HUT65613A - Process for high cell density fermentation of escherichia coli in an agitated boiler fermenter - Google Patents
Process for high cell density fermentation of escherichia coli in an agitated boiler fermenter Download PDFInfo
- Publication number
- HUT65613A HUT65613A HU9202332A HU233292A HUT65613A HU T65613 A HUT65613 A HU T65613A HU 9202332 A HU9202332 A HU 9202332A HU 233292 A HU233292 A HU 233292A HU T65613 A HUT65613 A HU T65613A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- batch
- process according
- fed
- glucose
- growth rate
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás E. coli törzsek, különösen rekombináns expressziórendszerekkel rendelkező vektorok gazdáiként használható E. coli törzsek nagy sejtsürüségü fermentálására. A találmány azokban az iparágakban használható, amelyekben olyan biotechnológiai eljárásokat alkalmaznak, mely eljárásokban az E. coli törzseket termelő organizmusként használják.
Az E. coli elterjedten használatos sejtgazdaként rekombináns DNS termékek előállításához. Nagy hozamok eléréséhez nemcsak a kívánt termék nagy intracelluláris koncentrációjára kell törekedni, hanem arra is, hogy a sejtkoncentráció a fermentorban minél nagyobb legyen.
Ha a sejttenyésztést hagyományos keverés tartály fermentorban kísérlik meg nagy sejtsürüséggel végezni, akkor problémát okoz a túl nagy kezdeti szubsztrát-koncentráció miatt bekövetkező növekedés-gátlás, valamint az, hogy esszenciális tápközeg-komponensek elfogynak a fermentáció folyamán, gátló hatást kifejtő anyagcsere-melléktermékek képződnek, és az oxigénbevezetés kapacitása kisebb a kívánatosnál.
A növekvő E. coli-kultura fokozódó oxigénigényének biztosítására különféle eljárások ismeretesek. így például növelik a keverő fordulatszámát és a gázbevezetés mértékét, illetve oxigénnel dúsított levegőt vezetnek be /Jung, G., Denefle,
P., Becquart, J., Mayaux, J. F./1988/ High cell density fermentation studies of recombinant Escherichia coli strains expressing humán interleukin -1/3. Ann. Inst. Pasteur/Microbiol.
··♦·
139: 129-146; Pasa, R., Clem, T. R., Shiloach, J /1989/ Use of a növel air separation system in a fed-batch férméntative culture of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 55: 13o5-13o7; Krüger, B./ 1989/ Ausbeutesteigerung in dér Fermentation durch Computereinsatz. BioTec Messtechnik, Okt, 65-67 éa Eppstein, L., Shevitz, J., Yang, X. M., Weiss, S. /1989/ Increased biomass production in a benchtop fermentor. Bio/Technology 7: 1178-1181/, tiszta oxigént vezetnek a fermentorba /Bauer, S., Shiloach, I. /1974/ Maximai exponential growth rate and yield of E. coli obtainable in a bench-scale fermentor. Biotechn. Bioeng. 16: 933-941; Shiloach, J. Bauer,
S. /1975 High-yield growth of E. coli at different temperaturé in a bench acale fermentor. Biotechn. Bioeng. 17: 227-239; Bauer, S., Shite, M. D. /1976 Pilot scale exponential growth of Escherichia coli W to high cell concentration with temperature variation. Biotechn. Bioeng. 18: 839-846; Beuer, S., Ziv, E. /1976 Dense growth of aerobic becteria in a bench-scale fermentor. Biotechn. Bioeng. 18: 81-94; Móri, H., Yano, T., Kodayashi, T., Shimizu, S. /1979/ High density cultivation of biomass in fed-batch system with DO-stat. J. Chem. Eng. 12: 313-319; Gleiser, I.E., Bauer, S /1981/ Growth of E. coli to high cell concentration by oxygen level control of carbon source concentration. Biotechn. Bioeng.: 23 Iol5-lo21;
Mitzutani, S., Móri, J., Shimizu, S., Sakaguchi, K., Kobayashi,
T. /1986/ Effect of amino acid supplement on cell yield and gene product in Escherichia coli harbouring plasmind. Biotechn. Bioeng. 28: 2o4-2o9; Bailex, F. J., Blankenship, J., Condra ···· • · · · · · · • · · · ··· ··· • * · ···· · · •••· ·9 « ··. (,
- 4 J. Η., Maigetter, R. Ζ., Ellis, R.W. /1987/ High-cell-density fermentation studies of a recombinant E. coli that expresses atrial natriuretic factor. J. Industrial Microbiol. 2: 47-52 és Krüger, B. /1989/ Ausbeutesteigerung in dér Fermentation durch Computereinsatz BioTec Messtechnik, Okt, 65-67/, vagy pedig a tenyésztést alacsony hőmérsékleten /Shiloach és Bauer/ 1975, Bauer éa White /1976/, valamint Bauer és Ziv /1976/ fent idézett közleményei/, illetve megnövelt nyomáson folytatják le. /Tsai, L. B., Mann, M., Morris, F., Rotgers, C., Fenton,
D./1987/ The effect of organic nitrogén and glucose on the production of recombinant humán insulin-like growth factor in high cell density Escherichia coli férméntations. J. Industrial Microbiol. 2: 181-187/.
