HUT63653A - Changing of fatty acids in transgenic plant tissues by delta 9 desaturase - Google Patents

Changing of fatty acids in transgenic plant tissues by delta 9 desaturase Download PDF

Info

Publication number
HUT63653A
HUT63653A HU929204175A HU9204175A HUT63653A HU T63653 A HUT63653 A HU T63653A HU 929204175 A HU929204175 A HU 929204175A HU 9204175 A HU9204175 A HU 9204175A HU T63653 A HUT63653 A HU T63653A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
expression cassette
plant
fatty acid
transformed
Prior art date
Application number
HU929204175A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9204175D0 (en
Inventor
David F Hildebrand
Scott W Grayburn
Original Assignee
Pioneer Hi Bred Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pioneer Hi Bred Int filed Critical Pioneer Hi Bred Int
Publication of HU9204175D0 publication Critical patent/HU9204175D0/hu
Publication of HUT63653A publication Critical patent/HUT63653A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
    • C12Y114/19002—Acyl-[acyl-carrier-protein] desaturase (1.14.19.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

KIVONAT
A találmány tárgya eljárás zsírsavak szintézisének megváltoztatására növényekben, valamint a megfelelő triacil-glicerin összetétel megváltoztatása. A® állati vagy élesztő eredetű zsírsav koenzim A deszaturáz génnel transzforrnáltVnövényi szövetek telített 16 és 18 szénatomos zsírsav termelése csökkent, ennek megfelelően az egyszeresen telítetlen 16 és 18 szénatomos zsírsavak mennyisége a transzformált hegszövetekben, levelekben és magokban megnövekedett .
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
Képviselő: |,
DANUBIA Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
Budapest r 6 3 6 5 3
C CLH Φ/ίΦ
C ÁÍLU
ZSÍRSAVAK MEGVÁLTOZTATÁSA TRANSZGÉNES NÖVÉNYI SZÖVETEKBEN Δ9 DESZATURÁZZAL
Pioneer Hi-Bred International, Inc., Des Moines, Iowa,
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
Feltalálók:
HILDEBRAND, Dávid F., Lexington, Kentucky,
GRAYBURN, W. Scott, Lexington, Kentucky,
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
A bejelentés napja: 1992. 12. 30.
Elsőbbsége: 1991. 12. 31. (07/816.288)
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
76332-1045 GÁ/kov
A találmány tárgya zsírsavak szintézisének megváltoztatása zsírsav-koenzim A vagy Δ9 deszaturáz gén alkalmazásával, és a megfelelő triacil-glicerin kompozíciók növényekben .
A növények természetes körülmények között számos zsírsavat, és még nagyobb számú lipidet szintetizálnak, köztük mono-, di- és triacil-glicerineket, foszfolipideket, glikolipideket és más, a zsírsavakból előállítható vegyületeket. A lipideknek egy adott növény által termelt választékát mind a növény genotípusa, mind a növénynek a környezeti tényezőkre, például melegre, hidegre, szárazságra adott válasza meghatározza. Azonban, tekintet nélkül a környezeti körülményekre, egy növény soha nem termelhet olyan összetételben zsírsavakat vagy lipideket, amelyhez nem rendelkezik a szükséges biokémiai rendszerrel, az ilyen biokémiai utakat végső soron a növény genotípusa szabja meg. A genetikai módosítás ismert eljárásai közé tartoznak a genetikai rekombinációs eljárások, amelyeket a növénytermesztők a teljes növény szintjén irányítanak. Ezek az eljárások, bár jól jellemzettek és lényegre törően vezethetők, jellemzően az olajtartalom növelésére és az összetétel javítására irányulnak a természetes biokémiai folyamatok optimalizálásával, nem pedig új biokémiai utak létrehozásával.
Egyidejűleg azonban folyamatos nagy érdeklődés kíséri a zsírsavak növényekben való deszaturációs (telítetlenné tevő) mechanizmusának megváltoztatását, mivel a telítetlen zsírsavaknak az élelmiszer minőségére jelentős befolyásuk van, és jelentősek biológiai folyamatokban is. A zsírok és olajok tulajdonságait zsírsav-összetételük határozza meg, ami viszont hatással van táplálkozási minőségükre és oxidációval szembeni stabilitásukra. Hasonló módon, azoknak a növényi lipideknek a sajátos szerkezete és összetétele, amelyeket a növény a zsírsavakból szintetizál, függ attól a zsírsav-készlettől, amely a lipidek bioszintézise során prekurzorként hozzáférhető.
Napjainkban érdeklődésre tart számot az élelmiszerek telített zsírsav tartalmának csökkentése. Orvosi és táplálkozástani kutatások arra vezettek számos élelmiszer- és élelmiszer-komponens-gyártót, hogy zsír- és olajalapú élelmiszereikben és élelmiszer-komponenseikben bizonyos összetétel megvalósítására törekedjenek. Ez a megkívánt összetétel gyakran magas mono- és politelítetlen zsírsav és az ennek megfelelő triacil-glicerin készletet jelent, vagy alacsony telített zsírsav és telített zsírsav-alapú triacil-glicerin tartalomra törekszenek. A növényi eredetű zsírok és olajok ipari felhasználói gyakran előnyben részesítik ipari eljárásaikban a meghatározott tulajdonságokkal bíró nyersanyagokat, és az ilyen meghatározott tulajdonságok gyakran egy bizonyos zsírsavegység magas %-os arányban való előfordulását jelentik. Ez az előnyben részesített zsírsavegység gyakran egy telítetlen zsírsavegység, például palmitoleát, oleát, linoleát vagy linolenát. Sajnálatos módon azonban a természet nincs ezzel összhangban, nincsenek olyan olajnövények, amelyek az előnyös összetételt hoznák létre. Erőfeszítések történtek ezért olyan olajos mag változatok és hibridek kifejlesztésére, amelyekkel magasabb egyszeresen telítetlen zsírsavtartalmú növényi olajok hozhatók létre. Figyelembe véve azonban a teljes-növény genetikai eljárások fejlődő jellegét, továbbra is fennáll a szükségessége és az arra vonatkozó igény, hogy olyan kompozíciók és eljárások jöjjenek létre, amelyek úgy hatnak és azt eredményezik, hogy génsebészeti eljárással egyetlen gén szintjén biokémiai utak legyenek teremthetők.
Ha a hagyományos növénynemesítési eljárásokkal sikerül is egy növényváltozat lipidjeiben a zsírsavösszetételt megváltoztatni, a növény természetes biokémiai útjai továbbra is korábbról ismert jellemzőiket fejtik ki, és korábbi korlátáikkal bírnak. így például azok az olajnövények (olajmag-növények), amelyeket a növénynemesítők fejlesztettek ki, a környezeti változásokra a szokásos módon reagálnak. Ezek közé a reakciók közé tartozik a melegebb tenyésztési körülmények között magasabb %-os telített zsírsav termelés, hűvösebb tenyésztési körülmények mellett magasabb %-os telítetlen zsírsavtermelés, miáltal adott zsírsavösszetételű olajnövény megbízható termelése éppoly nehézzé válik, mint az időjárás megjóslása. Ennek megfelelően igen kívánatos lenne olyan eszközökkel bírni, amelyek ezeket a környezeti befolyásokat kiegyenlítik. Ebben az irányban ezideig kevés erőfeszítést tettek.
