI/7B2ss-7B2 plazmidból (lásd a 2a példa).

Az EcoRI-SacI és a SacI-HindlH fragmentumokat a pUC 19-hez Egáljuk, amelyet EcoRI-vel és HindlII-al teljesen emésztünk. Egy helyes kiónt pUC19/EcoRI-HindIH/Invss-7B2-nek nevezünk. A plazmid kódolja a teljes invertáz jelző szekvenciát (57 aminosav) a teljes humán 7B2-vel (185 aminosav) és egy stop kodonnal egy keretben.

3b példa: Promoter előállítása az élesztő citoplazmás ciklofilin génből

Az élesztő c-ciklofilinből [ez a S.cerevisiae CYP1 gén; Haendler, B., Keller, K, Hiestand,

P.C., Kocher, HP., Wegmann, G., Mowa, N.R., Gene 83:39-46 (1989)] származó promotert PCR-rel izoláljuk. A PCR-t, ahogyan a 2a példában is tettük, S288C élesztőtörzsből származó genomikus DNS, mint templát, valamint két dezoxi-oligoribonukleotid, mint primer (lásd a SEQ ID No: 12 és 13-at) alkalmazásával hajtjuk végre. Egy mintegy 545 bázispár hosszúságú BamHI-EcoRI fragmentumot izolálunk és szubklónozunk pUC 18-ba, amelyet teljesen elemésztünk BamHI-el és EcoRI-el. 6 transzformánsból nyert DNS-t restrikciós enzimekkel és DNS szekvenálással elemzünk. Egy helyes kiónt pUC19/BamEH-EcoRI/CYPlp-nek nevezünk.

···«·· ·· « ♦ · · ♦♦· ♦·· • « · · « * · ·· «·»« ·· ··· ·· c példa: Alkalmas transzkripciós terminátor fragmentum megalkotása élesztő PH05 génből

A PH05 génből származó mintegy 377 bázispár hosszúságú SphI-PstI fragmentumot [Sphl kapcsolókat adunk a túlnyúló Sau3A helyhez a PH05 gén 3' végén; Meyhack, B., Bajwa, W., Rudoph, H., Hinnen, A., EMBO J., 6, 3455-3463, (1982)], amely hatékony transzkripciós terminátorként működik közre heterológ gének kifejezésében, pUC 19-be szubklónozzuk, amelyet teljesen emésztünk SphI-el és Pstl-el. A transzformánsok elemzése után egy megfelelő kiónt pUC19/SphI-PstI/PHO5T-nek nevezünk.

3d példa: Élesztő kifejező vektor előállítása a teljes 7B2 kiválasztására 7B2 jelző szekvencia alkalmazásával

Egy mintegy 545 bázispár hosszúságú BamHI-EcoRI CYPlp fragmentumot izolálunk a pUC19/BamHI-EcoRI/CYPlp-ből (lásd 3b példát).

A 18 aminosavas 7B2 jelző peptidet, a humán 7B2 185 aminosavját és egy stop kodont kódoló mintegy 620 bázispár hosszúságú EcoRI-HindlII fragmentumot izolálunk a pUC19/EcoRISphI/7B2ss-7B2-ből (lásd a 2a ábrát).

Egy mintegy 385 bázispár hosszúságú HindlII-SalI PHO5T fragmentumot izolálunk a pUC19/SphI-PstI/PHO5T-ből (lásd a 3c példát).

A BamHI-EcoRI, az EcoRI-HindlII és a HindlH-SalI fragmentumokat a pDP34 vektorhoz ligáljuk, amelyet teljesen emésztünk BamHI-el és Saü-el.A pDP34 plazmid egy E.coliS.cerevisiae ingázó vektor, amely tartalmazza a teljes S.cerevisiae 2 mikronos plazmidot és kódolja a S.cerevisiae URA3 és dLEU2 géneket, mint élesztő szelekciós markereket. Az E.coli HB 101-be történt transzformáció után DNS-t készítünk 24 transzformánsból. BamHI/SalI-vel végzett elemzéssel győződünk meg a kiónok helyességéről. Egy kiónt pDP34/BamHISaII/CYPlp-7B2ss-7B2-PHO5T-nek nevezünk.

·· · ·*·· »· ♦ ♦ ·»♦♦ • · · · · · · · · · ··· • · · » « ·

3e példa: Élesztő kifejező vektorok előállítása a csonkított 7B2 kiválasztására 7B2 jelző szekvencia alkalmazásával

A pDP34/Bamffl-SaII/CYPlp-7B2ss-7B2Ál-PHO5T pDP34/BamHI-San/CYPlp-7B2ss-7B2A2-PHO5T pDP34/BamHI-SaII/CYPlp-7B2ss-7B2A3-PHO5T

V néven hivatkozott plazmidokat pontosan a 3d példában leírtaknak megfelelően állítjuk elő. A 7B2 jelző szekvenciát, a csonka humán 7B2 gén kódoló régióját és egy stop kodont tartalmazó EcoRI-HindlII fragmentumokat izolálunk a megfelelő plazmidokból (lásd a 2b-d példákat).

