HUT63568A

HUT63568A - Composition and process for controlling the activity of rna by modifying the rna 5' cap structure

Info

Publication number: HUT63568A
Application number: HU923659A
Authority: HU
Inventors: Brenda F Baker
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1990-05-23
Filing date: 1991-05-22
Publication date: 1993-09-28
Also published as: DK0531447T3; CA2083377C; WO1991017755A1; ATE186464T1; FI925210A0; HU9203659D0; BR9106486A; DE69131773T2; KR930700118A; KR960004931B1; FI925210A; NO924309L; DE69131773D1; EP0531447A4; CA2083377A1; EP0531447B1; EP0531447A1; NO924309D0; JPH06500075A; ES2139578T3

Description

KOMPOZÍCIÓ ÉS ELJÁRÁS RNS AKTIVITÁSÁNAK SZABÁLYOZÁSÁRA AZ

RNS 5' CAP SZERKEZETÉNEK MÓDOSÍTÁSÁVAL

ISIS PHARMACEUTICALS, INC., Carlsbad, Ca,

Amerikai Egyesült Államok

Feltaláló:

BAKER Brenda, Carlsbad, Ca, Amerikai Egyesült Államok

A bejelentés napja: 19’9/. 05. 22.

Elsőbbsége: 1990. 05. 23. (527 599)

Amerikai Egyesült Államok

A nemzetközi bejelentés száma: PCT/US91/03606

A nemzetközi közzététel száma: WO 91/17755

A találmány tárgya kompozíció és eljárás RNS aktivitásának szabályozására az RNS 5' Cap szerkezetének módosításával .

75924—7418—GI

A találmány közelebbről betegségek kezelésére és biológiai kísérleti rendszerekben génkifejezés szabályozására szolgáló módszerekre vonatkozik. A találmány általában az antiszensz vegyületek gén-expresszióval kapcsolatos területére vonatkozik, főleg olyan fehérjék expressziójával kapcsolatban, amelyek az eukarióta és vírus RNS-ek 5' lezáró struktúrájától (5' Cap) függenek.

Az antiszensz vegyületek olyan molekulák, amelyek egy RNS specifikus nukleotid szekvenciájával képesek hibridizálódni. Az eukarióta és virális RNS-ek 5' lezáró (5' Cap) struktúrája egy szerkezetileg és kémiailag is egyedülálló egység, amely az RNS-ek 5’ végén található, és az RNS érettségének, élettartamának, valamint a transzláció hatékonyságának meghatározója.

Ismeretes, hogy az emlősök legtöbb testi funkcióját, beleértve a kóros állapotokat is, fehérjék befolyásolják. Az ilyen fehérjék, akár közvetlenül hatnak, akár az enzimatikus funkciójukon keresztül, igen nagy mértékben hozzájárulnak az emberek és állatok számos betegségéhez. A klasszikus gyógyászati módszerek általában az ilyen fehérjékkel való kölcsönhatáson alapulnak, azzal az erőfeszítéssel, hogy módosítsák a betegségeket okozó vagy fokozó funkciókat.

Újabban azonban kísérleteket tettek arra, hogy szelektíven befolyásolják az ilyen nem-kívánatos fehérjék termelődését azokkal a molekulákkal való kölcsönhatás alapján, amelyek irányítják a szintézisüket, azaz az intracelluláris RNS alapján. E kölcsönhatások magukban foglalják a komplementer antiszensz” oligonukleotidok, illetve analógjaik kötődését az intracelluláris RNS-hez szekvencia-specifikus módon, a Watson-Crick bázispárosodás alapján. A két molekula intracelluláris hibridizációját arra akarják kihasználni, hogy gátolják a kiválasztott mRNS szintézisét vagy megfelelő metabolizmusát, illetve alkalmazását a fehérje szintézisét végző transzlációs mechanizmus által. Az a vélemény alakult ki, hogy ha ily módon akadályozzuk a fehérjék termelődését, akkor ennek gyógyászati hatása lehet minimális mellékhatásokkal, mivel az antiszensz molekulák és az RNS szekvenciák közötti felismerés igen nagy reakció-specifitást mutat [Cancer Research, 48., 2659-68 (1988); Pharmaceutical Research, 5, 539-49 (1988); Anticancer Drug Design, 2, 117128 (1987)].

Az eddigi kísérleti megfigyelések alapján számos kémiai módosítást végeztek az antiszensz oligonukleotidokon, amelyekkel gyógyászati aktivitásukat akarták növelni. Ezen módosításoknak az volt a céljuk, hogy növeljék az antiszensz oligonukleotidoknak a sejtekbe való behatolási képességét, stabilizálják őket a nukleázokkal és más olyan enzimekkel szemben, amelyek zavarják intracelluláris szerkezetüket vagy aktivitásukat, illetve fokozzák a fehérjék termelődését gátló hatásukat. Ezen módosítások közé tartozik a molekula gerincének módosítása, abból a célból, hogy javítsák a stabilitást és a sejtekbe való behatolás képességét, ilyen például a metil-foszfonátok alkalmazása [Nucleic Acids Research, 6, 3009-24 (1979); Biochemistry, 18, 5134-43 (1979)], a metil-foszfor-tionátok alkalmazása [Journal of the American Chemical Society, 111, 2321-22 (1989)], a foszfor-tioátok alkalmazása [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 85, 7079-7083 (1987)], valamint a foszfor-amidátok alkalmazása [Biochemistry, 27., 7237-46 (1986); Nucleic Acids Research, 14, 3487-99 (1986)]. Ide tartozik például további kapcsolódó domének és/vagy reakciócentrumok hozzáadása az antiszensz részhez, azzal a céllal, hogy fokozzuk az antiszensz molekula hatékonyságát; ilyenek például az interkalátorok [Nucleic Acids Research, 15, 471736 (1987); Biochemistry, 27, 3997-4003 (1988)], az alkilező szerek és redox fémek [Nucleic Acids Research, 15, 8643-59 (1987); Acc. Chem. Rés., 19, 180-86 (1986)].

Ezen módosításoktól függetlenül a korábban készített antiszensz oligonukleotidok aktivitása nem volt elegendő ahhoz, hogy a terápiában, kutatásban vagy a diagnosztizálásban alkalmazzák őket. Az elégtelenségnek valószínűleg több oka van, például a kiválasztott RNS szekunder és tercier struktúrájának nem kielégítő ismerete, a sejtbe való bejutás, illetve felvétel alacsony százaléka, a reakcióközpontok inaktiválása más sejt-komponensek által és a fehérje-termelés gátlásához szükséges s^töchiometriai szükségletek.

Tehát igen régóta élő igény van olyan oligonukleotidokra, amelyek megfelelő gyógyászati hatékonysággal rendelkeznek, és nincs vagy nagyon kicsi a mellékhatásuk.

A találmány kóros állapotok kezelésében használható gyógyászati eljárásokra és anyagokra vonatkozik, az RNS aktivitásának befolyásolásán keresztül.

