PL171514B1 - ugrupowan nienasyconych kwasów tluszczowychi odpowiadajacych im pochodnych lipidowych w komórkach roslin i calych roslinach PL PL - Google Patents
ugrupowan nienasyconych kwasów tluszczowychi odpowiadajacych im pochodnych lipidowych w komórkach roslin i calych roslinach PL PLInfo
- Publication number
- PL171514B1 PL171514B1 PL92297262A PL29726292A PL171514B1 PL 171514 B1 PL171514 B1 PL 171514B1 PL 92297262 A PL92297262 A PL 92297262A PL 29726292 A PL29726292 A PL 29726292A PL 171514 B1 PL171514 B1 PL 171514B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- plants
- desaturase
- fatty acid
- cells
- coenzyme
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
- C12N9/0083—Miscellaneous (1.14.99)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8247—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified lipid metabolism, e.g. seed oil composition
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
- C12Y114/19—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with oxidation of a pair of donors resulting in the reduction of molecular oxygen to two molecules of water (1.14.19)
- C12Y114/19002—Acyl-[acyl-carrier-protein] desaturase (1.14.19.2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
1. Sposób zwiekszania zawartosci procentowe j ugrupowan nienasyconych kwasów tluszczowych i odpowiadajacych im pochodnych lipidowych w komórkach roslin i calych roslinach, znamienny tym, ze przeprowadza sie etap insercji do takich komórek roslin nych lub komórek calych takich roslin chimerycznej kasety ekspresyjnej zawierajacej klon cDNA kodujacy zasadniczo wylacznie desaturaze pochodnej kwas tluszczowy-koenzym A, polaczony w usuwalny sposób z sekwencjami regulatorowymi, pobudzajacymi ekspresje klonu cDNA w komórkach roslinnych. PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania zawartości procentowej ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających im pochodnych lipidowych w komórkach roślin i całych roślinach.
Znane jest, że rośliny wytwarzają w sposób naturalny asortyment kwasów tłuszczowych, a z wytworzonych przez siebie kwasów tłuszczowych syntetyzują jeszcze szerszy asortyment lipidów, w tym mono-, di- i triacylogliceroli, fosfolipidów, glikolipidów i innych. Specyficzny asortyment lipidów wytwarzanych przez każdą szczególną roślinęjest zdeterminowany zarówno przez genotyp rośliny jak i odpowiedź rośliny na czynniki środowiskowe, takiejak ciepło, zimno, susza, etc. Jednakże niezależnie od warunków środowiskowych roślina nie może nigdy wytwarzać kwasu tłuszczowego czy mieszanki lipidów, dla których nie posiada niezbędnego wyposażenia biochemicznego, a także drogi biochemiczne są ostatecznie zdeterminowane przez
171 514 genotyp. Tradycyjne metody modyfikacji genetycznej obejmują procesy rekombinacji genetycznej, którymi kieruje hodowca roślin na poziomie całej rośliny. Metody te, chociaż dobize scharakteryzowane i proste do przeprowadzenia, zwykle dają cząstkowe ulepszenie zawartości i składu oleju przez optymalizację naturalnej biochemii, nie zaś przez stworzenie nowych dróg biochemicznych.
Jednocześnie utrzymuje się ciągłe zainteresowanie zmianą m^ha^izmów desaturacji kwasów tłuszczowych w roślinach z powodu ich wpływu na jakość żywności i znaczenie dla procesów biologicznych. Właściwości tłuszczowe i olejów są zdeterminowane przez skład ich kwasów tłuszczowych, który z kolei wpływa na jakość odżywczą i odporność na utlenianie Podobnie specyficzne struktury i kompozycje innych lipidów roślinnych, które roślina syntetyzuje z kwasów tłuszczowych, są zależne od zasobu kwasów tłuszczowych, które są dostępne jako prekursory do biosyntezy tych lipidów.
Ostatnio zainteresowano się zmniejszeniem zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych w żywności. Badania medyczne i żywieniowe doprowadziły do tego, że wielu producentów żywności i składników żywności chce, aby ich żywność oraz składniki żywności na bazie tłuszczów i olejów miały określony skład. Te pożądane składy charakteryzują się często wysoką zawartością mono- i wielonienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających estrów triacyloglicerolu, lub niską zawartością nasyconych kwasów tłuszczowych i tnacylogliceroli na bazie nasyconych kwasów tłuszczowych. Pr/emystowi użytkownicy tłuszczów i ołejów pochodzenia roślinnego również preferują specyfikowanie surowców stosowanych w ich procesach przemysłowych, a takie specyfikacje wymagają często dużej zawartości procentowej jednego szczególnego kwasu tłuszczowego. Często preferowanym kwasem tłuszczowym jest ugrupowanie nienasyconego kwasu tłus/c/owego, takie jak palmitynian, oleinian, linolan lub linolenian. Niestety przyroda nie współdziała przez dostarczanie roślin oleistych, wytwarzających korzystne kompozycje. W związku z tym zapoczątkowano wysiłki, mające na celu opracowanie różnych odmian i hybryd nasion oleistych, które dają oleje roślinne o wyższych zawartościach mononienasyconych kwasów tłuszczowych. Jednakże z punktu widzenia inkrementalnych metod genetycznych działających na całą roślinę, istnieje nadal zapotrzebowanie i chęć posiadania kompozycji i sposobów, które mogą wpływać na drogi biochemiczne i tworzyć nowe drogi biochemiczne na poziomie pojedynczego genu metodami inżynierii genetycznej.
Nawet jeśli tradycyjne metody uprawy roślin pozwają na zmianę składu kwasów tłuszczowych w lipidach pochodzenia roślinnego, to naturalne drogi biochemiczne rośliny nadal wykazują wszystkie swoje znane ze stanu techniki charakterystyki i ograniczenia. Zatem na przykład rośliny oleiste, które ulepszono na drodze hodowli roślin wykazują naturalne reakcje na zmiany środowiskowe. Do reakcji tych należy skłonność do wytwarzania wyższych zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych w cieplejszych warunkach wzrostu i wyższych zawartości procentowych nienasyconych kwasów tłuszczowych w chłodniejszych warunkach wzrostu, co powoduje, że wiarygodna produkcja nasion oleistych o szczególnym składzie kwasów tłuszczowych jest równie trudna jak prognozowanie pogody. Zatem byłoby bardzo pożądane posiadanie środków, mogących kompensować te wpływy środowiskowe. W cel ten zainwestowano jak dotąd niewielkie wysiłki
Wreszcie istnieje ciągła potrzeba ulepszania i rozszerzania asortymentu środowiskowego upraw roślinnych. Niektóre gatunki roślin oleistych pochodzą z obszarów umiarkowanych, tropikalnych i subtropikalnych i są słabo dostosowane do obszarów produkcji o klimacie chłodniejszym Nawet nasiona oleiste, które nadają się do klimatów chłodniejszych mogą skorzystać na dodatkowym dostosowaniu, ponieważ przesunięcie czasu siewu na wiosnę i rozciągnięcie pory wzrostu na lato i jesień może być wykorzystane do zwiększenia zbiorów. Hodowcy roślin skupiają uwagę w dużym stopniu na jeden aspekt niezbędnej adaptacji klimatycznej i szybkości dojrzewania, ale innym ważnym aspektem adaptacji klimatycznej jest tolerancja na ochłodzenie (w odróżnieniu od odporności na zmarznięcie).
