HUT65851A - Organic coumpouds againts pathogens - Google Patents

Description

PATOGÉNEK ELLENI SZERVES VEGYÜLETEK

Max-Planck-Gesellschaft zűr Förderung dér Wissenschaften,

Göttingen, Német Szövetségi Köztársaság

Feltalálók:

LOGEMANN Susanna, Köln

SCHELL Josef Stefan, Köln

Német Szövetségi Köztársaság

A bejelentés napja: 1992. 07. 06.

Elsőbbsége: 1991. 07. 19. (9115669)

Nagy-Britannia

A találmány patogének széles köre ellen aktivitást mutató proteinekre, különösen növénypatogének leküzdésére alkalmas proteinekre vonatkozik.

75338-2703-GI

Ismeretes, hogy Ustilago maydis vírus egyes törzsei olyan proteineket választanak ki, amelyek halálosak az U. maydis érzékeny törzseire. Ezeket a proteineket az U. maydis kettősszálú RNS (dsRNS) vírusok meghatározott szegmensei kódolják. Eddig úgy hitték, hogy ezek a proteinek csak egyes üszöggombákra, azaz Ustilaginales gombákra toxikusak. így ismeretes, hogy bizonyos U. avenae, U. pullata, U. hordei, U. kolleri, U. nuda, U. sphaerogena, U. striiformis, U. tritici és Sorosporium consanguineum törzsek érzékenyek az U. maydis P4 vírus (UmVP4) által kódolt proteinre (P4-re).

Meglepő módon úgy találtuk, hogy a P4 protein, annak származékai és részei számos patogén ellen - beleértve az állati, humán és növénypatogéneket - értékes aktivitással rendelkezik.

A találmány tehát olyan proteinekre volnatkozik, amelyek az 1. szekvencia-ábrán bemutatott szekvencia 15-96. helyzetében levő aminosavakat tartalmazzák, illetve ezek változatait, amelyek egy vagy több aminosav hozzáadásával, cseréjével és/vagy kiiktatásával jönnek létre.

Az 1. szekvencia-ábrán olyan peptidet mutatunk be, amely 96 aminosav hosszúságú, és amelynek a karboxiterminálisa: Glu-Gly-Ser. Egy olyan cDNS klón manuális szekvenciaelemzése alapján, amely azt mutatta, hogy az ORF egy 96 aminosav hosszúságú proteint kódol (lásd a 2. szekvencia-ábra cDNS szekvenciáját) feltételeztük, hogy az 1. szekvencia-ábrán bemutatott peptidszekvencia az usztilin korrekt szekvenciája. Az ORF manuális elemzésének szekvenálóberendezéssel végzett ellenőrzésekor úgy találtuk, hogy az ORF egy 106

aminosav hosszúságú proteint kódol (lásd a 3. szekvencia-ábrát) . Ezt a korrigált szekvenciát azután igazoltuk. Az ellentmondás a manuális elemzés során végzett olvasáskor bekövetkezett hiba következménye volt, ahol a 2. szekvencia-ábrán levő 278. és 279. helyzetben levő C nukleotidokat hibásan kettős C-nek olvasták. A szekvenátorral végzett elemzéssel a nukleotidok C tripletnek adódtak, ahogyan a 4. szekvencia-ábra 288., 289. és 290. helyén látható.

A nukleotid-szekvencia olvasásának ilyen ellentmondása alapján azonban mérlegelendő, hogy a protein aktivitására nézve végzett vizsgálatok eredményére ne támaszkodjunk. Feltételezzük, hogy az 1. szekvencia-ábrán bemutatott szekvenciával rendelkező protein a természetes, a

3. szekvencia-ábrán bemutaott szekvenciával rendelkező proteinhez hasonló aktivitással rendelkezik.

így az 1.

szekvencia-ábrán bemutatott peptid egy előnyös módosítása esetén az 1. szekvencia-ábra 15-93. aminosav-helyzetében levő, előnyösen az 1-93. aminosav-helyzetében levő aminosav-szekvenciát módosítjuk, éspedig egy vagy több aminosavat hozzáadunk, kicserélünk és/vagy kiiktatunk.

Az 1. szekvencia-ábrán bemutatott protein egy további módosítása egy olyan proteint eredményez, amely a 3. szekvencia-ábra 16-106. aminosav-helyzetében levő, előnyösen 1-106. aminosav-helyzetében levő aminosavakat tartalmazza.

A fenti aminosav-szekvenciák (a továbbiakban a találmány szerinti proteinek) előállítása és azok módosítása ismert módon elvégezhető.

A találmány szerinti proteinek értékes, patogének »

·«· elleni, beleértve az állatok, ember és növények patogénjeit, különösen gombák elleni aktivitással rendelkeznek.

Az ilyen módosított szekvenciák előnyösen az 1. szekvencia-ábra 1-96. aminosav-helyzetében levő, előnyösen a