A találmány tárgykörébe tartoznak továbbá a gyógyászatban használható oligonukleotid analógok.

··· ·* ·

- 5 A találmány tárgya továbbá eljárás olyan oligonukleotid analógok előállítása, amelyek kisebb valószínűséggel okoznak nemkívánatos vagy toxikus mellékhatásokat vagy reakciókat.

A találmány tárgya továbbá eljárás olyan oligonukleotid analóg előállítása, amelyek gátolják egy kiválasztott mRNS érését, stabilizálódását és/vagy a transzlációs iniciálódását.

A találmány tárgykörébe tartozik továbbá az olyan oligonukleotid analógok alkalmazása, amelyek kémiailag vagy szerkezetileg módosítják a hírvivő RNS 5* lezáró struktúráját.

A találmány tárgya továbbá a hírvivő RNS 5’ lezáró része egyedülálló kémiai és szerkezeti tulajdonságainak kihasználása annak módosítása vagy eltávolítása céljából.

A találmány tárgya továbbá az RNS 5' lezáró részének katalitikus eltávolítása vagy módosítása.

A találmány tárgya továbbá az RNS 5¹ lezáró szerkezetének nem-katalitikus eltávolítása vagy kémiai módosítása.

A találmány értelmében az RNS aktivitását befolyásolni képes készítményeket állítunk elő. Ezek a készítmények egy olyan reaktív részt tartalmaznak, amely képes a kiválasztott RNS 5' lezáró részének kémiai vagy szerkezeti megváltoztatására, illetve eltávolítására. A készítmény tartalmaz még emellett egy irányító részt, amely specifikusan hibridizál a kiválasztott RNS 5' terminális régiójával, abból a célból, hogy a reaktív részt az 5' lezáró résszel reaktív helyzetbe hozzuk. A készítmények emellett adott esetben, de ··· ··« • ·

- 6 előnyösen tartalmazhatnak egy kapcsoló részt, acélból, hogy az irányozó és a reaktív részeket együtt tartsa.

Az előnyös megvalósítási módok szerint a készítmény reaktív része egy vagy több olyan funkciós részt tartalmaz, amely képes katalitikusán eltávolítani vagy katalitikusán módosítani a hírvivő RNS 5’ lezáró részét.

Egy másik előnyös megvalósítási mód szerint a készítmény reaktív része egy vagy több olyan funkciós részt tartalmaz, amely(ek) képes(ek) nem-katalitikus módon kémiailag vagy szerkezetileg módosítani, illetve eltávolítani a hírvivő RNS 5’ lezáró részét. Ezek a funkciós csoportok erre a célra rendelkezhetnek nukleofil, elektrofil, bázikus, savas, kationos, amfoter vagy redox aktivitással. Az ilyen egység lehet például imidazol, N-metil-imidazol, hisztamin, piridin, 1,5,9-triazaciklododekán, dietilén-triamin, trietil-amin-tetramin, illetve az 1,10-orto-fenantrolin vagy a bipiridin cink(II) vagy réz(II) komplexei. Ezek közül a trietil-amin-tetramin az előnyös, illetve a réz(II) komplexek még előnyösebbek. .

Az előnyös megvalósítási módok szerint a találmány szerinti irányzó részek egy 5-10 bázisból álló oligonukleotidot (vagy oligonukleotid analógot) tartalmaznak, amelyek felismerik a megcélzott transzkriptum 5' terminális régióját.

Az irányzó rész előnyösen egy oligonukleotid analóg, amelyben az oligonukleotidok közül legalább néhány helyettesítve van olyan struktúrákkal, amelyeknek az a funkciójuk, hogy megnöveljék a készítményeknek a sejtek intracelluláris • · ·»ί ·*« « • · · · · · régiójába való behatolási képességét, ahol a módosítandó aktivitású RNS található, valamint az is a funkciójuk, hogy a nukleázokkal szembeni rezisztenciát biztosítsák. Az egyik előnyös megvalósítási mód szerint az oligonukleotidokat vagy az oligonukleotid analógokat úgy formulázzuk, hogy a nukleotid egységek közötti kapcsoló csoportok közül legalább néhány kéntartalmú fajtát tartalmazzon, ilyenek például a foszfor-tioát egységek.

A készítmény kapcsoló része olyan funkciós csoportokat tartalmaz, amelyek optimalizálják a reaktív rész és az irányzó rész közötti kapcsolatot az 5' lezáró rész eltávolítása vagy módosítása céljából. Ezek a funkciók lehetnek specifikus hidrogén-donor és -akceptor tulajdonságúak, és a reaktív rész optimális elhelyezkedését biztosító motívumok. Egy másik megvalósítási mód szerint a kapcsoló rész egy vagy több aminosavat tartalmaz.

A találmány tárgya továbbá eljárás egy szervezetben termelődő fehérje termelődésének befolyásolására oly módon, hogy a szervezetet egy olyan készítménnyel hozzuk érintkezésbe, amelyet az előző megfontolásoknak megfelelően formuláztunk. Előnyös, ha a megcélzott RNS szekvenciát előre úgy választjuk meg, hogy egy olyan RNS legyen, előnyösen hírvivő RNS, amely azt a fehérjét kódolja, amelynek a képződését befolyásolni, gátolni kell, illetve le kell állítani. A készítmény alkalmazandó irányzó részét tehát úgy kell megválasztani, hogy komplementer, azaz antiszensz legyen az előre kiválasztott RNS szekvenciával.

A találmány tárgya továbbá eljárás olyan szervezetek ··· i·· · • « * « » kezelésére, amelyek egy fehérje nemkívánt termelődésével jellemezhető kóros állapotban szenvednek, oly módon, hogy a szervezetet egy olyan készítménnyel hozzuk kapcsolatba, amely az előző bekezdésekben megadott előnyös tulajdonságokkal rendelkezik.

A mellékelt 1. ábra az 5' lezáró rész szerkezetét mutatja.

A 2. ábra a mRNS 5’ lezáró szerkezete metilezett guanozin csoportján található támadáspontokat mutatja.

A 3. ábra mRNS 5' lezáró rész trifoszfát kötésén található támadáspontokat mutatja.

A 4. ábra a citozin felhasználásának két megközelítését mutatja, a kapcsoló rész lehorgonyzásához, hogy megjavítsuk a reaktív egység elhelyezkedését.

Ismeretes, hogy az eukarióta és a virális kis nukleáris RNS-ek és hírvivő RNS-ek egyedülálló struktúrával rendelkeznek az 5' végükön, ami ahhoz szükséges különböző mértékben, hogy megérjenek, stabilak legyenek és hatékonyan vegyenek részt a transzlációban. Az általános szerkezeti tulajdonságokat leírták [Journal of Molecular Biology, 99, 519-547^v(1975)], és az 1. ábrán mutatjuk be. A lezáró rész egy guanozin csoport, amely a 7-es pozícióban található nitrogénen metilezve van. Az RNS legutolsó 5' bázisához kötődik egy trifoszfát kötésen keresztül, ami az egyes csoportok 5' hidroxil csoportjait köti össze. Az 5' terminális bázis(ok) 2' hidroxiljai metilezve vannak.

A kis nukleáris RNS-ek és a hírvivő RNS-ek lezáró részei közötti különbség az, hogy a kis nukleáris RNS lezáró

- 9 része dimetilezve van a guanin csoport exociklusos aminocsoportján. Erről a tulajdonságról az a vélemény alakult ki, hogy fontos meghatározója a kis nukleáris RNS-ek és a hírvivő RNS-ek funkcionális irányítottsága közötti különbségnek [Nucleic Acids Research, 16, 8953 (1988)].

A lezáró struktúra a sejtmagban lejátszódó transzkripció során adódik hozzá a naszcensz transzkriptumhoz. A transzkripció lejátszódása után az eukarióta és néhány virális gén primer transzkriptumait érlelési folyamatoknak kell alávetni, mivel át nem íródó szekvenciák vannak jelen a transzkriptum kódoló szekvenciáján belül. Az 5' lezáró szekvenciáról kimutatták, hogy szükséges a primer transzkriptumok éréséhez, az érett RNS molekulák előállításához, főleg az illesztési reakciók során, amikor az intronok kihasadása lejátszódik [Cell, 38., 731-736 (1984)]. Az 5' lezáró szekvencia eltávolítása vagy hiánya következtében az RNS gyorsan lebomlik a sejtmagban és a citoplazmában [Mól. Bioi. Med., 5, 1-14 (1988); Cell, 32, 681-694 (1983)]. Az 5' lezáró struktúra nélkül az RNS valószínűleg érzékeny az 5' exonukleázok hatására. Végezetül, a mai napig vizsgált eukarióta és virális mRNS-eknek szükségük van az 5' lezáró struktúrára a transzláció iniciálásához [Cell, 9, 645-653 (1976); Federation of Experimental Biologists Society Letter, 96, 1-11 (19878); Prog. Nucleic Acids Research, 35, 173-207 (1988)]. Léteznek specifikus, a lezáró szakaszhoz (a továbbiakban Cap néven említjük) kapcsolódó fehérjék, amelyek egy fehérje>transzlációja iniciációjának mechanizmusához szükségesek [Cell, 40. 223-24 (1985); Prog. Nucleic Acids

- 10 Research, 35, 173-207 (1988)]. A hírvivő RNS 5' Cap struktúrája tulajdonságainak és funkciójának ismeretében ma az a vélemény alakult ki, hogy a struktúra bizonyos módosításai, például eltávolítása, illetve szerkezeti vagy kémiai módosításai kizárják a transzkriptumot mindenféle kellemetlen folyamatból, azaz például egy nemkívánt fehérje termelődéséből. Ma az a vélemény alakult ki, hogy az oligonukleotidok szolgáltathatnak ilyen gátló hatást.

Az RNS transzkriptum aktivitásának módosításához szükséges találmány szerinti készítmények három részből állónak tekinthetők: a reaktív rész, a kapcsoló rész és az antiszensz kapcsolódó felismerő egység.

A reaktív résznek az a funkciója, hogy eltávolítsa vagy megváltoztassa a megcélzott transzkriptum 5' Cap struktúráját oly módon, hogy a transzkriptum ne legyen képes működni egyik vagy több rá jellemző normál folyamatban, ami kezdődik a megcélzott transzkriptum 5’ Cap struktúrájának szintézisével, és tart a lebomlásig, illetve a megcélzott transzkriptumnak a transzlációs poolból való eltávolításáig.

A kapcsoló résznek az a funkciója, hogy az előállított molekula reaktív részét és az antiszensz kötődő részt együtt tartsa. A kapcsoló rész tartalmazhat szerves és/vagy szervetlen funkciós csoportokat, amelyek optimalizálják a reaktív rész pozícióját és orientációját, azzal a céllal, hogy a lehető legnagyobb precizitást érjük el az 5' Cap eltávolítására vagy módosítására irányuló specifikus aktivitásban.

Az antiszensz kötődő/felismerő egység szerepe az, hogy a reaktív egységet specifikusan a megcélzott 5' terminális régióhoz irányítsa, előnyösen úgy, hogy ne zavarja meg az említett célzott sejtfolyamatokat, és oly módon, hogy megkönnyítse a reaktív egység és a kapcsoló rész funkcionális működését.

Az 5' Cap struktúra tulajdonságait ki lehet használni egyenként vagy együttesen, amint az szükséges ahhoz, hogy elérjük a találmány céljait. Ilyenek lehetnek a foszfoanhidrid kötések, a foszfo-monoészter-anhidrid kötések, a metilezett guaninocsoportok, valamint a kapcsolódó ribózcsoport. Az egyes megközelítési módokra az alábbiakban adunk példát.

A 2. és 3. ábrán az 5' Cap struktúra reaktív atomjai és kötései láthatók, amelyek kémiai természetüknél fogva az adott reaktív egység esetében érzékenyek a módosításra vagy hasításra.

A 3. ábrán a metilezett guaninocsoport, valamint a kapcsolódó ribózcsoport látható, amelyek az 5* Cap struktúra módosításának jó célpontjai. A metilezett bázisnak mind a 2es pozícióban levő exociklusos nitrogénatomja (1-es hely), mind a 6-os pozícióban’ levő oxigénatomja (2-es hely) nukleofil tulajdonságú. Ennélfogva ezek alkilezéssel módosíthatók, például alkil-halogenidekkel, alfa-halogén-karbonilokkal vagy aziridinekkel mint funkciós csoportokkal.

Mind a nitrogén-metil-kötés (3a hely), mind a nitrogén glikozidos kötése (4a hely) labilis, az aromás gyűrű elektronhiányos állapota következtében. Ennélfogva a 7-metilcsoportban levő szénnek (3-as pozíció) vagy a ribóz 1-es szénatomjának (4-es hely) nukleofil támadása a nitrogénatom hasítását eredményezi, ezzel egy torz Cap struktúrát kapunk. A reaktív csoportok közé tartoznak az aminok, a hidroxilek és a szulfhidrilek.

A metilezett guaninocsoport 8-as pozíciójában levő szénatom (5-ös pozíció) elektrofil, a 7-es pozícióban levő metilezett és ennek következtében elektropozitív nitrogénatom miatt. Ennélfogva ez a hely alkalmas nukleofil csoportokkal, például aminokkal és hidroxilekkel való reakciók kivitelezésére.

A cukorgyűrű 3-as szénatomja és a 4-szénatomja között (6-os pozíció) a hasítást oxidációs úton érhetjük el, a 2’ és 3’ hidroxilcsoportokon keresztül, reaktív csoportok, például kelátba zárt fémek segítségével.

A 2. ábrán a foszfátgyűrűnek azok a pontjai láthatók, amelyek az 5’ Cap struktúra eltávolításának és módosításának élő célpontjai, reakciós csoportként nukleofil vagy elektrofil reagenseket alkalmazva.

Mind a foszforatomok (1-es pont), mind az 5-ös szénatom (2-es pont) alkalmasak a nukleofil támadásra. A nukleofil támadás eredménye lehet az egyik kapcsolt láncbeli oxigénatom helyettesítése, és ezzel a foszfoanhidrid lánc hasítása a mRNS legutolsó bázisa és a metilezett guanozin között. Ezek a reakciók lehetnek katalítikusak, megfelelő nukleofil reagensek (például aminok és karboxilátok) alkalmazásával.

A 3-as, 4-es és 5-ös pontban található oxigénatomok mind megfelelő pontok a nukleofilekkel kivitelezett katalí13 tikus hasítás fokozására vagy aktiválására (az 1-es és 3-as pontokban) protonálás vagy fémekkel való kölcsönhatás révén, a kapcsoló részhez kötött további funkciós csoportok révén. Emellett ezek az oxigének érzékenyek az elektrofil reagensekre és ezzel az alkilezésre, aminek az lehet az eredménye, hogy a foszfoanhidrid kötés irreverzibilisen módosul.

Egy összetett, terápiás hatású molekula reaktív csoportja lehet egy többszörös funkcióval rendelkező csoport, a kívánt reakció elérése érdekében, illetve lehet egyszerűen egy funkciós csoport ugyanennek a célnak az elérésére. A korábban említett példák szerint az elérhető csoportok lehetnek nukleofilek, például aminok, karboxilátok, tiokarboxilátok és hidroxidok a koordinációs kémia alkalmazásával; Lewis- vagy Brönsted-savak és -bázisok, beleértve a fémeket; valamint elektrofilek, például alfa-halogén-karbonilok/-amidok, aziridinek, metil-transzferázok.

Az 5' Cap struktúra katalitikus eltávolításának egy kézenfekvő módja, ha reaktív egységként piridint használunk. A piridin, amely nukleofil reagensként működik, képes arra, hogy kizárólag a piroföszfát-diésztert hasítsa foszfo-diészterek jelenlétében vizes körülmények között [Can. J. Biochem., 50, 287-291 (1972)]. Az ilyen típusú nukleofil, egy aromás nitrogén, a pirofoszfát kötést egy kovalens intermedieren keresztül hasítja el. Az intermediert azután hidrolizáljuk, az elhasított termék és a reaktív nukleofil ágens felszabadítására. Ez tehát egy katalitikus reakció.

A piridineket ismert szintézis-módszerekkel kapcsolhatjuk az aromás gyűrűn levő számos helyről egy antiszensz oligonukleotid molekulához [Katritzky and J.M. Lagowski, Organic Chemistry, 19 (1971)]. Egy ilyen kapcsolásnak az lehet a célja, hogy a reaktív piridin-nitrogént az 5' Cap struktúra elektrofil foszfor- vagy szénatomjához megfelelő, reaktív közelségbe juttassuk. Ennek egy példája szerint a különböző szubsztituenseknek az aromás gyűrű 4-es pozíciójához való kapcsolását a piridin N-oxid származékán keresztül érhetjük el. Az N-oxiddal végzett reakció, elektrofil (nitrálás) vagy nukleofil reakciómechanizmus szerint (alkoholok, aminok, halogének, szulfhidrilek vagy szerves kötésű fémcsoportok) megfelelően funkcionalizált piridin-származékokat eredményeznek, például egy aminon vagy egy karbonsavon keresztül, az antiszensz kapcsoló egység hozzákötésére.

A piridinnek mint nukleofil egységnek az az előnye a foszforatomok esetében, hogy semleges, és ezért az anionos foszfát-oxigénekről nominális elektrosztatikus interferencia éri őket [Science, 235, 1173-1178 (1987)]. A nukleozid mono-, di- és tri-foszfátok pKa-értékei alapján, valamint a pKa-nak és a távozó csoportnak a nukleofil helyettesítési reakciókban való aktivitása közötti kapcsolat alapján azt gondolják, hogy az az előnyös, ha egy nukleofil ágenst optimális pozícióba helyezünk az 5' Cap struktúra β-foszforatomján végrehajtott nukleofil támadás céljából.

A piridin mellett más szerves alkil- és aromás aminok is működhetnek nukleofilekként, Lewis-sav/bázisként, illetve általános sav/bázisként, és az 5’ Cap szerkezetében kémiai változást okozó anyagként. Az imidazolról, az N-metil-imidazolról, a hisztaminról, az 1,5,9-triazaciklodo15 dékánról, a dietil-amin-triaminról és a trietilamin-tetraminról is kimutatták, hogy az 5' Cap struktúrával reakcióba lépnek. Jelenleg az a vélemény terjedt el, hogy ezen aminoknak a reakciója az 5' Cap struktúrával a 7-metil-guanozino-csoport hidrolízisét okozza.

Az aminok mellett olyan fémkomplexek is léteznek, amelyeket sokkal hatékonyabbnak találtak az 5' Cap struktúra kémiai eltávolításában. Az 1,10-orto-fenantrolin és a bipiridin kelátképzőkkel létrehozott réz(II)- és cink(II)-komplexek még sokkal jobban reagálnak az 5' Cap struktúrával, mint az alkil- és aromás aminok. Az előbbiekből előállítható négy lehetséges komplex közül a réz(II)-orto-fenantrolin komplex volt a legreakcióképesebb. Jelenleg az az elterjedt vélemény, hogy ez a komplex reagál az 5' Cap struktúrával, és ez okozza a foszfoanhidrid kötés hidrolízisét nem-katalitikus úton.

A reaktív egység pontos elhelyezkedését a közötte és az antiszensz kapcsoló egység között található kapcsoló rész irányítja. A kapcsoló rész hossza bármennyi lehet, körülbelül 1 és 50 atom között, illetve előnyösebben 1 és 500 atom között lehet a távolság, kizárva midenféle egyéb additív kapcsolódó anyagokat, azaz a kapcsoló láncra vitt funkciós csoportokat. A kapcsoló részt az antiszensz kötődő részhez előnyösen étereken, észtereken és amidokon keresztül kapcsolhatjuk, az antiszensz lánc legutolsó bázisának cukorvagy foszfátcsoportján keresztül. A kapcsolódás lehet közvetlenül a legutolsó bázisról is, azaz például a pirimidinek 5-ös nitrogénatomjáról.. A kapcsolódás lehet a legutolsó bá16 zis 2-es pozíciójában is a purinok esetében. Az egyik megvalósítási mód szerint a kapcsoló rész egy vagy több aminosavat tartalmaz. Egy másik megvalósítási mód szerint a kapcsoló rész egy vagy több nem-komplementer természetes vagy módosított oligonukleotidot tartalmaz. Amint az a 6. példában látható, két extra kilógó” bázis jelenléte, amelyek az antiszensz oligodezoxiribonukleotid 3' végéről lógnak le (az RNS 5’ Cap strutúrájával szemben), nem gátolja az antiszensz oligonukleotidnak az 5¹ Cap struktúrát tartalmazó RNS-hez való hibridizálódását.

A kapcsoló rész tartalmazhat még további kötődő egységeket, például egy citozincsoportot vagy guanídiumcsoportot, amelyek az 5’ Cap struktúrára specifikusak, ilyen például a metilezett guanozincsoport vagy az anionos foszfátcsopgrt. A 4. ábrán egy sor példát láthatunk a citozin kapcsolódására. A cél az, hogy egy további kötő elemet adjunk a molekulához, amely még tovább torzítja, illetve rögzíti az 5' Cap konformációját. Emellett egy további lehetőséget szolgáltathat egy katalitikus hasítási egység, például egy nukleofil csoport javított elhelyezésére (vagy rögzítésére) a Cap kötés alfa vagy béta foszforatomja mellett. A citozint egy hosszban vagy összetételben specializált kapcsoló részen keresztül köthetjük a molekulához, illetve az egyik ismert foszfátkötésen keresztül.

A készítmény utolsó, meggondolandó része az antiszensz kapcsoló egység.. A molekulának ez a része az, amely a reaktív részt a módosításra kiválasztott hírvivő RNS-hez irányítja. Ebben a találmányban ez az antiszensz molekulát specifikusan a kiválasztott transzkriptum 5' régiójához köti, az 5’ Cap struktúrával reakcióképes távolságban. A készítmény irányító része általában vagy egy oligonukleotid, vagy egy oligonukleotid analóg. Ezt ismert módszerekkel, általában szilárd fázisú szintézis, oldatban végzett szintézis vagy enzimatikus szintézis módszerrel tervezik és állítják elő. A nukleinsav-szintetizátorok és a megfelelő enzimek kereskedelmi forgalomban vannak; ezeknek az alkalmazása a szakterületen jártas szakember számára általában nyilvánvaló. Az ismert módszerek alkalmasak arra, hogy majdnem mindenféle, észszerű hosszúságú oligonukleotid előállítható legyen velük.

Leírásunkban az oligonukleotid szakkifejezés öszszekapcsolt nukleotid egységekre vonatkozik, amelyek a természetben előforduló bázisokból és furanozilcsoportokból állnak, amelyeket természetes foszfo-diészter-kötések kapcsolnak össze. A kifejezés tehát a természetben előforduló egységekből álló természetes vagy szintetikus oligonukleotidokat jelöli.

Az oligonukleotid analóg kifjezés olyan egységeket jelöl, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan funkcionálnak, de amelyek természetben elő nem forduló részeket is tartalmaznak. Azaz az oligonukleotid analógok tartalmazhatnak megváltoztatott cukorcsoportokat, illetve cukor-kapcsolatokat. Ilyenek lehetnek például a foszfor-tioátok és más kéntartalmú fajták, amelyek használata ismert a szakirodalomban. A szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember képes lehet más, a találmány gyakorlatában alkal18 mazható kötések kiválasztására.

Az oligonukleotid analógok körébe tartozhatnak olyan fajták is, amelyek legalább néhány módosított bázist is tartalmaznak. így olyan purinok és pirimidinek is használhatók, amelyek a természetben nem fordulnak elő. Hasonlóképpen, a nukleotid alegységek furanóz részén végzett módosítások is előfordulhatnak, mindaddig, amíg a találmány szellemétől a módosítások nem térnek el.

Az ilyen analógokat legjobban úgy lehet leírni, mint amelyek funkcionálisan felcserélhetők a természetes oligonukleotidokkal (illetve a természetes mintára szintetizált oligonukleotidokkal), de a természetes szerkezettől eltérő egy-két változtatást tartalmaznak. Az összes ilyen analóg a találmány oltalmi körébe tartozik, mindaddig amíg képesek azzal az RNS molekulával hibridizálódni, amelyek a szerkezetileg vagy kémiailag módosítandó 5' Cap struktúrát hordozzák.

A találmány néhány megvalósítási módja szerint előnyös, ha oligonukleotid analógokat használunk az oligonukleotidok helyett. Ebben a szövegösszefüggésben az oligonukleotid analóg kifejezés olyan szerkezetre vonatkozik, amely általában hasonlít a természetes oligonukleotidokra abból a szempontból, hogy képes az értelmes szállal komplexet képezni. A módosítások arra irányulnak, hogy fokozzuk az antiszensz molekulának azt a képességét, hogy behatoljon a sejtek intracelluláris terébe, ahol a kiválasztott hírvivő RNS található, illetve arra irányulnak, hogy nukleáz rezisztensek legyenek az antiszensz oligonukleotidok. E céloknak az «*« »··

- 19 eléréséhez előnyös, ha- módosítjuk a molekula gerincét, nemionos, akirális vagy tiszta enantiomer egységeket használunk, néhány vagy az összes foszfodiészter kötés helyett. A módosítások közé tartozhat a kapcsoló és reaktív egység hozzákötésének fokozása a molekulához, azzal a céllal, hogy az 5’ Cap struktúra optimális reaktivitását érjük el. E célnak az elérésére használhatunk alfa-anomer oligonukleotidokat, amelyek párhuzamosan kötődnek (5'-3':5'-3') a kiválasztott transzkriptum 5’ terminális szekvenciájához. Bármely létező, illetve ezután felfedezendő módszer alkalmazható ezeknek a céloknak az elérésére, a találmány gyakorlatával összhangban. A találmány szerinti készítmények irányzó részei előnyösen oligonukleotidok vagy oligonukleotid analógok, körülbelül 5-50 bázisból vagy bázis-analógból, előnyösen 8-40 bázisból állnak.

A találmány szerinti megoldást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.

1. példa m7GpppG hasítása fémkomplexekkel és aminokkal Számos rézkomplexet, alkilamint és aromás amint, amelyeket megfelelő jelölteknek tartottunk arra, hogy az antiszensz oligonukleotidokhoz kapcsoljuk őket, megvizsgáltunk, hogy képesek-e kémiailag módosítani az m7GpppG-t (Pharmacia LKB Biotechnology), amely egyetlen, a metilezett guanozin (m7G) Cap struktúrával lezárt guanozin nukleotid. Ez a struktúra analógja egy mRNS molekula 5' Cap és az első (5' végű) nukleotidjának.

• ·« · · (a) Rézkomplexek: Az 1,10-orto-fenantrolin (beszerezhető: Lancaster Synthesis) és a bipiridin (Aldrich) réz(II)-komplexeit vizsgáltuk az alábbiak szerint. A rézkomplexeket (50-500 μπιοί/ΐ) és m7GpppG-t (50-500 μιηοΐ/ΐ) kombináltunk 20 mmol/1 HEPES pufferben (pH=7,l) 1,7 ml-es Eppendorf csövekben, 300 μΐ reakciótérfogatban. Különböző koncentrációkat használtunk annak meghatározására, hogy mi a rézkomplex és a szubsztrát közötti legjobb arány. A reakciókat 37 °C-on végeztük 24 óra hosszat, 6-8 óránkénti centrifugálással, majd újra keveréssel.

(b) Alkil és aromás aminok: Imidazolt, N-metil-imidazolt, hisztamint, piridint, 1,5,9-triazaciklododekánt, dietil-triamint és trietil-amin-tetramint (mindegyik Aldrich) vizsgáltunk az alábbiak szerint. 500 mmol/1 amint és 1 mmol/1 m7GpppG-t kombináltunk 9,65 ml-es Eppendorf csövekben, 20 μΐ össztérfogatban. A reakciókat 60 °C-on végeztük 12 óra hosszat, minden órában lecentrifugálva, majd újrakeverve az elegyet, hogy minimalizáljuk a párolgás és bepárolódás következtében beálló koncentráció-fluktuációt.

2. példa

A reakciók elemzése anioncserélő kromatoqráfiával Az egyes reakcióelegyekből kromatográfiás elemzés céljára alikvot részeket vettünk ki. Az injektált mintákat úgy állítottuk elő, hogy belső standardot adtunk hozzájuk (nikotinamid-adenozin-difoszfát, NAD, Boehringer Mannheim), majd a végső térfogatra hígítottuk (110 μΐ) kétszer desztillált vízzel. Az elkészített mintákat ezután egy 100 μΐ-es injektáló hurokba injektáltuk, majd ezt követően egy MonoQ HR 5/5 anioncserélő gyantával töltött oszlopot tartalmazó Pharmacia LKB FPLC-re (Fást Protein Liquid Chromatography) vittük. Az A oldószer: desztillált víz. A B oldószer: 1 mol/1 NaCl plusz 5 mmol/1 Na-foszfát (pH=7,0). A gradiens programja: 0-40 % B: 30 percig, 40 % Β: 1 percig, 40-100 % Β: 1 percig, 100 % Β: 1 percig, 100-0 % B: 0,1 percig, 0 % B: 10 percig. Az áramlási sebesség 1 ml/perc. A termékeket 260 nm-nél mért UV elnyeléssel lehet kimutatni. Az integrálást az LC-500 FPLC kontroll panel beépített programjával végeztük. Az imidazolok és alkilaminok arányát a megmaradó szubsztrát, az m7GpppG. alapján határoztuk meg, egy belső standarddal (NAD) szemben mérve t=0 óránál és t=12 óránál. A réz(II)-komplexek relatív mennyiségét a megmaradó szubsztrát, az m7GpppG mennyisége alapján határoztuk meg, egy belső standarddal (NAD), valamint a kontrollal (csak puffer) szemben mérve azonos reakciókörülmények között. A reagáló anyagok és a reakciótermékek UV elemzéséhez a kromatográfia során gyűjtöttük a csúcsokat, majd külön-külön elemeztük őket egy fotodiódasoros detektorral.

3. példa

Reakciósebességek és a termékek analízise

A vizsgált vegyületek közül a rézkomplexek reagáltak leginkább az 5' Cap struktúrával, az m7GpppG-vel. 24 óra alatt 37 °C-on a Cu(II):orto-fenantrolin a kiindulási anyag 52 %-át elhidrolizálta. Ez a fémkomplex GMP, m7GMP, GDP és m7GDP termékeket eredményez, amint az kromatográfiás módszeβ · ·»···· · « » · · · · «·· ··· ·« ·· «·

- 22 rekkel kimutatható. A termékek elemzését komplementer-injektálásos kísérletekkel végeztük, kereskedelmi forgalomban levő standardok és UV spektrum elemzés alapján. Ezek a termékek azt mutatják, hogy a szubsztrát foszfoanhidrid kötése elhidrolizál. Á Cu(II):orto-fenantrolin és az aszimmetrikus, valamint szimmetrikus foszfoanhidridek (m7GpppG és GpppG) közötti reakció további vizsgálata azt mutatta, hogy a fémkomplex és a szubsztrát közötti aránynak nagyobbnak vagy egyenlőnek kell lennie, mint a 2:1 arány, ha a vizsgált időtartamok (egészen 7 napig), hőmérsékletek (22 °C, 37 °C, 60 °C), valamint reakciókörülmények között hidrolízist akarunk megfigyelni. Azaz, jelenleg úgy gondoljuk, hogy ezek nem katalitikus reakciók, mivel ciklikus ismétlődés (turnover) nem volt megfigyelhető.

A fémkomplexekkel összehasonlítva az aromás és alkil-aminok viszonylag gyengén reakcióképesek. Abból a célból, hogy észszerű időtartamon belül (24 óra) megfigyelhessük ezeket a reakciókat, a hőmérsékletet és a koncentrációkat drasztikusan meg kellett növelni a fémkomplex reakciókban használtakhoz képest. Az aminok és az m7GpppG relatív reaktivitását az 1. táblázaton mutatjuk be.

	1. táblázat
Reaqens	Relatív reaktivitás

az m7GpppG-vel

Trietil-amin-tetramin	1,0
1,5,9-triazaciklododekán	0,8
Hisztamin	0,24
Dietil-amin-triamin	0,10
Imidazol	0,05
N-metil-imidazol	0,05
Piridin	0,01

A vizsgált aminok közül (imidazol, N-metil-imidazol, hisztamin, piridin, 1,5,9-triazaciklododekán, dietil-amin-triamin és trietil-amin-tetramin) a trietil-amin-tetramin volt a legaktívabb, 60 °C-on 6 óra alatt a kiindulási anyag 47 %-ának az elvesztését okozta. Az aminokkal, mind alkil-, mind aromás aminokkal végzett reakciók eltértek azoktól, amelyeket a fémkomplexekkel kaptunk. Megfigyelt reakcióképessége alapján, és olyan antiszensz oligonukleotidokat keresve, amelyek ilyen reaktív egységekkel vannak felszerelve, egy sokkal kiterjedtebb analízist végeztünk a trietil-amin-tetraminnal.

A trietil-amin-tetramin és az 5' Cap struktúra egymással való reakciópontjainak további meghatározása és lokalizálása céljából három további szubsztrátumot használtunk: GpppG, GMP és m7GMP. Ez a reakciósor lehetővé tette hogy különbséget tegyünk a foszfoanhidrid kötéseknél leját24 szódó kémia és valamelyik guanin bázisnál lejátszódó kémia között. 60 °C-on 12 óra elteltével 500 mmol/1 trietil-amin-tetramin és 1 mmol/1 szubsztrát reakciójában nem volt megfigyelhető változás sem a GpppG-vel, sem a GMP-vel, míg ugyanilyen körülmények között az m7GMP 68 %-a elveszett, ami összehasonlítható a teljes Cap szubsztráttal kapott eredménnyel. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a trietil-amin-tetramin primer vagy iniciációs reakciócentruma kizárólag az N7-metilezett guanozincsoporton található, és nem a foszfoanhidrid kötésen, sem pedig a metilezetlen guanozincsoporton·

Általánosságban a fémkomplexeknek az 5’ Cap struktúrával való reakciópontjai eltérnek az aminokéitól; az általunk vizsgált fémkomplexek előszeretettel hidrolizálják a trifoszfo-anhidrid kötést, míg az aminok (példánkban a trietil-amin-tetramin) előszeretettel reagál a 7-metil-guanozin-csoporttal. Ez látható a 2. táblázatban:

2. táblázat (A reakció-centrumok vastagítva láthatók) Fémkomplexek Aminok m7GpppG m7gpppG

4. példa

Oligonukleotidok kémiai szintézise

A módosítatlan oligonukleotidokat egy automatizált DNS-szintetizátorral (Applied Biosystems 380B) szintetizáltuk, standard foszforamidát kémiát és jóddal való oxidációt alkalmazva.

5. példa

5¹ —Metilezett quanozin fm7G)-vei lezárt oliqoribonukleotidok szintézise

A lezárt oligonukleotidok oly módon állíthatók elő, hogy a kereskedelmi forgalomban levő m7GpppG-t ligáljuk egy kémiailag szintetizált 5'-foszforilezett oligoribonukleotidhoz, T4 RNS ligáz (Pharmacia) alkalmazásával. 2,5 mmol/1 m7GpppG-t, 0,3 mmol/1 oligoribonukleotidot, 0,3 mmol/1 ATP-t, 30 egység T4 RNS ligázt elegyítünk 50 mmol/1 HEPES puffer (pH=8,0) plusz 10 mmol/1 MgC12 és 0,7 % DMSO összetételt! oldattal. A ligálás eredménye 50 %-os.

6. példa

A 3¹ lógó bázisok hatása egy 5¹-lezárt oliqoribonukleotiddal komplementer antiszensz oligoribonukleotid hibridizációs tulajdonságaira

Egy 5'-végén lezárt 14 nukleotid hosszúságú (a Cap struktúra nélkül) oligonukleotidot szintetizáltunk oly módon, hogy kereskedelmi forgalomban levő m7GpppG-t (Pharmacia) ligáltunk a kémiailag szintetizált 5'-foszforilezett 14-tagú oligonukleotidhoz, amelyet a továbbiakban ISIS 2975-ként említünk (a szekvenciát lásd az alábbi 3. táblázatban), T4 RNS ligáz (Pharmacia) felhasználásával. A kívánt terméket (50 %-os ligálási hatásfok) gélen tisztítottuk natív körülmények között, majd desztillált vízbe extraháltuk a gél feldarabolásával és áztatásával. A lezárt « *4 ·· ··«« • · ♦ Λ 4 4 · 4 • 4 · · · termék meglétét úgy igazoltuk, hogy összehasonlítottuk a kiindulási anyag és a tisztított anyag mobilitását (az utóbbinak kisebb a mobilitása), valamint oly módon hogy megfigyeltük, hogy a lezárt termék (a továbbiakban ISIS m7G2975ként említjük) érzéketlen a borjúbél alkalikus foszfatázzal (Boehringer Mannheim) való defoszforilezésre, míg az 5' foszforilezett kiindulási anyag, az ISIS 2975 ugyanilyen körülmények között defoszforileződik.

Két antiszensz oligonukleotidot szintetizáltunk, az ISIS 3043-at és az ISIS 3044-et, amelyek komplementerek az

ISIS 2975-tel. Ennek a három oligonukleotidnak a szekvenciáját a 3. táblázatban mutatjuk be.
		3. táblázat
	Ref. szám	Szekvencia (5'-3·)	Szekv. szám
	ISIS—2975	CUA UAA GGA UCA CG	1.
	ISIS-3044	GTC ATC CTT ATA GC	2.
	ISIS-3043	GTC ATC CTT ATA GCG C	3.

Az ISIS 3044 egy 14 tagú oligonukleotid, amely bázisról-bázisra komplementer a 14 bázisból álló oligoribonukleotid régióval. Az ISIS 3043, egy 16 tagú oligonukleotid a 3’ végén két további, nem-komplementer bázist tartalmaz, egy G-t és egy C-t (ezek a lezárt ISIS m7G2975-tel való specifikus hibridizáció esetében a Cap struktúrával szemben találhatók) . Az antiszensz oligonukleotidokat 1:1 arányban összekevertük ISIS m7G2975-tel 3 μιηοΐ/ΐ koncentrációban 100 mmol/1 nátriumot és 10 mmol/1 foszfátot (pH=7,0) tartalmazó oldatban. Ezután a mintákat hővel denaturáltuk (85 °C, 5 perc), majd lassan szobahőmérsékletre hütöttük. Ezután olvadáspont kísérleteket végzünk 10-90 °C között Gilford Response II alkalmazásával, 0,5 °C-os lépésekben. A Tm értékeket úgy határoztuk meg, hogy az olvadási profilok első differenciálhányadosát képeztük. Az ISIS m7G2975:ISIS 3044 duplex és az ISIS m7G2975:ISIS 3043 duplex olvadási profilját összehasonlítottuk. Az ISIS 3043:ISIS m7G2975 duplex esetében a Tm értéket 41,5 °C-nak; az ISIS 3044:ISIS m7G2975 duplex esetében a Tm értéket 42,5 °C-nak találtuk. Ez a két Tm érték a kísérleti hibák határain belül azonos.

Ezek az eredmények azt mutatják, hogy egy, az 5' végén Cap struktúrát tartalmazó RNS 5' vége ellen irányított antiszensz oligonukleotid 3' végén található lelógó bázisok nem változtatják meg az oligonukleotid hibridizációs tulajdonságait, a lelógó bázisok és a transzkriptum 5' Cap struktúrája közötti kölcsönhatás következtében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy egy olyan egységet lehet kapcsolni egy antiszensz molekula 3’ végéhez, amely reagál az mRNS 5' Cap struktúrájával, anélkül, hogy megzavarnánk az antiszensz molekula és az RNS egymással való hibridizációját· « «4 · * ···· • · ·· 4 9 9 • · 494 9 « · · · * · ·»· 4·9 *» ·· ·*

SZEKVENCIALISTA (1) Általános információ:

(i) Bejelentő: ISIS Pharmaceuticals and Brenda Baker (ii) Bejelentés címe: KOMPOZÍCIÓ ÉS ELJÁRÁS RNS AKTIVITÁSÁNAK SZABÁLYOZÁSÁRA AZ RNS 5' CAP SZERKEZETÉNEK MÓDOSÍTÁSÁVAL (iii) Szekvenciák száma: 3 (iv) Levelezési cím:

(A) Címzett:

(B) Utca:

(C) Város:

(D) Állam:

(E) Ország:

(F) Irányítószám:

(v) Komputerrel olvasható forma:

(A) Hordozó típusa:

(B) Komputer:

(C) Operátor rendszer:

(D) Software:

(vi) A jelen bejelentés adatai:

(A) A bejelentés száma:

(B) A bejelentés napja:

(C) Osztály:

(vii) Az elsőbbségi bejelentés adatai:

(A) A bejelentés száma: 527 599 (B) A bejelentés napja: 1990. 05. 23. (viii) A képviselő adatai: (A) Név: (B) Regisztrálási szám: (C) Aktaszám: (ix) Telekommunkikációs informéciók: (A) Telefon: (B) Telefax:

Információk az 1. szekvenciára vonatkozóan (i) Szekvencia-jellemzők: (A) Hossz: 14

··· ·*· · • · · · (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: egy (D) Topológia: ismeretlen (xi) Szekvencia leírása: 1. szekvencia: CUAUAAGGAU CACG (2) Információk az 2. szekvenciára vonatkozóan:

(i) Szekvencia-jellemzők:

(A) Hossz: 14 (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: egy ' (D) Topológia: ismeretlen (xi) Szekvencia leírása: 2. szekvencia: GTCATCCTTA TAGC (2) Információk az 3. szekvenciára vonatkozóan:

(i) Szekvencia-jellemzők:

(A) Hossz: 16 (B) Típus: nukleinsav (C) Szálszám: egy (D) Topológia: ismeretlen (xi) Szekvencia leírása: 3. szekvencia:

GTCATCCTTA TAGCGC

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. RNS aktivitásának módosítására szolgáló kompozíció, azzal jellemezve, hogy az alábbi elemekből áll:

- egy reaktív rész, amely képes módosítani vagy eltávolítani az mRNS 5' Cap struktúráját;

- egy irányzó rész, amely specifikusan hibridizálható az RNS egy előre meghatározott nukleotid szekvenciájával és

- egy kapcsoló rész a célzó és a reaktív komponensek összekapcsolására.
2. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy oly módon van kialakítva, hogy a reaktív részt olyan pozícióba hozza, amely képes az 5' Cap struktúra egy atomjával, kötésével, kötéseivel vagy konformációjával reakcióba lépni.
3. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész egy az 5' Cap struktúra foszfoanhidrid kötését hasítani képes nukleofil funkciós csoportot tartalmaz.
4. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész egy fém koordinációs komplexet tartalmaz.
5. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész egy az 5’ Cap struktúra foszfoanhidrid kötésének hidrolízisekor létrejövő átmeneti állapotot stabilizálni képes egységet tartalmaz.
6. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jelle- ·· ·9 · ·· • 4 ··· ·««· • · · · 9· ··· ··· ·· ·· »· mezve, hogy a reaktív rész egy az 5' Cap struktúra foszfoanhidrid kötése hasítását katalizálni képes savas funkciós csoportot tartalmaz.
7. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész egy alkilező funkciót tartalmaz.
8. A 7. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy alkilező funkcióként szulfonileket, alkil-halogenideket, alfa-halogén-karbonilokat vagy -amidokat, aziridint, nitrogén-mustárokat, Michael-akceptorokat vagy más alkilező szereket tartalmaz.
9. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész interkalálja az 5' Cap struktúrát és/vagy az 5' végen levő bázist a kiválasztott RNS-en.
10. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész szabad gyökök képzésére képes funkciós csoportot tartalmaz·
11. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsoló rész 1-50 atomot tartalmaz .
12. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsoló rész legalább 1-10 atomot tartalmaz.
13. A 11. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsoló rész legalább egy oldalláncbeli csoportot tartalmaz.
14. A 13. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az oldalláncbeli csoport egy heterociklusos bázis.
15. A 14. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a bázis citozin.
16. A 13. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az oldalláncbeli csoport egy kationos funkciós csoport.
17. A 16. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a funkciós csoport guanidin, amidin, amin vagy fémkomplex.
18. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely 5-50 bázist tartalmaz.
19. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely 8-40 bázist tartalmaz.
20. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely körülbelül 15 bázist tartalmaz.
21. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely specifikusan hibridizálódik a kiválasztott mRNS transzkriptum 5' végéhez.
22. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely specifikusan hibridizálódik a magban levő éretlen pre-mRNS-hez.
23. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy olyan oligonukleotid analóg, amelyben egy oligonukleotidnak legalább néhány foszfo-

-diészter kötését egy nem-ionos vagy akirális kapcsolat helyettesíti.
24. Eljárás egy olyan szervezet kezelésére, amely egy nemkívánt fehérje termelésével jellemezhető betegségben szenved, azzal jellemezve, hogy a szervezetet az 1. igénypont szerinti kompzícióval hozzuk érintkezésbe.
25. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész az 5' Cap struktúra foszfoanhidrid hasítására képes reaktív egységet tartalmaz.
26. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész olyan funkciós csoportot tartalmaz, amely képes strukturálisan vagy kémiailag módosítani az 5’ Cap struktúra 7-metil-guanozino-csoportját.
27. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész egy vagy több alkil-amin egységet tartalmaz.
28. A 27. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy alkil-amin egységként 1,5,9-triazaciklododekánt, dietilén-triamint vagy trietilén-tetramint tartalmaz.
29. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész egy vagy több aromás csoportot tartalmaz.
30. A 29. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy aromás amin egységként imidazolt, N-metil-imidazolt, hisztamint vagy piridint tartalmaz.
31. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív egység egy, az 5' Cap struktúra foszfoanhidrid csoportjának hasítására képes savas funkciós csoportot tartalmaz.
32. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a reaktív rész az RNS 5' Cap struktúrájának elfedésével gátolja az 5' Cap-specifikus kapcsolódó fehérjék kötődését.
33. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a kapcsoló rész 1-500 atomból áll.
34. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a kapcsoló rész legalább egy nukleotidot tartalmaz .
35. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a kapcsoló rész legalább egy aminosavat tartalmaz .
36. Az 1 igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy oligonukleotid vagy oligonukleotid analóg, amely körülbelül 15-25 bázisból áll.
37. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy olyan oligonukleotid analóg, amelyben legalább az egyik a nukleotidok közötti foszfodiészter kötést egy kéntartalmú kötés helyettesíti.
38. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy olyan oligonukleotid analóg, amelyben legalább az egyik foszfodiészter kötést egy kéntartalmú kötés helyettesíti.
39. A 38. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy a kéntartalmú kötés egy foszfotioát egység.
40. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész egy olyan oligonukleotid ana- lóg, amelyben legalább az egyik foszfodiészter kötést enantiomer-specifikus királis kötés helyettesíti.
41. Az 1. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy az irányzó rész legalább egy módosított bázist tartalmaz.
42. A 4. igénypont szerinti kompozíció, azzal jellemezve, hogy fém koordinációs komplexként 1,10-orto-fenantrolin cink(II) komplexet, bipiridin cink(II) komplexet, 1,10-orto-fenantrolin cink(II) komplexet vagy bipiridin réz(II) komplexet tartalmaz.