Sposób zwiększania zawartości procentowej ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających im pochodnych lipidowych w komórkach roślin i całych roślinach, polega według wynalazku na tym, ze przeprowadza się etap insercji do takich komórek roślinnych lub komórek całych roślin chimerycznej kasety ekspresyjnej zawierającej klon
171 514 cDNA kodujący zasadniczo wyłącznie desaturazę pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A, połączony w usuwalny sposób z sekwencjami regulatorowymi, pobudzającymi ekspresję klonu cDNA w komórkach roślinnych.
W sposobie według wynalazku przeprowadza się następny etap płciowej lub klonowej reprodukcji całych roślin w ten sposób, że co najmniej jednakopiasekwencji kasety ekspresyjnej jest obecna w komórkach potomstwa roślin po reprodukcji.
Korzystnie sposób według wynalazku prowadzi się tak, ze kasetę ekspresyjną wprowadza się do komórek przez elektroporację.
Szczególnie korzystnie kasetę ekspresyjną wprowadza się przez bombardowanie mikrocząstkami.
Szczególnie korzystnie kasetę ekspresyjną wprowadza się do komórek przez mikroiniekcję.
Sposób według wynalazku polega na tym, że w przypadku zwiększenia zawartości procentowej ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających im pochodnych lipidowych w roślinach dwuliściennych podatnych na iniekcję Agrobacterium, kasetę ekspre.s^^yną wprowadza się do komórek przez infekcję komórek za pomocą Agrobacteria, którego plazmid został zmodyfikowany tak, że zawiera chimeryczną kasetę ekspresyyną zawierającą klon cDNA kodujący zasadniczo wyłącznie desaturazę pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A, połączony w usuwalny sposób z sekwencjami regulatorowymi, pobudzającymi ekspresję klonu cDNA w komórkach roślinnych.
W sposobie według wynalazku korzystnie jako gen desaturazy pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A stosuje się gen desaturazy steary lo-koenzym A, a szczególnie korzystnie gen ssaka lub drożdżowy.
W sposobie według wynalazku jako gen desaturazy pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A korzystnie stosuje się szczurzy gen desaturazy stearylo-koenzym A.
Chimeryczny konstrukt genowy do genetycznej modyfikacji roślin, ma na celu zwiększenie wytwarzania przez nie i zawartości nienasyconych kwasów tłuszczowych oraz odpowiadających lipidów, wytwarzanych z tych kwasów tłuszczowych. Chimeryczny konstrukt genowy składa się z sekwencji, która koduje zasadniczo wyłącznie pochodną kwas tłuszczowy-koenzym A lub enzym desaturazę Δ 9. Sekwencja kodująca jest związana w sposób usuwalny z górnymi i dolnymi składnikami regulującymi, które działają pobudzając ekspresję genu (produkcję enzymu) w komórkach roślin. Nienasycone kwasy tłuszczowe są wytwarzane przez różne enzymy w komórkach zwierząt i roślin, a homologia strukturalna lub sekwencyjna między desaturazami występującymi w komórkach zwierzęcych i drożdżowych a odpowiadającej enzymami w roślinach jest mała. Jednakże obecnie stwierdzono, że jeśli konstrukt zawierający gen desaturazy zależnej od koenzymu A wprowadzi się do komórek roślinnych za pomocą konwencjonalnej metody transformacji, takiej jak bombardowanie mikrocząstkami, infekcję Agrobacterium lub mikroiniekcję, to gen ulega ekspresji w komórkach pod kontrolą umieszczonych obok siebie roślinnych sekwencji regulatorowych i z powodzeniem oddziaływuje z maszynerią biochemiczną, którajest naturalnie obecna w komórkach roślin w celu katalizowania desaturacji naturalnie wytwarzanych ugrupowań palmitynianu i stearynianu z wytworzeniem palmitoolemianu i oleinianu. Powodując tworzenie większych ilości tych mononienasyconych związków wynalazek ten sprzyja również wytwarzaniu ugrupowań innych kwasów tłuszczowych o wyższych stopniach nienasycenia, dla których kwasy mononienasycone służą jako prekursory. Te nienasycone ugrupowania są identyczne z naturalnie występującymi ugrupowaniami nienasyconych kwasów tłuszczowych i mogą być następnie włączone do zapasowych lipidów triacyloglicerolowych w tkankach roślin poprzez istniejące drogi biochemiczne. W ten sposób skład procentowy ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających triacylogliceroli (jak również mono- i digliceroli, fosfolipidów i innych lipidów pochodzących od kwasów tłuszczowych) zwiększa się. Zatem wynalazek niniejszy dostarcza również komórki roślin i całe rośliny, mające zwiększoną zawartość procentową ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających lipidów pochodzących od kwasów tłuszczowych, w których komórki roślin zawierają chimeryczny konstrukt genowy. Sposób zwiększania zawartości procentowej ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających pochod171514 nych lipidowych kwasów tłuszczowych w komórkach roślin i całych roślinach, obejmuje etap insercji do takich komórek roślinnych lub komórek takich całych roślin chimerycznego konstruktu genowgoo
---- c> O o:______ ,,,,
UłU© pun UWflg^ 1UÓH.
λ o H t n ml/n nH-orl m ri o 1 r\ λ i z\/ ictniPm ri \ iy iy lvzi 11 ci j u.i\.w uik juu muuvn? w j , νι. , kwasy tłuszczowe, znajdowane w liściach tytoniu, kwasy palmitynowy (16.0) i stearynowy (18:0) Przy wykorzystaniu tych cząsteczek jako substratów, wiązania podwójne tworzą się w tym samym czasie poprzez jednoczesne reakcje desaturacji. Reakcje te przebiegają z udziałem desaturazy, która katalizuje usunięcie wodoru oraz składników biorących udział w transporcie elektronów. W roślinach pierwszy etap desaturacjijestkatalizowany przez rozpuszczalny enzym, znajdujący się w chloroplastach. W roślinach wyższych kwasy 16: L i 18.1 tworzą się z kwasów palmitynowego i stearynowego, zestryfikowanych białkiem przenoszącym acyle (ACP) lub pewnymi lipidami glicerolowymi Następne reakcje desaturacji mogą przebiegać zarówno w plastydach jak i w siateczce endoplazmatycznej, przy czym enzymy występujące w różnych miejscach subkomórkowych są kodowane przez różne geny. Ustalono, że aktywność specyficznych desaturaz w systemie roślinnym kontroluje co najmniej osiem genów.
Badania in vitro desaturazy szafianu wykazują, że istnieje wymóg dodawania do ekstraktów E. coli ferrodoksyny. Podobne wyniki uzyskano dla desaturazy awokado.
W korzystnej postaci wynalazku stosuje się szczurzą desaturazę stearylokoenzym A. Jest to desaturaza Δ 9, która u normalnego szczura wymaga elektronów ze zredukowanego cytochromu bs w cytoplazmie. Jednakże w normalnych roślinach reakcje te normalnie zachodzą z udziałem desatmazy Δ 9 w chloroplastach. Międzybłonowe formy kwasów tłuszczowych w cytoplazmie mogą występować jako pochodne CoA. Obecnie odkryto, że desaturaza organizmu należącego do innego świata (zwierzęcego) może skutecznie funkcjonować z podstawowymi elementami drogi biochemicznej rośliny mimo znacznej rozbieżności między sekwencjami i strukturami genu ornz białka w świecie zwierzęcym i roślinnym. Zatem istotą wynalazku jest stworzenie drogi biochemicznej w roślinie, która normalnie wykorzystuje formy CoA kwasów tłuszczowych i funkcjonuje w cytoplazmie a nie w chloroplastach. Wyniki uzyskane z wykorzystaniem wynalazku wskazują, ze cytochrom bs i reduktaza cytochromu bs obecnie w roślinach mogą zastąpić odpowiadające składniki normalnie znajdowane w funkcjonalnym kompleksie desaturazy szczurzej.