3. szekvencia-ábra 16-106. aminosav-helyzetében levő, még előnyösebben a 3. szekvencia-ábra 1-106. aminosav-helyzetében levő aminosavakat tartalmazó aminosav-szekvencia funkcionális ekvivalense. Ide értendők az 1. szekvencia-ábra 1. vagy 15. aminosav-helyzetétől a 93. aminosav-helyzetéig terjedő és a 3. szekvencia-ábra 1. vagy 16. aminosav-helyzetétől a 106. aminosav-helyzetéig terjedő aminosav-szekvencia funkcionálisan ekvivalens variánsai. A találmány szerinti proteinek szekvenciája előnyösen homológiát mutat az 1. szekvencia-ábra 15-93. aminosav-helyzetében levő és/vagy a 3. szekvencia-ábra 1-106. vagy 16-106. aminosav-helyzetében levő aminosav-szekvenciával rendelkező proteinével. Homológ aminosav-szekvencián olyan szekvenciát értünk, amelyhez egy vagy több aminosavat hozzáadtunk, kicseréltünk vagy kiiktattunk belőle. A találmány szerinti megoldás egy előnyös megvalósítási módja szerint a módosított szekvencia legalább 70 % homológiát mutat az 1. szekvencia-ábrán bemutatott, 15-96. aminosav-helyzetekben levő szekvenciával rendelkező protein szekvenciájával. A találmány szerinti megoldás egy másik előnyös megvalósítási módja szerint a módosított szekvencia legalább 70 % homológiát mutat az 1. szekvencia-ábrán bemutatott, 15-93. aminosav-helyzetekben levő szekvenciával rendelkező protein szekvenciájával. A találmány szerinti megoldás egy további előnyös megvalósítási módja szerint a módo * · ·· · • · * * · • ··· · · • · · · • · · · · · · sított szekvencia legalább 70 % homológiát mutat a 3. szekvencia-ábrán bemutatott, 1-106. aminosav-helyzetekben levő szekvenciával rendelkező protein szekvenciájával. A találmány szerinti megoldás egy további előnyös megvalósítási módja szerint a módosított szekvencia legalább 70 % homológiát mutat a 3. szekvencia-ábrán bemutatott, 16-106. aminosav-helyzetekben levő szekvenciával rendelkező protein szekvenciájával. A módosított szekvenciák a találmány szerinti proteinekkel előnyösen legalább 80 %, még előnyösebben legalább 90 % homológiát mutatnak.

A találmány szerinti megoldás fent bemutatott megvalósítási módja olyan proteinre vonatkozik, amely az N-terminálisán egy az 1. szekvencia-ábrán bemutatott, 1-14. aminosav-helyzetekben levő aminosav-szekvenciával rendelkező, kapcsolódó oligopeptidet vagy annak egy módosított változatát tartalmazza, amelyhez egy vagy több aminosavat hozzáadtunk, kicseréltünk és/vagy kiiktattunk.

Az oligopeptid módosított változatai előnyösen az 1. szekvencia-ábra 1-14. aminosav-helyzetében levő szekvencia vagy a 3. szekvencia-ábra 1-15. aminosav-helyzetében levő szekvencia funkcionálisan ekvivalens változatai.

Az oligopeptidek előnyösen homológiát mutat az 1. szekvencia-ábra 1-14. aminosav-helyzetében levő és/vagy a 3. szekvencia-ábra 1-15. aminosav-helyzetében levő aminosavszekvenciával rendelkező oligopeptidével. A módosított szekvenciák előnyösen legalább 70 %, előnyösebben legalább 80 %, még előnyösebben 90 % homológiát mutatnak az 1. szekvenciaábra 1-14. aminosav-helyzetében levő és/vagy a 3. szekven6 ·· * · Λ « · • · ··· « » ·♦· ··*· ·· * *»· cia-ábra 1-15. aminosav-helyzetében levő aminosav-szekvenciával rendelkező oligopeptidével.

A találmány tárgya továbbá eljárás patogének leküzdésére, amelynek során a patogénre vagy annak megjelenési formájára a találmány szerinti protein patogének ellen hatásos mennyiségét alkalmazzuk.

A találmány szerinti megoldás egy megvalósítási módja a növények patogénjei, különösen gombák leküzdésére szolgáló eljárás, ami abban áll, hogy a növényi patogénre vagy annak megjelenési formájára a találmány szerinti protein patogének ellen hatásos mennyiségét alkalmazzuk.

A találmány szerinti proteinre érzékeny növényi patogének az Ustilaginales csoportba tartozó gombák mellett az Oomycetes osztályba tartozó gombák, különösen a Peronosporák, mint például a Bremia, Pythium, Phythophtora, Peronospora fajok; a Deuteromycetes osztályba tartozó gombák, mint például a Rhizoctonia, Phoma, Fusarium, Botrytis, Verticillium, Didymella, Cryptocline és Alternaria fajok; rozsdagombák, például az Uredinales; a Basidiomycetes osztályba tartozó gombák, mint például a Puccinia fajok; valamint bakteriális növényi patogének, beleértve a Pseudomonadaceae családba tartozó baktériumokat, mint például a Xanthomonas fajokat.

A találmány szerinti eljárás alkalmazható kétszikű növényekre, például káposztára, sárgarépára, paradicsomra, borsra, uborkára, spenótra, zöldsalátára és dohányra, valamint egyszikűekre, mint például gabonára, kukoricára, póréhagymára és hagymára stb-re.

A találmány szerinti proteinek ismert módon alkalmazhatók. Növényi patogének ellen például a találmány szerinti protein olyan peszticid kompozíció formájában alkalmazható, amely a találmány szerinti, patogén elleni proteint a patogének ellen hatásos mennyiségben tartalmazza mezőgazdaságilag elfogadható vivőanyag mellett. Az ilyen kompozíciók kívánt esetben további segédanyagokat, például tapadásjavító anyagokat stb-t is tartalmazhatnak.

Az ilyen peszticidek ismert módon állíthatók elő, például úgy, hogy a találmány szerinti izolált proteint alkalmazzuk hatóanyagként. Ha protein izolátumot alkalmazunk, a proteint előnyösen lényegében véve tiszta formában alkalmazzuk.

A vivőanyag kifejezésen folyékony vagy szilárd anyagot értünk, amelyet azért adunk a proteinhez, hogy azt alkalmazható vagy előnyösebben alkalmazható formába hozzuk, ami nem befolyásolja hátrányosan a hatóanyagot. Előnyös vivőanyagok például a víz, xilol, talkum, kaolin, diatomaföld, stabilizálószerek, például pufferek, a proteinek és a kezelendő növény közötti kontaktust elősegítő felületaktív anyagok, UV-sugárzás ellen védő anyagok stb.

A permetezőszer formájában, például vízben diszpergálható koncentrátumok vagy nedvesíthető porok formájában használt készítmények nedvesítő és diszpergáló hatású felületaktív anyagokat, például formaldehid és naftalinszulfonátok kondenzációs termékét, alkil-aril-szulfonátot, ligninszulfonátot, hosszú szénláncú alkilszulfonátokat, etoxilezett alkil-fenolokat és etoxilezett zsíralkoholokat tártál mázhatnak. Különösen előnyös felületaktív anyag a Tween-80 és a Trixton-X-100.