Fölöslegbe vett oxigénnel az E. colit glukózt és ásványi sókat tartalmazó közegben 16,5 g X/l száraz biomassza koncentrációig fermentáltak /Reiling, Η. E., Laurila, H., Fiechter, A. /1985/ Mass culture of Escherichia coli: Médium development fór low and high density cultivation of Escherichia coli B/r in minimál and complex média. J. Biotechnoi. 2: 191-2o6/. Mások 19 g X/l száraz biomassza koncentrációt értek el, amint ez Krüger /1989/, valamint Eppstein és mtsai /1989/ fent idézett közleményeiben olvasható. Nagyobb sejtsürüségek eléréséhez fed-batch technikára van szükség, egyrészt hogy kiküszöböljék a szubsztanciák inhibicióját és korlátozását, másrészt hogy megakadályozzák az inhibitor hatású anyagcsere-melléktermékek képződését. Minden esetben szükség van azonban arra, hogy a szénforrás, valamint a nitrogénforrásként és pH-szabályozóként ··· ·· · használt ammónia mellett más tápanyagokat is adagoljanak. Eppstein és mtsai /1989/ idézett közleménye szerint 39 g Σ/1-t lehet elérni, ha a glukózt és ásványi sókat tartalmazó tápközeghez kiegészítő adalékként sókat adnak, mig Fass és mtsai /1989/ idézett közleménye szerint 45 g Σ/l érhető el, ha az eredetileg bevitt, glukózt és ásványi sókat tartalmazó tápközeghez magnéziumszllfátot is tartalmazó glukóz oldatot adagolnak. Sók utólegos adagolásával elértek 95 g Σ/l értéket is /Fan, J.G., Rhee, J. S., Lebeault, J.M, /1987/ Physiological contraints in increasing biomass concentration of Escherichia coli B in fed-batch culture. Biotechnoi. Lett. 9: 89-94/.
Végeztek fed-batch fermentációt olyan, glukózt és ásványi sókat tartalmazó tápközegekben is, amelyekhez a beoltás előtt élesztőextraktumot vagy autolizált élesztő-port adtak. Ily módon, a sejtnövekedés közben csupán glukózt és ammóniát adagolva, minden más adalék mellőzésével 38 g S/l értéket értek el, amint erről Móri és mtsai /1979/ tájékoztatnak idézett közleményükben. Sók utólagos adagolásával nagyobb száraz biomassza koncentrációt lehetett elérni, nevezetesen Bauer és White /1976/ szerint 47 g X/l-t, Shiloach és Bauer /1975/ szerint 55 g S/l-t, Beuer és Ziv /1976/ szerint pedig 68 g Σ/1-t, amint az említett szerzők fent idézett közleményeiből kitűnik. Sók, nyomelemek és vitaminok utólagos beadagolásával 7o g Σ/l értéket értek el /Fleschko, L,, Ritch, T. /1986/ Production of humán alpha consensus interferon in recom binant Escherichia coli, Chem. Eng. Comm. 45: 229-24o/. Igen nagy sejtsürüséget, nevezetesen 110 g Σ/1-t /Cutayar, J.M., • « ♦ ···· • · · · · ·· ··· • · · ···· · · ···· ·· · ··* *«
- 6 Poillon, D. /1989/ High cell density culture of E. coli in a fed-batch system with dissolved oxygen as substrate feed indicator. Biotechnoi. Lett, 11: 155-16o/, illetve 125 g X/l-t /Móri és tsai /1979/ idézett közleménye/ lehetett elérni glukóz és ammónia szokásos adagolása melletti komplex utólagos só—, élesztőextraktum- és nyomelem-adagolással. Kém növelte viszont tovább a száraz biomassza-koncentrációt a beoltás előtt élesztőkivonattal már kiegészített, glukózt és ásványi sókat tartalmazó tápközeg bectotriptonnal vagy peptonnal való további kiegészítése, valamint az említett komplex szubsztrát fermentáció közben való adagolása /Bailey és mtsai /1987/, illetve Tsai és mtsai /1987/ idézett közleményei/. Igen száraz biomassza koncentrációt, nevezetesen lo5 g X/l értéket értek el a fent leirt fed-batch technika /glukóz és sók adagolása/ és oxigénnel dúsított levegővel való levegőztetés kombinálásával /Eppstein és mtsai /1989/ idézett közleménye/. Krüger /1989/ idézett közleménye szerint oxigénnel való levegőztetéssel 112 g X/l értéket értek el.
Ezeknek az eljárásoknak az a hátrányuk, hogy igen összetett tápanyag-adagolási rendszerekkel működnek. A glukózon, illetve a magnéziumszulfáttal kevert glukózon és az ammónián kivül minden más tápanyagot különleges tápszubsztrát-adagolással kell bejuttatni a fermentorba, egyszerűbb esetben időnkénti beadással, más esetben pedig időben szabályozott adagolási fázisokban. Még a gázalaku szubsztrátumot, az oxigént is ily módon kell bejuttatni. Az újabb törekvések tehát olyan eljárásra irányulnak, amelyben nagy sejtsürüség érhető el glukózt ·· • ·· * • »Ρ·
A ·« «·· • · · és ásványi sókat tartalmazó tápközegben anélkül, hogy a szokásos, magnéziumszulfáttal kevert glukóz-oldaton és ammónián, valamint a szokásos levegőztetésen kivül további tápanyag bevitelére, vagy akár csak a levegő tiszta oxigénnel való dúsítására volna szükség.
Az E. coli sejteket, amelyek vektorok gazdasejtjei, és igy rekombináns DNS-termékek képzésére használhatók, a rekombináns termék beviendő expressziós rendszerének megfelelően kell fermentálni. Ez azt jelenti, hogy az E. coli gazdasejteket előbb a kapcsolható expressziós rendszerekkel nagy sejtsürüségre fermentálják, és azután hajtják végre a kapcsolást a rekombináns DUS-expresszióval. Az E. colit illetően ismeretes homológ és heterológ expressziós rendszerek sora is, amely rendszerek konstitutívak, illetve amelyekben az expresszió kis fajlagos növekedési ütem esetén nagyobb, mint az, amely a mindenkori tápközegben lehetséges maximális fajlagos növekedési ütemmel /yi / elérhető. A fajlagos növekedési ütemet az alábbi képlettel definiálhatjuk:
μ = 1/X.dX/dt
Ismeretesek olyan oldatok, amelyekben E. coli ' ' max növekedést értek el. így például azzal, hogy a szénforrást konstans, a μ max biztosításához szükségesnél kisebb ütemben vezették be a fermetlébe, elérték, hogy a kultúra fajlagos növekedési üteme a maximális alatt maradt, azaz αλ < ju _ nővekedés volt tapasztalható /Zabriskie, D.W. és Arcuri, E. J./1986/ «**· »··· * *Ν * · «Λ «· • · ···· »· · ·♦· ···
Factors influencing productivity of fermentations employing recombinant microorganisms. Enzyme Microb. Technoi. 8: 706-717· Ennek az eljárásmódnak azonban az a hátránya, hogy az /1 értéke mindig változik. Haa a beadagolás sebességét állandó értéken tartanák az egész fed-batch folyamat során, akkor a yu állandóan csökkenne.