Zaobserwowano również, ze synteza nienasyconych kwasów tłuszczowych i otrzymywanych z nich lipidów jest powszechną odpowiedzią roślin na zimne warunki środowiskowe. Wykazano, że bakterie o zmienionym składzie kwasów tłuszczowych w błonach komórkowych przezywają w niższych temperaturach niż szczepy typu dzikiego. Bez zamiaru ograniczania się przez teorię można uważać, że synteza tych kwasów tłuszczowych i lipidów, które pozostają ciekłe w temperaturach niższych niż ich odpowiedniki nasycone pomaga utrzymać płynność błon komórkowych w niskich temperaturach i przez to pomaga roślinie znosić te niższe temperatury. Zatem wynalazek niniejszy oferuje również możliwość zwiększenia tolerancji roślin na zimno przez zwiększenie ich naturalnej zdolności do syntezy nienasyconych kwasów tłuszczowych i otrzymywanych z nich lipidów.
I odwrotnie, należy rozumieć, ze rośliny wykazują również skłonność do syntetyzowania całkowicie nasyconych kwasów tłuszczowych i otrzymywanych z nich lipidów w cieplejszych warunkach środowiskowych. Z drugiej strony geny desaturazy stosowane w wynalazku są zwykle otrzymywane ze zwierząt lub drożdży, a zatem funkcjonują dość efektywnie w tempe·· laturach cieplejszych, normalnie utrzymywanych przez te naturalne organizmy gospodarzy. Zatem niniejszy wynalazek zapewnia również zdolność wyrównywania lub kompensowania efektów cieplejszych temperatur wzrostu na skład lipidów w roślinach oleistych przez dostarczenie genu desaturazy, który jest bardziej aktywny w wyższych temperaturach i w związku z tym wytwarza ilości produktów desaturacji kwasów tłuszczowych przy wzroście temperatury
Chociaż przy użyciu kasety ekspresyjnej i sposobu według wynalazku mogą być modyfikowane dowolne gatunki roślin, w tym ograniczeń gatunki z rodzajów Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manicot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanurn, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus,
171 514
Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Rununculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browalia, Glycine, Lolium, Triticum i Datura, modyfikacje kwasów tłuszczowych sposobem według wynalazku najkorzystniej dokonuje się. w pak, szafran, orzeszki ziemne, eistych roślinach uprawnych, takich jak soja, kukurydza, len, chińskie drzewo wydzielające substancje tłuszczowe, jojoba i orzech palmowy.
Desaturaza pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A może być klonowana w dowolnym odpowiednim gospodarzu zwierzęcym lub drożdżowym, ponieważ wykazano, że sekwencja tego genu jest w znacznym stopniu zachowana w gatunkach ssaków i istnieją nawet regiony homologii między genami ssaków i drożdży. Geny kodujące desaturazę katalizują etap przejścia od 18:0 do 18·1 zostały sklonowane dla szczura, myszy i drożdży. Projekt Genomu Ludzkiego pozwoli na wytworzenie sekwencji kodującej dla ludzkiej desaturazy kwas tłuszczowy-koenzym A, która może być w razie potrzeby wykorzystana. Z drugiej strony nie stwierdzono wykrywalnej identyczności między sekwencją aminokwasów szczurzej desaturazy stearylo-koenzymu A (stosowanej w opisanych tu pracach transformacyjnych) a desaturazą stearylo-koenzymu A rącznika (Ricinus communis), tak więc potrzebny gen zależny od koenzymu A nie może być uzyskany z roślin.
Przez lipidy otrzymane z kwasów tłuszczowych należy rozumieć każdy naturalnie występujący lipid roślinny, którego prekursorem jest nasycony lub nienasycony kwas tłuszczowy C12 lub wyższy, syntetyzowany w roślinie. Należą do nich, bez ograniczeń, mono-, di- i triacyloglicerole, fosfolipidy takie jak fosfatydylocholina i fosfatydyloetanoloamina, glikolipidy i inne lipidy tkanek liściowych i inne. Przez przekształcenie naturalnie występujących zasobów kwasów tłuszczowych od syntezy związków nasyconych w kierunku syntezy związków nienasyconych wynalazek niniejszy powoduje, że naturalna droga biochemiczna rośliny uprzywilejowuje wytwarzanie odpowiadających lipidów otrzymanych z nienasyconych kwasów tłuszczowych.
Przedmiot wynalazku jest objaśniony na rysunku, na którym:
fig. 1 przedstawia mapę plazmidu, zastosowanego do pracy transformacyjnej opisanej w przykładach I-V;
fig. 2 przedstawia wykres słupkowy, obrazujący wyniki eksperymentów z przykładów I-fV, pokazujący różnice w stosunkach 16:1/16:0 i 18:1/18:0 dla tkanki kontrolnej i transformowanej tkanki kalusa;
fig. 3 jest wykresem słupkowym, przedstawiającym wyniki eksperymentów z przykładów I-IV, pokazującym komputerowo generowany obraz żelów, pokazujący obecność genu amplifikowanego przez PCR;
fig. 4 jest wykresem słupkowym, obrazującym wyniki eksperymentów z przykładów I-IV, przedstawiającym różnice w stosunkach 16:1/16:0 i 18:1/18:0 w kontrolnej i transformowanej tkance roślinnej;
fig. 5 jest wykresem słupkowym, obrazującym wyniki eksperymentów z przykładów I-IV, pokazującym różnice w zawartościach procentowych kwasów tłuszczowych 16:0, 18:2 i 18:3 w roślinach kontrolnych i transformowanych;
fig. 6 jest wykresem słupkowym, obrazującym wyniki eksperymentów z przykładów 1-1V, przedstawiającym różnice w zawartościach procentowych 16:1, 16:3 i 18:0 między tkankami roślin kontrolnych i transformow-anych;
fig. 7 jest wykresem słupkowym, obrazującym wyniki eksperymentów z przykładów 1-IV, przedstawiającym różnice w stosunkach 16:1/16:0 i 18:1/18:0 w tkankach roślin kontrolnych i transformowanych;
fig. 8 jest wykresem słupkowym, obrazującym wyniki eksperymentów z przykładów I-IV, pokazującym zmiany w stosunkach kwasów nasyconych do nienasyconych w dojrzałych nasionach roślin transformowanych zgodnie z wynalazkiem.
Poniższe przykłady ilustrują praktyczną realizację wynalazku bez zamiaru ograniczania go.