A találmány szerinti proteinek széles pH-tartományban, például 4,0 és 9,0 pH-érték közötti tartományban stabilak, így a víz előnyös vivőanyag. Kívánt esetben azonban a kompozíció egy puffért is tartalmazhat, hogy a kompozíció pH-ját a kívánt értékhatáron belül tartsuk. E célra bármilyen puffer alkalmazható, amely kompatibilis a találmány szerinti proteinekkel és egyébként nem hat károsan a növényre. Előnyös pufferek például az 50 mmol/1 Tris-HCl, nátrium-szukcinát vagy nátrium-citrát stb.

A találmány szerinti proteinek mennyisége a kompozícióban rendszerint 1 ^g/ml és 500 /xg/ml közötti, azonban az alsó értéknél alacsonyabb mennyiség is alkalmazható, a használt proteintől, a kezelendő növénytől, a kezelés körülményeitől stb-től függően.

Ha a készítmény felületaktív anyagot is tartalmaz, ennek mennyisége rendszerint 0,001 és 20 tömeg% közötti, a szükséges mennyiséget szakember meg tudja határozni.

További hatóanyagok, például hasonló vagy komplementer aktivitást mutató peszticidek vagy más hasznos hatóanyagok, például inszekticidek szintén alkalmazhatók a találmány szerinti proteinekkel együtt annak érdekében, hogy a készítmény hatásspektrumát szélesítsük, illetve mezőgazdasági hasznosságát fokozzuk.

A találmány szerinti proteinek más növényi patogénleküzdő komponensekkel együtt is alkalmazhatók a kétszikű és egyszikű növényeken alkalmazható kompozíciókban. A növényi patogéneket leküzdő szerek különböző módon képesek hatni, így például oly módon, hogy gátolják a növényi patogén növekedését, gátolják a növényi patogénekben a biokémiai utak kulcsenzimeit, stb. A növényi patogének, amelyek ellen a találmány szerinti proteineket alkalmazzuk, tipikusan gombák, különösen azok, amelyeket a fentiekben felsoroltunk. A találmány szerinti proteinek a növényekre olyan kompozíciók formájában alkalmazhatók, amelyek egy- vagy többféle, növényi patogént leküzdő komponenst, például irtó hatású proteint tartalmaznak. így az alkalmazott kompozíció egyik komponensként tartalmazhat például egy P4 proteint vagy annak egy származékát szükség szerinti alkalmas adalékanyagokkal, segédanyagokkal és vivőanyagokkal együtt. Eljárhatunk úgy is, hogy két vagy több irtó'' proteint alkalmazunk a növényekre kompozíció formájában. Egy további lehetséges mód az, hogy először egy olyan első kompozíciót, amely egy irtó proteint tartalmaz, majd közvetlenül utána vagy egy megfelelő időtartam múlva egy olyan második kompozíciót alkalmazunk a növényekre, amely egy további irtó proteint tartalmaz. Ilyen módon irtó proteinek sora felváltva alkalmazható a növényekre. Alkalmas további irtó proteinek például a Pl, illetve P6 jelű - vagy más jelölés szerint KP1 és KP6 jelű - proteinek. Az ilyen további irtó proteinek ismertek a technika állása szerint: P6 proteint például Tao J. és munkatársai a Molecular and Cellular Biology (1990) 1373-1381. irodalmi helyen ismertetik. Előnyös az olyan kompozíció, amely P4 és P6 keverékét tartalmazza.

Eljárhatunk továbbá úgy is, hogy a növényi patogén leküzdő vagy irtó protein inaktív formájából alakítjuk ki a kompozíciót. A proteineket azután úgy aktiváljuk, hogy egy alkalmas további komponenst adagolunk, amely a proteineket aktív formájúvá alakítja. Az inaktív protein például preproprotein vagy pro-protein formában lehet jelen, amely alkalmas reagens, például megfelelő enzim hatására aktív formává alakul. Alkalmas enzimek például a hidrolázok, például a helyspecifikus proteázok stb. A kompozícióban jelen levő egyes proteinek relatív mennyisége nem kritikus. A proteinek jelen lehetnek egymáshoz viszonyított egyenlő arányban, a relatív mennyiség az alkalmazástól, a kezelendő növénytől, a kezelés körülményeitől stb-től függ.

A kompozícióban jelen levő protein mennyisége 1 Mg/ml és 500 /xg/ml közötti lehet, azonban ezen határokon kívül is lehet az alkalmazott irtó proteinek keverékétől, a kezelendő növénytől, a kezelés körülményeitől stb-től függően.

A fenti, találmány szerinti proteineket, vivőanyagot vagy más adalékanyagokat tartalmazó kompozíciókat azután a kezelendő növényre, magvakra vagy a növény növekedési helyére juttatjuk. A kompozíció kijuttatása történhet szakember számára ismert módon, például a növényre történő permetezéssel. A kompozíció alkalmazandó mennyisége függ attól, hogy mit kezelünk (azaz növényt, magvakat vagy talajt), a kezelés típusától (azaz permetezés, porozás vagy magcsávázás) , a kezelés céljától (megelőző vagy gyógyító), a kezelendő patogén típusától és az alkalmazás idejétől.

A találmány szerinti peszticid kompozíciókat patogé• ·

- 11 nek által megtámadott növényekre kívánatos módon 100-5000 1/ha mennyiségben alkalmazzuk. Sok növény esetén kívánatos lehet, hogy a kezelést szükség esetén néhány hét múlva megismételjük a növényen jelen levő patogénektől való kívánt védelem elérése érdekében. Ezenkívül megelőzés céljából a patogének támadására különösen érzékeny növények a patogén jelenlétének vagy a patogénnel való fertőzés tünetének első jele előtt permetezhetők vagy más módon kezelhetők a találmány szerinti kompozíciókkal.