Kifejlesztettek olyan stratégiát is, amely szerint a fajlagos növekedési ütem /i értékét a szénforrás bevezetési sebességének szabályozásával időről időre újra beállították, ahogy a sejtsürüség növekedett. /Allén, B. R, és Luli, G. W. /1985/ A gradient-fedd process fór obtaining high cell densities fór recombinant E. coli, mely közleményre Lee és Mohler hivatkozik az EP 0315944 A2 Európa szabadalmi közzétételi iratban/. Ennek a stratégiának viszont az a hátránya, hogy az ja értéke egy bizonyos tűréshatáron belül, melyet a glukóz és a sejtsürüség off-line mérésének gyakorisága szab meg, folytonosan változik, miközben a folyamatot /i</i max növekedéssel kell vezetni. A specifikus növekedési ütem változásai következtében ingadozó lesz az anyagcsere, ami destabilizálja a rendszert, különösen akkor, ha inhibitor hatású anyagcsere-melléktermékek is képződnek. Konstans yu növekedési érték megvalósítására alkalmas szabályozott növekedési ütemű fermentáció ismeretes a 315 944 sz. Európa szabadalmi közzétételi iratból /Lee, S. és Mohler, R.D. /1989/ Controlled growth rate fermentation EP 0315944 A2/. Ennek az eljárásnak az a lényege, hogy folyamatosan mérik a sejtek által növekedés közben fejlesztett széndioxidot, ebből számítógéppel kiszámítják a mindenkori aktuális növekedési ütemet, és azonnal beállítják a kívánt növekedési ütemhez szükséges *·♦· · f··* *· * · ι · « • · · ··· «·· * · ···· · · szénforrás-adagolási sebességet a géphez kapcsolt szénforrás -beadagolón. Ily módon sikerült az E. coli tenyésztését csaknem állandó /u<aa értéken vezetni a 0,3-60 g X/l sejtsürüség -tartományban. Az a stratégia azonban, mely szerint ayu állandó értéken tartásához a mért C02 mennyiséget használják fel, elvileg hibás, mert a C02 mennyisége nem olyan jel, amely minden esetben korrelációban van a növekedéssel. Különösen igy van ez abban az esetben, amikor változások állnak be az anyagcserében, vagy a sejtek anaplerotikus bioszintézisét alkalmazzák, amikoris ez a helyzet különösen nagy sejtsürüség és szénhiány esetén következhet be. Ennek az eljárásnak egy további hátránya, hogy ha kimerítik az oxigénbevitel növelésének lehetőségét a mindenkor alkalmazott fermentor-rendszerben, akkor a sejtnövekedés gyorsan megszakad, minthogy azonnal lecsökken az oldott oxigén koncentrációja. A yu - konst. <F/Umax ütemű növekedési szakasz után nem lehetséges a növekedést érzékelhető módon meghosszabbítani a sejtsürüség további növelésére /u</i „„„ ütemben, miközben a ju értéke folytonosan csökken. Emellett az oldott széndioxid koncentrációja a beállított pH-tartományban nagyon erősen függ a pH értékétől; már kis pH-változások negatívan befolyásolják a mérési jelet és végső soron meghamisíthatják a yü -számítás eredményét.
A találmány célja, hogy olyan fermentációs eljárást biztosítson, amely lehetővé teszi E. coli stabil anyagcserével való szaporítását és igen nagy sejtsürüség elérését.
• · ? · « • « * ··· ··· • .· ··« · ·
Ιο
A találmány célja az, hogy nagy E. coli sejtsűrűséget valósítson meg keverős tartályfermentorban oly módon, hogy egy maximális fajlagos növekedési ütemii növekedési szakasz után a tenyésztés szubmaximális fajlagos növekedési ütemben folytatódik, miközben a fermentációs közegben oldott oxigén koncentrációja egy adott értéken vagy afölött marad.
A találmány feladata, hogy az ismert megoldások hátrányainak kiküszöbölésével lehetővé tegye E. coli fermentálását glukózt és ásványi sókat tartalmazó közegben, keverős tartályfermentorban nagy sejtsürüség eléréséig, anélkül, hogy a magnéziumszulfáttal kiegészített glukóz, az ammónia és a habzásgátló utánpótlását nem számítva bármilyen más tápanyag utólagos betáplálására vagy a bevezetett levegő oxigénnel való dúsítására volna szükség. A találmány feladata továbbá a fermentációt úgy vezetni, hogy az E. coli sejtek először maximális fajlagos növekedési ütemeben //u fejlődjenek, majd egy meghatározott időn keresztül szubmaximális fajlagos növekedési ütemben folytatódjék a fermentáció.
Az említett feladatot Escherichia coli nagy sejtsürüségü fermentációjának keverős tartályfermentorban való lefolytatásával a találmány szerint oly módon oldjuk meg, hogy nitrogénforrást, szerves szénforrást és ásványi sókat tartalmazó közegben fermentálunk, a fermentációt több szakaszban végezzük, úgy, hogy előbb egy batch szakaszban maximális fajlagos növekedési ütemben fermentálunk, majd egy fed-batch szakaszban szubmaximális fajlagos növekedési ütemben fermentálunk, amikor*94* ·· 4··· · • « · · 4 ·· • · · · ··«··« • * · ···· · · ••·· ·· · »·«·» is a sejtnövekedést az oxigénbevezetéssel és magnéziumszulfáttal kiegészített glukóz-oldat alkalmazásával irányítjuk és/vagy szabályozzuk.