Végül, folyamatos igény van a haszonnövények környezeti elterjedtségének javítására és kiterjesztésére. Egyes olajos mag fajták mérsékelt, szubtrópusi és trópusi környezetből származnak, és a hűvösebb termelési területekhez gyengén adaptálódtak. Még azon olajos magvak esetén is elő nyös a további adaptáció, amelyeknek a hűvösebb éghajlat megfelel, mivel a korábbi tavaszi ültetés és a nyáron és ősszel megnyújtott tenyésztési időszak esetenként nagyobb terméshozamban nyilvánul meg. A növénytermesztők figyelmük nagy részét a szükséges klimatikus adaptáció egy szempontjára összpontosították, az érési sebességre, de van a klimatikus adaptációnak egy másik fontos szempontja is, a hidegtűrés (megkülönböztetendő a fagytűréstől).
A következőkben az ábrákat ismertetjük.
Az 1. ábrán az 1-5. példákban leírt transzformációs munkához alkalmazott plazmid térképét mutatjuk be.
A 2. ábrán az 1-4. példában bemutatott kísérletek eredményeinek oszlopgrafikonját mutatjuk be, ahol látható a 16:1/16:0 és 18:1/18:0 arány a kontroliban és transzformált hegszövetben (a fenti, és a leírás további részében szereplő arányoknál az első szám a szénatomok számát, a második a vegyületben lévő telítetlen kötések számát jelöli).
A 3. ábrán az 1-4. példákban leírt vizsgálatok eredményeit mutatjuk be oszlopgrafikonban, az ábrán komputerrel létrehozott kép látható azokról a génekről, amelyek a találmány szerinti, PCR (polimeráz láncreakció) révén sokszorozott gén jelenlétét mutatják.
A 4. ábrán az 1-4. példákban leírt vizsgálatok eredményeit bemutató oszlopgrafikon látható, az ábrán a kontroll és a transzformált növényi szövet 16:1/16:0 és 18:1/18:0 arányaiban lévő különbségeket mutatjuk be.
Az 5. ábra az 1-4. példák szerinti vizsgálatok eredményeit mutatja be oszlopgrafikonban, az ábrán a kontroll • · · · és a transzformált növény 16:0, 18:2 és 18:3 zsírsavainak százalékos mennyiségében jelentkező különbséget mutatjuk be.
A 6. ábrán az 1-4. példák szerinti vizsgálatok eredményeit mutatjuk be oszlopgrafikonban, az ábrán a kontroll és a transzfonnált növényi szövet 16:1, 16:3, 18:0 és 18:1 vegyületeinek százalékos szintje közötti különbséget ábrázoljuk.
A 7. ábrán az 1-4. példák szerinti vizsgálatok eredményeit mutatjuk be oszlopgrafikonban, az ábrán a kontroll és a transzformált növényi szövet 16:1/16:0 és 18:1/18:0 arányaiban lévő különbséget mutatjuk be.
A 8. ábrán az 1-5. példák szerinti vizsgálatok eredményeit mutatjuk be oszlopgrafikonban, az ábrán a találmány szerint transzformált növény érett magvának telített zsírsav: telítetlen zsírsav arányának változását mutatjuk be.
Az alábbiakban részletesebben ismertetjük a találmányt .
A találmány növények genetikai módosítására egy kiméra gén konstrukciót nyújt, melynek révén a növények telítetlen zsírsav termelése és telítetlen zsírsav tartalma, valamint az ezekből a zsírsavakból termelődő lipidek menynyisége növelhető. A kiméra gén konstrukció egy olyan szekvenciát tartalmaz, amely lényegében csak egy zsírsav koenzim A (CoA) vagy A 9 deszaturáz enzimet kódol. A kódoló szekvencia működőképesen kötött azokhoz az 5’-vég, illetve a 3'-vég irányában elhelyezkedő regulátor komponensekhez, amelyek a génnek a növényi sejtekben való kifejeződését (az * ···· ·· ·« •« « · · · • · · · · · • · · ♦ enzim termelődését) váltják ki. A telítetlen zsírsavakat a növényi és az állati sejtekben különböző enzimek termelik, kevés szerkezeti vagy szekvenciális homológia van az állati és élesztősejtekben, valamint a növényekben található megfelelő enzimek között. Azt találtuk azonban, hogy ha egy koenzim A-függő deszaturáz gént tartalmazó találmány szerinti konstrukciót szokásos transzformációs eljárással beviszünk a növényi sejtekbe - ilyen transzformációs eljárások például a mikrorészecske-bombázás, az Agrobacteriumos fertőzés vagy a mikroinjektálás - a gén a sejtben a mellérendelt növény regulációs szekvenciájának szabályozása alatt kifejeződik, és sikeresen működik közre a növényi sejtekben természettől fogva jelenlévő bioszintetikus rendszer ama működésében, mellyel a természetesen termelődő palmitát és sztearát egységek telítetlenné válását katalizálja, miáltal palmitoleátot és oleátot termel. Azáltal, hogy ezen egyszeresen telítetlen vegyületek nagyobb mennyiségének képződését segíti elő, a találmány kedvez más magasabb telítetlenségi fokú zsírsavegységek termelődésének is, amelyek prekurzorául az egyszeresen telítetlen zsírsavak szolgálnak. Ezek a telítetlen egységek azonosak a természetben előforduló telítetlen zsírsavegységekkel, és ezután a meglévő biokémiai utak révén beépülhetnek a növényi szövetek triacil-glicerin tartalék lipidjei közé. Ily módon növekszik a telítetlen zsírsavegységek és megfelelő triacil-glicerinek (valamint a mono- és diacil-glicerinek, foszfolipidek és egyéb zsírsav eredetű lipidek) százalékos mennyisége. Ennek megfelelően a találmány olyan növényi
sejteket és teljes növényeket biztosít, amelyekben a telítetlen zsírsavegységek és a megfelelő zsírsav-eredetű lipidek mennyisége megnövekedett, ezek a növényi sejtek a találmány szerinti kiméra gén konstrukciót tartalmazzák. A találmány tárgyát képezi egy eljárás is növényi sejtekben és teljes növényekben lévő telítetlen zsírsavegységek és az ezeknek megfelelő zsírsav eredetű lipidek százalékos menynyiségének növelésére, amely eljárás abban áll, hogy a nevezett növényi sejtekbe vagy a teljes növény sejtjeibe egy a találmány szerinti kiméra gén konstrukciót inzertálunk.