A találmány szerinti proteineket tartalmazó kompozíciókat növényi patogének leküzdésére különösen olyan mezőgazdaságilag elfogadható sejtrendszerek formájában alkalmazhatjuk, amelyeket a találmány szerinti proteinek termelése érdekében transzforrnáltunk vagy transzfektáltunk. Alkalmas gazdasejtek például az élesztők, baktériumok, például a Bacillus fajok, mint pl. a Bacillus thüringiensis, B. cereus, B. subtilis és a Pseudomonas fajok, mint pl. a Pseudomonas fluorescens, E. coli, valamint a növényi sejtek.

Az ilyen transzformált vagy transzfektált gazdasejtek előnyösen szokásos fermentációs módszerekkel alkalmas tápanyagokat tartalmazó közegeken növeszthetők.

Az ilyen sejtek alkalmas szuszpenzióját elkészíthetjük oly módon, hogy a fermentlevet kívánt koncentrációra bepároljuk. Kívánt esetben adalékanyagokat is adhatunk hozzá.

Hasonlóképpen nedvesíthető porokat úgy állíthatunk elő, hogy a fermentlevet, amely tartalmazhat például emulgeálószereket, UV-sugárzás ellen védő komponenseket stb-t, permetezve szárítjuk, és a kapott szilárd terméket poritjuk.

Az így kapott készítmények a tápközeg komponenseinek egy részét vivőanyagként tartalmazzák.

Eljárhatunk úgy is, hogy a fermentlé centrifugálásával a tápközeg nagyobb részecskéit elválasztjuk, majd a fenti módon alkalmas szuszpenzió-koncentrátum vagy nedvesíthető por készítménnyé alakítjuk. Az alkalmas készítmények milligrammonként vagy milliliterenként általában 1x10 - 1x10 CFUt tartalmaznak.

A találmány szerinti proteinek rekombináns DNS technikával állíthatók elő.

A találmány tehát továbbá olyan rekombináns DNS molekulákra vonatkozik, amelyek a találmány szerinti proteint kódoló DNS-szekvenciákat tartalmaznak. Az 1. szekvencia-ábrán bemutatott 15-96. aminosav-helyeken levő aminosav-szekvenciát kódoló DNS molekula egy példáját a 2. szekvencia-ábrán mutatjuk be. A 4. szekvencia-ábra olyan DNS molekulát mutat be, amely a 3. szekvencia-ábrán bemutatott 16-106., valamint 1-106. aminosav-helyeken levő aminosav-szekvenciát kódolja. A genetikai kód degeneráltsága miatt a 2. és 4. szekvencia-ábra legtöbb, egy bizonyos aminosavat kódoló tripletje más, ugyanazt az aminosavat kódoló tripletekre cserélhető anélkül, hogy ez a DNS molekula által kódolt protein szekvenciáját érintené. így például látható, hogy a 4. szekvencia-ábra első tizennégy tripletje más, mint a 2. szekvencia-ábra első tizennégy tripletje, a nukleotid tripletekben jelentkező különbség azonban nem okoz eltérést az 1-96., illetve 1-93. aminosavat tartalmazó protein aminosavaiban, amint ezt az 1. szekvencia-ábrán bemutatjuk.

A találmány szerinti proteint kódoló DNS-szekvenciákat a továbbiakban a találmány szerinti rekombináns DNSszekvenciáknak nevezzük. A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciák szokásos, gazdasejtek - például mikroorganizmusok, pl. E. coli vagy B. subtilis - transzfomálására vagy transzfektálására szolgáló módszerekkel egy vektorba bevihetők, hogy a találmány szerinti proteineket használható mennyiségben termeljük. A vektor kifejezésen olyan vivőanyagot értünk, amelynek segítségével DNS fragmentumok gazdaszervezetbe vihetők be. A találmány szerinti rekombináns DNS molekulák növényi genomba is bevihetők, hogy így csökkentsük az illető növény növényi patogénekkel szembeni érzékenységét .

A találmány tehát olyan rekombináns DNS molekulákra is vonatkozik, amelyek a találmány szerinti rekombináns DNS szekvenciákat tartalmazzák működőképesen kapcsolva Olyan szabályozó szekvenciához (azaz promoterhez) , amely a gazdasejtben történő átírását szabályozza, továbbá kívánt esetben egy terminátor szekvenciához.

A promoter kifejezésen olyan nukleotid-szekvenciát értünk, amely a transzkripciós starthelytől felfelé helyezkedik el, és tartalmazza az expresszióhoz szükséges összes szabályozó szekvenciát, beleértve az mRNS vezető szekvenciáját kódoló területet is. A vezető szekvencia tartalmazza a riboszóma kötőhelyeket, és a transzlációt az AUG startkodonnál indítja. Promoterek ismertek a technika állása szerint.

A klónozó módszerek szintén ismertek, illetve ismert módszerek adaptálhatók. A találmány szerinti proteineket kó doló szekvenciákat tartalmazó DNS-t megfelelő regulátor szekvenciák szabályozása alatt plazmidokba építjük be, és így olyan vektorokat kapunk, amelyeket sejtekbe transzformálunk vagy transzfektálunk, így a transzformált vagy transzfektált sejtet képessé tesszük arra, hogy a proteineket termelje. A DNS adott esetben más szignál-szekvenciákat is tartalmazhat, amelyek a protein expressziós termék kifejeződését a sejt különböző alkotóelemeinél vagy extracellulárisan teszik lehetővé. A DNS tipikusan egy olyan rekombináns DNS molekula, amely egy első DNS-szekvenciát tartalmaz, amely egy második, kapcsolódó DNS-szekvencia átíródását segíti elő, ahol ez a második DNS-szekvencia a találmány szerinti proteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz. A rekombináns DNS molekula előnyösen egy olyan aminosav-szekvenciát kódol, amelynek a szekvenciája lényegében véve homológ a találmány szerinti protein fent ismertetett szekvenciájával. A homológra mértéke előnyösen 70 %, előnyösen legalább 80 %, még előnyösebben legalább 90 %. Az ilyen rekombináns DNS molekulák tipikusan azok, amelyek a találmány szerinti protein aminosav-szekvenciájával rendelkező proteint kódolják, ahol az N-terminális aminosav egy olyan oligopeptidhez kapcsolódik, amelynek a szekvenciája az 1. szekvencia-ábrán bemutatott 1-14. aminosav-helyeken levő vagy a 3. szekvencia-ábrán bemutatott 1-15. aminosav-helyeken levő aminosav-szekvenciával vagy ezek módosított változatával rendelkezik.