Przykład I. Konstruowanie roślinnego plazmidu ekspresyjnego cDNA szczurzej desaturazy stearylo-CoA składa się z sekwencji kodującej o długości
1,1 kb i nietranslacyjnej sekwencji o długości 3,5 kb. Gen stosowany w przykładach koduje
171 514 aminokwasy od 3 do 256. PlazmidpDs3-358, skonstruowany w sposób opisany w J. Biol. Chem., 263:2532-2536, został dostarczony przez P. Strittmatera. Plazmid ten trawiono BamHI i SstI, uwalniając fragment o długości 1,2 kb, który zawierał gen desaturazy szczurzej. Gen ten poddano ligacji z Bluesctript SK+ (Stratagene), trawionym BamHI i SstI Plazmid ten następnie trawiono HindIII i SstI, uwalniając fragment o długości 1,2 kb. Roślinny wektor ekspresji pKYLX71:35S jest pochodną pKYLX71, w której promotor CaMV 35S zastąpiono promotorem 35S, zawierającym duplikacje zasad -416 do -90 w stosunku do miejsca początku transkrypcji. Plazmid ten trawiono HindIII i SstI, podziałano fosfatazą alkaliczną z jelit cielęcych i ligowano z fragmentem odługości 1,2 kb, opisanym powyżej, tworząc p71‘RDS. Oprócz genu strukturalnego desaturazy szczurzej plazmid ten zawiera gen fototransferazy neomycynowej (nadający oporność na kanar mycynę), szeroki zakres początku replikacji RK2 gospodarza, krańce T-DNA i sygnał poliadenylacji. Mapa tego plazmidu jest przedstawiona na figurze 1. Plazmid kontrolny nie posiadał genu strukturalnego desaturazy szczurzej, ale poza tym był identyczny. Za pomocą plazmidów transformowano kompetentne E. coli TB 1. Pojedyncze kolonie uzyskano z płytek LB suplementowanych kanamycyną w stężeniu 50 mg/l i tetracykliną w stężeniu 12,5 mg/l. Kolonie przeniesiono do hodowli płynnych i przygotowano DNA poprzez lizę alkaliczną. Plazmidy o oczekiwanej wielkości użyto do dalszych eksperymentów.
Przykład II. Transformacja roślin
Rośliny Nocotiana tabacum (Xanthi) transformowano, stosując namnażanie łączne z Agrobacterium tumefaciens w sposób ogólnie praktykowany (patrz na przykład artykuł Horscha et al., Science 227: 1229-1231 z 1985 r.) poza tym, że zamiast krążków użyto taśm z liści. Selekcji na oporność na kanamycynę dokonano w stężeniu 100 mg/l. Indukcja kalusa, puszczanie pędów i korzeni zachodziły w obecności kanamycyny. W celu zahamowania podziału Agrobacterium tumefaciens do pożywki dodano mefoxin o stężeniu 300 mg/l.
Plazmidy pKYLX71:35S i p712RDS przeniesiono z E. coli do szczepu A. tumefaciens LBA4404, stosując metodę kojarzenia potrójnego przy użyciu pRK2013 jako plazmidu pomocniczego.
Przykład III. Izolacja DNA roślinny i amplifikacja sekwencji
Cały DNA roślinny wyizolowano z zielonych liści za pomocą ekstrakcji tiocyjanianem guanidyniowym. Po zmieszaniu całości roślinnych kwasów nukleinowych z 4M LiCl i odwirowaniu supernatant (zawierający DNA) usunięto do nowej rurki i wytrącono dwiema objętościami etanolu. Następnie DNA odwirowano, przemyto 70% etanolem, wysuszono pod próżnią i ponownie zawieszono w 1 mM Tris, 0,1 mM EDTA o pH 7,5.
Katalizowaną polimerazą reakcję replikacji (PCR) przeprowadzono w roztworze o objętości całkowitej 20 μ] i zawierającym 200 ng całego DNA z liści, 11 ng primerów (5' ACGTGGATCCACCATGCCGGCCCACATGCTC 3’) i (5' GCTACTCTTGTGGCTCCC 3’), 1 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,01% żelatyny i 1 jednostkę polimerazy Gaq DNA (polimerazą DNA AmpliTaqTM DNA, Perkin-Elmer Cetus). Kontrola negatywna zawierała wszystkie te same składniki oprócz DNA roślinnego. Druga negatywna kontrola zawierała DNA roślin opornych na kanamycynę, transformowanych wektorem użytym do transformacji rośliny (pKYLX71:35S), ale bez sekwencji desaturazy. Mieszaniny reakcyjne pokryto olejem mineralnym i umieszczono w urządzeniu do cyklicznego zmieniania temperatury (Lab Line). Temperaturę zmieniano cyklicznie na 95°C przez 2 sekundy (denaturacja), po czym do 64°C i 59°C po 2 sekundy (wygrzewanie), po czym do 72°C przez 180 sekund (rozszerzanie) przez łącznie 30 cykli Produkty reakcji łańcuchowej katalizowanej polimerazą frakcjonowano na 0,8% żelu agarozowym w TAE jako buforze rozwijającym. Markerami wielkości były drabinki DNA o długości 1 kb (BRL).
Przykład IV. Frakcjonowanie lipidów i analiza kwasów tłuszczowych
Tkankę liściową (w przybliżeniu 0,5 g) umieszczono w 3 ml mieszaniny chloroform:metanol (2:1) i rozdrobniono w aparacie Tissumizer (Tekmar). Następnie rozpuszczalniki odparowano na aparacie Speedvac i frakcjonowano na płytce pokrytej żelem krzemionkowym 60 w celu izolacji PC. Plamki zdrapano i otrzymano estry metylowe w układzie kwas siarkowy/metanol w sposób opisany poniżej. Próbki liści użyte do obliczenia suchej masy liofilizowano.
171 514
Estry metylowe kwasów tłuszczowych łącznie otrzymano w rurkach szklanych ze 100 mg tkanki kalusa, którą drobiono z 2 ml 1% kwasu siarkowego w metanolu za pomocą tissumizera w sposób opisany powyżej lub za pomocą szklanych pałeczek. Liści przygotowanych do analizy ~ w tłuszczowych łącznic nie rozdrabniano. TransestryUikacja przebiegała cn°r a. ooc aż do pozostania około 0,2 ml metanolu. Bezpośrednio do tkanki roślinnej dodano kwas heptadekanowy (17:0, 1 mg/ml w heksanie) jako wzorzec wewnętrzny w ilości 0,1 mg na gram tkanki świeżej wagi. Przed ekstrakcją tkanki heksan pozostawiono do odparowania na około 10 minut. Ilościowe oznaczenie kwasów tłuszczowych łącznie w roślinie przeprowadzono przez porównanie pól pików na chromatogramach z polami pików kwasu heptadekanowego. Dla ilościowego oznaczenia kwasów tłuszczowych w oddzieleniu od lipidów frakcjonowanych na płytkach TLC do każdej plamki dodano przed zdrapaniem 25 mg kwasu nonadekanowego (19:0). Estry metylowe kwasów tłuszczowych analizowano za pomocą chromatografu gazowej w sposób opisany przez Dahmer et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 66:543-548 (1989) poza tym, że użyto kolumny Hewlett Packard FFAP.
Wzorce dla PC, FFA, TG, 16:0, etc. pochodziły z firmy Sigma. Liście z mutanta FadC Arabidopsis italiana mogą akumulować 16:1 [Science 252.80-87 (1991)]. Liście mutanta FadD mogą akumulować 16:2 z odpowiadającym zmniejszeniem akumulacji 16:3. Ekstrakty z tych liści i liści typu dzikiego użyto do oznaczenia czasów retencji dla 16:1, 16:2 i 16:3.
Wyniki
Po transformacji za pośrednictwem Agrobacterium tumefaciens przeprowadzono badania zmienionego składu kwasów tłuszczowych w opornych nakanamycynę kalusach tytoniu. Kilka kalusów miało wyższe stosunki 16:1/16:0 i/lub 18:1/18:0 niż kontrole (figura 2). Ze stosunku 16:1/16:0 nie da się przewidywać stosunku 18:1/18:0. W dziewięciu z dziesięciu badanych transiOrmantów desaturazowych stosunek 18:1/18:0 był wyższy niż stosunek 16:1/16:0, co obserwowano również w kalusie kontrolnym. Dane te sugerują, że regenerowane rośliny mogą mieć również zmienione poziomy kwasów tłuszczowych.
Dane wskazujące na obecność wprowadzonego genu desaturazy są przedstawione na figurze 3. Amplifikacja całego DNA rośliny poprzez katalizowaną przez polimerazę replikację (PCR) potwierdziła, że oczekiwany produkt o długości 1,1 kb nie jest widoczny w 2 roślinach kontrolnych, transformowanych plazmidem, nie mającym szczurzego genu desaturazy. Figury 4 do 7 obrazują dane, uzyskane z analizy liści tych samych roślin.
Podobnie jak w przypadku kalusów, oczekiwano wzrostu stosunków 16:1/16:0 i/lub 18:1/18:0 dla liści ze szczurzym genem desaturazy w porównaniu z kontrolami. Figura 4 przedstawia wyraźny wzrost stosunku 16:1/16:0 dla dwóch roślin (RT i RU) transformowanych szczurzym genem desaturazy. Roślina RT ma wyższy stosunek 18:1/18:0 w porównaniu z kontrolami, natomiast roślina Ru nie. Stoi to w przeciwieństwie do danych z kalusów (figura 2), gdzie stosunki 18:1/18:0 były znacznie wyższe dla kalusów ze szczurzym genem desaturazy niż w kontrolach. Jednakże promotor CaMV 35S nie działa tak dobrze w pewnych zróżnicowanych tkankach jak w niezróżnicowanych tkankach kalusa, co może wyjaśnić różnicę.
Ponieważ nie było wiadomo, jaki efekt może mieć wprowadzenie desaturazy na skład i poziom kwasów tłuszczowych, oznaczano również ilości 16:0, 16:1, 16:2, 16:3,18:0, 18:1,18:2 i 18:3. Dla uwidocznienia jak zmieniają się te wielkości, połączono ilości 16:0, 16:1, 16:2, 16:3, 18:0, 18:1, 18:2 i 18:3 w liściach tytoniu i ilość każdego kwasu wyrażono jako procent ilości łącznej (figura 5). Dla roślin RT i RU można zaobserwować duży wzrost ilości 16:1. jak również zmniejszenie ilości 16:0 i 18:0. Poziomy 18:2 również wzrosły w porównaniu z kontrolami. Desaturazowe transformanty RT i RU również miały zmniejszoną zawartość procentową 18:3 w porównaniu z kontrolami.
W celu uzyskania całościowego poglądu na akumulację lipidów połączono kwasy tłuszczowe 16 i 18 węglowe (16:0, 16:1, 16:2, 16:3, 18:0, 18:1, 18:2 i 18:3) i wyrażono ich ilości w mg kwasu tłuszczowego na gram świeżej masy lub suchej masy (danych nie przedstawiono). Podobieństwo między łącznymi poziomami kwasów tłuszczowych 16 i 18 węglowych w roślinach kontrolnych i transformowanych desaturazą sugeruje, że istnieje kompensacja między drogami metabolizmu lipidów w liściach. Taka kompensacja była wnioskowana dla różnych mutantów desaturazowych Arabidopsis [Science 252:80)-87 (1991)].
171 514
W celu dodatkowego wykazania zwiększonych poziomów 16:1 w tytoniu transformowanym desaturazą otrzymanym w wyniku wprowadzenia genu lipidy liściowe frakcjonowano na klasy. Ponieważ 16:1 normalnie nie występuje w fosfatydylocholinie rośliny, ^uauaimuj νφ narwjc vaiuyivj uiu^jiuuj^t wjmM piLCUdidWiunc Πα llguizc U.
Można zauważyć, że 16:1 wykryto jedynie w fosfatydylocholinie z roślin transformowanych szczurzym genem desaturazy. Ta jakościowa różnica między kontrolami a transformantami desaturazowymi stanowi wyraźny dowód, ze wprowadza desaturaza funkcjonuje w tkance liściowej. Obecność 16:1 w fosfatydylocholinie z liści transformowanych szczurzym genem desaturazy (figura 6) jest niezbędnym wymogiem dla zmiany składu lipidów w nasionach, które zawierają przede wszystkim triglicerydy. Fosfatydylocholina jest bezpośrednim prekursorem triglicerydu w rozwijających się nasionach.
Zdolność do manipulowania składem kwasów tłuszczowych w roślinach za pomocą desaturazy szczura wykazuje, że w celu zmiany poziomów lipidów może być zastosowane podejście inne niż selekcja mutantów.
Przykład V. Zbadano również ziarno z roślin transgenicznych stwierdzając, że dramatyczny wzrost zawartości kwasów tłuszczowych w lipidach liściowych łącznie uwidocznił się w lipidach nasion, jakkolwiek na niższym poziomie, co jest widoczne z figury 7. Stosunek kwasów tłuszczowych nasyconych do nienasycowych również wzrósł w reprezentatywnych transformantach desaturazowych w porównaniu z kontrolnymi tkankami liści i nasion roślin transgenicznych (figura 7). Jest to dodatkowo zilustrowane przez obserwację stosunku nasyconych do nienasyconych kwasów tłuszczowych 16 węglowych. Jak jest widoczne z figury 8, wybrane rośliny transgeniczne G, M, U, T, J i W mają znaczny spadek stosunków 16:0/(, 16:1 + 16:2+16:3) w porównaniu z rośliną kontrolną E.
Przykład VI. Plazmid pDs3-358, skonstruowany w sposób opisany w J. Biol. Chem., 263: 2532-2536, został dostarczony przez P. Strittmattera. Plazmid trawiono BamHI i Sstl, uwalniając fragment o długości 1,2 kb, zawierający szczurzy gen desaturazy. Fragment ligowano z poprzednio otrzymanym wektorem ACT, pALLNAPG1, otrzymując pALLNAPSCD; wynikiem tego procesu było zestawienie części kodującej desaturazę stearylo-kocnzymu A bezpośrednio za specyficznym dla ziarna promotorem typu napin w wektorze binarnym, gotowym do trans formacji rośliny.
Kasetę promotor-gen, przenoszącą promotor typu napin i gen desaturazy stearylo-1koenzymu A wycięto jako fragment HindII-SstI i zastosowano do zastąpienia fragmentu HindII-SstI wektora binarnego, pALLTKrep, w celu generowania pALLTKNAPSCD, który był strukturalnie i funkcjonalnie równoważny pALLNAPSCD poza tym, że zapewniał wyraźniejszą selekcję roślin transgenicznych przez antybiotyk kanamycynę. Transferu DNA do Agrobacterium dokonano przez transformację bezpośrednio do organizmów, w przeciwieństwie do opisanego powyżej kojarzenia potrójnego roślin. Gen insertowano do komórek kanoli przez rozerwanie komórek i namnażanie łączne, a całe transformanty kanoli odzyskiwano z hodowli transformowanego kalusa. Z uzyskanych transformowanych roślin otrzymano nasiona.
171 514
Wykaz sekwencji (1) INFORMACJE OGOLNE (i) ZGŁASZAJĄCY:
Hildebrand, David Grayburn, W. Scott (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: Zmiana kwasów tłuszczowych w tkankach roślin transgenicznych za pomocą desaturazy Δ9 (iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 (iV) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Pioneer Hi-Bred International, Inc.
(B) ULICA: 700 Capital Square
400 Locust Street (C) MIASTO: Des Moines (D) STAN: Iowa (E) iKRAJ: Stany Zjednoczone (F) ZIP: 50309 (v) NOŚNIK KOMPUTEROWY:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka 3,5 cala, pojemność
760 kb (B) KOMPUTER: IBM-kompatybilny (C) SYSTEM OPERACYJNY: MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Microsoft WORD (Format tekstu ASCII) (vi) DANE O ZGŁOSZENIU (A) NR ZGŁOSZENIA (B) DATA ZGŁOSZENIA:
(C) KLASYFIKACJA:
171 514 (viil) INFORMACJA O PEŁNOMOCNIKU/AGENCIE (A) NAZWISKO: Roth, Michael J.
(B) NUMER REJESTRACYJNY: 29342 (C) NUMER AKT: 0174 US (ix) INFORMACJE ΪTEEEOOMUIKAAYYNN:
(A) TELEFON: (515) 245-3594 (B) TELEFAX: (515) 245-3634 (2) INFORMACJE O SEWKWENCJI O NR IDENTYFIKACYJNYM 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 31 zasad (B) TYP: nukleotydowa (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy CD) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNE: nie (iv) ANTYSENSOWNE: nie (x) INFORMACJE O PUBLIKACJI
| (A) AUTORZY: Stritmatter et al | ||
| (C) | CZASOPISMO: J. Biol. | Chem. |
| (D) | TOM: 263 | |
| (F) | STRONY: 2532-2536 | |
| (G) | DATA: 1988 |
(xi) OPIS SEKWENCJI
Primer stosowany do amplifikacji DNA przez katalizowaną polimerazą reakcję łańcuchową (PCR)
Sekwencja o nr identyfikacyjnym 1 ACGTGGATCC ACCATGCCGG CCCACATGCT C 31
171 514 (2) INFORMACJE DLA SEKWENCJI O NR IDENTYFIKACYJNYM 2:
(i) charakterystyka sekwencji:
(A) DŁUGOŚĆ: 18 zasad (B) TYP: nukleotydowa (C) ILOŚĆ ŁAŃCUCHÓW: pojedynczy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNE: tak (iv) ANTYSENSOWNE nie (x) INFORMACJE O PUBLIKACJI
| (A) AUTORZY: Stritmatter et al | ||
| (C) | CZASOPISMO: J. Biol. | Chem. |
| (D) | TOM: 263 | |
| (F) | STRONY: 2532-2536 | |
| (G) | DATA: 1988 |
(xi) OPIS SEKWENCJI
Primer stosowany do amplifikacji DNA przez katalizowaną polimerazą reakcję łańcuchową (PCR)
Sekwencja o nr identyfikacyjnym 2
GCTACTCTTG
TGGCTCCC
171 514
Mapa plazmidu do ekspresji desaturazy szczurzej w tytoniu
FIG.1
171 514
FIG.2
Stosunek
171 514
FIG.3
171 514
Roślina
FIG.4
171 514 % kwasów tłuszczowych 16 i 18 węglowych łącznie
FIG.5
171 514
Kwas tłuszczowy
FIG.6
171 514
FIG.7
Stężenie w jug/g świeżej wagi
800
CE
RT
RU
CJ
Roślina
171 514
16:0 /16:14-16:2+16:3
200
160
120
Ο
G Μ Ε U Τ J W Dójrzate nasiona
FIG.8
Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz. Cena 4,00 zł
Claims (9)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób zwiększania zawartości procentowej ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających im pochodnych lipidowych w komórkach roślin i całych roślinach, znamienny tym, że przeprowadza się etap insercji do takich komórek roślinnych lub komórek całych takich roślin chimerycznej kasety ekspresyjnej zawierającej klon cDNA kodujący zasadniczo wyłącznie desaturazę pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A, połączony w usuwalny sposób z sekwencjami regulatorowymi, pobudzającymi ekspresję klonu cDNA w komórkach roślinnych.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się następny etap płciowej lub klonowej reprodukcji całych roślin w ten sposób, że co najmniej jedna kopia sekwencji kasety ekspresyjnej jest obecna w komórkach potomstwa roślin po reprodukcji.
- 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kasetę ekspresyjną wprowadza się do komórek przez elektroporację.
- 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kasetę ekspresyJną wprowadza się do komórek przez bombardowanie mikrocząstkami.
- 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kasetę eks^pr^^^yną wprowadza się do komórek przez mikroimekcję.
- 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku zwiększenia zawartości procentowej ugrupowań nienasyconych kwasów tłuszczowych i odpowiadających im pochodnych lipidowych w roślinach dwuliściennych podatnych na infekcję Agrobacterium, kasetę ekspresyjną wprowadza się do komórek przez infekcję komórek za pomocą Agrobacteria, którego plazmid został zmodyfikowany tak, że zawiera chimeryczną kasetę ekspresy)ną zawierającą klon cDNA kodujący zasadniczo wyłącznie desaturazę pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A, połączony w usuwalny sposób z sekwencjami regulatorowymi, pobudzającymi ekspresję klonu cDNA w komórkach roślinnych.
- 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako gen desaturazy pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A stosuje się gen desaturazy stearylo-koenzym A.
- 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako gen desaturazy pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A stosuje się gen ssaka lub drożdżowy.
- 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako gen desaturazy pochodnej kwas tłuszczowy-koenzym A stosuje się szczurzy gen desaturazy stearylo-koenzym A.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US81628891A | 1991-12-31 | 1991-12-31 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL297262A1 PL297262A1 (en) | 1993-09-06 |
| PL171514B1 true PL171514B1 (pl) | 1997-05-30 |
Family
ID=25220185
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL92297262A PL171514B1 (pl) | 1991-12-31 | 1992-12-31 | ugrupowan nienasyconych kwasów tluszczowychi odpowiadajacych im pochodnych lipidowych w komórkach roslin i calych roslinach PL PL |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5866789A (pl) |
| EP (1) | EP0550162B1 (pl) |
| JP (1) | JPH0698777A (pl) |
| KR (1) | KR930013121A (pl) |
| AT (1) | ATE190661T1 (pl) |
| AU (2) | AU671962B2 (pl) |
| CA (1) | CA2084348A1 (pl) |
| DE (1) | DE69230785T2 (pl) |
| HU (1) | HUT63653A (pl) |
| MX (1) | MX9207053A (pl) |
| NZ (1) | NZ245367A (pl) |
| PL (1) | PL171514B1 (pl) |
Families Citing this family (63)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7705215B1 (en) | 1990-04-17 | 2010-04-27 | Dekalb Genetics Corporation | Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof |
| DE69333034T2 (de) * | 1992-03-13 | 2004-04-01 | Agrigenetics, Inc., San Diego | Modifikation pflanzlicher Öle durch Verwendung von Desaturase |
| US5639645A (en) * | 1993-09-22 | 1997-06-17 | Mitsubishi Corporation | Recombinant Δ9 desaturase and a gene encoding the same |
| DE69433941T2 (de) * | 1993-12-28 | 2005-07-28 | Kirin Beer K.K. | Gen für die fettsäure-desaturase, besagtes gen enthaltender vektor, eine pflanze, in die besagtes gen eingebracht ist, und ein verfahren zur schaffung besagter pflanze |
| US7745694B1 (en) | 1997-04-11 | 2010-06-29 | Monsanto Technology Llc | Methods and compositions for synthesis of long chain polyunsaturated fatty acids in plants |
| US6051754A (en) * | 1997-04-11 | 2000-04-18 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US5968809A (en) | 1997-04-11 | 1999-10-19 | Abbot Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids |
| US6075183A (en) * | 1997-04-11 | 2000-06-13 | Abbott Laboratories | Methods and compositions for synthesis of long chain poly-unsaturated fatty acids in plants |
| US7585645B2 (en) * | 1997-05-27 | 2009-09-08 | Sembiosys Genetics Inc. | Thioredoxin and thioredoxin reductase containing oil body based products |
| US6225528B1 (en) * | 1997-09-04 | 2001-05-01 | Rutgers, The State University Of New Jersey | Method of making pathogen-resistant plants by transformation with a fatty acid desaturase gene |
| WO1999050430A2 (en) | 1998-03-30 | 1999-10-07 | Dow Agrosciences Llc | Modification of fatty acid composition in plants by expression of an aspergillus nidulans delta-9 coa desaturase |
| PT1086236E (pt) | 1998-06-12 | 2007-12-12 | Calgene Llc | Ácidos gordos poliinsaturados em plantas |
| ATE334206T1 (de) | 1999-06-07 | 2006-08-15 | Basf Plant Science Gmbh | Delta6-acetylenase und delta6-desaturase aus ceratodon purpureus |
| DE10030976A1 (de) | 2000-06-30 | 2002-01-10 | Basf Ag | DELTA6-Desaturasegene exprimierende Pflanzen und PUFAS enthaltende Öle aus diesen Pflanzen und ein Verfahren zur Herstellung ungesättigter Fettsäuren |
| DE10102337A1 (de) | 2001-01-19 | 2002-07-25 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren, neue Biosynthesegene sowie neue pflanzliche Expressionskonstrukte |
| CA2340998C (en) * | 2001-03-21 | 2012-01-03 | Saskatchewan Wheat Pool | Selective modification of plant fatty acids |
| MXPA04007327A (es) | 2002-01-30 | 2004-11-26 | Basf Plant Science Gmbh | Nuevo gen de enlogasa y metodo para producir acidos grasos poliinsaturados. |
| GB2385852A (en) | 2002-02-27 | 2003-09-03 | Rothamsted Ex Station | Delta 6-desaturases from Primulaceae |
| DE10219203A1 (de) | 2002-04-29 | 2003-11-13 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in Pflanzen |
| EP2216405A1 (en) | 2002-05-03 | 2010-08-11 | Monsanto Technology LLC | Speed specific USP promoters for expressing genes in plants |
| KR100539649B1 (ko) | 2002-12-02 | 2005-12-29 | 산요덴키가부시키가이샤 | 연료 전지용 세퍼레이터 및 이를 이용한 연료 전지 |
| US7078234B2 (en) | 2002-12-18 | 2006-07-18 | Monsanto Technology Llc | Maize embryo-specific promoter compositions and methods for use thereof |
| CA2510462A1 (en) | 2002-12-19 | 2004-07-08 | University Of Bristol | Method for producing polyunsaturated fatty acids in a transgenic plant or microorganism comprising an introduced delta-9-elongase and a delta-8-desaturase |
| WO2004076617A2 (de) | 2003-02-27 | 2004-09-10 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren |
| BRPI0408896A (pt) | 2003-03-28 | 2006-04-25 | Monsanto Technology Llc | promotores de planta para uso no desenvolvimento precoce de sementes |
| EP2365063B1 (de) | 2003-03-31 | 2015-10-14 | University Of Bristol | Neue pflanzliche Acyltransferase spezifisch für langkettige mehrfach ungesättigte Fettsäuren |
| MXPA05010571A (es) | 2003-04-08 | 2005-11-23 | Basf Plant Science Gmbh | Delta-4-desaturasas a partir de euglena gracilis, que expresan plantas y aceites que comprenden pufa |
| ES2590077T3 (es) | 2003-08-01 | 2016-11-18 | Basf Plant Science Gmbh | Procedimiento para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos |
| US11952581B2 (en) | 2003-08-01 | 2024-04-09 | Basf Plant Science Gmbh | Process for the production of polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| EP1656449B1 (en) | 2003-08-21 | 2009-05-06 | Monsanto Technology LLC | Fatty acid desaturases from primula |
| AU2005217080B2 (en) | 2004-02-27 | 2011-02-24 | Basf Plant Science Gmbh | Method for producing unsaturated omega-3 fatty acids in transgenic organisms |
| EP2623584B1 (de) | 2004-02-27 | 2019-04-10 | BASF Plant Science GmbH | Verfahren zur Herstellung mehrfach ungesättigter Fettsäuren in transgenen Pflanzen |
| CN1968688A (zh) | 2004-04-16 | 2007-05-23 | 孟山都技术有限公司 | 脂肪酸去饱和酶在玉米中的表达 |
| US7364883B2 (en) | 2004-05-07 | 2008-04-29 | Yeastern Biotech Co., Ltd. | Process for producing poly-unsaturated fatty acids by oleaginous yeasts |
| EP1856264B1 (en) | 2005-02-26 | 2014-07-23 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| CA2598792A1 (en) | 2005-03-02 | 2006-09-08 | Metanomics Gmbh | Process for the production of fine chemicals |
| DE102005013779A1 (de) | 2005-03-22 | 2006-09-28 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von mehrfach ungesättigten C20- und C22-Fettsäuren mit mindestens vier Doppelbindungen in transgenen Pflanzen |
| AU2006257101B2 (en) * | 2005-04-19 | 2011-04-28 | Basf Plant Science Gmbh | Starchy-endosperm and/or germinating embryo-specific expression in mono-cotyledonous plants |
| EP2151498A3 (en) | 2005-04-20 | 2010-12-15 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| EP1882037A2 (en) | 2005-05-10 | 2008-01-30 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
| DE102005038036A1 (de) | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen |
| GB2431158A (en) | 2005-10-13 | 2007-04-18 | Rothamsted Res Ltd | Process for the production of arachidonic and/or eicosapentaenoic acid |
| DE102005052551A1 (de) | 2005-11-02 | 2007-05-16 | Rothamsted Res Harpenden | Verfahren zur Herstellung von y-Linolensäure und/oder Stearidonsäure in transgenen Brassicaceae und Linaceae |
| GB0603160D0 (en) | 2006-02-16 | 2006-03-29 | Rothamsted Res Ltd | Nucleic acid |
| AR059376A1 (es) | 2006-02-21 | 2008-03-26 | Basf Plant Science Gmbh | Procedimiento para la produccion de acidos grasos poliinsaturados |
| US8629195B2 (en) | 2006-04-08 | 2014-01-14 | Bayer Materialscience Ag | Production of polyurethane foams |
| EP2041275B1 (en) | 2006-07-19 | 2011-05-04 | Monsanto Technology, LLC | Fatty acid desaturases from tetraselmis suecica |
| EP2061879A2 (en) | 2006-08-24 | 2009-05-27 | BASF Plant Science GmbH | Isolation and characterization of a novel pythium omega 3 desaturase with specificity to all omega 6 fatty acids longer than 18 carbon chains |
| US8710299B2 (en) | 2006-10-06 | 2014-04-29 | Basf Plant Science Gmbh | Processes for producing polyunsaturated fatty acids in transgenic organisms |
| CN101631868B (zh) | 2007-02-16 | 2016-02-10 | 巴斯福植物科学有限公司 | 用于在单子叶植物中调节胚特异性表达的核酸序列 |
| EP2176416B1 (de) | 2007-07-31 | 2016-03-16 | BASF Plant Science GmbH | Elongasen und verfahren zur herstellung mehrfach ungesättigter fettsäuren in transgenen organismen |
| DE112008003237T5 (de) | 2007-12-14 | 2011-03-17 | Basf Plant Science Gmbh | Promotoren von Brassica napus für samenspezifische Genexpression |
| CN102066564B (zh) | 2008-04-30 | 2015-02-11 | 罗特哈姆斯泰德研究有限公司 | 去饱和酶和在转基因生物中产生多不饱和脂肪酸的方法 |
| US8853383B2 (en) | 2008-07-01 | 2014-10-07 | Basf Plant Science Gmbh | Promoters from Brassica napus for seed specific gene expression |
| EP2331695B1 (en) | 2008-08-26 | 2014-07-23 | BASF Plant Science GmbH | Nucleic acids encoding desaturases and modified plant oil |
| ES2435572T3 (es) | 2008-12-12 | 2013-12-20 | Basf Plant Science Gmbh | Desaturasas y proceso para la producción de ácidos grasos poliinsaturados en organismos transgénicos |
| CA3020943A1 (en) | 2009-04-22 | 2010-10-28 | Basf Plant Science Company Gmbh | Whole seed specific promoter |
| CA2760326A1 (en) | 2009-05-13 | 2010-11-18 | Basf Plant Science Company Gmbh | Acyltransferases and uses thereof in fatty acid production |
| WO2011003901A1 (en) | 2009-07-10 | 2011-01-13 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for endosperm-specific expression in plants |
| WO2011067712A1 (en) | 2009-12-03 | 2011-06-09 | Basf Plant Science Company Gmbh | Expression cassettes for embryo-specific expression in plants |
| AR081302A1 (es) * | 2010-06-24 | 2012-08-01 | Brookhaven Science Ass Llc | Acumulacion de acidos grasos omega-7 ( -7) en semillas de plantas |
| CA2804925A1 (en) | 2010-06-25 | 2011-12-29 | Basf Plant Science Company Gmbh | Acyltransferases from thraustochytrium species and uses thereof in fatty acid production |
| CN103740739B (zh) * | 2014-01-20 | 2015-09-23 | 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所 | 高山离子芥内质网型ω-3脂肪酸去饱和酶基因及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5057419A (en) * | 1988-09-22 | 1991-10-15 | Rutgers University | Genetically engineered plasmid and organisms for the production of specialized oils |
| DE4004800C2 (de) * | 1990-02-13 | 2000-12-21 | Aventis Cropscience Gmbh | Im Habitus und Ertrag veränderte transgene Pflanzen |
| EP0472722B1 (en) * | 1990-03-16 | 2003-05-21 | Calgene LLC | Dnas encoding plant desaturases and their uses |
| WO1991018985A1 (en) * | 1990-05-25 | 1991-12-12 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleotide sequence of soybean stearoyl-acp desaturase gene |
| EP0616644B1 (en) * | 1991-12-04 | 2003-07-02 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Fatty acid desaturase genes from plants |
-
1992
- 1992-12-02 CA CA002084348A patent/CA2084348A1/en not_active Abandoned
- 1992-12-04 NZ NZ245367A patent/NZ245367A/en unknown
- 1992-12-07 EP EP92311125A patent/EP0550162B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-07 MX MX9207053A patent/MX9207053A/es unknown
- 1992-12-07 DE DE69230785T patent/DE69230785T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-12-07 AT AT92311125T patent/ATE190661T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-12-15 AU AU30187/92A patent/AU671962B2/en not_active Ceased
- 1992-12-25 JP JP4347356A patent/JPH0698777A/ja not_active Withdrawn
- 1992-12-30 KR KR1019920026607A patent/KR930013121A/ko not_active Application Discontinuation
- 1992-12-30 HU HU929204175A patent/HUT63653A/hu unknown
- 1992-12-31 PL PL92297262A patent/PL171514B1/pl unknown
-
1996
- 1996-01-18 US US08/588,540 patent/US5866789A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-24 AU AU60693/96A patent/AU6069396A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69230785D1 (de) | 2000-04-20 |
| KR930013121A (ko) | 1993-07-21 |
| MX9207053A (es) | 1993-07-01 |
| PL297262A1 (en) | 1993-09-06 |
| NZ245367A (en) | 1994-08-26 |
| EP0550162B1 (en) | 2000-03-15 |
| CA2084348A1 (en) | 1993-07-01 |
| US5866789A (en) | 1999-02-02 |
| HUT63653A (en) | 1993-09-28 |
| AU3018792A (en) | 1993-07-08 |
| AU6069396A (en) | 1996-11-21 |
| DE69230785T2 (de) | 2000-08-10 |
| ATE190661T1 (de) | 2000-04-15 |
| JPH0698777A (ja) | 1994-04-12 |
| HU9204175D0 (en) | 1993-04-28 |
| EP0550162A1 (en) | 1993-07-07 |
| AU671962B2 (en) | 1996-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL171514B1 (pl) | ugrupowan nienasyconych kwasów tluszczowychi odpowiadajacych im pochodnych lipidowych w komórkach roslin i calych roslinach PL PL | |
| JP4511043B2 (ja) | アシル−ａｃｐチオエステラーゼの発現による大豆油中のステアレート含量の増加 | |
| US7812220B2 (en) | Engineering β-ketoacyl ACP synthase for novel substrate specificity | |
| Liu et al. | Enhanced seed oil content by overexpressing genes related to triacylglyceride synthesis | |
| US6441278B1 (en) | Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content | |
| Katavic et al. | Improving Erucic Acid Content in Rapeseed through Biotechnology: What Can the Arabidopsis FAE1 and the Yeast SLC1‐1 Genes Contribute? 1, 2 | |
| Wickramarathna et al. | Heterologous expression of flax PHOSPHOLIPID: DIACYLGLYCEROL CHOLINEPHOSPHOTRANSFERASE (PDCT) increases polyunsaturated fatty acid content in yeast and Arabidopsis seeds | |
| JP2003501065A (ja) | 脂肪酸のβ酸化に関わる蛋白質をコードする核酸配列とその使用法 | |
| Grayburn et al. | Fatty acid alteration by a Δ9 desaturase in transgenic tobacco tissue | |
| AU2006249983B2 (en) | Safflower with elevated gamma-linolenic acid | |
| US7038112B2 (en) | Fatty acid elongases | |
| CA2180386C (en) | Canola oil having increased oleic acid and decreased linolenic acid content | |
| WO2000011012A1 (en) | Synthetic fatty acid desaturase gene for expression in plants | |
| JP2004321189A (ja) | 遺伝子修飾植物におけるヒドロキシル化脂肪酸の製造 | |
| JPH10510438A (ja) | 植物ステアロイル−ａｃｐチオエステラーゼ配列および植物種子油のステアリン酸塩含量を増大させる方法 | |
| Chellamuthu et al. | Increase in alpha-linolenic acid content by simultaneous expression of fatty acid metabolism genes in Sesame (Sesamum indicum L.) | |
| Tian et al. | Characterization of a PLDζ2 homology gene from developing castor bean endosperm | |
| US20110189697A1 (en) | Recombinant cells and plants for synthesis of very long chains fatty acid (vlcfa) | |
| Shockey et al. | Assessing the biotechnological potential of cotton type-1 and type-2 diacylglycerol acyltransferases in transgenic systems | |
| WO2000075343A2 (en) | ENGINEERING β-KETOACYL ACP SYNTHASE FOR NOVEL SUBSTRATE SPECIFICITY | |
| Choudhary et al. | Agrobacterium mediated transformation of Petunia hybrida with yeast Δ-9 fatty acid desaturase | |
| US20050170478A1 (en) | Expression of phospholipid:diacylglycerine acyltranssferase (pdat) for the production of plant storage lipids with polyunsaturated fatty acids | |
| Kridl et al. | New sources of fats, waxes and oils: the application of biotechnology to the modification of temperate oilseeds. | |
| Weselake et al. | Heterologous expression of flax PHOSPHOLIPID: DIACYLGLYCEROL CHOLINEPHOSPHOTRANSFERASE (PDCT) increases polyunsaturated fatty acid content in yeast and Arabidopsis seeds | |
| Faure et al. | Recombinant Cells And Plants For Synthesis Of Very Long Chains Fatty Acid (vlcfa)(Patent WO 2009/156469 A1) |