A dohány növényt modellrendszerként tekintve, a dohány leveleiben két fő telített zsírsav található, a palmitinsav (16:0) és a sztearinsav (18:0). Ezeket a molekulákat szubsztrátként használva kettőskötéseket hozunk létre, egyszerre egyet, egymást követő deszaturálási reakciókkal. Ezekben a reakciókban deszaturázok vesznek részt, amelyek a hidrogén eltávolítását és az elektron átvitelt katalizálják. A növényekben az első deszaturálási lépést egy a kloroplasztokban elhelyezkedő oldható enzim katalizálja. A maga sabbrendű növényekben az acil-hordozós-proteinekké (ACP) vagy bizonyos glicerin-lipidekké észterezett palmitinsavból és sztearinsavból 16:1 és 18:1 zsírsavak képződnek. A deszaturációs reakció (a telítetlenné válás) mind a plasztidokban, mind az endoplazmatikus retikulumban végbemehet, a különböző szubcelluláris elhelyezkedések esetén az enzimeket nyilvánvalóan különböző gének kódolják. Feltehetőleg a növényrendszerek fajlagos deszaturáz aktivitását legalább 8 gén szabályozza.
*
- 9 Pórsáfrány (olajözön”) deszaturázzal végzett in vitro vizsgálatok azt mutatják, hogy az E. coli extraktumokhoz ferridoxin adagolása szükséges. Hasonló eredményekre jutottunk avokádó deszaturáz vizsgálatával.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint patkányból származó sztearil koenzim A deszaturázt alkalmazunk. Ez egy Λ 9 deszaturáz, amely egészséges patkányban a citoplazmában lévő redukált citokróm b5~ből von el elektronokat. Ez a reakció a szokásos növényekben általában a kloroplasztban zajlik le Δ9 deszaturáz révén. A zsírsavak intermembrán formái CoA-szármázékok formájában létezhetnek a citoplazmában. Arra a felismerésre jutottunk, hogy egy más élő-rendszerből származó deszaturáz hatékonyan működhet oly módon, hogy a biológiai út legfontosabb komponenseivel a növény látja el, annak a nagy eltérésnek ellenére, ami a két elő-rendszerben jelen lévő gének és proteinszekvenciák között fennáll. így a találmány tárgya egy olyan biokémiai út létrehozása a növényben, amely szokásosan a zsírsavak CoA formáit használja fel, és inkább a citoplazmában működik, mint a kloroplasztban. A találmány alkalmazásával végzett vizsgálatok azt mutatják, hogy a növényekben jelen lévő citokróm bg és citokróm bg reduktáz megfelelően tudja helyettesíteni a funkcionális patkány deszaturáz komplexben szokásosan előforduló komponenseket.
Azt is megfigyeltük, hogy a telítetlen zsírsavak és az ezekből származó lipidek szintézise a növény szokásos válasza hideg környezeti feltételekre. A megváltozott membrán zsírsav-összetétellel bíró baktériumok alacsonyabb hő-
mérsékleten voltak képesek túlélésre, mint a vad típusú törzsek. Bár ennek okát nem kívánjuk következő feltételezésünkre korlátozni, úgy véljük, hogy azoknak a zsírsavaknak és lipideknek a szintézise, amelyek alacsonyabb hőmérsékleten maradnak folyékonyak, mint az ezeknek megfelelő telített zsírsavak és lipidek, hozzájárul ahhoz, hogy a membrán fluiditása alacsony hőmérsékleten megmaradjon, segíti a növényt az alacsony hőmérséklet elviselésében. Ennek megfelelően találmányunk lehetőséget nyújt arra is, hogy növények hidegtűrését fokozzuk telítetlen zsírsavak és ezekből származó lipidek szintézisére való természetes képességük fokozásával .
Az előzőek fordítottjaként, a növények hajlamosak arra, hogy melegebb környezeti körülmények között teljesen telített zsírsavakat és ezekből származó lipideket szintetizáljanak. Másrészt, a találmány szerint alkalmazott deszaturáz gének jellemzően állati vagy élesztő eredetűek, ezért meglehetősen hatékonyan működnek melegebb hőmérsékleteken, amelyeket természetes gazdaszervezetük általában nyújt. így a találmány azt a lehetőséget is biztosítja, hogy a melegebb tenyésztési körülmények hatásait az olajnövények lipid-összetételére kiküszöböljük vagy kompenzáljuk azáltal, hogy olyan deszaturáz gént alkalmazunk, amely magasabb hőmérsékleteken aktívabb, és így nagyobb mennyiségű zsírsav deszaturázt termel magasabb hőmérsékleten.
Bár bármely növényi faj módosítható a találmány szerinti expressziós kazetta és eljárások alkalmazásával, ezek közé tartoznak példaként, a korlátozás szándéka nélkül a * 9 ·*«· · w« · • · ·· ·<·»· * * « · · ·« • · * « · · ♦ · · ··· ·· »··« ««
- 11 Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geránium, Manicot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petúnia, Digitális, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Triticum és Datura nemzetségek, a találmány szerint elvégezhető zsírsav módosítások legnagyobb előnnyel az olajnövényeknél használhatók, ilyen növények például a szójabab, a napraforgó, a repce, a pórsáfrány, a földimogyoró, a kukorica, a len, a kínai-faggyúfa, a jojoba és a pálma.
A zsírsav koenzim A deszaturáz bármely megfelelő állati vagy élesztő gazdaszervezetből klónozható, mivel megállapítást nyert, hogy ennek a génnek a szekvenciája az emlős fajok során át rendkívül konzervatív, még az emlős és élesztő gének között is vannak homológ régiók. A 18:0 18:1 átalakulási lépést katalizáló deszaturázt kódoló gént patkányból, egérből és élesztőből klónoztuk. Végül a Humán Genom Project (emberi genom terv) el fogja készíteni a humán zsírsav CoA deszaturázt kódoló szekvenciát, amelyet kívánság szerint használni lehet. Másrészt, nem találtunk kimutatható azonosságot a patkány sztearil CoA deszaturáz (amelyet az itt leírt transzformációs munkánál használunk) és a ricinus (Ricinus communis) sztearil-ACP deszaturáz között, így a szükséges koenzim A-dependens gént nem tudtuk növényekből kinyerni.
- 12 A zsírsav-eredetű lipid megjelölésen bármely olyan természetes előfordulású növényi lipidet értünk, amelynek prekurzora egy telített vagy telítetlen, 12 vagy magasabb szénatomszámú zsírsav, amelyet a növény szintetizál. Ezek közé tartoznak többek között a mono-, di- és triacil-glicerinek, foszfolipidek, például a foszfatidil-kolin és foszfatidil-etanolamin, glikolipidek és a levélszövetek egyéb lipidjei. Azáltal, hogy a természetes előfordulású zsírsav kiindulási anyagokat a telített vegyületekből telítetlen vegyületek szintézisére használjuk fel, a találmány olyan irányba hat, hogy a növényben meglévő természetes biokémiai út a megfelelő telítetlen zsírsav-eredetű lipidek termelődésének kedvez.