A proteinek előállítását a találmány értelmében úgy végezzük, hogy egy gazdaszervezetet egy olyan vektorral transzformálunk vagy transzfektálunk, amely egy a találmány ♦ ·

- 15 szerinti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz, majd a transzformált vagy transzfektált gazdasejtet tenyésztjük, hogy a proteint termelje. Számos transzformált, illetve transzfektált sejtrendszert lehet használni, azonban előnyösen általában Gram-negatív vagy Gram-pozitív típusú bakteriális sejteket transzforrnálünk vagy transzfektálunk.Egy előnyös Gram-negatív baktérium az E. coli, amellyel a biotechnológiában már jelentős gyakorlati tapasztalatokat értek el, és amelyhez számos alkalmas és működőképes plazmid és transzfer vektor ismert és hozzáférhető. Egy másik Gram-negatív baktérium, amelybe proteint kódoló szekvenciát hordozó plazmidot vittek be, a Pseudomonas fluorescens. További alkalmas gazdasejtek a Bacillus thüringiensis (B.t.), B. cereus és a B. subtilis. E. coli transzformálására alkalmazható tipikus promoterek a Ptac, ^ptrp, ^ptrc és a Ρχ. Ezek mind beszerezhetők a Pharmacia cégtől. A találmány szerinti proteinek a transzformált vagy transzfektált sejtekből vagy azok tenyészközegéből ismert módon izolálhatok és szokásos módszerekkel tisztíthatok.

A találmány szerinti DNS-szekvenciák olyan növények genomjába is beépíthetők, amelyek érzékenyek patogénekre. E célra bármely alkalmas módszer használható, így például Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidja segítségével, elektroporációval, elektrotranszformációval, ballisztikus belövéssel, mikroinjektálással, vírussal vagy olyan vegyszerekkel, amelyek a szabad DNS felvételét indukálják vagy fokozzák. Szakember számára az ilyen módszerek és ezen növények transzformálására való alkalmazása jól ismert. A találmány

szerinti proteineket kódoló DNS-szekvencia előnyösen működőképesen kapcsolódik alkalmas szabályozó szekvenciákhoz, például 5' promoter és 3' regulátor (terminátor) szekvenciákhoz és szignál szekvenciákhoz az intracelluláris vagy extracelluláris célbajuttatáshoz, amelyek növényekben működőképesek, és az egészet egy vektorba iktatjuk be. A promoter a DNS-t konstitutív vagy differenciális módon fejezheti ki. A DNS expresszióját differenciálisán szabályozó promoterek például azok, amelyek betegség vektorokkal, például úgy nevezett sebbel indukálhatok vagy ilyenek a patogénnel indukálható promoterek is. Konstitutív promoterek például a vírus promoterek, mint pl. a 35S-CaMV vagy annak módosulatai. A transzformált növényi sejtek, miután a teljes növényt regeneráltuk és kifejlesztettük belőlük, lehetővé teszik, hogy a DNS-szekvencia a növényi genomnak stabil és permanens részévé váljék, és az egyik generációról a következőre mitózis és mieózis útján jusson át, és az expresszió olyan proteint eredményezzen, amely öröklődő módon biztosítja, hogy a növény csökkent érzékenységet mutasson növényi patogének támadásával szemben.

A találmány tehát olyan transzgenikus szervezetekre is kiterjed, amelyek a találmány szerinti rekombináns DNS-t tartalmazzák.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük.

1. példa: P4 tisztítása * · · • *·

Az UmVP4-t minimál tápközegen (szervetlen sókat és cukrot tartalmazó tápközeg) növesztjük. A P4 proteint az UmVP4 preprotoxinként termeli és érett proteinként választja ki a tápközegbe. A P4-t úgy tisztítjuk, hogy a proteint tartalmazó 4 1 tápközeget 2 ultraszűréssel 100-200 ml-re koncentrálunk, majd anioncserének, kationcserének és méret szerinti frakcionálásnak vetjük alá.

Az anioncseréhez a koncentrátum pH-ját 50 mmol/l-es Trissel 8-ra állítjuk, és 10 g DE52-cellulózzal 3-4 óra hosszat keverjük. A szuszpenzió leszűrésével eltávolítjuk a port, a szűr letet ultraszűrjük, 12 óra hosszat 50 mmol/l-es nátrium-acetáttal szemben pH=4 értéknél dializáljuk, majd egy S-Sepharose oszlopon átnyomjuk. Az oszlopot 50 mmol/l-es nátrium-acetáttal pH=4 értéknél mossuk, majd kétszer 55 ml 50 mmol/1 NaCl-ben 0,2-0,6 mol/1 NaCl lineáris gradiensével eluáljuk. Az aktív frakciókat liofilizálással koncentráljuk, és vízzel szemben dializáljuk. A dializátumot 100 mmol/1 Trisben (pH=8) és 150 mmol/1 NaCl-ben Superdex 75 oszlopon méret szerint frakcionáljuk. Az így kapott, tisztított P4-t tartalmazó aktív frakció tisztasági adatai a következők:

kiindulási térfogat 41 bevitt K-egység* 7700 E = teljes protein 5mg

K-egység* kihozatal 400-500E = protein mennyisége 50M9

Mg P4/K-egység* 0,1 mű • ·· · · · • » 9 ·

K-egység/^g P4 10 E *K-egység: Levine és munkatársai [Nucleic Acids Research 6, 3717-3731 (1979)] szerint végzett biológiai vizsgálatban a gátló zónák kialakításához szükséges egység.