3f példa: Élesztő kifejező vektor előállítása a teljes 7B2 kiválasztására élesztő SUC2 jelző szekvencia alkalmazásával

A pUC19/BamHI-EcoRI/CYPlp-ből (lásd 3b példa) származó mintegy 545 bázispár hosszúságú BamHI-EcoRI CYPlp fragmentumot és a pUC19/EcoRI-SacI/Invss-7B2-ből [(egzakt konstrukció); lásd 3a példa] származó mintegy 220 bázispár hosszúságú EcoRI-SacI fragmentumot pUC 19-be szubklónozzuk, amelyet teljesen emésztünk BamHI-el és Sacl-el, mint a 3a példában. Az egyik helyes klónból származó DNS-t pUC19/BamHI-SacI/CYPlpInvss-7B2 (5' vég)-nek nevezzük.

Egy, a CYP1 promotert, az invertáz szignáál szekvenciát és a pUC19/BamHI-SacI/CYPlpInvss-7B2 (5' vég)-ből származó humán 7B2 gén 5' végét tartalmazó mintegy 765 bp-os BamHI-SacI fragmentumot, egy mintegy 410 bázispár hosszúságú, a humán 7B2 gén 3' végét a pUC19/EcoRI-SphI/7B2ss-7B2 (lásd a 2a példát) plazmidból származó stop kodont tartalmazó SacI-HindlII fragmentumot, és a pUC19/SphI-PstI/PHO5T (lásd a 3c példát) plazmidból származó mintegy 377 bázispár hosszúságú HindlII-Sall fragmentumot ligálunk a pDP34 vektorhoz, amelyet teljesen emésztünk BamHI-el és SalI-el. Az E.coli HBlOl-be történő transzformáció után DNS-t készítünk 24 transzformánsból. BamHI/SaII-el és BamHT/HindTTT31 ··«· ·· ·· ···-* ·· ···«·· ·· • ·· · ··· ··· • · · · · · · ·· · · ·· ·· · ·· ·· al végzett elemzéssel igazoljuk a helyes kiónokat. Egy ilyen kiónt pDP34/BamHI-SaII/CYPlpInvss-7B2-PHO5T-nek nevezünk.

3g példa: Élesztő kifejező vektorok előállítása a csonkított 7B2 kiválasztására 7B2 jelző szekvencia alkalmazásával

A pDP34/BamHI-SaII/CYP lp-Invss-7B2A 1-PH05T pDP34/BamHI-San/CYP lp-Invss-7B2A2-PHO5T pDP34/BamHLSaII/CYPlp-Invss-7B2A3-PHO5T néven hivatkozott plazmidokat pontosan a 3f példában leírtaknak megfelelően állítjuk elő. A csonkított humán 7B2 gének kódoló régiójának 3' végét tartalmazó SacI-HindHI fragmentumokat izoláljuk a megfelelő plazmidokból (lásd a 2b-d példákat).

3h példa: pDP33/BamHI-San/CYPlp-Invss-7B2-PHO5T pDP33/BamHI-San/CYPlp-Invss-7B2Al-PHO5T pDP33/BamHI-San/CYPlp-Invss-7B2A2-PHO5T pDP33/BamHI-San/CYPlp-Invss-7B2A3-PHO5T előállítása

A fenti plazmidokat pontosan a 3f és g példákban leírtaknak megfelelően állítjuk elő. A megfelelő fragmentumokat ligáljuk a pDP33-hoz, amely csaknem azonos a pDP34-gyel, az egyetlen különbség, hogy pDP33-ból hiányzik az S.cerevisiae URA3 gén, amely a pDP34 plazmidban élesztő szelekciós markerként van jelen. A dLEU2 által kódolt hiányos promoter, amely a pDP33 plazmidban van jelen, hozzájárulhat a fenti plazmid konstrukciók másolatai számának emeléséhez a LEU2 alléi nem funkcionális genomiális másolatával rendelkező élesztősejtben.

• ·

3i példa: Az AB110 prbl- S.cerevisiae törzs transzformációja a humán 7B2 gént kódoló plazmidokkal

Az élesztő transzformációt a következő irodalmakban leírtaknak megfelelően végezzük: Klebe és társai, Gene 25:333-341 (1983) és Hinnen és társai, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 75:1929(1978).

A S.cerevisiae AB 110 prb~-t [lásd a 4b példát; a PRB1 kódolja az élesztő proteáz B gént], vagy bármely más élesztőtörzset, amely el van szakítva az A és B élesztő proteázoktól, az alább felsorolt plazmidokkal transzformálunk, a transzformánsokat a leírtaknak' megfelelően nevezzük el:

Plazmidok	Transzformánsok nevei
pDP34/BamHI-Sa 1I/CYP lp-7B2ss-7B2-PHO5T	yHBl
pDP34/BamHI-SalI/CYPlp-7B2ss-7B2Ál-PHO5T	yHB2
pDP34/BamHI-SalI/CYPlp-7B2ss-7B2A2-PHO5T	yHB3
_PDP34/BamHI-SalI/CYPlp-7B2ss-7B2A3-PHO5T	yHB4
pDP3 4/B amHI-S a 11/C YP lp-Invss-7B2-PHO5 T	yHB5
pDP34/BamHI-SalI/CYPlp-Invss-7B2Al-PHO5T	yHB6
pDP34/Bamffl-SalI/CYPlp-Invss-7B2A2-PHO5T	yHB7
pDP34/BamHI-SalI/CYPlp-Invss-7B2A3-PHO5T	yHB8
pDP33/BamHI-SalI/CYPlp-Invss-7B2-PHO5T	yHB9
_PDP33/BamHI-SalI/CYPlp-Invss-7B2Al-PHO5T	yHBIO
pDP33/BamHI-Sa 1I/CYP lp-Invss-7B2A2-PHO5T	yHBll
pDP3 3 /B amHl-Sa 11/C YP 1 p-Invss-7B2A3-PHO5 T	yHB12

·4·« «· ·« «««4 ·· ·»···» · ♦ • * · · »·· *·· • · · · ♦ · · ·· «··· ·♦ · ·· ··

Mindegyik transzformánsból három telepet kiválasztunk és egy további számmal jelölünk meg (pl. yHBl-1, yHBl-2, yHBl-3).

3j példa: 7B2 élesztő transzformánsok tenyésztése rázólombik-tenvészetekben

Az AB 110 S.cerevisiae törzset (Matalfa. his 4-580. Ieu2, ura3-52, pep4-3. [cir⁰]) mások leírták [Barr, P.J. és társai, J.Biol.Chem. 263, 16471-16478 (1988)]. Egy 8,4 g/1 aminosav nélküli élesztő nitrogén bázist (Difco), 10 g/1 L-aszparagint, 1 g/1 hisztidint és 20 g/1 glukózt tartalmazó minimális tápközeget használunk előtenyészetként. Ehhez a tápközeghez adunk 1 g/1 leucint vagy 1 g/1 uracilt attól függően, hogy a pDP34-et vagy a pDP33-t kívánjuk-e szelektálni. A 7B2-t a fotenyészetben fejezzük ki, amely 30 g/1 glukózzal kiegészített 1,7 g/1 élesztő nitrogén bázist, 8,5 g/1 kazaminosavat és a szükséges aminosavakat tartalmazza. Az élesztő transzformánsokat (lásd 3i példa) 30°C-on tenyésztjük körkörös rázón, 180 fordulat/percen 48 órán keresztül 10 ml mennyiségű előtenyészet tápközegben, és 48 órán keresztül 60 ml mennyiségű fő tenyészetben.

A sejtek alikvotjait összegyűjtjük és a kiválasztott 7B2-t 10-50-szeresen sűrítjük Centricon-10 szűrők (Amicon) alkalmazásával. A koncentrált felülúszót inkubációra használjuk IGF-l-et tartalmazó élesztő tenyészközeggel. Az intracelluláris és a kiválasztott 7B2 kvalitatív becslését Western foltképzéssel végezzük tisztított 7B2 alkalmazásával, amelyet a 7B2 E.coli-ban való kifejeződéséből (lásd az 1. példát) nyerünk. A 7B2 antitestek felismerésére MON-102 monoklonális antitestet alkalmazunk (lásd az 1. példát).

4. példa: Az IGF-1 előállításának javítása 7B2 in vitro vagy in vivő alkalmazásával

4a példa: S.cerevisiae transzformációja a humán IGF-l-et kódoló plazmiddal

A S.cerevisiae AB 110 törzset, tehát egy olyan törzset, amely képes a humán inzulin-szerű növekedési faktort (IGF-1) kiválasztani, a pDP34/GAPDHp-alfaFL-IGFl-alfaFL-IGFl-alfaFT plazmiddal [Steube, K. és társai, Eur.J.Biochem., 198:651-657 (1991)] transzformáljuk. A pDP34/GAPDHp-alfaFL-IGFl-alfaFT-ban jelen lévő IGF-1 kifejezési kazettát tartalmazó ·· 9 ·« ·« • · · b ··· • « · e « · «

..........* stabil pFBY66 2 mikronos plazmidot [91810124.7 számú európai szabadalmi bejelentés] szintén AB 110-be transzformáljuk. A transzformánsokat általánosan yIGF-nek nevezzük.

4b példa: S.cerevisiae együtt-transzformálása a humán IGF-1 gént kódoló és a humán 7B2 gént kódoló plazmidokkal.

A S.cerevisiae AB 110 prbl~-t. tehát azt a törzset, amely el van szakítva az A és B élesztő proteázoktól, a pFBY66 plazmiddal (lásd a 4a példát), illetve az alábbi plazmidok bármelyikével együtt-transzformáljuk.

pDP33ZBamHI-San/CYPlp-Invss-7B2-PHO5T pDP33/BamHI-SaII/CYPlp-Invss-7B2Al-PHO5T pDP33/'BamHI-SaII/CYP Ip-Invss-7B2A2-PHO5T pDP33/BamHI-SaII/CYP lp-Invss-7B2A3-PHO5T (lásd a 3h példát). A transzformánsokat általánosan yIGF/7B2-nek nevezzük.

4c példa: ylGF növesztése rázólombikos tenyészetben, valamint az IGF-1 fehérje kvantitatív meghatározása nagyteljesítményű folyadékkromatográfiával (HPLC)

6,5 g/1 élesztőkivonatot, 4,5 g/1 kazaminosavat és 20 g/Ί glukózt tartalmazó dús tápközegben tenyésztjük az ylGF élesztő transzformánsokat; ez a tápközeg nem szelektív előtenyészet közeg. Az IGF-1-et a fő tenyésztő közegben fejezzük ki, amely azonos a 7B2 kifejezésére használt közeggel (lásd a 4a példát).

A sejtek alikvotjait összegyűjtjük és a kiválasztott, a tenyésztőközegben lévő aktív monomer IGF-1 molekulát HPLC-vel és ELISA-val mérjük [Steube, K. és társai, Eur.J.Biochem., 198:651-657(1991)].

λ··Φ ·♦ ··»*·· ·····* · *· • · φ φ ····♦» • a · « k 9· ·· ««φ* »· »♦··*

4d példa: vIGF/7B2 növesztése rázólombikos tenyészetekben, valamint az IGF-1 fehéije meghatározása Western foltképzéssel yIGF/7B2 élesztő transzformánsokat (lásd a 4b példát) tenyésztünk a 4c példának megfelelően. A sejtek alikvotjait összegyűjtjük és a monomer IGF-l-et Western foltképzéssel becsüljük fel. Eredményül azt kapjuk, hogy az yIGF/7B2-ből kapott redukált monomer IGF-1 mennyisége több, mint amit az yIGF-ből kaptunk (lásd a 4a példát).

4e példa: 7B2 hatásai aktív, monomer IGF-1 titeneire

7B2 koncentrált felülúszóit (lásd a 4b példát) az IGF-l-et tartalmazó élesztőtenyészet felülúszóval inkubáljuk (lásd a 3j példát), ATP jelenlétében vagy hiányában (a végső koncentráció 1-10 mM), 30°C-on, 1 órán keresztül. Az aktív monomer IGF-1 titeijeit HPLCvel méijük. Ugyanezen tenyészet felülúszóit 30°C-on inkubáljuk 7B2 távollétében, de ATP jelenlétében, valamint mind ATP, mind 7B2 távollétében is. A HPLC értékek összehasonlítása megmutatja, hogy a tenyészet felülúszók 7B2-vel való inkubációja után ATP jelenlétében az IGF-1 titerek jelentős növekedése tapasztalható.

Tipikusan 60 μΐ élesztőtenyészet felülúszót (amely 2,5 pg aktív IGF-1 monomert és 20 pg inaktív molekulát tartalmaz) 60 pl 20-szorosan koncentrált 7B2 felülúszóval (amely 5pg csonkított 7B2-t tartalmaz), amely yHB6-ból, yHB7-ből, yHB 10-ből és yHB 11-ből választódott ki, inkubálunk 6pl 200 mM ATP jelenlétében 1 órán át 30°C-on, amelyet EDTA hozzáadása követ (a végső koncentráció 2 mM). E keverék 100 pl-ét HPLC-vel elemezzük.

5.példa: POMC előállításának javítása 7B2 segítségével

5a példa: Tiszta POMC fehéije előállítása és in vitro dezaggregáció

A rekombináns POMC fehéijét standard molekuláris biológiai technológiákkal állítjuk elő. Hasonlóan a tiszta POMC-t a POMC cDNS pGEX-KG vektorba való klónozásával kapjuk. A pGEX-KG vektor egy módosított változata a pGEX-2T vektornak, amelybe egy kapcsoló is van beépülve, amely többszörös klónozó helyeket tartalmaz (3. ábra). Ezt a vektort úgy tesszük alkalmazhatóvá, hogy egy hipofízis könyvtárból izolált, POMC cDNS-t tartalmazó

9··· 99 99 999999 • 9 9 9 9 9 99

9 9 9 999999 ···· 9 ·· • 9 ···· ♦· 999·· pBluescript kiónt tenyésztünk, majd a POMC cDNS-t eltávolítjuk EcRI-el és Xhol-el való emésztéssel. Ezt az 1 kb-s EcoRI-XhoI fragmentumot a pGEX-KG vektor EcoRI és Xhol helyeibe klónozzuk. Ezt a kiónt pGEX-KG-POMC-nek nevezzük. E klón kifejezéséből tiszta GST-POMC fúziós fehérjét, majd trombinnal való hasítás után tiszta POMC-t nyerünk. Az aggregált POMC rekombináns 150 μΐ, 50 mM trisz-HCl-ben, amely 150 mM NaCl-t és 2,5 mM CaCb-t is tartalmaz, együtt inkubáljuk rekombináns 7B2-vel és a nélkül 45 percig jégen inkubáljuk. A natív gél elektroforézis megmutatja, hogy a 7B2 hozzáadása a dezaggregált POMC mennyiségének jelentős növekedését eredményezi.

5b példa: Radiokatívan jelzett. újonnan szintetizált aggregált POMC in vitro dezaggregációja

A 7B2 képességét arra, hogy dezaggregálja a proopiomelanokortin prohormont (POMC) úgy teszteljük, hogy a 7B2-t újonnan szintetizált POMC-vel inkubáljuk. A POMC fehérje, amely több mint 90%-a a Xenopus köztes hipofízis sejtek által szövettenyészetben termelt, újonnan szintetizált összes fehérjéknek. A 7B2 kölcsönhatását aggregált POMC-vel natív poliakrilamid géleken és HPLC-vel elemezzük.

Az újonnan szintetizált POMC-t a fekete-adaptált Xenopus neurointermediáris lebenyei (köztes hipofízis sejtek) termelik a lebenyek 1 órás inkubációja során 5mCi/ml [3\S]-metionint is tartalmazó tápközegben. A fehérjéket IN HCl-lel vonjuk ki,fagyasztva szárítjuk, majd újra oldjuk 150μ1, 150 mM NaCl-t, 2,5 mM CaC12-t, és 50 mM trisz-HCl-t tartalmazó tápközegben, pH 7,5. A radioaktívan jelzett fehérjék 30 μΐ alikvotjaihoz (amelyek mintegy 1 pg POMC-t tartalmaznak) 5pg-ot adunk vagy rekombináns 7B2-ből (amelyet az 1. példában leírtak szerint készítünk el), GroEL-ből és BSA-ból (Sigma), vagy alfa-krisztallinból, majd a mintákat 45 percig jégen inkubáljuk.

A mintákat velük megegyező mennyiségű gél terhelőpufferrel keverjük össze és 6-25% akrilamid, 0,2-0,15% bisz-akrilamid, nem denaturáló gradiens gélen elektroforézisnek vetjük alá 100 V-on 3 órán át, amelyet fixálás követ, majd a gél szárítása autoradiográfiához. A radioaktívan nem jelzett fehérjéket Coomassie kékkel való festéssel mutatjuk ki. Annak igazolására, hogy a natív gélen található csíkokban lévő összes radioaktivitás az újonnan • « · · ··· ·♦· • · · · · « * ·· ···· 4»· ·♦· ·· szintetizált POMC-nek tulajdonítható, a csíkokat kimetszük a szárított gélből, majd újra nedvesítjük 1 M trisz-HCl-lel való fedéssel, pH 8,0, egy órán keresztül. Ezután a trisz puffért SDS minta pufferral helyettesítjük, majd a mintákat felforraljuk és 12,5% SDS-poliakrilamid gébé helyezzük.

A savas extrakciós eljárás, amelyet radioaktívan jelzett fehéijék Xenopus köztes hipofízis sejtekből való készítésére alkalmazunk, denaturált (aggregált) POMC sejteket eredményez, amely nem kerül be natív gélekbe és nem hajtogatódik újra spontánul az alkalmazott körülmények között és a kísérletek időkeretén belül. Az aggregált POMC rekombináns 7B2vei (amelyet az 1. példában leírtak szerint készítünk el) való inkubációja azonban a legtöbb aggregátum mintegy 120 K-s radioaktívan jelzett csíkká való konverzióját eredményezi a natív gélben, míg a GroEL-lel való inkubáció az aggregátumok csak egy részének mintegy 50K-s csíkká való konverziójához vezet. A szarvasmarha szérum albumin mezofilikus fehérével, vagy az alfa-krisztallin oligomer fehéijével történő inkubációnak nincs hatása. A radioaktívan jelzett szalagok natív gélből való kimetszése, amelyet SDS-PAGE követ, megmutatja, hogy a csíkok monomer 37K POMC-ből állnak.

Denaturált radioaktívan jelzett POMC-t és 7B2-vel kezelt radioaktívan jelzett POMC-t szintén HPLC-vel (SP8750 modell, Spectra Physics) elemezzük UltraSherogel oszlopon (SEC 2000, Beckman) 100 mM KH2PO4-el, 100 mM Na2SC>4-el (pH 7,0), mint oszlop elúciós pufferekkel 1 ml/perc átfolyással. A radioaktív frakciókat β-számlálóval számláljuk meg. Ugyanezzel az észlelési eljárással a monomer POMC jelentős növekedését tapasztaljuk 7B2-vel való inkubáció után.

5c példa: 7B2 in vivő működése: 7B2 és POMC együtt kifejeződése magasabbrendű eukarióta sejtekben, amelyek a fehéijekiválasztódás szabályozott útvonalával bírnak

7B2 és POMC termeléséhez eukarióta sejtekben a pECV5-Xho eukarióta kifejező vektort alkalmazzuk. Ezt a 6,8 kb hosszúságú vektor a pECV5 vektorból származik, amelyet Az Epstein-Barr vírusból eredő cDNS kifejező vektor előállítása és tulajdonságai humán sejtekben ···· ·· ·· #··♦ ·· • tf···· · · • · · » ··· ··· • · · · · · · ·· ···· ·» ··· ·· című cikk ír le, P.B.G.M. Beit és társai, Gene 84. 407-417 (1989). A pECV5 klónozó helyében lévő SstI restrikciós helyet Xhol restrikciós hellyel cseréljük fel a pECV-Xho vektorban.

A pECV5-Xho vektor tartalmazza a Rous Sarcoma Vírus (RSV) promotert, amelyet klónozó helyek, majd egy β-globin intron és egy poliadenilációs jel követ a hatékony poliadenilezés érdekében. Az RSV promoter általában igen aktív és ez bizonyára így van az alkalmazott AtT20 sejtekben is. A pECV5-Xho vektor rezisztenciát nyújt a sejteknek transzfekció után a higromicin antibiotikum ellen, mivel szerkezetében higromicin rezisztencia gént tartalmaz.

Egy, az érett 7B2 fehéijét kódoló mintegy 0,8 kb humán 7B2 fragmentumot kihasítunk a 7B2 cDNS-t tartalmazó pABl vektorból KpnI-gyel és Xhol-gyel való emésztéssel, majd a pECV5Xho vektor KpnI-XhoI helyeibe ligáljuk. Ennek eredményeképp a pECV5-Xho-7B2 kiónt kapjuk. Hasonló módon egy 1,1 kb-s, az érett POMC fehéijét kódoló EcoRI-EcoRI POMC cDNS fragmentumot megfelelő irányultságban a vektor EcoRI helyébe, az RSV promoter után építjük be. A pECV5-Xho-7B2 és pECV5-Xho-POMC plazmidokat AtT20 sejtekbe transzferáljuk 2-15 pg DNS elektroporációjával. Az AtT20 egy tumor sejt, amely egér hipofízis elülső lebenyéből származik. Egy nappal a transzfekció után elkezdjük a szelekciót a sejtek higromicint tartalmazó (80 pg/ml) tenyészközegben való inkubációjával. Két héttel később egyedi kiónok izolálhatok és ezek stabil transzfektált AtT20 sejtvonalakká fejlődnek.

Northem folt analízis és monoklonális és poliklonális antitestekkel való immunprecipitáció segítségével meghatározható, hogy a 7B2 és a POMC túltermelése, tehát mind az RNS-, mind a fehéije-szint 20-, 30-szoros növekedése következett be ezekben a sejtekben. Ezen konstrukciók transzfekciójának nincs hatása a sejt növekedésének mértékére. Mint vártuk, a 7B2 erőteljesebb növekedése következik be a 7B2 cDNS-sel transzfektált sejtekben, ami azt mutatja, hogy több 7B2 ment végig a szabályozott útvonalon; ez a 7B2 tehát csak akkor hagyja el a sejtet, ha a sejt kiválasztási tevékenységét stimuláljuk. Ez be is bizonyosodik, mintán a sejtet 5mM 8-Br-cAMP-vel stimuláljuk.

···· ·· «· ···· ·· ····«· · · • · · · ··♦ ··· • · * · · · · ·· ···· ·· ··· ··

A mind POMC-vel, mind 7B2-vel transzfektált sejtekkel való ACTH termelés ACTH radioimmun-vizssgálattal összehasonlítható a csak POMC-vel transzfektált sejtek ACTH termelésével.

A hipofízis pars intermedia melanotróp sejtjei olyan sejtek, amelyek a POMC prohormont 7B2vel koordinálva fejezik ki, tehát amikor a POMC kifejezés megnövekszik, a 7B2 termelése is növekszik. Azon eshetőség tanulmányozására, miszerint a 7B2 hősokk-fehérje, Xeopus laevis béka hipofízisének melanotróp sejtjeit ezen sejtek normál inkubációs hőmérsékletén (21 °C) inkubáljuk és ugyanezen mennyiségű sejtet inkubálunk 30 °C-on (hősokk) egy órán keresztül, PH]-lizin jelenlétében is. A termelt POMC mennyisége körülbelül ugyanakkora mindkét sejtben, míg a hősokk-sejtekben lényegesen több (kb. ötszörös mennyiségű) 7B2 termelődik; a termelt 7B2-t 7B2-ellenes monoklonális antitestekkel vizsgáljuk. Ez azt mutatja, hogy a 7B2 valóban hősokk-fehéije.

Egy ismert szintézis technológia segítségével a 7B2 mRNS (vagyis 7B2 antisense oligonukleotid) fehérjekódoló részének nukleotid szekvenciája ellen irányuló szintetikus egyszálú DNS részeit állítjuk elő. Ezek az antisense ohgonukleotidok alkalmazhatók a 7B2 mRNS 7B2-vé való transzlációjának blokkolására a sejtben: mivel az antisense ohgonukleotidok kötődnek az mRNS-hez, a fehérje nem olvasható le, vagy az RNS-t a sejten belül speciális RNS-ázok elbontják. Ezért a 7B2 termelése ilyetén blokkolásának hatása a biológiailag aktív vegyületekre tanulmányozható. Ezek a kísérletek hasonló módon kiteljeszthetők a 7B2 antisense oligonukleotidokkal kezelt AtT20 sejtekre is.

• · · · · · ·· · · 4 · · « • · ·· ·· ·· • · · ···· ·· · • · · · · · · ·· · · · · ·· ··* · ·

Szekvencia lista

SEQ ED No. 1

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 26 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: részleges humán genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: 9-26 pozíció: a humán 7B2 1-6 aminosavai jelző szekvenciájának sense szála; 3-9 pozíció: Eco Rí hely

ATGAATTCAT GCTATCTGGC CTACTG 26

SEQ ED No.2

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 26 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: részben humán genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: 12-26 pozíció: a humán 7B2 kódoló szekvenciájának antisense szála; 3-8 pozíció:

Sphlhely; 9-11 pozíció: stop kodon

TAGCATGCTT ACTCTGGATC CTTATC 26

SEQ ED No.3

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 54 bázis

Száltípus: kettős

Topológia: lineáris

Közvetlen kísérleti forrás: PEC7B2

Jellemzők: a humán 7B2 gén által kódolt 18 aminosavas jelző peptid

ATG CTA TCT GGC CTA CTG TTT TGG CTG GCA TCT GGA36

Met Leu Ser Gly Leu Leu Phe Trp Leu Alá Ser Gly

510

TGG ACT CCA GCA TTT GCT

Trp Thr Pro Alá Phe Alá

SEQ ID No.4

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 558 bázis

Száltípus: kettős

Topológia: lineáris

Közvetlen kísérleti forrás: PEC7B2

Jellemzők: 185 aminosavas humán 7B2

TAC AGC

CCC Pro

CGG ACC CCT Arg Thr Pro 5

GAC Asp

CGG GTC

TCA GAA GCA

36

Tyr

Ser

Arg

Val

Ser 10

Glu

Alá

GAT

ATC

CAG

AGG

CTG

CTT

CAT

GGT

GTT

ATG

GAG

CAA

72

Asp

Ile

Gin

Arg

Leu

His

Gly

Val

Met

Glu

Gin

15

20

TTG

GGC

ATT

GCC

AGG

CCC

CGA

GTG

GAA

TAT

CCA

GCT

108

Leu

Gly

Ile

Alá

Arg

Pro

Arg

Val

Glu

Tyr

Pro

Alá

25

-

30

35

CAC

CAG

GCC

ATG

AAT

CTT

GTG

GGC

CCC

CAG

AGC

ATT

144

His

Gin

Alá

Met

Asn

Leu

Val

Gly

Pro

Gin

Ser

Ile

40

45

GAA Glu

GGT Gly 50

GGA GCT

CAT His

GAA Glu

GGA Gly 55

CTT Leu

CAG Gin

CAT His

TTG Leu

GGT Gly 60

180

Gly

Alá

CCT

TTT

GGC

AAC

ATC

CCC

AAC

ATC

GTG

GCA

GAG

TTG

216

Pro

Phe

Gly

Asn

Ile

Pro

Asn

Ile

Val

Alá

Glu

Leu

70

ACT Thr	GGA Gly	GAC Asp 75	AAC Asn	ATT Ile	CCT Pro	AAG GAC	TTT Phe	AGT Ser	GAG Glu	GAT Asp
Lys	Asp 80
CAG	GGG	TAC	CCA	GAC	CCT	CCA	AAT	CCC	TGT	CCT	GTT
Gin	Gly	Tyr	Pro	Asp	Pro	Pro	Asn	Pro	Cys	Pro	Val
85					90					95

252

288 • ·

• · * · · « ·· ···· ·· ··· · ·

GGA AAA ACA GAT

GAT Asp

GGA Gly

TGT Cys

CTA GAA AAC ACC CCT

324

Gly

Lys

Thr

Asp 100

Leu

Glu 105

Asn

Thr Pro

GAC

ACT

GCA

GAG

TTC

AGT

CGA

GAG

TTC

CAG

TTG

CAC

360

Asp

Thr

Alá

Glu

Phe

Ser

Arg

Glu

Phe

Gin

Leu

His

110

115

120

CAG

CAT

CTC

TTT

GAT

CCG

GAA

CAT

GAC

TAT

CCA

GGC

396

Gin

His

Leu

Phe

Asp

Pro

Glu

His

Asp

Tyr

Pro

Gly

125

130

TTG

GGC

AAG

TGG

AAC

AAG

AAA

CTC

CTT

TAC

GAG

AAG

432

Leu

Gly

Lys

Trp

Asn

Lys

Leu

Tyr

Glu

Lys

135

140

ATG

AAG

GGA

GAG

AGA

CGA

AAG

CGG

AGG

AGT

GTC

468

Met

Lys

Gly

Glu

Arg

Lys

Arg

Ser

Val

145

150

155

AAT

CCA

TAT

CTA

CAA

GGA

CAG

AGA

CTG

GAT

AAT

GTT

504

Asn

Pro

Tyr

Leu

Gin

Gly

Gin

Arg

Leu

Asp

Asn

Val

160

165

GTT

GCA

AAG

TCT

GTC

CCC

CAT

TTT

TCA

GAT

GAG

540

Val

Alá

Lys

Ser

Val

Pro

His

Phe

Ser

Asp

Glu

170

175

180

GAT

AAG

GAT

CCA

GAG

TAA

558

Asp

Lys

Asp

Pro

Glu

185

SEQ ID No. 5 Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 29 bázis

V ·

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: részben humán genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: 12-29 pozíció: a humán 7B2 kódoló szekvenciájának antisense szála; 3-8 pozíció:

Sphl hely; 9-11 pozíció: stop kodon

TAGCATGCTT AGTTCCACTT GCCCAAGCC 29

SEQ ED No.6

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 29 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: részben humán genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Hindin hely; 9-11 pozíció: stop kodon ataagctttt actctcctcc cttcatctt ♦ · · · • «

SEQ Π) No. 7

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 29 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: részben humán genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

HindUI hely; 9-11 pozíció: stop kodon

ATAAGCTTTT ATGCAACAAC ATTATCCAG

SEQ ID No. 8

Szekvencia típusa: DNS a hozzátartozó pepiiddel

Szekvencia hosszúsága: 69 bázis

Száltípus: kettős

Topológia: lineáris

Eredeti kísérleti forrás: pUC19/BamHI-XhoI/GAPDH-IT

Jellemzők: 77-63 pozíció: élesztő SUC2 gén által kódolt 19 aminosavas jelző peptid kódoló régiója; 1-6 pozíció: EcoRI hely; 64-69 pozíció: Xhol hely • · · · · ···· • · · · · · • · · ··« • · · 4 ·

GAATTC	ATG	CTT	TTG	CAA	GCT	TTC	CTT	TTC	CTT	TTG	36
	Met	Leu	Leu	Gin	Ala	Phe	Leu	Phe	Leu	Leu
					5					10
GCT GGT	TTT	GCA	GCC	AAA	ATA	TCT	GCA	CTCGAG		63
Ala Gly	Phe	Ala	Ala	Lys	Ile	Ser	Ala

SEQ ID No.9

Szekvencia típusa: DNS a hozzátartozó peptiddel

Szekvencia hosszúsága: 36 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: S.cerevisiae és humán genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: 1-18 pozíció: a S.cerevisiae SUC2 génje (Alal4-Alal9) jelző peptidjének sense szála

GCA GCC AAA ATA TCT GCA. TAC AGC CCC CGG ACC CCT 36

Ala Ala Lys Ile Ser Ala Tyr Ser Pro Arg Thr Pro ' 5 10

SEQ ID No. 10

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 20 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris ···· ♦· ·· ·«·· ·· • · · · · · · • · · ···« ··

- _ ······ ' · · .... .· ... ..

Forrás: humán genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: a humán 7B2 kódoló régiójának antisense szála

ATGAGCTCCA CCTTCAATGC 20

SEQIDNo.il

Szekvencia típusa: DNS a hozzátartozó pepiiddel

Szekvencia hosszúsága: 21 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: részben S.cerevisiae genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: 9-20 pozíció: a jelző peptid 1-4 aminosavaihoz tartozó S.cerevisiae SUC2 jelző peptidjének sense szála

TAGAATTC ATG CTT TTG CAA G 21

Met Leu Leu Gin

SEQ ED No. 12

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 30 bázis

Száltípus: egyes * · • ··« ·· · • · · · · ♦··· ·· ··· ··

Topológia: lineáris

Forrás: élesztő genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: 11-30 pozíció: a S.cerevísiae CYP1 gén promoter régiójának 5' vége; 5-10 pozíció:

BamHI hely

ATATGGATCC TCTAGAACCT TTCATCATCT 30

SEQ ED No. 13

Szekvencia típusa: DNS

Szekvencia hosszúsága: 30 bázis

Száltípus: egyes

Topológia: lineáris

Forrás: élesztő genom DNS

Közvetlen kísérleti forrás: szintetikus

Jellemzők: 11-30 pozíció: a S.cerevísiae CYP1 gén promoter régiójának 3' vége; 5-10 pozíció:

Claims

1. Eljárás fehéije előállítására azzal jellemezve, hogy a fehéijét in vivő vagy in vitro 7B2-vel kezeljük.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás fehéije előállítására valamely bioaktív fehéije vagy prekurzor aminosavszekvenciájával bíró polipeptidet kódoló genetikai információval transzformált, és ezt a polipeptidet vagy prekurzort kifejezni képes gazdasejt segítségével azzal jellemezve, hogy a sejtet transzformáljuk további olyab genetikai információval is, amely lehetővé teszi, hogy 7B2 fejeződjék ki az említett polipeptiddel vagy prekurzorral együtt, és a polipeptidet vagy prekurzort in vivő úgy kezeljük, hogy a polipeptid vagy prekurzor dezaggregációját vagy helyes hajtogatását elősegítsük, vagy úgy, hogy a polipeptid vagy prekurzor kívánt esetben a sejt kiválasztásra késztetése után, kiválasztódjék.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy eukarióta gazdasejtet alkalmazunk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan eukarióta sejtet alkalmazunk, amely szabályozott fehéijeszállítási és kiválasztási útvonallal rendelkezik.

5. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a polipeptidet vagy prekurzort in vivő úgy kezeljük, hogy a polipeptid, kívánt esetben azután, hogy a sejtet kibocsátásra késztettük, kiválasztódjék.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a prekurzort olyan módon fejezzük ki, és kezeljük, hogy a kiválasztott polipeptid bioaktív fehéije legyen.

7. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy neuronális vagy endokrin sejtet alkalmazunk.

8. A 3. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztősejtet alkalmazunk.

·· * ···

9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sejtet olyan DNS szekvenciával transzformáljuk, amely képes egy bioaktív fehéije aminosav szekvenciájával rendelkező polipeptidet kifejezni.

10. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a bioaktív fehéije aminosav szekvenciájával rendelkező polipeptidet kiválasztjuk.

11. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a bioaktív fehéije az IGF-1.

12. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a bioaktív fehéije peptid hormon, neuropeptid, növekedési faktor vagy koagulációs faktor.

13. A 12. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a bioaktív fehéije valamely peptid hormon vagy neuropeptid.

14. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a 7B2 humán 7B2.

15. Az 1. igénypont szerinti eljárás a fehéije dezaggregációjára vagy aggregációjának megakadályozására in vitro, azzal jellemezve, hogy a fehéijét vagy aggregátumait 7B2-vel kezeljük.

16. Transzformált gazdasejt, amely valamely bioaktív fehéije vagy prekurzora aminosavszekvenciájával bíró polipeptidet kódoló genetikai információval van ellátva, és képes kifejezni ezt a polipeptidet vagy prekurzort azzal jellemezve, hogy a sejt transzformálva van továbbá olyan genetikai információval is, amely lehetővé teszi, hogy 7B2 fejeződjék ki az említett polipeptiddel vagy prekurzorral együtt, és a polipeptid vagy prekurzor úgy legyen kezelhető in vivő, hogy a polipeptid vagy prekurzor, kívánt esetben a sejt kiválasztásra késztetése után, kiválasztódjék.

17. A 16. igénypont szerinti transzformált sejt azzal jellemezve, hogy a sejt eukarióta sejt.

18. A 17. igénypont szerinti transzformált sejt azzal jellemezve, hogy a sejt eukarióta sejt, amely szabályozott fehéijeszáilítási és kiválasztási útvonallal rendelkezik.

• ·

19. A 17. igénypont szerinti transzformált sejt azzal jellemezve, hogy a sejt élesztősejt.

20. A 16. igénypont szerinti transzformált sejt azzal jellemezve, hogy a sejtet olyan genetikai információval van transzformálva, amely képessé teszi, hogy humán 7B2-t fejezzen ki.

21. A 16. igénypont szerinti transzformált sejt azzal jellemezve, hogy a bioaktív fehérje valamely peptid hormon, neuropeptid, növekedési faktor vagy koagulációs faktor.

22. A 21. igénypont szerinti transzformált sejt azzal jellemezve, hogy a bioaktív fehérje valamely peptid hormon vagy neuropeptid.

23. A 16. igénypont szerinti transzformált sejt azzal jellemezve, hogy a bioaktív fehérje az IGF1.

24. Eljárás 7B2 transzformált sejtben való előállítására azzal jellemezve, hogy a 7B2-t kódoló genetikai információval transzformált gazdasejtet tenyésztünk.