A következőkben a találmányt példákban mutatjuk be a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
A növény expressziós plazmidiának konstruálása
A patkány sztearil CoA deszaturáz cDNS egy 1,1 kb kódoló szekvenciából áll, amelyet egy 3,5 kb szekvencia követ, amely a fehérjeszintézisben nem vesz részt. A példákban alkalmazott gén a 3-356 aminosavakat kódolja. A J. Bioi. Chem., 263, 2532-2536 szakirodalmi helyen leírt módon létrehozott pDs3-358 plazmidot P. Strittmattertől kaptuk. Ezt a plazmidot BamHI-vel és Sstl-vel emésztve egy 1,2 kb-os fragmentum szabadul fel, amely a patkány deszaturáz gént tartalmazza. Ezt BamHI-vel és Sstl-vel emésztett Bluescript SK+-hoz (Stratagene) ligáijuk. Ezt a plazmidot ezután HindlII-val és Sstl-vel emésztve egy 1,2 kb-os frag·» ·
- 13 mentum válik szabaddá. A pKYLX71:35S növényi expressziós vektor a pKYlX71 származéka, amelyben a CaMV 35S promotert egy olyan 35S promoter helyettesíti, amely a transzkripció kezdeti helyéhez viszonyított -416 - -90 bázisokat kettőzötten tartalmazza. Ezt a plazmidot HindlII-val és Sstl-vel emésztjük, borjúbél lúgos foszfatázzal kezeljük, és az előzőekben ismertetett 1,2 kb-os fragmentummal ligáljuk, így nyerjük a p712RDS-t. Ez a plazmid a patkány deszaturáz struktúrgénen kívül neomicin foszfotranszferáz gént (amely kanamicin rezisztenciát ad), egy replikációból származó széles, gazda eredetű RK2 tartományt, T-DNA végeket és egy poliadenilálási szignált tartalmaz. Ennek a plazmidnak a térképét az 1. ábrán mutatjuk be. A kontroll plazmid nem tartalmazza a patkány deszaturáz struktúrgént, egyébként ezzel azonos. Ezzel a plazmiddal kompetens E. coli TB1 sejteket transz forrná ltunk. 50 mg/1 kanamicinnel és 12,5 mg/1 tetraciklinnel kiegészített LB lemezekről egyedülálló telepeket nyertünk. A telepeket folyékony tápközegbe vittük, és DNS-t készítettünk lúgos lízissel. A kívánt méretű plazmidokat használtuk a további vizsgálatokban.
2. példa
Növény transzformálása
Nicotiana tabacum cv. Xanthi növényeket Agrobacterium tumefaciens-szel együtt tenyésztve transzforrnáltunk, az eljárást Horsch és munkatársai, Sciene 227, 1229-12231 (1985) által leírt módon végeztük, azzal az eltéréssel, hogy levélkorongok helyett levélcsíkokat alkalmaztunk. A kanamicin rezisztenciára vonatkozó szelekciót 100 mg/1 kon14 centrációnál végeztük. A kanamicin jelenlétében mind a szőve theg-képződés, mind hajtások kialakulása, mind gyökérképződés bekövetkezett. A tápközegbe 300 mg/1 koncentrációban mefoxint adagoltunk az Agrobacterium tumefaciens elkülönülés megakadályozására. A pKYLX71:35S és a p712RDS plazmidokat E. coliból A. tumefaciens LBA4404 törzsbe 3-szülős keresztezéssel vittük át pRK2013 segítő (helper) plazmid alkalmazásával .
3. példa
Növényi DNS izolálása és szekvencia sokszorozás
A zöld levelekből savas guanidin-tiocianátos extrahálással elkülönítjük a teljes növényi DNS-t. Az ossz növényi nukleinsavat 4 mól/l-es lítium-kloriddal elegyítjük, a felülúszóx. (amely a DNS-t tartalmazza) egy másik csőbe átvisszük, és két térfogat etanollal kicsapjuk. A DNS-t kicentrifugáljuk belőle, 70 %-os etanollal mossuk, vákuumban szárítjuk, majd 1 mmól/l-es Trisz, 0,1 mmól/l-es EDTA, pH = = 7,5-es pufferben újra szuszpendáljuk.
A PCR-eket 20 μΐ össztérfogatban végezzük, amely 200 ng OSSZ levél DNS-t, 11 ng (5' ACGTGGATCCACCATGCCGGCCCACATGCTC 3’ és 5' GCTACTCTTGTGGCTCCC 3') prímért, 1 mmól/1 dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t, 50 mmól/1 kálium-kloridot, 10 mmól/1 pH = 8,3-es Triszt, 1,5 mmól/1 magnézium-kloridőt, 0,01 % zselatint és 1 egység Taq DNS polimerázt (AmpliTaqTM DNS polimeráz, Perkin-Elmer Cetus) tartalmaz. A negatív kontroll minden fenti összetevőt tartalmaz, kivéve a növényi DNS-t. Egy másik negatív kontroll olyan kanamicin rezisztens növényekből származó DNS-t tartalmaz, amelyet a növények transzformálására alkalmazott, de deszaturáz szekvenciát nem tartalmazó vektorral (pKYLX71:35S) transzformáltunk. A reakcióelegyet ásványolajjal fedjük, és hő-ciklus készülékbe (Lab-Line) helyezzük. A hőmérsékletet 2 s ideig 95 °C értéken (denaturálás) , majd 2-2 s ideig 64 °C, és 59 °C értéken (temperálás és illesztés), végül 180 s ideig 72 °C értéken (extenziő) tartjuk, összesen 30 ciklust végzünk. A PCR termékeket 0,8 %-os agaróz gélen frakcionáljuk, TAE futtatópuffért alkalmazunk. Méret-marker 1 kb DNS sorozatot (BRL) alkalmazunk.
4. példa
Lipid frakcionálás és zsírsav analízis
Mintegy 0,5 g levélszövetet mintegy 3 ml 2:1 arányú kloroform/metanol elegybe helyezünk, és szövethomogenizátorral (Tekmar) homogenizáljuk. Az anyagot Speedvac berendezésben töményítjük, és szilikagél 60 lemezen frakcionáljuk PC izolálás céljából. A foltokat lekaparjuk, és kénsav és metanol elegyével az alábbiakban megadott módon metilészterré alakítjuk. A szárazanyagtartalom meghatározására szolgáló levélmintákat liofilizáljuk.
Az összes zsírsavból metil-észtert készítünk üvegcsövekben, 100-200 mg hegszövetből indulunk ki, amelyet 2 ml 1 %-os metanolos kénsavban szövethomogenizátorral, amint azt az előzőekben említettük, vagy üvegbottal homogenizálunk. Az össz-zsírsav analízis céljára szolgáló leveleket nem homogenizáljuk. Az átészterezést 80 °C hőmérsékleten végezzük amíg mintegy 0,2 ml metanol marad vissza. Belső standardként közvetlenül a növényi szövethez 0,1 mg/g friss szövet arányban heptadekánsavat (17:0; 1 mg/ml-es hexános oldat) adunk. A hexánt hagyjuk mintegy 10 percig elpárologni a szövet extrahálását megelőzően. Az össz-zsírsav menynyiséget a kromatogram csúcs alatti területeinek a heptadekánsav csúcs alatti területével való összehasonlításával határozzuk meg. A zsírsavaknak a vékonyréteg lemezeken frakcionált lipidekből történő mennyiségi meghatározására 25 mg nonadekánsavat (19:0) adunk minden folthoz lekaparás előtt. A zsírsav-metil-észtereket kromatográfiás eljárással vizsgáljuk [Dahmer és munkatársai: J. Amer, Oil Chem. soc., 66. 543-548 (1989) által leírt módon, azzal az eltéréssel, hogy Hewlett Packard FFAP oszlopot alkalmazunk.
A PC, FFA, TG, 16:0, stb. standardok a Sigma cégtől származóak. Az Arabidopsis thaliana FadC mutáns levelek a 16:1 vegyületet akkumulálják (Science 252, 80-87 (1991)]. A FadD mutáns levelek a 16:2 akkumulálására képesek a 16:3 megfelelő csökkenése mellett. A 16:1, 16:2 és 16:3 retenciós idejének meghatározására ezekből és vad típusú levelekből származó extraktumokat alkalmazunk.
A következő eredményeket értük el.
Agrobacterium tumefaciens közvetítette transzformálást követően kanamicin rezisztens dohány hegszöveteket vizsgálunk sorozatban zsírsavösszetételük megváltozásának megállapítására. Egyes hegszövetek magasabb arányban tartalmazzák a 16:1/16:0 és/vagy 18:1/18:0 vegyületeket, mint a kontrollok (2. ábra). A 18:1/18:0 arány nem mondható meg előre a 16:1/16:0 arányból. Tíz vizsgált deszaturáz transzformáns közül kilencben a 18:1/18:0 arány magasabb volt, mint a 16:1/16:0 arány, ugyanez volt látható a kontroll hegszövetekben. Ezek az adatok azt engedik sejteni, hogy a regenerált növények megváltozott zsírsav-szintekkel is bírhatnak .
Azokat az adatokat, amelyek bevitt deszaturáz gén jelenlétét jelzik a 3. ábrán mutatjuk be. A teljes növényi DNS PCR sokszorozása megerősítette, hogy a kívánt 1,1 kb-os termék nem található meg abban a két kontrollnövényben, amelyet patkány deszaturáz gént nem tartalmazó plazmiddal transzformáltunk. A 4-7. ábrákon grafikusan ábrázoljuk a fenti növények leveleinek elemzési eredményeit.
Reméltük, hogy a hegszövethez hasonlóan a patkány deszaturáz gént tartalmazó levelek ugyancsak megnövekedett 16:1/16:0 és/vagy 18:1/18:0 aránnyal bírnak a kontrollokhoz viszonyítva. A 4. ábrán két, patkány deszaturáz génnel transzformált növény (RT és RU) egyértelműen megnövekedett 16:1/16:0 arányát mutatjuk be. Az RT növény esetén a 18:1/18:0 arány magasabb, míg az RU növénynél nem. Ez ellentétben van a hegszövetre kapott adatokkal (2. ábra), ahol a 18:1/18:0 arány következetesen magasabb a patkány deszaturáz gént hordozó hegszövetben, mint a kontrollókban. Azonban a CaMV 35S promoter nem működik olyan jól bizonyos differenciálódott szövetekben, mint a nem-differenciálódott hegszövetsejtekben, ez magyarázhatja a különbséget.
Mivel nem volt ismert, hogy a bevitt deszaturáz milyen hatást válthat ki a zsírsav-összetételre és a zsírsav mennyiségre, meghatároztuk a 16:0, 16:1, 16:2, 16:3, 18:0, 18:1, 18:2 és 18:3 vegyületek mennyiségét. Ezen egységek
változásának láthatóvá tételére összesítjük a dohánylevelekben lévő 16:0, 16:1, 16:2, 16:3, 18:0, 18:1, 18:2 és 18:3 mennyiségeit, és minden egyes zsírsav mennyiségét ennek az össz-zsírsavtartalomnak a %-os arányában fejezzük ki (5. ábra). Nagy növekedést észlelünk a 16:1-ben, valamint csökkenést a 16:0 és 18:0 esetén az RT és RU növényekben. A 18:2 mennyisége is megnövekedett a kontrollokhoz képest. Az RT és RU deszaturáz transzformánsok 18:3 aránya csökkent a kontroliokéhoz képest.
Annak érdekében, hogy a lipidek akkumulációjáról általános áttekintést nyerjünk, összesítjük a 16 és 18 szénatomos zsírsavak (16:0, 16:1, 16:2, 16:3, 18:0, 18:1, 18:2 és 18:3) mennyiségét, és a friss növény grammjára vagy a száraz tömeg grammjára (erre vonatkozó adatok nem szerepelnek az ábrákon) vonatkoztatva milligramm mennyiségben adjuk meg. A 16 és 18 szénatomos zsísavak ossz mennyiségének a kontroliban és a deszaturázzal transzformált növényekben való hasonló értékei arra engednek következtetni, hogy a levél lipid-metabolizmusának útjai között kiegyenlítődés következik be. Ilyen kiegyenlítődés van jelen az Arabidopsis [Science 252. 80-87 (1991)] különféle deszaturáz mutánsai esetén is.
Annak további jelzésére, hogy a bevitt gén termékéből származó deszaturázzal transzformált dohányban megnövekedett a 16:1 szint, a levél-lipideket osztályokba soroltuk. Mivel a 16:1 vegyület szokásosan nem jelenik meg a növény foszfatidil-kolinjában (PC), ezt a frakciót részletesebben vizsgáltuk, eredményeinket a 6. ábrán mutatjuk be.
Látható, hogy a 16:1 csak azoknak a növényeknek a foszfatidil-kolinjából mutatható ki, amelyeket patkány deszaturáz génnel transzforrnáltunk. Ez a minőségi különbség a kontrollok és a deszaturáz transzformánsok között nyilvánvaló bizonyítékát adja annak, hogy a bevitt deszaturáz gén működik a levélszövetben. A 16:1 jelenléte a patkány deszaturáz génnel transzformált levelekből származó foszfatidil-kolinban (6. ábra) szükségszerű ahhoz, hogy a mag lipid-összetétele, amely elsősorban triglicerid, megváltozzon. A foszfatidil-kolin a fejlődő magokban lévő triglicerid közvetlen prekurzora.
Az a lehetőség, hogy növények zsírsavösszetételét kezelni tudjuk patkányból származó deszaturázzal, azt mutatja, hogy a növényi lipidszint megváltoztatására más lehetőség is van, mint a mutáns szelekció.
5. példa
Megvizsgáltunk transzgénes növényekből származó magokat is, és az ossz levél lipid 16:1 zsírsavegységeinek rendkívüli növekedésének megismétlődését észleltük a mag lipidekben is, bár alacsonyabb szinten, amint az a 7. ábrán látható. Ugyancsak megnövekedett a vizsgált deszaturáz transzformánsok telített/telítetlen zsírsav aránya a kontroll transzgénes növényi levél és magszövetek hasonló arányához képest (7. ábra). Ezt támasztja alá a 16 szénatomos zsírsavegységek telített/telítetlen arányára vonatkozó megfigyelésünk is. Amint az a 8. ábrán látható, a kiválasztott transzgénes növények, a G, M, U, T, J és W nagy csökkenést mutatnak a 16:0/(16:1 + 16:2 + 16:3) arányban az E »· · · • · kontrollnövényhez viszonyítva.
6. példa
A J. Bioi. Chem., 263, 2532-2536 szakirodalmi helyen leírt módon létrehozott pDs3-358 plazmidot P. Strittmattertől kaptuk. Ezt a plazmidot BamHI-vel és Sstl-vel emésztve egy 1,2 kb-os fragmentum szabadul fel, amelyik patkány deszaturáz gént tartalmazza. Ezt az előzőekben elkészített ACT vektorral, a pALLNAPGl-gyel ligáijuk, így a pALLNAPSCD-t nyerjük; ezzel az eljárással a sztearil CoA deszaturázt kódoló részt közvetlenül a mag-fajlagos promóter napin mögé helyezzük egy bináris vektorban, amely a növény transzformálására kész.
A napin promótert és a sztearil CoA deszaturáz gént tartalmazó promóter-gén kazettát HindlII-SstI fragmentumként kihasítjuk, és egy bináris vektor, a pALLTKrep HindlII-SstI fragmentumának helyettesítésére használjuk, így hozzuk létre a pALLTKNAPSCD-t, amely szerkezetileg és funkcionálisan ekvivalens a pALLNAPSCD-vel, azzal az eltéréssel, hogy jobban szelektálja a transzgénes növényeket kanamicin antibiotikumon. A DNS-nek Agrobacteriumba való átvitelét közvetlenül az organizmusba történő transzformálással valósítjuk meg, mivel a háromszülős párosítást - az előzőekben leírtak szerint - ellenezzük. A gént canola sejtekbe inzertáljuk a sejt megsértésével és együttes tenyésztéssel, és a teljes canola transzformánsokat regeneráljuk a transzformált hegszövetekből. A regenerált transzformált növényekből magokat nyerünk.
Az 1 azonosítási számú szekvenciára vonatkozó infor21 máció:
(1) a szekvencia jellemzői:
(Ά) hossza: 31 bázis (B) típusa: nukleotid (C) szála: 1 szálú (D) topológia: lineáris (ii) molekulatípus: szintetikus DNS (iii) hipotetikus: nem (iv) antiszenz: nem (x) publikációs információ:
(A) szerzők: Strittmatter és munkatársai (C) folyóirat: J. Bioi. Chem. 263. 2532-2536 (1988) (xi) a szekvencia leírása:
DNS sokszorozási polimeráz láncreakcióban (PCR) alkalmazott primer.
azonosítási számú szekvencia:
ACGTGGATCC ACCATGCCGG CCCACATGCT C (2) a 2 azonosítási számú szekvenciára vonatkozó információk:
(i) a szekvencia jellemzői:
(A) hossza: 18 bázis (B) típusa: nukleotid (C) szála: 1 szálú (D) topológia: lineáris (ii) molekulatípus: szintetikus DNS (iii) hipotetikus: nem (iv) antiszenz: nem
• 4 (x) publikációs információ:
(A) szerzők: Strittmatter és munkatársai (C) folyóirat: J. Bioi. Chem. 263, 2532-2536 (1988) (xi) a szekvencia leírása:
DNS sokszorozási polimeráz láncreakcióban (PCR) alkalmazott primer.
azonosítási számú szekvencia:
GCTACTCTTG TGGCTCCC.
♦

Claims (21)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Kiméra expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy egy olyan cDNS kiónt tartalmaz, amely lényegében pusztán egy zsírsav koenzim A deszaturázt kódol, amely működőképesen kötődik egy regulátor szekvenciához, ami a cDNS kiónnak a növényi sejtekben való kifejeződését váltja ki.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, azzal jellemez ve, hogy működőképesen kötött egy regulátor szekvenciához, amely a cDNS klón baktérium sejtekben való kifejeződését váltja ki.
  3. 3. Baktérium sejtek, amelyek idegen plazmádként a 2. igénypont szerinti expressziós kazetta legalább egy kópiáját tartalmazzák.
  4. 4. Transzformált növényi sejtek, azzal jel- lemez ve, hogy az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta legalább egy kópiáját tartalmazzák.
    5. A 4. igénypont szerinti transzformált sejtek, azzal jei. j « 1 1 e m e z v e, hogy egyszikű fajok sejt- 6. AZ 5. igénypont szerinti transzformált sejtek, azzal j β 1 1 e m e z v e, hogy kukorica, cirok, bú-
    za, pálma vagy rizs sejtjei.
  5. 7. A 4. igénypont szerinti transzformált sejtek, azzal jellemez ve, hogy kétszikű fajok sejt- jei.
    4 ♦
  6. 8. A 7. igénypont szerinti transzformált sejtek, azzal jellemez ve, hogy szójabab, repce, jojóba, kínai-faggyúfa, dohány, pórsáfrány, földimogyoró vagy napraforgó sejtjei.
  7. 9. Sejt vagy szövettenyészet, amely a 8. igénypont szerinti sejteket tartalmazza.
  8. 10. Transzformált szójabab növény, amelynek sejtjei az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta legalább egy kópiáját tartalmazzák.
  9. 11. Transzformált repcenövény, amelynek sejtjei az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta legalább egy kópiáját tartalmazzák.
  10. 12. Transzformált napraforgónövény, amelynek sejtjei az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta legalább egy kópiáját tartalmazzák.
  11. 13. Transzformált pórsáfrány növény, amelynek sejtjei az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta legalább egy kópiáját tartalmazzák.
  12. 14. Transzformált földimogyoró növény, amelynek sejtjei az 1. igénypont szerinti expressziős kazetta legalább egy kópiáját tartalmazzák.