Ez a frakció használható nyulakban poliklonális antiszérum előállítására.

2. példa: dsRNS M2-szeqmens izolálása

Az UmVP4 M2-szegmense a P4 gént dsRNS formájában kódolja. Ügy izoláljuk, hogy a gombasejtet elroncsoljuk, és a vírusrészecskéket a sejtmentes extraktum NaCl/PEG kicsapásával koncentráljuk. Proteináz K-val végzett emésztés és fenolos kloroformos extrakció után a vírus genomot etanollal kicsapjuk és PAA gélen méret szerint frakciónáljuk, EtBr-rel megfestjük, és az M2-szegmenst kivágjuk. Az akrilamidról eluálva, majd ioncserélő kromatográfiás tisztítás után a dsRNS M2-szegmens alkalmas a cDNS szintézishez.

3. példa: cDNS

Az első cDNS kiónokat random primer alkalmazásával szintetizáljuk.

Mintegy 15 Mg random prímért összeolvasztunk 1-2 pg UmVP4 M2-szegmenssel, reverz transzkriptázzal kezeljük, és a második szálat RN-áz H/E. coli DNS-polimeráz módszerrel szintetizáljuk. Az így kapott, mintegy 200 bp hosszúságú rövid cDNS kiónokat E. coliba klónozzuk. A Northern biot vizsgálatban az UmVP4 genomhoz hibridizáló kiónokat szekvenál* « ·· « · 4 4 · • · · · · · « • · * · ♦ ♦••••·· ·· ·

- 19 rövid szekvenciáját képviselik.

Ezeket a szintetikus oligonukleotidokat M2-szegmensekkel olvasztjuk össze, amelyek új sorozat cDNS-hez szolgálnak fajlagos primerként a dsRNS denaturálása után, amit úgy végzünk, hogy 2 pg M2-szegmenst 10 μΐ víz, 4 p,g oligonukleotid és 100 μΐ DMSO jelenlétében 30 percig 65 °C-on hevítünk, majd kicsapjuk, centrifugáljuk és a csapadékot szárítjuk.

Az enzimhez alkalmas 4 μΐ 5x reakciópuffért (250 mmol/1 Tris, pH=8, 200 mmol/1 KC1 és 30 mmol/1 MgCl₂), 2 μΐ 0,1 mol/1 DTT-t, 1 μΐ 10 mmol/1 nukleotidokat, 0,5 μΐ Gene 32 proteint, 10 μΐ vizet és 1 μΐ MMLV Superscriptet (reverz transzkriptáz) összekeverünk és 38 °C-ra előmelegítünk.

Az előmelegített elegyet a csapadékhoz (amelyben nukleinsavak vannak oldva) adjuk, és az elegyet 38 °C-on 5 percig inkubáljuk. A hőmérsékletet ezután 3 percenként 1 °Ckal emeljük, amíg a 44 °C-ot el nem érjük.

Ezután a 30 percig 44 °C-on tartott elegyhez 0,5 μΐ MMLV-t adunk. Az így kapott cDNS első szálat PCR technikával további oligokat alkalmazva amplifikáljuk. A cDNS kiónok első és második sorozatának szekvencia-elemzése adja az érett P4 protein szekvencia adatait. Ezekből a cDNS kiónokból konstruáljuk a P4 gént és különböző, növényekben és mikroorganizmusokban való kifejezéshez alkalmas szabályozó szekvenciákhoz ligáljuk.

4. példa: P4-szekvencia

A P4 proteint tisztítjuk, és poliklonális antitestek

4. példa: P4-szekvencia

A P4 proteint tisztítjuk, és poliklonális antitestek előállításához használjuk. Ezen antitesteket a kapott szekvencia adatok faj lagosságának ellenőrzésére kétféleképpen használhatjuk.

1. A vélt P4 szekvenciákat bakteriális szabályozó szekvenciákhoz ligáljuk, így expressziós vektort kapunk. Western biot elemzéssel kimutatható, hogy a kifejezett bakteriális termékek a P4 elleni antitestekkel reagálnak. Olyan esetben, ha a P4 szekvencia vagy annak egy aktív része fejeződött ki, a bakteriális termék P4 aktivitással rendelkezik.

2. A 3. példa szerinti cDNS szekvenciát olyan vektorokhoz ligáljuk, amelyek in vitro transzkripciót tesznek lehetővé, és az in vitro RNS-t retikulocita lizátumba viszszük át. Ezek az in vitro transzlációs termékek, valamint az M2-szegmensek in vitro transzlációs termékei reagálnak az antitestekkel.

3. A P4 szekvencia úgy is meghatározható, hogy a tisztított P4 protein szekvenciáját határozzuk meg, és a kapott adatokat összevetjük az előzőleg kapott cDNS szekvenálási adatokkal.

5. példa: E. coli transzformálása

A 2. szekvencia-ábrán bemutatott DNS 43-288. szakaszáról készült cDNS-t pUC19 vektorba (a komplementer szálba) , majd egy BamHI restrikciós fragmensen keresztül a pEV-vrf vektorba klónozzuk, így kapjuk a pEV-2-18 jelű plazmidot. [Sokoldalú expressziós vektor klónozott géntermékek • · ·* · • ·♦ · · · » · · ·· • · · · * ·

5. szekvencia-ábra szerinti DNS cDNS szekvenciáját tartalmazza, alkalmas tápközegen tenyésztjük, centrifugáljuk, ultrahanggal kezeljük, és a sejtlizátumot in vitro tesztben Ustilago maydisra nézve agar tápközegen vizsgáljuk. A 6. szekvencia-ábra szerinti proteint taralmazó sejtlizátum fungicid aktivitást mutat.

6. példa: E. coli transzformálása

A 4. szekvencia-ábrán bemutatott DNS 53-282. szakaszáról készült cDNS-t pUC19 plazmidba klónozzuk, így kapjuk a pUC2-17 plazmidot (a komplementer szálban). A pUC83G PCR kiónt, amely a 4. szekvencia-ábra 174-330. DNS szakaszát tartalmazza, PCR kísérletekben képezzük. A 4. szekvenciaábra 53-282. DNS szakaszának cDNS-eit pEVvrf2-be klónozzuk egy BamHI restrikciós fragmensen keresztül, így kapjuk a pEV2—17 plazmidot. A 4. szekvencia-ábra 175-282. szakaszának megfelelő szekvenciákat eltávolítjuk a pEV2-17ből, és a 175-313. DNS-szakasszal helyettesítjük, amelyet a pUC83G-ből vágunk ki, így kapjuk a pEV2-19 plazmidot. A pEV2-19-t tartalmazó primer transzformánsok sejtlizátuma fungicid aktivitást mutat.

7. példa: E. coli transzformálása

A 3. szekvencia-ábra szerinti 2-15. aminosavaknak megfelelő DNS-szekvenciát és a 4. szekvencia-ábra 1-49. DNSszekvenciáját kikövetkeztetjük a protein N-terminálisának szekvencia adataiból, és pUC2-19-ben a 4. szekvencia-ábra szerinti 53-313. DNS szekvenciához adjuk. Párhuzamosan a • ·» ·* · «·· · · • · Λ · '· *·· «·«» *· · szekvencia adataiból, és pUC2-19-ben a 4. szekvencia-ábra szerinti 53-313. DNS szekvenciához adjuk. Párhuzamosan a 286-306. DNS szekvenciát (kivéve a 289. számút) nyolc további bázispárral együtt szokásos PCR módszerrel a Cvéghez adjuk. A kapott PCR termék tartalmazza a 4. szekvencia-ábra 1-306. DNS-szekvnciáját, és az 1-94., valamint további három aminosavakat kódol. Ezt a pET-llt vektorba, a Novagentől beszerezhető pET 11 d származékába klónozzuk, így kapjuk a pET2-31-t. A pET2-31-t tartalmazó transzformánsok sejtlizátuma fungicid aktivitással rendelkezik.

8. példa: E. coli transzformálása

A pUCQ kiónt szokásos PCR módszerrel pUC83G-ből képezzük. A pUCQ tartalmazza a 4. szekvencia-ábra szerinti 175-337. DNS-szekvenciát. pUCQ klónból való szekvenciákat pUC2-30-ba iktatunk be, és a pUC2-30 175-306. szekvenciáit cseréljük ki vele. így a pUC2-40-t kapjuk, amely a 4. szekvencia-ábra szerinti 1-337. szekvenciát tartalmazza. A pUC2-40-ből SphI-gyel kivágjuk a 8-337. szekvenciát és a pET llt-be iktatjuk be, így kapjuk a pET2-40-t. A pET2-40 a

4. szekvencia-ábra szerinti 1-106. aminosavakat kódolja.

9. példa: Az ustilin gén szubklónozása és növénybe való transzformálása

A pUC2-40X cDNS kiónt standard PCR reakciókörülmények között tartjuk. A primereket olyan farokkal látjuk el, hogy homológok legyenek a start- és stop-kodonokkal.

Ust-1 primer:

d (GCAGATATCATGCTTGGAATTAATTGCAGAGGG)

7. szekvencia-ábra

Ez egy EcoRV helyet eredményez rögtön a start kodon közelében, és az eljárásban a 4. szekvencia-ábra szerinti BamHI helyet nemvágható hellyé mutálja:

Ust-2 primer:

d (GCAACCTGCAGCTCAACACGAGTTTACG)

8. szekvencia-ábra

Ez egy PstI helyet eredményez a stop kodontól távol eső végen. Az ilyen primereket olyan standard PCR kísérletekben használjuk, amelyekben templátként a pUC2-40X használható. A kapott PCR fragmenst a gélről DEAE membránnal (NA-45, Schleicher és Schüll cégtől beszerezhető) izoláljuk és a Smal-gyel linearizált bluescriptbe klónozzuk, így kapjuk a pUST-2 plazmidot. Hozzáadott EcoRV és PstI restrikciós helyek megkönnyítik a további plazmidok konstruálását. Az ustilin gént EcoRV-PstI emésztéssel kivágjuk a pUST-2 plazmádból. A fragmenst izoláljuk és Smal-Pstl-gyel linearizált pZU-B-be iktatjuk Gielen J. J. L. és munkatársai módszerével [Bio/Technology 9, 1363-1367 (1991)], így kapjuk a pUST-2B rekombináns plazmidot. A 35S-omega promotert, ustilin gént és NOS terminátort tartalmazó kiméra kazettát BamHl-Xbal emésztéssel kivágjuk a pUST-2B plazmidból. Az izolált kiméra génkazettát a BamHI/Xbal emésztéssel linearizált pBIN19 ν · · · · · * * · · · midba iktatjuk, így kapjuk a pUST-2BB biner transzformációs vektort. A kapott pUST-2BB plazmidot növények transzformálására használjuk Horsch és munkatársai módszerével [Plánt Molecular Biology Manual Ά5, 1-9 (1988), Kluwes Academic

Publishers, Dordrecht, Hollandia].

Növényi patoqént leküzdő aktivitás

U. maydis tenyészközegét, amely a toxint termelő UmVP4 törzset tartalmazta, liofilizáltuk, és a következő patogénekkel vizsgáltuk agar tápközegen:

Phoma 1ingám

Alternaria brassicicola

Phytium violáé

Phytophthora porri

Xanthomonas carotae

Xanthomonas vesicatoria

Cryptocline cyclaminis

Alternaria dauci

Alternaria pluriseptata

Didymella lycopersici

Fusarium oxysporum conglutinans fysio 1

Botrytis aclada

Pythium ultimum

Verticillium lycopersici

Rhisoctonia solani

Puccinia porri peronospora farinosa f, sp. spinaceae

Xanthomonas maltophilia

Analóg vizsgálatokat végeztünk standardként steril tápközegen és U. maydis tenyészközegén, amely nem tartalmazott UmVP4 törzset.

A vizsgált tápközegek szabályozták a patogének növekedését, míg standardok nem gyakoroltak hatást a patogének növekedésére.

A gombakártevők elleni tesztet megismételtük a tisztított P4 protein vizes oldatával. A vizsgált protein fungicid aktivitását igazoltuk.

Peszticid kompozíciók

A példa

P4 protein

50 Mg/ml víz

B példa

P4 protein	50 Mg/ml víz
Puffer	10 mmol/1 nátrium-foszfát, pH=7,0

C példa

P4 protein	50 gg/ml víz
Triton X-100	0,05 töm/térf%

B példa

P4 protein

Puffer μg/ml víz mmol/1 nátrium-foszfát, pH=7,0

Triton X-100

0,05 töm/térf%

Claims (21)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás növények patogénjeinek leküzdésére, azzal jellemezve, hogy a növény patogénjeire vagy annak megjelenési formájára olyan a növény patogénjeit leküzdeni képes proteint vagy annak funkcionálisan ekvivalens módosított változatát alkalmazzuk, amelynek aminosav-szekvenciája az 1. szekvencia-ábrán bemutatott aminosav-szekvencia 15-96. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciát tartalmazza, illetve a módosított változat egy vagy több hozzáadott aminosavat, aminosavcserét és/vagy -kiiktatást tartalmaz.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. szekvencia-ábra 15-93. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával rendelkező proteint alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 3. szekvencia-ábra 15-106. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával rendelkező proteint alkalmazunk.
4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. szekvencia-ábra 15-96. aminosav-helyén levő, illetve a 3. szekvencia-ábra 15-106. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával legalább 70 % homológiát mutató proteint alkalmazunk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az 1. szekvencia-ábra 15-96. aminosav-helyén levő, illetve a 3. szekvencia-ábra 15-106. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával legalább 80 % homológiát mutató proteint alkalmazunk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve.

   hogy az 1. szekvencia-ábra 15-96. aminosav-helyén levő, illetve a 3. szekvencia-ábra 15-106. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával legalább 90 % homológiát mutató proteint alkalmazunk.
7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan proteint alkalmazunk, amelynek aminosav-szekvenciája az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti és amelynek N-terminálisához egy olyan oligopeptid vagy annak módosulata kapcsolódik, amely az 1. szekvencia-ábrán bemutatott aminosav-szekvencia 1-14. aminosav-helyén vagy a

   3. szekvencia-ábrán bemutatott aminosav-szekvencia 1-15. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával rendelkezik, illetve a módosulat egy vagy több hozzáadott aminosavat, aminosavcserét és/vagy -kiiktatást tartalmaz.
8. 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás Oomycetes, Deuteromycetes vagy Basidiomycetes osztályba tartozó gombák vagy Uredinales vagy Pseudomonadaceae csoportba tartozó baktériumok leküzdésére, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti módon járunk el.
9. 9. Növények patogénjeinek leküzdésére szolgáló kompozíció, azzal jellemezve, hogy az 1-7. igénypontok bármelyike szerint említett protein patogének ellen hatásos mennyiségét tartalmazza.
10. 10. A 9. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy még KP6 proteint vagy annak olyan módosulatát tartalmazza, amely egy vagy több hozzáadott aminosavat, aminosavcserét és/vagy -kiiktatást tartalmaz.
11. 11. Rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy olyan DNS szakaszt tartalmaz, amely az 1-7. igénypontok bármelyike szerint említett aminosav-szekvenciát kódolja.
12. 12. A 11. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy még olyan DNS-szekvenciát is tartalmaz, amely képes elősegíteni a rekombináns DNS transzkripcióját, és amelyhez működőképesen további DNS-szekvencia kapcsolódik.
13. 13. A 12. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-szekvencia olyan DNS szabályozása alatt áll, amely működőképesen képes elősegíteni az említett DNS-szekvencia kifejeződését E. coliban.
14. 14. A 12. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-szekvencia olyan DNS szabályozása alatt áll, amely működőképesen képes elősegíteni az említett DNS-szekvencia kifejeződését egy a patogén által megtámadható növényben.
15. 15. A 14. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az említett DNS szekvencia még egy olyan szignál szekvenciát is tartalmaz, amely képes a proteint extracelluláris helyre célbajuttatni.
16. 16. Eljárás az 1-7. igénypontok bármelyike szerint említett protein előállítására, azzal jellemezve, hogy sejteket olyan vektorral transzformálunk vagy transzfektálunk, amely egy a 11-15. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-t tartalmaz, és a kapott sejtek tenyésztésével proteint termelünk.
17. 17. Mikroorganizmusok, növényi sejtek, növények és utódaik, azzal jellemezve, hogy egy a 11-15. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-t tartalmazó vektorral vannak transzformálva.
18. 18. Eljárás növények patogénjei ellen rezisztenciát vagy toleranciát mutató formává regenerálódó képességgel rendelkező transzgenikus növényi sejtek vagy növények előállítására, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtet vagy növényt olyan vektorral transz forrná Íjuk, amely egy a 14. vagy 15. igénypont szerinti rekombináns DNS-t tartalmaz.
19. 19. Protein, azzal jellemezve, hogy

    i) az 1. szekvencia-ábra 15-96. aminosav-helyén, ii) az 1. szekvencia-ábra 1-96. aminosav-helyén vagy iii) a 3. szekvencia-ábra 15-106. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával vagy iv) az i) , ii) vagy iii) olyan módosulatával rendelkezik, amely egy vagy több hozzáadott aminosavat, aminosavcserét és/vagy -kiiktatást tartalmaz.
20. 20. Lényegében véve tiszta protein, azzal jellemezve, hogy a 3. szekvencia-ábra 1-106. aminosav-helyén levő aminosav-szekvenciával rendelkezik,
21. 21. Protein, azzal jellemezve, hogy lényegében véve szekvencia homológiát mutat a 20. igénypont szerinti proteinnel .