Az eljárás egy speciális kiviteli módja szerint a fed-batch szakaszban olyan időprofilt alakítunk ki, melyben kvázikonstans szubmaximális fajlagos növekedési ütemet tartunk. Azonkívül a fed-batch szakaszt a keverős tartályfermentorra előre megadott maximális oxigénbevitel elérése után egy olyan rész-szakasszal fejezhetjük be, melynek során a fajlagos növekedési ütem lecsökken.
A találmány szerinti eljárás kivitele során fermentálhatunk E. coli K12 törzset /ATCC1O 798/ vagy annak egy származékát, előnyösen az E. coli TG1 /DSM 6 056/ származékot.
A fermentálást végezhetjük kiegészítő adalékok jelenlétében, és ezzel kompenzálhatjuk az auxotrófiát. így például ha tiamin-auxotrófiával kell számolni, akkor az E. coli törzset tiamin jelenlétében fermentáljuk. Az E. coli TG1 törzset például<Í4,5 mg/liter koncentrációjú tiamin jelenlétében fermentálhatjuk.
Eljárhatunk úgy, hogy az oxigént az egész fermentádió folyamán levegőbevezetéssel biztosítjuk. Eljárhatunk azonban úgy is, hogy először levegőt vezetünk be, majd később a levegőztetéshez oxigénnel dúsított levegőt vagy oxigént használunk.
Szerves szénforrásként monoszaccharidokat, diszaccharidokat és/vagy poliolokat használhatunk. Használhatunk például glukózt, szaccharózt, laktózt és glicerint.
««#· ·· *· 4««· « * » · · · · » • 999 ···««· • · 9 »♦·· 9« ·♦·· 99 9 «···«
- 12 Az eljárás egy speciális kiviteli módja szerint a fed-batch szakaszban használhatunk magnéziumszulfáttal kiegészített és habzásgátlót tartalmazó glukóz oldatot.
Az eljárás egy további speciális kiviteli módja szerint a fed-batch szakaszban használhatunk 19,2 g MgSO^^HgO/liter koncentrációjú magnéziumszulfáttal kiegészített glukóz oldatot, melynek koncentrációja például^700 g/liter lehet.
Eljárhatunk oly módon is, hogy a találmány szerinti eljárás bán olyan tápközeget használunk, amely már az egész fermentációhoz szükséges összes tápanyagot tartalmazza, eltekintve attól, hogy
- a pH beállítására vizes ammóniumhidroxid-oldatot, például^. 25% koncentrációjú oldatot adagolunk,
- a fed-batch szakaszban magnéziumszulfáttal /például^.19,2 g I/IgS0^.7H20/liter koncentrációban/ kiegészített, például-^7oo g/liter koncentrációjú glukóz oldatot adagolunk, és
- adott esetben habzásgátlót, például Ucolub N115 készítményt adagolunk.
A találmány szerinti eljáráshoz olyan kvalitatív összetételű tápközeget használunk, amely tartalmazhat például glukózt, kálium-rdihidrogénfoszfátot, diammónium-hidrogénfoszfátot, magnéziumszulfátot, vascitrátot, kobaltkloridot, mangánkloridot, rézkloridot, bórsavat, nátrium-molibdátot, cinkacetátot, Titriplex
Ill-at és/vagy citromsavat, valamint adott esetben habzásgátlót és adott esetben az auxotrófiát kompenzáló kiegészitó adalékot.
Különösen előnyös az olyan tápközeg, amely például-^· 5o g/liter glukózt, £:13,3 g/liter KE^PO^-ot, £-4 g/liter /MH^/gHPO^-ot
1,2 g/liter MgSO^.7H20 -ot,^.6o mg/liter vascitrátot 2,5 mg/liter CoCl2.6H20~ot, Z-15 mg/liter MnCl2.4H20-ot 1,5 mg/liter
CuCl2·2H20-ot, Z. 3mg/liter H^BO^-at, Z 2,5 mg/liter
NagMoO^.2H20-ot mg/liter Zn/CH^COO/2.2H20-ot, Z. 8,4 mg/liter
Titriplex Ill-at és/vagy ^1,7 g/liter citromsavat, valamint adott esetben Z o,l ml/liter Ucolub habzásgátlószert tartalmaz.
A találmány szerinti eljárásban a tápközeg alkotórészeit célszerűen a következő sorrendben adagoljuk be a fermentorba:
- előbb a kálium-dihidrogénfoszfátot, a diammónium-hidrogénfoszfátot és/vagy a citromsavat,
- azután a kobaltklorid, mangánklorid, rézklorid, bórsav, nátrium-molibdát, cinkacetát és/vagy Titriplex III adott esetben törzsoldatokból készített oldatát
- azután a vascitrátot,
- azután adott esetben a habzásgátlót, majd a tápközeget sterilizáljuk.
A törzsoldatokból összeállított oldat készítésekor először célszerűen a Titriplex Ill-at mérjük be.
A fermentorba betöltött oldat sterilizálása után bevihetjük a fermentorba a glukóz és/vagy a magnéziumszulfát sterili— zált oldatát.
A tápközeg beoltása után a batch szakasz előtt lag fázis jelentkezhet.
A batch szakaszban 7,5-nél kisebb pH értéken, célszerűen
6,6-6,9 pH értéken, előnyösen mintegy 6,8 pH-nál fermentálunk.
A pH értéket ammóniumhidroxid oldattal, célszerűen 25 % vagy annál kisebb koncentrációjú ammóniumhidroxid oldattal állíthatjuk be.
·
- 14 A találmány szerinti eljárást végezhetjük oly módon is, hogy a batch szakaszban a keverő fordulatszámának fokozatos növelésével 1 %-ot meghaladó, előnyösen 5-2o %, célszerűen mintegy lo % p02 értéket állítunk be.
A batch szakasz befejeződése után oly módon térhetünk át a fed-batch szakaszra jellemző szubmaximális fajlagos növekedési ütemre, hogy a keverő fordulatszámát lecsökkentjük, például
5-6o perc alatt, vagy pedig a keverő fordulatszámát állandó értéken tartjuk, például o,5-lo órán át.
A fed-batch szakaszban a glukóz adagolással 1 %-nál nagyobb előnyösen 5-2o %, különösen előnyösen mintegy lo % p02 értéket állítunk be.
A fed-batch szakaszban beállíthatjuk a kívánt szubmaximális fajlagos növekedési ütemet fokozott oxigénbevitellel is. Evégett megnövelhetjük a keverő fordulatszámát, a gázbevezetés sebességét, a nyomást és/vagy a levegő oxigéntartalmát, vagy pedig oxigént vezethetünk be.
Ha a fed-batch szakaszban a szubmaximális fajlagos növekedési ütemet figyelemmel kisérjük, akkor azáltal beállíthatjuk a megfelelő oxigénbeadagolást. A szubmaximális fajlagos növekedési ütem követésére alkalmas módszer például a fermentorból távozó gáz oxigéntartalmának folyamatos ellenőrzése.
Lefolytathatjuk a találmány szerinti eljárást oly módon is, hogy a fed-batch szakaszban a technikailag lehetséges maximális oxigénbevitel elérése után a kultúrát a p02 glukóz adagolás utján való szabályozásával csökkenő szubmaximális növekedési ütemben tovább fermentáljuk.
A teljesség kedvéért megjegyezzük, hogy a száraz biomassza koncentrációját oly módon változtathatjuk, hogy változtatjuk a batch szakasz és a fed-batch szakasz egymáshoz viszonyított időtartamát és/vagy változtatjuk a fed-batch szakaszban a kvázikonstans értéken tartandó szubmaximális fajlagos növekedési ütemet. így legalább mintegy 95 g X/l értéket érhetünk el például akkor, ha E. coli TG1 törzset /i = o,lo7 1/h - konst. értéken tenyésztünk a fed-batch szakaszban.
Ha az adott fermentor-rendszerben az oxigénbevezetés teljesítménye tovább már nem növelhető, a találmány szerinti eljárás meglepő módon további növekedési lehetőséget biztosit: csökkenő érték mellett, anélkül, hogy a tápközegben lévő sejtekben oxigénhiány következne be, a pOg-szabályozás révén. A fent említett tápközegben ily módon az E. coli TG1 tenyésztése során legalább 110 g X/l száraz' biomassza koncentrációt érhetünk el, miközben a végtérfogat nem haladja meg a fermentor nettó térfogatának 76 %-át.
A találmányt a mellékelt ábrával és a következő példával szemléltetjük.
1. példa
E. coli TG1 törzset tenyésztettünk nagy sejtsűrűségű fermentációs eljárással egy 72 literes fermentorban /B. Braun Meisungen A.G. Typ 8015.1.01/.
liter térfogatú tápközeget készítettünk beoltásra az alábbi összetétellel: 25 g/liter glukóz, 13,3 g/liter KHgPO^, 4 g/liter /NH^/gHPO^, 1,2 g/liter MgS0^.7Hg0, 6o mg/liter « · · · ·
- 16 vas/III/- citrát, 2,5 mg/liter CoCl2»6H20, 15 mg/liter MnCLg.41^0,
1,5 mg/liter CuC12.2H20, 3 mg/liter 25mg/liter
Na2Mo0^.2H20, 8 mg/liter Zn/CH^C00/2.2H20 4,5 mg/liter tiamin,
8,4 mg/liter Titriplex III, 1,7 g/liter citromsav és o,l ml/liter Ucolub N115. Előbb 148 g /NH4/2HP04«ot, 492,1 g KH2P04~ot és
62,9 g citromsavat mint szárazanyagot oldottunk fel mintegy 3o liter ionmentesitett vízben a fermentorban, azután hozzáadtunk 257,4 ml nyomelem-oldatot, majd 2,22 g vas/III/-citrát 3oo ml vízzel készített oldatát és 3,7 ml Ucolub N115-öt. A nyomelemkeverék-oldatot a következő törzsoldatokból állítottuk elő az oldatok felsorolás szerinti sorrendben való bemérésével:
62,2 ml Titriplex III /5g/liter/, 34,3 ml CoC12.2H20 /2,7 g/liter/,
34.7 ml CuC12.2H20 /1,6 g/liter/, 34,7 MnCl2.4H20 /16 g/liter/,
27.8 ml Η^ΒΟ^ /4 g/liter/, 3o,8 ml Na2Mo04.2H20/3 g/liter/, és
32.9 ml Zn/CH^C00/2.2H20/ 9 g/liter/. Az oldatot a szokásos módon sterilizáltuk a fermentorban. Végül hozzáadtunk még külön sterilizált glukóz-oldatot /1,0175 kg glukóz monohidrát 2,5 liter vízzel készített oldatát/, sterilizált magnéziumszulfát oldatot /44,4 g MgS04.7H20 1 liter vizes oldatát/, sterilizált tiamin oldatot /166,5 mg loo ml vízben/, a pH-t 25 %-os vizes ammóniumhidroxid oldattal 6,6-ra állítottuk be, majd az oldatot steril vízzel 36,8 liter térfogatra töltöttük fel. Ezután beoltottuk 2oo ml 2o térf. %-os felolvasztott glicerines E. coli TG1 kultúrával.
Az E. coli TG1 törzset 28 C° hőmérsékleten 1,5 bar nyomáson 6,8 pH értékű oldatban, 85 liter/perc gázbevezetés mellett tenyésztettük. A pH-t az egész fermentáció alatt 25 %-os ammóniumhidroxid oldat szabályozott adagolásával tartottuk állandó értéken. Az 1. ábrán bemutatjuk a keverési fordulatszám, a száraz biomassza Σ koncentrációja, a glukózkoncentráció és az oldott oxigén koncentráció időbeli alakulását.
A nagy sejtsürüségü. fermentáció batch szakaszában a beoltás t=0 időpontjától kezdve a kultúra egy rövid, mintegy 2 órás lag-fázis után maximális fajlagos növekedési ütemben
- 0,456 1/h/ fejlődött. A lo % elérése után a pOg -t a keverő fordulatazárnának szabályozott növelésével állandó
értéken tartottuk a továbbiakban. A kezdetben beadagolt glukóz elfogyasztása után a batch szakasz végétért. A pOg drasztikusan megnövekedett. Ezután a pOg-t már nem szabályoztuk a keverő fordulatszámával. Avégett, hogy a fajlagos növekedési ütemet /1 = o,456 értékről ja = o
1/h értékre csökkentsük keverési fordulatszámot percenként 42o-ról percenként 25o-re csökkentettük 3o perc alatt. Azután a pOg-t a magnéziumszulfáttal /19,2 g MgS0^.7Hg0/liter/ kiegészített glukóz oldat /700 g/liter/ adagolásával szabályoztuk. A fed-batch szakasz első fázisában a /i-t az oxigénbevezetés növelésével tartottuk állandó értéken. Ezért a fordulatszámot egy Pl-szabályozóval az ja értékének megfelelően állítottuk be. A fajlagos növekedési ütemet közvetett módon a rendszer oxigén-egyenlegéből az alábbi formulával határoztuk meg:
/i/t/ Qn /t/ Ug t
κ + J q0 /r/ar to d ahol Qn az oxigénfogyasztás sebessége, Ug ··
K a t időpontban mért száraz biomassza-koncentráció és az oxigénre számított hozam-koefficiens hányadosa.
A fed-batch szakasz első fázisának végén a száraz biomassza koncentrációja 95 g/liter értéket ért el. A műszakilag lehetséges legnagyobb keverési fordulatszám elérése után a tovább már nem növelhető oxigénbevitellel a fed-batch szakasz második fázisában a kultúra állandóan csökkenő /u értéken növekedett. Ennek a fázisnak, egyúttal az egész fermentációnak a végén 110 g X/liter száraz biomassza koncentrációt lehetett elérni.
Claims (30)
1. Eljárás Escherichia coli nagy sejtsürüségü fermentálására keverős tartályfermentorban, azzal j ellemezve , hogy nitrogénforrást, szerves szénforrást és ásványi sókat tartalmazó közegben fermentálunk, a fermentációt több szakaszban hajtjuk végre úgy, hogy előbb egy batch szakaszban maximális fajlagos növekedési ütemben fermentálunk, majd egy fed-batch szakaszban szubmaximális fajlagos növekedési ütemben fermentálunk, melyet magnéziumszulfáttal kiegészített glukóz-oldatot alkalmazva az oxigénbevitellel irányítunk és/vagy szabályozunk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a fed-batch szakaszban szubmaximális fajlagos növekedési ütemü fermentálás! időprofilt alakítunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a fed-batch szakaszban időprofilként kvázikonstans fajlagos növekedési ütemet alakítunk ki.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fed-batch szakaszt a keverős tartályfermentor által eleve meghatározott maximális oxigénbevitel elérése után olyan rész-szakasszal fejezzük be, amelyben a szubmaximális fajlagos növekedési ütem csökken.
5-2o %, célszerűen mintegy lo% pO2 értéket állítunk be.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy E. coli K12 /ATCC 10 798/ törzset vagy annak egy származékát, előnyösen E. coli TG1 /DSM 6 056/ törzset fermentálunk.
• «
- 2ο -
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy kiegészítő adalékok jelenlétében fermentálunk, és az auxotrófiát kompenzáljuk.
7,5 előnyösen 6,6 és 6,9 közötti, célszerűen mintegy 6,8 pH értéken fermentálunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a fermentálandó E, coli törzs tiamin-auxotrófiája esetén tiamin jelenlétében fermentálunk.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy E. coli TG1 törzset legfeljebb 4,5 mg/liter tiamin-koncentrációju közegben fermentálunk.
9. Az 1-B. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az oxigéngáz biztosítására az egész fermentáció alatt levegőt vezetünk be, vagy a fermentáció kezdetén levegőt, majd oxigénnel dúsított levegőt vagy tiszta oxigént vezetünk be.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy szerves szénforrásként monoszaccharidokat, diszaccharidokat és/vagy poliolokat használunk.
11. A lo. igénypont szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy szerves szénforrásként glukózt, szaccharózt, laktózt és/vagy glicerint használunk.
12. Az 1-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy a fed-batch szakaszban magnéziumszulfáttal kiegészített, habzásgátlószert tartalmazó glukóz-oldatot használunk.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy a fed-batch szakaszban lég··»· ♦ * • ♦· feljebb 19,2 g IígSO^-THgO/liter koncentrációjú magnéziumszulfáttal kiegészített, előnyösen legfeljebb 7oo g/liter koncentrációjú glukóz oldatot használunk.
14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárást olyan tápközegben hajtjuk végre, amely már az egész fermentációhoz szükséges összes tápanyagot tartalmazza, eltekintve attól, hogy a pH beállítására vizes ammóniumhidroxid oldatot adagolunk, amelynek koncentrációja előnyösen legfeljebb 25 %, - a fed-batch szakaszban magnéziumszulfáttal - melynek koncentrációja előnyösen legfeljebb 19s2 g MgS0^.7H20/liter - kiegészített, előnyösen legfeljebb 700 g/liter koncentrációjú glukóz oldatot adagolunk, - adott esetben habzásgátlószert, előnyösen Ucolub N115-öt adagolunk.
15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal j ellemezve , hogy olyan kvalitatív összetételű tápközeget használunk, amely glukózt, kálium-dihidrogénfoszfátot, doammónium-hidrogénfoszfátot, magnéziumszulfátot, vascitrátot, kobaltkloridot, mangánkloridot, rézkloridot, bórsavat, nátrium-molibdátot, cinkacetátot, Titriplex Ill-at és/vagy citromsavat, valamint adott esetben habzásgátlót és adott esetben az auxotrófiát kompenzáló kiegészítő adalékot tartalmaz.
16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan tápközeget használunk, amely legfeljebb 5o g/liter glukózt, legfeljebb 13,3 g/liter KELjPO^-ot, legfeljebb 4 g/liter /NH^/gHPO^-ot, legfeljebb 1,2 g/ > <
liter I.ígSO^.ΪΗ^Ο-οt, legfeljebb 60 mg/liter vascitrátot, legfeljebb 2,5 mg/liter CoClg.őHgO-ot, legfeljebb 15 mg/liter ItoCl2.4H20-ot, legfeljebb 1,5 mg/liter CuCl2.2H20-ot, legfeljebb 3 mg/liter H^BOy-at, legfeljebb 2,5 mg/liter lTa2Mo0^.2H20-ot legfeljebb 8 mg/liter Zn/CH^C00/2.2H2O-ot legfeljebb 8,4 mg/liter Titriplex Ill-at és/vagy legfeljebb 1,7 g/liter citromsavat, valamint adott esetben legfeljebb o,l ml/liter Ucolub habzásgátlószert tartalmaz.
17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tápkozeg alkotórészei közül előbb a kálium-dihidrogénfoszfátot, a diammónium-hidrogénfoszfátot és/vagy a citromsavat,
- azután a kobaltklorid, a mangánklorid, a rézklorid, a bórsav, a nátrium-molibdát, a cinkacetát és/vagy a Titriplex
III oldatát, amelyeket adott esetben törzsoldatokból készítünk,
- azután a vascitrátot,
- azután adott esetben a habzásgátlószert visszük be a fermentorba, majd a tápközeget sterilizáljuk.
18. A 17· igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a törzsoldatokból elkészítendő oldathoz először a Titriplex Ill-at mérjük be.
19. Az 1-17· igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal j ellemezve , hogy a fermentorba bemért oldat sterilizálása után glukóz és/vagy magnéziumszulfát sterilizált oldatát visszük be a fermentorba.
< ♦
2ο.
Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a batch szakaszban legfeljebb
21. A 2o. igénypont szerinti eljárás,azzal j e 1 lémé z v e , hogy a pH értékét vizes ammóniumhidroxid oldattal állítjuk be, amelynek koncentrációja előnyösen legfeljebb 25 %·
22. Az 1-21, igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a batch szakaszban a keverési fordulatszám fokozatos növelésével legalább 1 % előnyösen
23. Az 1-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy a batch szakasz befejeződése után oly módon térünk át a fed-batch szakaszra jellemző szubmaximális fajlagos növekedési ütemre, hogy
- a keverési fordulatszámot előnyösen 5-6o perc alatt lecsökkent j ük,
- vagy a keverési fordulatszámot előnyösen o,5-lo órán át állandó értéken tartjuk.
24. Az 1-23· igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a fed-batch szakaszban a glukóz adagolással a p02-t 1%-nál nagyobb értékre, előnyösen 5-2o %-ra, célszerűen mintegy lo %-ra állítjuk be.
25. Az 1-24 igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fed-batch szakaszban a kívánt szubmaximális fajlagos növekedési ütemet megnövelt oxigénbevitellel állítjuk be.
• · · ··· • · ·· ·
26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal j e 1 leni e z v e , hogy megnöveljük a keverési fordulatszámot, a gázbevezetés ütemét, a nyomást és/vagy a levegő oxigéntartalmát, vagy pedig oxigéngázt vezetünk be.
27. Az 1-26. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fed-batch szakaszban ellenőrizzük a szubmaximális fajlagos növekedési ütemet, és azáltal állítjuk be a megfelelő oxigénbevitelt.
28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve , hogy a szubmaximális fajlagos növekedési ütemet a fermentorból távozó gáz oxigéntartamával ellenőrizzük.
29. Az 1-28. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fed-batch szakaszban az oxigénbevitel műszakilag lehetséges maximumának elérése után a pO2-t glukóz adagolással szabályozva a kultúrát csökkenő szubmaximális növekedési ütemben tovább fermentáljuk.
30. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal j ellemezve , hogy száraz biomassza koncentrációt oly módon változtatjuk, hogy a batch szakasz és a fed-batch szakasz egymáshoz viszonyított időtartamát és/vagy a fed-batch szakaszban az állandó értéken tartandó szubmaximális fajlagos növekedési ütem nagyságát változtatjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4001518A DE4001518A1 (de) | 1990-01-19 | 1990-01-19 | Verfahren zur hochzelldichte-fermentation von escherichia coli in einem ruehrkesselfermentor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9202332D0 HU9202332D0 (en) | 1993-05-28 |
| HUT65613A true HUT65613A (en) | 1994-07-28 |
Family
ID=6398409
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202332A HUT65613A (en) | 1990-01-19 | 1990-12-24 | Process for high cell density fermentation of escherichia coli in an agitated boiler fermenter |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0511226B1 (hu) |
| AT (1) | ATE119570T1 (hu) |
| BR (1) | BR9007980A (hu) |
| CA (1) | CA2073974A1 (hu) |
| CS (1) | CS11791A2 (hu) |
| DE (2) | DE4001518A1 (hu) |
| DK (1) | DK0511226T3 (hu) |
| HU (1) | HUT65613A (hu) |
| WO (1) | WO1991010721A2 (hu) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9602825D0 (en) * | 1996-02-12 | 1996-04-10 | Therexsys Ltd | Method of plasmid dna production and purification |
| US5981735A (en) * | 1996-02-12 | 1999-11-09 | Cobra Therapeutics Limited | Method of plasmid DNA production and purification |
| WO2012028522A1 (en) | 2010-08-30 | 2012-03-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Alkaline feed |
| WO2013137622A1 (en) * | 2012-03-12 | 2013-09-19 | Hanmi Science Co., Ltd. | Method of culturing e. coli cells for high density |
| WO2020169564A1 (en) | 2019-02-20 | 2020-08-27 | Basf Se | Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and trace element feed |
| MX2021010110A (es) | 2019-02-20 | 2021-09-21 | Basf Se | Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de medio definido y alimentacion de magnesio. |
| CN115786214B (zh) * | 2022-12-26 | 2023-08-18 | 湖北擎科生物科技有限公司 | 感受态大肠杆菌的高密度发酵培养基及高密度发酵培养方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2601254B2 (de) * | 1976-01-15 | 1977-11-10 | B. Braun Melsungen Ag, 3508 Melsungen | Verfahren zur regelung des partialdruckes von gasen in fermentoren |
| NZ183731A (en) * | 1976-04-02 | 1980-04-28 | Ici Ltd | Process for culturing cells(microorganism and tissue culture) dependent on the relationship between cycle time and biomass efficiency ratio |
| FR2505359B1 (fr) * | 1981-05-08 | 1985-07-05 | Air Liquide | Procede et installation de fabrication de microorganismes |
| CA1293217C (en) * | 1987-11-09 | 1991-12-17 | Sooyoung Stanford Lee | Controlled growth rate fermentation |
| EP0345588A1 (de) * | 1988-06-03 | 1989-12-13 | Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) | Verfahren und Anordnung zur Regelung eines biologischen Wachstumsprozesses |
-
1990
- 1990-01-19 DE DE4001518A patent/DE4001518A1/de active Granted
- 1990-12-24 WO PCT/EP1990/002301 patent/WO1991010721A2/de active IP Right Grant
- 1990-12-24 DE DE59008683T patent/DE59008683D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-24 BR BR909007980A patent/BR9007980A/pt unknown
- 1990-12-24 HU HU9202332A patent/HUT65613A/hu unknown
- 1990-12-24 CA CA002073974A patent/CA2073974A1/en not_active Abandoned
- 1990-12-24 DK DK91901288.0T patent/DK0511226T3/da active
- 1990-12-24 EP EP91901288A patent/EP0511226B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-12-24 AT AT91901288T patent/ATE119570T1/de not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-18 CS CS91117A patent/CS11791A2/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS11791A2 (en) | 1991-08-13 |
| DE4001518A1 (de) | 1991-07-25 |
| WO1991010721A3 (de) | 1991-09-19 |
| DK0511226T3 (da) | 1995-04-10 |
| WO1991010721A2 (de) | 1991-07-25 |
| ATE119570T1 (de) | 1995-03-15 |
| DE4001518C2 (hu) | 1992-01-30 |
| CA2073974A1 (en) | 1991-07-20 |
| BR9007980A (pt) | 1992-11-17 |
| DE59008683D1 (de) | 1995-04-13 |
| EP0511226B1 (de) | 1995-03-08 |
| EP0511226A1 (de) | 1992-11-04 |
| HU9202332D0 (en) | 1993-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2107097C1 (ru) | Способ получения лизина | |
| Nakano et al. | Influence of acetic acid on the growth of Escherichia coli K12 during high-cell-density cultivation in a dialysis reactor | |
| US7521203B2 (en) | Feeding processes for fermentation | |
| EP2825633B1 (en) | Method of culturing e. coli cells for high density | |
| CN103517989B (zh) | 在受控制的氧饱和度下通过发酵生产l-胱氨酸的方法 | |
| US20240067993A1 (en) | Method of culture | |
| JP2008054688A (ja) | アカルボースの製造のためのオスモル濃度制御発酵方法 | |
| US7381545B2 (en) | Method for controlling metallophosphate precipitation in high cell density fermentations | |
| RU2631001C2 (ru) | Способ получения полипептида | |
| HUT65613A (en) | Process for high cell density fermentation of escherichia coli in an agitated boiler fermenter | |
| JP3721136B2 (ja) | Ｏ−アセチル−ｌ−セリンを発酵法で製造する方法 | |
| HU228689B1 (hu) | Eljárás heterológ fehérjék gombasejtekkel történõ elõállítására | |
| CN117701459A (zh) | 一种大肠杆菌高密度发酵培养基及发酵工艺 | |
| CN111944857B (zh) | 一种提高l-异亮氨酸产率的发酵方法 | |
| RU2447143C2 (ru) | СПОСОБ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Bacillus brevis ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГРАМИЦИДИНА С | |
| JP4149253B2 (ja) | 微生物の低温培養方法 | |
| US6303351B1 (en) | Process for the continuous production of citric acid by fermentation | |
| CN114854809B (zh) | 一种微氧诱导大肠杆菌发酵重组蛋白质的方法 | |
| CN108277238B (zh) | 一种三孢布拉霉发酵产番茄红素的方法及番茄红素 | |
| JP2006521801A (ja) | 低濃度の炭素含有養分及び窒素含有養分を用いる発酵方法 | |
| JP6391956B2 (ja) | ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法 | |
| Selahzadeh et al. | Citric acid fermentation and the effects of temperature | |
| JP6391957B2 (ja) | ５−アミノレブリン酸又はその塩の製造方法 | |
| MUKHACHEV et al. | Changing of Acidity of Culture Liquids during Growing Inoculates and Seeding Materials in Lysine Manufacturing |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |