JPH0698777A - トランスジェニック植物組織における、△９デサチュラーゼによる脂肪酸の改変 - Google Patents

トランスジェニック植物組織における、△９デサチュラーゼによる脂肪酸の改変

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JPH0698777A
JPH0698777A JP4347356A JP34735692A JPH0698777A JP H0698777 A JPH0698777 A JP H0698777A JP 4347356 A JP4347356 A JP 4347356A JP 34735692 A JP34735692 A JP 34735692A JP H0698777 A JPH0698777 A JP H0698777A
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Abstract

(57)【要約】 【目的】植物における脂肪酸および対応するトリアシグ
ルリセロール組成物の合成を改変すること。 【構成】動物または酵母源から得られる脂肪酸補酵素デ
サチュラーゼを用いて形質転換された植物組織は、形質
転換されたカルス、葉および種子において、１６および
１８炭素の一価不飽和脂肪酸の増加に伴った、１６およ
び１８炭素の飽和脂肪酸の減少を示す。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、脂肪酸−補酵素Ａまた
は△９デサチュラーゼ遺伝子を用いることによる、植物
における脂肪酸および対応するトリアシルグリセロール
組成物の合成の改変に関する。
【０００２】
【従来の技術】植物は、天然において、一群の脂肪酸を
生成し、その脂肪酸からより広範囲な群の脂質、例え
ば、一価アシルグリセロール、ジアシルグリセロール、
トリアシルグリセロール、リン脂質、糖脂質等を合成す
る。特定の植物により生成される特定の群の脂質は、そ
の植物の遺伝子型、および熱、寒気、干ばつ等の環境要
因に対する応答により決定される。しかし、環境条件に
は関係なく、植物は、その生成に必須の生化学的機構を
有さない脂肪酸または脂質組成物は決して生成し得な
い。そのような生化学経路は、最終的には遺伝子型によ
り決定される。従来の遺伝子改変方法は、植物品種改良
家による、全植物体レベルにおける遺伝子組み換え工程
を含む。これらの方法は、その特徴が良く理解され、行
うのも簡単であるが、一般に、新たな生化学経路をつく
りだすことによるのではなく、天然の生化学的機構を最
適化することにより、好ましい油の含有量および組成比
を増加させる。
【０００３】同時に、植物における脂肪酸の不飽和化機
構は、食物の質に影響を与え、また生物学的プロセスに
おいて意義があるために、その機構の改変には関心が寄
せられ続けている。油脂の特性は、それらの脂肪酸組成
により決定され、その脂肪酸組成物は、栄養素としての
質および酸化安定性に影響を与える。同様に、植物が脂
肪酸から合成する他の植物脂質の特定構造および組成
は、これらの脂質の生合成のための前駆体として利用し
得る脂肪酸プールの構成に依存する。
【０００４】近年、食物中の飽和脂肪酸の含有量を減少
させることに関心が寄せられている。医学的および栄養
学的研究により、多くの食物および食物成分生産者が、
油脂をベースとした食物および食物成分において特定の
組成物を求めるようになっている。このような所望の組
成物は、しばしば、一価および多価不飽和脂肪酸ならび
に対応するトリアシルグリセロールを多く含有する。言
い換えれば、飽和脂肪酸および飽和脂肪酸をベースとし
たトリアシルグリセロールの含有量は少ない。植物由来
の油脂を工業上用いる使用者はまた、工業工程において
使用される供給材料の特定化を好むが、このような特定
化では、しばしば、単一の脂肪酸部分が高い割合を占め
ることが要求される。好ましい脂肪酸部分は、しばし
ば、パルミトレイン酸誘導体、オレイン酸誘導体、リノ
ール酸誘導体、またはリノレン酸誘導体のような不飽和
脂肪酸部分である。残念なことに、天然には、このよう
な好ましい組成物を生成する脂肪種子植物は存在しな
い。従って、一価不飽和脂肪酸を多く含有する植物油を
生成する脂肪種子植物の変種および雑種を開発するため
の努力がなされ始めている。しかし、全植物を用いる遺
伝学的方法の増加的な性質を考慮すると、遺伝子工学を
通じて単一遺伝子レベルで生化学経路に影響を与え、か
つ生化学経路をつくりだし得る組成物および方法に対す
る必要性および要求は存在し続けている。
【０００５】たとえ従来の植物品種改良方法が、植物変
種の脂質における脂肪酸の組成を改変するのに成功した
場合でも、その植物の天然の生化学経路は依然として、
当該技術において認識される特徴および限界のすべてを
示す。従って、例えば、植物品種改良により改善された
脂肪種子作物は、環境の変化に対して通常通り応答を示
す。これらの応答には、より温暖な成長条件下でより高
い割合の飽和脂肪、およびより冷涼な成長条件下ではよ
り高い割合の不飽和脂肪を生成する傾向が含まれ、この
傾向は、天候を予想することが困難であるのと同様に、
特定の脂肪酸組成物を有する脂肪種子の信頼性のある生
産を困難にしている。従って、これらの環境による影響
を補うための手段を有することもまた強く望まれる。こ
の目的を達成するための努力は、現在までのところ、ほ
とんどなされていない。
【０００６】最後に、作物の環境範囲を改善し、広げる
ことが所望され続けている。温帯、亜熱帯および熱帯地
方原産のある種の脂肪種子植物種は、より冷涼な生産地
域にはあまり適さない。たとえより冷涼な機構に適した
脂肪種子であっても、さらなる適応は利益をもたらし得
る。なぜなら、植え付け時期を春に移動させ、また成長
時期を夏および秋まで延長させることにより、時には作
物の生産量を増加し得るからである。植物品種改良家
は、必要な気候上の適応の１つの局面である、成熟速度
は著しく注目してきたが、気候上の適応の他の重要な局
面は、（凍結耐性とは区別される）冷涼耐性である。
【０００７】
【発明の要旨】本発明によると、実質的に脂肪酸補酵素
ＡデサチュラーゼのみをコードするｃＤＮＡクローンを
含むキメラ発現カセットであって、植物細胞中において
該ｃＤＮＡクローンを発現させる調節配列に、機能し得
るように連結される、発現カセットが提供される。
【０００８】好ましい実施態様によると、前記発現カセ
ットは、バクテリア細胞において前記ｃＤＮＡクローン
を発現させる調節配列に、機能し得るように連結され
る。
【０００９】本発明のもう１つの局面によると、前記発
現カセットの少なくとも１つのコピーを外来プラスミド
として含む、バクテリア細胞が提供される。
【００１０】本発明のさらにもう１つの局面によると、
前記発現カセットの少なくとも１つのコピーを含む、形
質転換された植物細胞が提供される。
【００１１】好ましい実施態様によると、前記形質転換
された植物細胞は、単子葉植物種の細胞である。
【００１２】好ましい実施態様によると、前記形質転換
された植物細胞は、トウモロコシ、モロコシ、小麦、ヤ
シまたはイネの細胞である。
【００１３】好ましい実施態様によると、前記形質転換
された植物細胞は、双子葉植物種の細胞である。
【００１４】好ましい実施態様によると、前記形質転換
された細胞は、大豆、菜種、ホホバ、ナンキンハゼ、タ
バコ、サフラワー、ピーナッツ、またはヒマワリの細胞
である。
【００１５】本発明のさらにもう１つの局面によると、
前記細胞を含む細胞培養物または組織培養物が提供され
る。
【００１６】本発明のさらにもう１つの局面によると、
形質転換された大豆植物であって、その細胞が、前記発
現カセットの少なくとも１つのコピーを含む、大豆植物
が提供される。
【００１７】本発明のさらにもう１つの局面によると、
形質転換された菜種植物であって、その細胞が、前記発
現カセットの少なくとも１つのコピーを含む、菜種植物
が提供される。
【００１８】本発明のさらにもう１つの局面によると、
形質転換されたヒマワリ植物細胞であって、その細胞
が、前記発現カセットの少なくとも１つのコピーを含
む、ヒマワリ植物が提供される。
【００１９】本発明のさらにもう１つの局面によると、
形質転換されたサフラワー植物であって、その細胞が、
前記発現カセットの少なくとも１つのコピーを含む、サ
フラワー植物が提供される。
【００２０】本発明のさらにもう１つの局面によると、
形質転換されたピーナッツ植物であって、その細胞が、
前記発現カセットの少なくも１つのコピーを含む、ピー
ナッツ植物が提供される。
【００２１】本発明のさらにもう１つの局面によると、
植物細胞および全植物体における不飽和脂肪酸部分およ
び対応する脂肪酸由来の脂質の組成比を増加させる方法
であって、該植物細胞または該全植物体の細胞に、前記
キメラ発現カセットを挿入する工程を包含する、方法が
提供される。
【００２２】好ましい実施態様によると、前記方法は、
前記発現カセットにより提供される配列の少なくとも１
つのコピーが、再生後の細胞において存在するように、
前記全植物体を有性的またはクローン的に再生させる工
程をさらに包含する。
【００２３】好ましい実施態様によると、前記発現カセ
ットは、エレクトロポレーションにより前記細胞内に導
入される。
【００２４】好ましい実施態様によると、前記発現カセ
ットは、ミクロパーティクルボンバードメントにより前
記細胞内に導入される。
【００２５】好ましい実施態様によると、前記発現カセ
ットは、ミクロ注入により前記細胞内に導入される。
【００２６】本発明のさらにもう１つの局面によると、
アグロバクテリウム感受性の双子葉植物における不飽和
脂肪酸部分および対応する脂肪酸由来の脂質の組成比を
増加させる方法であって、プラスミドが前記発現カセッ
トを含むように改変されたアグロバクテリウムに細胞を
感染させることにより、該発現カセットが該細胞内に導
入される、方法が提供される。
【００２７】好ましい実施態様によると、前記脂肪酸−
補酵素Ａデサチュラーゼ遺伝子は、ステアリル−補酵素
Ａデサチュラーゼ遺伝子である。
【００２８】好ましい実施態様によると、前記脂肪酸−
補酵素Ａデサチュラーゼ遺伝子は、哺乳類または酵母起
源である。
【００２９】好ましい実施態様によると、前記脂肪酸−
補酵素Ａデサチュラーゼ遺伝子は、ラットからのステア
リル−補酵素Ａ遺伝子である。
【００３０】
【発明の構成】本発明は、植物の遺伝子を改変させて、
不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸から生成される対応す
る脂質の生成量および含有量を増加させるためのキメラ
遺伝子構築物を提供する。このキメラ遺伝子構築物は、
実質的に脂肪酸−補酵素Ａまたは△９デサチュラーゼ酵
素のみをコードする配列を含む。このコード配列は、植
物細胞における遺伝子の発現（酵素の生成）を引き起こ
すように作用する上記および下流の調節成分にコード配
列が機能し得るように連結される。不飽和脂肪酸は、植
物および動物細胞において異なる酵素により生成され、
動物および酵母細胞において見いだされるデサチュラー
ゼと、植物中の対応する酵素との間には、構造または配
列に関する相同性はほとんど存在しない。しかし、今
回、以下のことが見いだされた。すなわち、補酵素Ａに
依存性のデサチュラーゼをコードする遺伝子を含む本発
明による構築物が、ミクロパーティクル・ボンバードメ
ント、アグロバクテリウム（Agrobacterium）感染、ま
たはミクロ注入のような従来の形質転換法により植物細
胞に導入されると、この遺伝子は、隣接する植物調節配
列の制御の元に細胞中で発現され、植物細胞中に天然に
存在する生合成機構とうまく相互作用し、天然に生成さ
れるパルミチン酸およびステアリン酸部分の脱飽和を触
媒し、パルミトレイン酸誘導体およびオレイン酸誘導体
を生成する。これらの一価不飽和化合物をより多量に形
成させることにより、本発明はまた、一価不飽和物が前
駆体として利用される、高度に脱飽和した他の脂肪酸部
分の生成に有利である。これらの不飽和部分は、天然に
存在する不飽和脂肪酸部分と同一であり、存在する生化
学経路を介して植物組織中のトリアシルグリセロール貯
蔵脂質に導入され得る。このようにして、不飽和脂肪酸
部分および対応するトリアシルグリセロール（および一
価アシルグリセロール、ジアシルグリセロール、リン脂
質、および他の脂肪酸由来の脂質）の組成比が増加す
る。従って、本発明はまた、不飽和脂肪酸部分および対
応する脂肪酸由来の脂質を高い組成比で含む植物細胞お
よび全植物体を提供し、ここで、植物細胞は、本発明に
よるキメラ遺伝子構築物を含む。本発明はまた、植物細
胞および全植物体における不飽和脂肪酸部分および対応
する脂肪酸由来の脂質の組成比を増加させる方法も提供
し、この方法は、このような植物細胞またはこのような
全植物体の細胞に、本発明によるキメラ遺伝子構築物を
導入する工程を包含する。
【００３１】モデル系として、タバコ植物を考えると、
タバコの葉には、パルミチン酸（１６：０）およびステ
アリン酸（１８：０）の２つの主要な飽和脂肪酸が存在
する。これらの分子を基質として用いると、連続した脱
飽和反応により、１回当り１個の二重結合が形成され
る。これらの反応には、水素除去を触媒するデサチュラ
ーゼ、および電子伝達成分が必要である。植物におい
て、第１の脱飽和工程は、葉緑体に局在する可溶性酵素
により触媒される。高等な植物においては、１６：１お
よび１８：１が、アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）また
は特定のグリセロール脂質にエステル化されたパルミチ
ン酸およびステアリン酸から形成される。後続の脱飽和
反応は、色素体および小胞体の両方において起こり得
る。細胞内のこれらの異なる位置において見いだされる
酵素は、見かけ上異なる遺伝子がコードしている。植物
系における特異的なデサチュラーゼの活性を制御する少
なくとも８個の遺伝子が存在すると推定されている。
【００３２】サフラワーのデサチュラーゼのインビトロ
での研究では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）抽出物にフェレ
ドキシンを添加したものが必要であることが示されてい
る。同様の結果は、アボカドのデサチュラーゼにおいて
も見いだされた。
【００３３】本発明の好ましい実施態様においては、ラ
ットからのステアリル補酵素Ａデサチュラーゼが使用さ
れる。これは、正常なラットにおいて細胞質中の還元型
シトクロムｂ5からの電子を必要とする△９デサチュラ
ーゼである。しかし、正常な植物では、これらの反応は
通常、葉緑体における△９デサチュラーゼを介して起こ
る。細胞質における膜間形の脂肪酸は、補酵素Ａ誘導体
として存在し得る。他の界における生物からのデサチュ
ラーゼは、２つの界において遺伝子およびタンパク質の
配列および構造が大きく異なるにもかかわらず、植物に
より供給される必須の生体経路成分と共に、効果的に機
能し得ることが今回発見された。従って、本発明は、通
常は、補酵素Ａ型の脂肪酸を用い、葉緑体よりはむしろ
細胞質において機能する、植物内の生化学経路の形成を
含む。本発明を用いて得られる結果により、植物中に存
在するシトクロムｂ5およびシトクロムｂ5リダクターゼ
が、機能的なラットデサチュラーゼ複合体において通常
見いだされるこれらの対応成分の代わりとなり得ること
が示される。
【００３４】さらに、不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸
由来の脂質の合成は、冷涼な環境条件に対する植物の一
般的な応答であることが観察されている。改変された膜
脂肪酸組成物を有する細菌は、野生型菌株よりも低い温
度で生存することが示されている。理論により限定する
意図はないが、これらの脂肪酸および脂質は対応する飽
和化合物よりも低い温度まで液状を保ち、そのため低温
の膜流動性を維持することから、その合成は植物にが低
温耐性を付与すると考えられている。従って、本発明は
また、不飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸由来の脂質を合
成する植物の天然の能力を引き上げることにより、植物
の寒冷耐性を向上させる機会を提供する。
【００３５】逆に、より温暖な環境条件下では、植物は
また、完全に飽和した脂肪酸およびその脂肪酸由来の脂
質を合成する傾向があることが理解される。他方、本発
明に使用されるデサチュラーゼ遺伝子は、典型的には、
動物または酵母から得られるため、これらの天然の宿主
生物により提供されるより暖かい温度において、大変効
率的に機能する。従って、本発明はまた、高温であるほ
どより活性なために、温度の上昇と共により多量の脂肪
酸脱飽和物を生成するデサチュラーゼ遺伝子を提供する
ことにより、脂肪種子植物中の脂質組成物に対する、よ
り高い成長温度の影響を相殺または補う能力を提供す
る。
【００３６】（産業上の応用）Fragaria、Lotus、Medic
ago、Onobrychis、Trifolium、Trigonella、Vigna、Cit
rus、Linum、Geranium、Manicot、Daucus、Arabidopsi
s、Brassica、Raphanus、Sinapis、Atropa、Capsicum、
Datura、Hyoscyamus、Lycopersicon、Nicotiana、Solan
um、Petunia、Digitalis、Majorana、Cichorium、Helia
nthus、Lactuca、Bromus、Asparagus、Antirrhinum、He
merocallis、Nemesia、Pelargonium、Panicum、Pennise
tum、Ranunculus、Senecio、Salpiglossis、Cucumis、B
rowallia、Glycine、Lolium、Triticum、およびDatura
属からの種を含むがそれらに限定されない、任意の植物
種が、本発明の発現カセットおよび方法を用いて改変さ
れ得るが、本発明により提供される脂肪酸の改変は、大
豆、ヒマワリ、菜種、サフラワー、ピーナッツ、トウモ
ロコシ、アマ、ナンキンハゼ、ホホバ、およびヤシなど
の油含有作物において最も有利に用いられることが予想
される。
【００３７】脂肪酸−補酵素Ａデサチュラーゼ遺伝子
は、任意の適切な動物または酵母宿主からクローニング
され得る。なぜなら、この遺伝子の配列は、哺乳類種間
において高度に保存されており、哺乳類と酵母遺伝子と
の間にさえ相同性を有する領域が存在することが分かっ
ているからである。１８：０から１８：１への工程を触
媒するデサチュラーゼをコードする遺伝子は、ラット、
マウスおよび酵母からクローニングされている。ヒトゲ
ノムプロジェクトは、最終的に、ヒトの脂肪酸−補酵素
Ａデサチュラーゼのコード配列を提示するが、所望され
るならこの配列を用い得る。他方、ラットのステアリル
補酵素Ａデサチュラーゼのアミノ酸配列（本願に記載の
形質転換工程において使用される）と、ヒマ(Ricinus c
ommunis)ステアリル−ＡＣＰデサチュラーゼとの間には
検出可能な同一性は見いだされていない。そのため、必
要とされる補酵素Ａ依存性遺伝子は、植物からは得られ
ない。
【００３８】本願における用語「脂肪酸由来の脂質」と
は、植物中に合成された飽和もしくは不飽和C12または
より高級な脂肪酸を前駆体として有する、任意の天然植
物脂質のことを指す。これらの脂質には、モノアシルグ
リセロール、ジアシルグリセロール、トリアシルグリセ
ロール、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルエ
タノールアミンのようなリン脂質、糖脂質、および葉組
織が有する他の脂質等が含まれるが、特に限定はされて
いない。これらの化合物の合成に用いられる天然脂肪酸
「原料」を飽和から不飽和に変換することにより、本発
明は、植物中に存在する天然の生化学経路を、対応する
不飽和脂肪酸由来の脂質の生成に有利なものにする。
【００３９】以下の実施例は、本発明の実施を例示する
が、本発明を限定するものではない。
【００４０】
【実施例】
（実施例１） 植物発現プラスミドの構築 ラット由来のステアリル補酵素ＡデサチュラーゼのｃＤ
ＮＡは、１．１ｋｂのコード配列およびそれに続く３．
５ｋｂの非翻訳配列からなる。本願の実施例に使用され
る遺伝子は、３番目から３５６番目までのアミノ酸をコ
ードする。J. Biol. Chem., 263:2532-2536の記載に従
って構築されたプラスミドｐＤｓ３−３５８は、P. Str
ittmatterにより提供された。このプラスミドを、Ｂａ
ｍＨＩおよびＳｓｔＩで消化し、ラットのデサチュラー
ゼ遺伝子を含む１．２ｋｂの断片を放出させた。この断
片を、ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩで消化したBluescript
SK+（Stratagene）に連結した。次いで、このプラスミ
ドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｓｔＩで消化し、１．２ｋ
ｂの断片を放出させた。植物発現ベクターｐＫＹＬＸ７
１：３５ＳはｐＫＹＬＸ７１の誘導体であり、このベク
ターにおいて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、転写開
始部位に対して−４１６から−９０に重複した塩基配列
を含む３５Ｓプロモーターと置換されている。このプラ
スミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｓｔＩで消化し、仔牛
の腸アルカリン性ホスファターゼで処理し、上記の１．
２ｋｂの断片に連結して、ｐ７１2ＲＤＳを形成した。
ラットのデサチュラーゼの構造遺伝子に加えて、このプ
ラスミドは、ネオマイシンリン酸転移酵素（カナマイシ
ン耐性を与える）、広宿主範囲のＲＫ２コピー点、Ｔ−
ＤＮＡボーダー、およびポリアデニル化シグナルを含
む。このプラスミドの地図を図１に示す。コントロール
のプラスミドは、ラットのデサチュラーゼ構造遺伝子を
欠いているが、それ以外は同一であった。反応性のＥ．
ｃｏｌｉ ＴＢ１をこのプラスミドで形質転換した。５
０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび１２．５ｍｇ／Ｌのテ
トラサイクリンを補足したＬＢプレートから、単一コロ
ニーを回収した。コロニーを液体培養物に移し、ＤＮＡ
をアルカリ溶解により調製した。予想された大きさのプ
ラスミドを、以下の実験に用いた。
【００４１】（実施例２） 植物形質転換 タバコ（Nicotiana tabacum）品種「キサンチ(Xanth
i)」の植物体を、ディスクの代わりに葉片を用いること
以外は一般に実施されているように（例えば、Horschら
による1985年の文献、Science 227:1229-12231を参
照）、Agrobacteriumtumefaciensを用いた共培養により
形質転換した。カナマイシン耐性の選択は、１００ｍｇ
／Ｌの濃度で行った。カルス誘導、発芽（shooting）、
および発根（rooting）はすべて、カナマイシンの存在
下で生じた。Agrobacterium tumefaciensの分裂を阻害
するために、３００ｍｇ／Ｌのメフォキシン（Mefoxi
n）を培地に含ませた。
【００４２】ｐＲＫ２０１３をヘルパープラスミドとし
て用いる三親交雑により、プラスミドｐＫＹＬＸ７１：
３５Ｓおよびｐ７１2ＲＤＳを、Ｅ．ｃｏｌｉからA. tu
mefaciens株ＬＢＡ４４０４に移動させた。
【００４３】（実施例３） 植物ＤＮＡの単離および配列の増幅 植物の全ＤＮＡを、酸性グアニジニウムチオシアネート
抽出を用いて、緑葉から単離した。植物の全核酸を４Ｍ
のＬｉＣｌに混合し、遠心分離にかけた後、（ＤＮＡを
含む）上清を新しい管に移し、２容量のエタノールで沈
降させた。次いで、ＤＮＡを遠心分離にかけ、７０％の
エタノールで洗浄し、真空乾燥し、１ｍＭのトリス、
０．１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ７．５中で再懸濁させた。
【００４４】ＰＣＲは、全容量２０μＬ中で行い、２０
０ｎｇの葉の全ＤＮＡ、１１ｎｇのプライマー（5'ACGT
GGATCCACCATGCCGGCCCACATGCTC3'）および（5'GCTACTCTT
GTGGCTCCC3'）、１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴ
ＰおよびｄＴＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのトリ
ス ｐＨ８．３、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．０１％
のゼラチンおよび１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（ＡｍｐｌｉＴａｑＴＭ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｅｒ
ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を含んでいた。一方
の陰性コントロールは、植物ＤＮＡを除いて、すべて同
一の成分からなっていた。他方の陰性コントロールは、
植物形質転換に使用したベクター（ｐＫＹＬＸ７１：３
５Ｓ）を用い、デサチュラーゼ配列は用いずに形質転換
したカナマイシン耐性植物からのＤＮＡを含んでいた。
反応混合物は、鉱油で覆い、熱サイクラー（Ｌａｂ−Ｌ
ｉｎｅ）中に置いた。温度を、９５℃で２秒間（変
性）、次いで６４℃および５９℃でそれぞれ２秒間（ア
ニーリング）、次いで７２℃で１８０秒間（延長）で、
合計３０循環させた。ＰＣＲ生成物を、ＴＡＥを泳動用
緩衝液として０．８％のアガロースゲル上で分画した。
サイズマーカーは１ｋｂのＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ
ｓ）（ＢＲＬ）であった。
【００４５】（実施例４） 脂質の分画および脂肪酸の分析 葉状組織（約０．５ｇ）を、３ｍＬのクロロホルム：メ
タノール（２：１）中に入れ、Tissumizer(Tekmar)で粉
砕した。次いで、溶剤をSpeedvacで濃縮し、ＰＣの単離
のためにシリカゲル６０プレート上で分画した。スポッ
トを削り、メチルエステルを硫酸／メタノール中で下記
のように調製した。乾燥重量を測定するために使用した
葉状試料は凍結乾燥した。
【００４６】全脂肪酸のメチルエステルを、１００ー２
００ｍｇのカルス組織からガラス管中で調製した。カル
ス組織は、上記のようにTissumizerを用いて、またはガ
ラス棒を用いて、２ｍＬの１％硫酸メタノール溶液中で
粉砕した。全脂肪酸を分析するために準備した葉は粉砕
しなかった。エステル交換を、約０．２ｍＬのメタノー
ルが残るまで８０℃で行った。ヘプタデカン酸（１７：
０；ヘキサン中１ｍｇ／ｍＬ）を、新鮮重１ｇの組織当
り０．１ｍｇで、内部標準として植物組織に直接加え
た。組織を抽出する前に、ヘキサンを約１０分間蒸発さ
せた。全植物脂肪酸は、クロマトグラム上のピーク領域
を、ヘプタデカン酸の領域と比較することにより定量し
た。ＴＬＣプレート上で分画した脂質からの脂肪酸を定
量するために、２５ｍｇのノナデカン酸（１９：０）
を、削り取る前に各スポットに加えた。ヒューレットパ
ッカードＦＦＡＰカラムを用いたこと以外は、Dahmer
ら、J. Amer. Oil Chem. Soc. 66:543-548 (1989)に記
載のようにして、ガスクロマトグラフィーにより脂肪酸
メチルエステルを分析した。
【００４７】ＰＣ、ＦＦＡ、ＴＧ、１６：０等の標準物
質は、シグマから入手した。Arabidopsis thalianaのＦ
ａｄＣ変異体からの葉は、１６：１を蓄積し得る（Scie
nce252:80-87 (1991)）。ＦａｄＤ変異体の葉は、１
６：２を蓄積し得、それに対応して１６：３が減少す
る。これらの葉および野生型の葉からの抽出物を用い
て、１６：１、１６：２および１６：３の保持時間を決
定した。
【００４８】（結果）Agrobacterium tumefaciensで媒
介した形質転換の後に、カナマイシン耐性のタバコカル
スを、改変された脂肪酸組成に関してスクリーニングし
た。いくつかのカルスは、コントロールよりも１６：１
／１６：０および／または１８：１／１８：０の比率が
高かった（図２）。１８：１／１８：０の比率は、１
６：１／１６：０の比率からは予想できなかった。調べ
た１０個のデサチュラーゼ形質転換体のうち９個におい
て、コントロールカルスにおいても観察されたように、
１８：１／１８：０の比率は、１６：１／１６：０の比
率よりも高かった。これらのデータは、再生した植物に
おいて、脂肪酸の量もまた変化した可能性を示唆してい
た。
【００４９】導入されたデサチュラーゼ遺伝子の存在を
示すデータを、図３に示す。植物の全ＤＮＡのＰＣＲ増
幅により、予想された１．１ｋｂ生成物は、ラットのデ
サチュラーゼ遺伝子を欠いているプラスミドで形質転換
された２個のコントロール植物中には見られないことが
確認された。図４から７は、これらの植物からの葉を分
析することにより得られたデータをグラフにより示す。
【００５０】カルスと同様に、ラットのデサチュラーゼ
遺伝子を有する葉は、コントロールと比較した場合に、
１６：１／１６：０および／または１８：１／１８：０
の比率が増加することが期待された。図４は、ラットデ
サチュラーゼ遺伝子で形質転換された２つの植物（ＲＴ
およびＲＵ）に関して１６：１／１６：０の比率が明確
に増加したことを示している。植物ＲＴは、コントロー
ルよりも１８：１／１８：０の比率が高いが、一方ＲＵ
はコントロールよりも１８：１／１８：０の比率は高く
ない。これは、カルスからのデータ（図２）と対照的で
ある。カルスからのデータでは、１８：１／１８：０の
比率が、コントロールよりも、ラットのデサチュラーゼ
遺伝子を有するカルスにおいて常に高かった。しかし、
ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、いくつかの分化組織に
おいては、未分化のカルス細胞におけるほどにはうまく
作用せず、このことにより、この相違が説明され得る。
【００５１】導入されたデサチュラーゼが、脂肪酸の組
成および量にどんな影響を与え得るかは公知でなかった
ため、１６：０、１６：１、１６：２、１６：３、１
８：０、１８：１、１８：２および１８：３の量も求め
た。これらの部分がどのように変化したかを具体的に示
すために、タバコの葉における１６：０、１６：１、１
６：２、１６：３、１８：０、１８：１、１８：２およ
び１８：３の量を合計して各脂肪酸の量をこの全体に対
する百分率で表した（図５）。植物ＲＴおよびＲＵにお
いて、１６：１は大きく増加し、１６：０および１８：
０は減少していることが理解される。１８：２の量もま
た、コントロールと比較して増加した。デサチュラーゼ
形質転換体ＲＴおよびＲＵはまた、コントロールと比較
して１８：３の割合が減少した。
【００５２】脂質の蓄積を概観するために、１６および
１８炭素脂肪酸（１６：０、１６：１、１６：２、１
６：３、１８：０、１８：１、１８：２および１８：
３）を合計し、１グラムの新鮮重量または乾燥重量当り
のｍｇＦＡとして表した（データは示していない）。コ
ントロールと、デサチュラーゼで形質転換した植物との
間の、１６炭素脂肪酸および１８炭素脂肪酸の全量にお
ける類似性は、葉脂質の代謝に関係する経路間での補償
を示唆する。このような補償は、Arabidopsisの様々な
デサチュラーゼ変異体において示されている（Science
252:80-87(1991)）。デサチュラーゼで形質転換された
タバコにおいて見いだされる１６：１の量の増加が、導
入された遺伝子の産物から生じたことをさらに示すため
に、葉脂質を、クラスに分画した。１６：１は、通常、
植物のホスファチジルコリン（ＰＣ）においては観察さ
れないため、この画分をさらに詳しく調べ、図６に示す
結果を得た。１６：１は、ラットのデサチュラーゼ遺伝
子で形質転換された植物からのＰＣにおいてのみ検出さ
れたことが理解される。コントロールとデサチュラーゼ
形質転換体との間のこの質的な相違により、導入された
デサチュラーゼが葉組織において機能していることが明
確に証明される。ラットデサチュラーゼ遺伝子で形質転
換された葉からのホスファチジルコリンにおける１６：
１の存在（図６）は、主としてトリグリセリドである、
種子の脂質組成を変化させるための必要条件である。ホ
スファチジルコリンは、生育する種子におけるトリグリ
セリドの直接の前駆体である。
【００５３】ラットからのデサチュラーゼを用いて、植
物における脂肪酸組成を操作することが可能であるとい
う事実は、植物脂質の量を改変する上で、変異体選択以
外のアプローチが使用され得ることを示す。
【００５４】（実施例５）トランスジェニック植物の種
子もまた調べた。葉脂質全体における１６：１脂肪酸部
分の著しい増加は、図７に示すように低いレベルではあ
るが、種子脂質において反映されている。不飽和／飽和
脂肪酸の比率もまた、コントロールのトランスジェニッ
ク植物の葉および種子組織と比較して、代表的なデサチ
ュラーゼ形質転換体において増加していた（図７）。こ
れは、１６炭素脂肪酸部分の不飽和物に対する飽和物の
比率を観察することによりさらに説明される。図８に示
すように、選択されたトランスジェニック植物Ｇ、Ｍ、
Ｕ、Ｔ、Ｊ、およびＷにおいては、コントロール植物Ｅ
に比べて、１６：０／（１６：１＋１６：２＋１６：
３）が大きく減少した。
【００５５】（実施例６）J. Biol. Chem., 263:2532-2
536の記載に従って構築されたプラスミドｐＤｓ３−３
５８は、P. Strittmatterから提供された。このプラス
ミドを、ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩで消化し、ラットの
デサチュラーゼ遺伝子を含む１．２ｋｂの断片を放出さ
せた。この断片を、予め形成したＡＣＴベクターｐＡＬ
ＬＮＡＰＧ１に連結し、ｐＡＬＬＮＡＰＳＣＤを生成し
た。この工程により、ステアリル補酵素Ａデサチュラー
ゼをコードする部位は、二元ベクター中の種子特異的プ
ロモーターであるナピン（napin）の直後に配置され、
植物形質転換に利用できる状態となった。
【００５６】ナピンプロモーターおよびステアリル補酵
素Ａデサチュラーゼ遺伝子を担持するプロモーター遺伝
子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩ断片として切
り取り、二元ベクターｐＡＬＬＴＫｒｅｐのＨｉｎｄＩ
ＩＩ−ＳｓｔＩ断片と置換するのに使用し、ｐＡＬＬＴ
ＫＮＡＰＳＣＤを生成した。このｐＡＬＬＴＫＮＡＰＳ
ＣＤは、トランスジェニック植物にカナマイシン抗生物
質に関してより明確な選択能を提供したこと以外は、構
造的および機能的にｐＡＬＬＮＡＰＳＣＤと同等であっ
た。このＤＮＡのAgrobacteriumへの転移は、上記のよ
うな三親交雑とは異なって、生物体への直接的な形質転
換により成し遂げられた。遺伝子を、細胞創傷および共
培養によりカノーラ（canola）細胞へ挿入し、全カノー
ラ形質転換体を、形質転換されたカルス培養物から再生
させた。結果として生じた再生形質転換植物から種子を
得た。
【００５７】以上のように本発明においては、植物にお
ける脂肪酸および対応するトリアシルグリセロール組成
物の合成の改変方法が提供される。動物または酵母源か
ら得られる脂肪酸補酵素Ａデサチュラーゼ遺伝子で形質
転換された植物組織は、形質転換されたカルス、葉およ
び種子において、１６および１８炭素の一価不飽和脂肪
酸の増加に伴った、１６および１８炭素の飽和脂肪酸の
減少を示す。
【００５８】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 ACGTGGATCC ACCATGCCGG CCCACATGCT C 31 配列番号：２ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 GCTACTCTTG TGGCTCCC 18
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１ー５に記載の形質転換工程において使
用されるプラスミドのプラスミド地図。
【図２】実施例１ー４の実験の結果を示す棒グラフ。コ
ントロールおよび形質転換されたカルス組織における、
１６：１／１６：０の比率および１８：１／１８：０の
比率の相違を示す。
【図３】実施例１ー４の実験結果を示すグラフ。ＰＣＲ
により増幅された本発明の遺伝子の存在を示す、コンピ
ューターで作成したゲルの画像を示す。
【図４】実施例１ー４の実験結果を示す棒グラフ。コン
トロールおよび形質転換された植物組織における、１
６：１／１６：０の比率および１８：１／１８：０の比
率の相違を示す。
【図５】実施例１ー４の実験結果を示す棒グラフ。コン
トロールおよび形質転換された植物における、１６：
０、１８：２および１８：３脂肪酸の割合の相違を示
す。
【図６】実施例１ー４の実験結果を示す棒グラフ。コン
トロールおよび形質転換された植物組織における、１
６：１、１６：３、１８：０および１８：１の割合の相
違を示す。
【図７】実施例１ー５の実験結果を示す棒グラフ。コン
トロールおよび形質転換された植物組織における、１
６：１／１６：０の比率および１８：０／１８：０の比
率の相違を示す。
【図８】実施例１ー５の実験結果を示す棒グラフ。本発
明により形質転換された植物の成熟種子における、不飽
和脂肪酸に対する飽和脂肪酸の比率の変化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 15/82 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 デイビッド エフ． ヒルデブランド アメリカ合衆国 ケンタッキー 40503, ファイエッテ カウンティ，レキシント ン，ヘザー ウェイ 2359 (72)発明者 ダブリュー． スコット グレイバーン アメリカ合衆国 ノース ダコタ 58103, カス カウンティ，ファーゴ，エイピーテ ィー． 308，サウス，セブンス ストリ ート 20

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】実質的に脂肪酸補酵素Ａデサチュラーゼの
    みをコードするｃＤＮＡクローンを含むキメラ発現カセ
    ットであって、植物細胞中において該ｃＤＮＡクローン
    を発現させる調節配列に、機能し得るように連結され
    る、発現カセット。
  2. 【請求項２】バクテリア細胞において前記ｃＤＮＡクロ
    ーンを発現させる調節配列に、機能し得るように連結さ
    れる、請求項１に記載の発現カセット。
  3. 【請求項３】請求項２に記載の発現カセットの少なくと
    も１つのコピーを外来プラスミドとして含む、バクテリ
    ア細胞。
  4. 【請求項４】請求項１に記載の発現カセットの少なくと
    も１つのコピーを含む、形質転換された植物細胞。
  5. 【請求項５】単子葉植物種の細胞であることをさらなる
    特徴とする、請求項４に記載の形質転換された細胞。
  6. 【請求項６】トウモロコシ、モロコシ、小麦、ヤシまた
    はイネの細胞であることをさらなる特徴とする、請求項
    ５に記載の形質転換された細胞。
  7. 【請求項７】双子葉植物種の細胞であることをさらなる
    特徴とする、請求項４に記載の形質転換された細胞。
  8. 【請求項８】大豆、菜種、ホホバ、ナンキンハゼ、タバ
    コ、サフラワー、ピーナッツ、またはヒマワリの細胞で
    あることをさらなる特徴とする、請求項７に記載の形質
    転換された細胞。
  9. 【請求項９】請求項８に記載の細胞を含む細胞培養物ま
    たは組織培養物。
  10. 【請求項１０】形質転換された大豆植物であって、その
    細胞が、請求項１に記載の発現カセットの少なくとも１
    つのコピーを含む、大豆植物。
  11. 【請求項１１】形質転換された菜種植物であって、その
    細胞が、請求項１に記載の発現カセットの少なくとも１
    つのコピーを含む、菜種植物。
  12. 【請求項１２】形質転換されたヒマワリ植物細胞であっ
    て、その細胞が、請求項１に記載の発現カセットの少な
    くとも１つのコピーを含む、ヒマワリ植物。
  13. 【請求項１３】形質転換されたサフラワー植物であっ
    て、その細胞が、請求項１に記載の発現カセットの少な
    くとも１つのコピーを含む、サフラワー植物。
  14. 【請求項１４】形質転換されたピーナッツ植物であっ
    て、その細胞が、請求項１に記載の発現カセットの少な
    くも１つのコピーを含む、ピーナッツ植物。
  15. 【請求項１５】植物細胞および全植物体における不飽和
    脂肪酸部分および対応する脂肪酸由来の脂質の組成比を
    増加させる方法であって、該植物細胞または該全植物体
    の細胞に、請求項１に記載のキメラ発現カセットを挿入
    する工程を包含する、方法。
  16. 【請求項１６】前記発現カセットにより提供される配列
    の少なくとも１つのコピーが、再生後の細胞において存
    在するように、前記全植物体を有性的またはクローン的
    に再生させる工程をさらに包含する、請求項１５に記載
    の方法。
  17. 【請求項１７】前記発現カセットが、エレクトロポレー
    ションにより前記細胞内に導入される、請求項１５に記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】前記発現カセットが、ミクロパーティク
    ルボンバードメントにより前記細胞内に導入される、請
    求項１５に記載の方法。
  19. 【請求項１９】前記発現カセットが、ミクロ注入により
    前記細胞内に導入される、請求項１５に記載の方法。
  20. 【請求項２０】アグロバクテリウム感受性の双子葉植物
    における不飽和脂肪酸部分および対応する脂肪酸由来の
    脂質の組成比を増加させる方法であって、プラスミドが
    請求項１に記載の発現カセットを含むように改変された
    アグロバクテリウムに細胞を感染させることにより、該
    発現カセットが該細胞内に導入される、方法。
  21. 【請求項２１】前記脂肪酸−補酵素Ａデサチュラーゼ遺
    伝子が、ステアリル−補酵素Ａデサチュラーゼ遺伝子で
    ある、請求項１に記載の発現カセット。
  22. 【請求項２２】前記脂肪酸−補酵素Ａデサチュラーゼ遺
    伝子が、哺乳類または酵母起源である、請求項１に記載
    の発現カセット。
  23. 【請求項２３】前記脂肪酸−補酵素Ａデサチュラーゼ遺
    伝子が、ラットからのステアリル−補酵素Ａ遺伝子であ
    る、請求項２１に記載の発現カセット。
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