  13. 15. Eljárás telítetlen zsírsavegységek és az ezeknek megfelelő zsírsav eredetű lipidek százalékos összetételének növelésére növényi sejtekben és teljes növényben, azzal jellemezve, hogy az ilyen növényi sejtekbe vagy a teljes növény sejtjeibe az 1. igénypont szerinti kiméra expressziós kazettát inzertáljuk.
  14. 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal tf ··*<
    «· » jellemezve, hogy a teljes növényt ivarosán vagy klónozással reprodukáljuk oly módon, hogy a reprodukcióból származó szaporulat sejtjeiben az expressziós kazetta által nyújtott szekvencia legalább egy kópiája legyen jelen.
  15. 17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós kazettát elektroporációval visszük be a sejtekbe.
  16. 18. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós kazettát mikrorészecske-bombázással visszük be a sejtekbe.
  17. 19. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az expressziós kazettát mikroinjektálással visszük be a sejtekbe.
  18. 20. Eljárás telítetlen zsírsavegységek és az ezeknek megfelelő zsírsav eredetű lipidek százalékos mennyiségének növelésére Agrobacteriumra érzékeny kétszikű növényekben, amelyeknek sejtjeibe az expressziós kazettát a sejteknek agrobaktériummal való fertőzésével visszük be, amelynek egy plazmidja oly módon módosított, hogy magában foglalja az 1. igénypont szerinti expressziós kazettát.
  19. 21. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy zsírsav koenzim A desz aturáz génje sztearil koenzim A deszaturáz gén.
  20. 22. Az 1. igénypont szerinti expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy zsírsav koenzim A deszaturáz génje emlős vagy élesztő eredetű.
  21. 23. A 21. igénypont szerinti expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy a zsírsav koenzim A deszaturáz génje egy patkányból származó sztearil koenzim A deszaturáz gén.
    óid ΟΧΙ-
HU929204175A 1991-12-31 1992-12-30 Changing of fatty acids in transgenic plant tissues by delta 9 desaturase HUT63653A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US81628891A 1991-12-31 1991-12-31

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9204175D0 HU9204175D0 (en) 1993-04-28
HUT63653A true HUT63653A (en) 1993-09-28

Family

ID=25220185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU929204175A HUT63653A (en) 1991-12-31 1992-12-30 Changing of fatty acids in transgenic plant tissues by delta 9 desaturase

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5866789A (hu)
EP (1) EP0550162B1 (hu)
JP (1) JPH0698777A (hu)
KR (1) KR930013121A (hu)
AT (1) ATE190661T1 (hu)
AU (2) AU671962B2 (hu)
CA (1) CA2084348A1 (hu)
DE (1) DE69230785T2 (hu)
HU (1) HUT63653A (hu)
MX (1) MX9207053A (hu)
NZ (1) NZ245367A (hu)
PL (1) PL171514B1 (hu)

Families Citing this family (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
PT561569E (pt) * 1992-03-13 2003-10-31 Agrigenetics Inc Modificacao de oleos vegetais utilizando dessaturase
US5639645A (en) * 1993-09-22 1997-06-17 Mitsubishi Corporation Recombinant Δ9 desaturase and a gene encoding the same
ES2222462T3 (es) * 1993-12-28 2005-02-01 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Gen que codifica acido graso-desaturasa, vector que contiene dicho gen, planta que contiene dicho gen transferido a ella y procedimiento para crear dicha planta.
US5968809A (en) 1997-04-11 1999-10-19 Abbot Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids
US7745694B1 (en) 1997-04-11 2010-06-29 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants
US6075183A (en) * 1997-04-11 2000-06-13 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US6051754A (en) * 1997-04-11 2000-04-18 Abbott Laboratories Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants
US7585645B2 (en) * 1997-05-27 2009-09-08 Sembiosys Genetics Inc. Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products
US6225528B1 (en) * 1997-09-04 2001-05-01 Rutgers, The State University Of New Jersey Method of making pathogen-resistant plants by transformation with a fatty acid desaturase gene
AR023301A1 (es) 1998-03-30 2002-09-04 Dow Agrosciences Llc Metodo para modificar gencticamente una planta para que la misma produzca una semilla vegetal con niveles alterados de rcidos grasos saturados
US6459018B1 (en) 1998-06-12 2002-10-01 Monsanto Technology Llc Polyunsaturated fatty acids in plants
US7183458B1 (en) 1999-06-07 2007-02-27 Basf Plant Science Gmbh Δ6 acetylenase and Δ6-desaturase from ceratodon purpureus
DE10030976A1 (de) 2000-06-30 2002-01-10 Basf Ag DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren
DE10102337A1 (de) 2001-01-19 2002-07-25 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte
CA2340998C (en) * 2001-03-21 2012-01-03 Saskatchewan Wheat Pool Selective modification of plant fatty acids
US7179647B2 (en) 2002-01-30 2007-02-20 Basf Plant Science Gmbh Elongase gene and method for producing polyunsaturated fatty acids
GB2385852A (en) 2002-02-27 2003-09-03 Rothamsted Ex Station Delta 6-desaturases from Primulaceae
DE10219203A1 (de) 2002-04-29 2003-11-13 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen
EP2216405A1 (en) 2002-05-03 2010-08-11 Monsanto Technology LLC Speed specific USP promoters for expressing genes in plants
KR100539649B1 (ko) 2002-12-02 2005-12-29 산요덴키가부시키가이샤 연료 전지용 세퍼레이터 및 이를 이용한 연료 전지
US7078234B2 (en) 2002-12-18 2006-07-18 Monsanto Technology Llc Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof
ES2525212T3 (es) 2002-12-19 2014-12-19 University Of Bristol Procedimiento novedoso de producción de ácidos grasos poliinsaturados
CA2517253C (en) 2003-02-27 2018-07-03 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of polyunsaturated fatty acids
EP2116606B1 (en) 2003-03-28 2012-12-19 Monsanto Technology, LLC Novel plant promoters for use in early seed development
EP2365063B1 (de) 2003-03-31 2015-10-14 University Of Bristol Neue pflanzliche Acyltransferase spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren
MXPA05010571A (es) 2003-04-08 2005-11-23 Basf Plant Science Gmbh Delta-4-desaturasas a partir de euglena gracilis, que expresan plantas y aceites que comprenden pufa
US11952581B2 (en) 2003-08-01 2024-04-09 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
CA3037924A1 (en) 2003-08-01 2005-02-10 Basf Plant Science Gmbh Method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
CN1871353B (zh) 2003-08-21 2013-04-24 孟山都技术有限公司 来自报春的脂肪酸去饱和酶
ES2375363T3 (es) 2004-02-27 2012-02-29 Basf Plant Science Gmbh Método para la preparación de ácidos grasos omega-3 insaturados en organismos transgénicos.
JP4567047B2 (ja) 2004-02-27 2010-10-20 ビーエーエスエフ プラント サイエンス ゲーエムベーハー トランスジェニック植物における多価不飽和脂肪酸の製造方法
EP1734947B1 (en) 2004-04-16 2015-04-15 Monsanto Technology, LLC Expression of fatty acid desaturases in corn
US7364883B2 (en) 2004-05-07 2008-04-29 Yeastern Biotech Co., Ltd. Process for producing poly-unsaturated fatty acids by oleaginous yeasts
EP1856264B1 (en) 2005-02-26 2014-07-23 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
EP1871883A1 (en) 2005-03-02 2008-01-02 Metanomics GmbH Process for the production of fine chemicals
DE102005013779A1 (de) 2005-03-22 2006-09-28 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen
CA2606220A1 (en) * 2005-04-19 2006-12-21 Basf Plant Science Gmbh Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants
EP2151498A3 (en) 2005-04-20 2010-12-15 BASF Plant Science GmbH Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
AU2006245701B2 (en) 2005-05-10 2011-04-28 Basf Plant Science Gmbh Expression cassettes for seed-preferential expression in plants
DE102005038036A1 (de) 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen
GB2431158A (en) 2005-10-13 2007-04-18 Rothamsted Res Ltd Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid
DE102005052551A1 (de) 2005-11-02 2007-05-16 Rothamsted Res Harpenden Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae
GB0603160D0 (en) 2006-02-16 2006-03-29 Rothamsted Res Ltd Nucleic acid
AR059376A1 (es) 2006-02-21 2008-03-26 Basf Plant Science Gmbh Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados
US8629195B2 (en) 2006-04-08 2014-01-14 Bayer Materialscience Ag Production of polyurethane foams
WO2008011468A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Monsanto Technology Llc Fatty acid desaturases from tetraselmis suecica
CA2659993C (en) 2006-08-24 2016-01-05 Basf Plant Science Gmbh Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains
ES2531391T3 (es) 2006-10-06 2015-03-13 Basf Plant Science Gmbh Delta-5 desaturasas y procedimiento para la preparación de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos no humanos
US20110035840A1 (en) 2007-02-16 2011-02-10 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledoneous plants
WO2009016208A2 (de) 2007-07-31 2009-02-05 Basf Plant Science Gmbh Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen
WO2009077478A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
WO2009133145A1 (en) 2008-04-30 2009-11-05 Basf Plant Science Gmbh Desaturase and method for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms
CA2989798C (en) 2008-07-01 2019-11-05 Basf Plant Science Gmbh Promoters from brassica napus for seed specific gene expression
US9090902B2 (en) 2008-08-26 2015-07-28 Basf Plant Science Gmbh Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil
DE112009003708T5 (de) 2008-12-12 2012-09-13 Basf Plant Science Gmbh Desaturasen und Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenenOrganismen
DE112010003162T5 (de) 2009-04-22 2012-08-16 Basf Plant Science Company Gmbh Gesamtsamen-spezifischer Promotor
EP2821492A3 (en) 2009-05-13 2015-04-08 BASF Plant Science Company GmbH Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production
WO2011003901A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants
AU2010325720A1 (en) 2009-12-03 2012-07-19 Basf Plant Science Company Gmbh Expression cassettes for embryo-specific expression in plants
AR081302A1 (es) * 2010-06-24 2012-08-01 Brookhaven Science Ass Llc Acumulacion de acidos grasos omega-7 ( -7) en semillas de plantas
CA2804925A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Basf Plant Science Company Gmbh Acyltransferases from thraustochytrium species and uses thereof in fatty acid production
CN103740739B (zh) * 2014-01-20 2015-09-23 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 高山离子芥内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶基因及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5057419A (en) * 1988-09-22 1991-10-15 Rutgers University Genetically engineered plasmid and organisms for the production of specialized oils
DE4004800C2 (de) * 1990-02-13 2000-12-21 Aventis Cropscience Gmbh Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen
WO1991013972A1 (en) * 1990-03-16 1991-09-19 Calgene, Inc. Plant desaturases - compositions and uses
WO1991018985A1 (en) * 1990-05-25 1991-12-12 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleotide sequence of soybean stearoyl-acp desaturase gene
AU675923B2 (en) * 1991-12-04 1997-02-27 E.I. Du Pont De Nemours And Company Fatty acid desaturase genes from plants

Also Published As

Publication number Publication date
AU3018792A (en) 1993-07-08
DE69230785D1 (de) 2000-04-20
CA2084348A1 (en) 1993-07-01
DE69230785T2 (de) 2000-08-10
PL171514B1 (pl) 1997-05-30
NZ245367A (en) 1994-08-26
ATE190661T1 (de) 2000-04-15
HU9204175D0 (en) 1993-04-28
EP0550162B1 (en) 2000-03-15
MX9207053A (es) 1993-07-01
PL297262A1 (en) 1993-09-06
AU671962B2 (en) 1996-09-19
EP0550162A1 (en) 1993-07-07
KR930013121A (ko) 1993-07-21
JPH0698777A (ja) 1994-04-12
US5866789A (en) 1999-02-02
AU6069396A (en) 1996-11-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT63653A (en) Changing of fatty acids in transgenic plant tissues by delta 9 desaturase
US10925293B2 (en) Methods of producing lipids
US7053267B2 (en) Plant seed oils
US7301070B2 (en) Plant fatty acid synthases and use in improved methods for production of medium-chain fatty acids
US6426447B1 (en) Plant seed oils
WO2000075350A2 (en) Nucleic acid sequences encoding proteins involved in fatty acid beta-oxidation and methods of use
JPH11506323A (ja) 酵母ｓｌｃ遺伝子を用いての植物脂質及び種子油の変更
AU2014413993A1 (en) Generation of transgenic canola with low or no saturated fatty acids
EP0666865A1 (en) Plant fatty acid synthases
JPH09501325A (ja) 形質転換植物における蝋エステル
US5859342A (en) Antisense nucleotide sequences affecting fatty acid catabolism in plants
US10370674B2 (en) Generation of transgenic canola with low or no saturated fatty acids
WO2000075343A2 (en) ENGINEERING β-KETOACYL ACP SYNTHASE FOR NOVEL SUBSTRATE SPECIFICITY
US20050170478A1 (en) Expression of phospholipid:diacylglycerine acyltranssferase (pdat) for the production of plant storage lipids with polyunsaturated fatty acids
EP1624066A2 (en) Plant fatty acid synthases and use in improved methods for production of medium-chain fatty acids
CA2463166A1 (en) Production of oil with higher erucic acid content
WO2004007744A2 (en) Engineering $g(b)-ketoacyl acp synthase for novel substrate specificity
AU2008201181A1 (en) Production of oil with higher erucic acid content

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: THE UNIVERSITY OF KENTUCKY RESEARCH FOUNDATION, US

DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee