HUT63457A - Process for producing triarginine insulins - Google Patents
Process for producing triarginine insulins Download PDFInfo
- Publication number
- HUT63457A HUT63457A HU9203688A HU9203688A HUT63457A HU T63457 A HUT63457 A HU T63457A HU 9203688 A HU9203688 A HU 9203688A HU 9203688 A HU9203688 A HU 9203688A HU T63457 A HUT63457 A HU T63457A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- arg
- tri
- insulin
- human
- proinsulin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/28—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány a klinikai orvostudományokhoz kapcsolódik, és a diabetes kezelésére alkalmas inzulin új formáját nyúj t j a.
A diabetes terápia napjainkban elsősorban közbenső és elnyújtott hatású inzulin termékekkel történő kezelésből áll. Ezeket a készítményeket a beteg éjszakai cukorszíntjenek ellenőrzésére, valamint a betegek egész napos injekciózására tervezték.
Az említett készítmények általános jellemzője, hogy oldhatatlan inzulin szuszpenziók. így az injekciók mennyisége széles skálán mozoghat, és a szubkután injekció után a cukorszíntet ellenőrizni kell (Skyler, J. S.z Medical Clinics of North America, 72, 1337-1354 (1988)). Az említett készítmények közül némelyik a hosszú hatásidő biztosítása céljából szubsztanciális mennyiségű protamin hozzáadást igényel. A protamin egy hal eredetű fehérje, mely egyes paciensekben antitest képződést okoz (Ellerhorst, J. A. és társai, The American Journal of the Medical Sciences, 299, 298-301 (1987)) .
A rekombináns DNS technológia megjelenésével számos inzulin analógot szintetizáltak, melyek a készítményben teljesen feloldott állapotban voltak, és a természetes eredetű inzulinnál jóval hosszabb hatásidőt mutattak (Markussen J. és társai, Protein Engineering, 1, 215-223 (1987)). Az elnyújtott hatású inzulinok sokat ígérő megközelítését nyújtja az a lehetőség, hogy azokat alacsony pH mellett (pH 3-4) teljesen feloldott állapotba hozzuk. A • · · · • «
-3szubkután injekció után a test-környezet természetes pH-jára (pH 7.4) történő gyors beállás-az analógok kicsapódását, vagy kristályosodását okozhatja. A 7.4 pH melletti lassú újra feloldódásuk csökkenti a kívánt hatás eléréséhez szükséges időt.
Ebben a megközelítésben két probléma jelentkezik. Előszöris az erősen savas oldatokkal történő krónikus kezelés fájdalmat, bőr nekrózist, és hámlást okoz (DeLuca, Ρ. P. és Rapp, R. P. Pharmaceutics and Pharmacy Practice; Banker, G. S. és Chalmers, R. K. Eds.; 238-278 (1982), J. B. Lippencott Co. Philadelfia, PA). A semleges körüli pH-val (pH 6-7) rendelkező oldatok ilyen szempontból sokkal előnyösebbek lennének. Másodszor, mivel az inzulin analógok jelenléte a szervezetben nem természetes, és így azokat a szervezet mint idegen anyagokat ismeri fel, az inzulin analógokkal szemben antitestek képződnek, melyek megzavarhatják a beteg inzulin terápiáját, vagy más problémákat okozhatnak (Patterson, R. és társai, Annals of Allergy, 64, 459-462 (1990)). A fehérjeszerkezet változásának minimalizálásával ez az alapvető probléma elkerülhető.
Egy közbenső hatásidővel, és 4-5 körüli pH mellett kedvező oldhatósági tulajdonságokkal rendelkező inzulin analógot, nevezetesen a di-arginin inzulint már ismertették (Zeuzem, S., és társai, Diabetologia, 33, 65-71 (1990)). Ugyanakkor a di-arginin inzulinnál hiányzik a jelen találmány egyik előnye, mégpedig a pH 6 körüli jó oldhatóság. Továbbá a jelen találmány vegyülete jobb • · *
-4hatásidőt mutat a di-arginin inzulinnál.
Savas készítményeknél, a fent említett fiziológiai problémákkal szemben a természetes eredetű inzulin-szerű (insulin-like) molekulák esetében alacsony pH-nál más problémák merülnek fel. Savas környezetben az A-lánc 21. számú aszpargi-gyöke (A21) erősen hajlamos a deamidálódásra és egyéb mellékreakciókra, melyek nem kívánt dimerek és polimerek képződéséhez vezethetnek (Markussen. J., és társaiProtein Engineering, 2, 157-166 (1988)). Ezek a reakciók elsősorban pH 4 alatt mennek végbe, míg pH 5 felett szinte nem is játszódnak le (Id.). így a humán terápia esetében a leginkább megfelelő egy olyan inzulin-szerű molekula lenne, mely megnyúlt hipoglikémiás hatással, és kis immunogenicitással rendelkezik, és a készítmény pH 6 felett oldható.
A jelen találmány alapja az a felfedezés, hogy az inzulin analógok egyes típusai, melyekre itt mint triarginin (tri-arg) inzulinra, és tri-arg inzulin analógokra hivatkozunk, az inzulin természetes szerkezetével rendelkeznek, továbbá három további arginin gyökkel, és egy állati modellen elnyújtott hipoglikémiás aktivitást mutatnak, valamint pH 6.1-ig oldat formájában állíthatók elő.
A találmány az alábbi képlettel rendelkező vegyületre irányul:
ahol X-et és Z-t az alábbi csoportból választjuk ki: Alá,
| Arg, Asx, Cys, Glx, Gly, His, Ile, | Leu, | Lys, Met, Phe, Pro, | ||
| Ser, Thr, Trp, Tyr, vagy | Val, | és Y- | -t az | alábbi csoportból |
| választjuk ki: His, Asp, | vagy | Glu, | vagy | ezek |
gyógyszerészetileg elfogadott nem toxikus sói közül. A leginkább előnyös vegyületek azok, melyek a variábilis helyeken a természetesen előforduló aminosavakat tartalmazzák, nevezetesen X Asn, Y His, és Z Asn.
A találmány tehát felöleli a humán proinzulin split (64) proinzulin-tri-arg-analógjait (hasított(64) proinzulin-tri-arg-analógjait), ahol a B-lánc 3. számú gyökét (B3) és az A-lánc 21. számú gyökét az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, Arg, Asx, Cys, Glx, Gly, His, • · · · *
-6—
Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, vagy Val, és a B-lánc 10. számú gyökét (BIO) az alábbi csoportból választjuk ki: His, Asp, vagy Glu, és ahol a C peptid 64. számú gyöke (Lys-64), és a C peptid 65. számú gyöke (Lys-65) közötti amid-kötés (peptid-kötés) törött, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadott nem toxikus sói közül.
A találmány továbbá felölei a split (64) proinzulin-tri-arg-analógot tartalmazó dez (64) proinzulintri-arg-analógokat, ahol a Lys-64 el van távolitva, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadott nem toxikus sóit. A leginkább előnyös vegyületek azok, melyek a variábilis helyeken a természetesen előforduló aminosavakat tartalmazzák, nevezetesen ahol a B3-győk és az A21-gyök Asn, és a BlO-gyök His.
A találmány tárgya egy eljárás a humán tri-arg inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy:
(a) a humán proinzulint tripszinnel és karboxipeptidáz B-vel hozzuk kapcsolatba, így dez (64) humán proinzulin keletkezik.
(b) izoláljuk a dez (64) humán proinzulint;
(c) a dez (64) humán proinzulint tripszinnel hozzuk kapcsolatba; és (d) izoláljuk a tri-arg inzulint.
A találmány tárgya továbbá egy eljárás a humán tri-arg inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy:
(a) a humán proinzulint lizin-endopeptidázzal hozzuk kapcsolatba, olyan körülmények között, melyek kedvezően hasítják el a humán • « ,*·4 « ·· • · · · · · · « · · · * · · «···· · · · · ···*·««····
-7proinzulinban a Lys-64 és az Arg-65 közötti peptid-kötést, és így hasított (split) 64 humán proinzulin keletkezik;
(b) izoláljuk a hasított (split) 64 humán proinzulint;
(c) a split (64)humán proinzulint tripszinnel hozzuk kapcsolatba; és (d) izoláljuk a humán tri-arg inzulint.
Az 1. ábra a tri-arg inzulin és a tri-arg inzulin analógok elsődleges aminosav szekvenciáját és a három diszulfid kötést mutatja be. Az egyes gyökök alatt levő számok az amino-termlnusnál kezdődő szekvenciában a megfelelő gyököknek felelnek meg. A B-lánc 3. helyén levő X jelölés a 20 természetes aminosav valamelyikét jelenti. A B-lánc 10. helyén levő Y jelölés His, Asp, vagy Glu lehet, és az A-lánc karboxi-terminusán levő Z jelölés a 20 természetes aminosav valamelyikét jelenti.
A 2. ábra a humán proinzulin elsődleges aminosav szekvenciáját szemlélteti. A feketével befestett gyökök a természetes humán proinzulint ábrázolják, míg a fehéren hagyott gyökök a természetes humán proinzulinhoz kapcsolódó peptideket (C-peptid) ábrázolják.
A jelen leírás céljára a 20 természetben általánosan előforduló L-aminosavat az általánosan ismert három betűs rövidítései jelöltük, ami a Code of Federal Regulations 1.822 37. kötetében található meg. Szintén a jelen leírás céljából számos kifejezést alkalmaztunk, melyeket az alábbiakban Ismertetünk.
• · · · · • ··
-8A tri-arg inzulin kifejezés olyan humán inzulinra vonatkozik, mely a B-lánc karboxi-terminusán két további arginin-gyökkel (Arg-31 és Arg-32, lásd 1. és 2. ábra), és az A-lánc amino-terminusán egy további arginin-gyökkel rendelkezik (Arg-0 A-lánc, lásd 1. ábra, és Arg-65, lásd 2. ábra).
A tri-arg inzulin analóg kifejezés olyan tri-arg inzulinra vonatkozik, melyben a 20 természetesen előforduló aminosav valamelyike a B3 vagy az A21 helyek valamelyikén, vagy mindegyikén helyettesítve van, és a BIO helyen a His, az Asp, vagy a Glu helyettesítve van.
A proinzulin-tri-arg analóg kifejezés olyan humán proinzulinra vonatkozik, mely a lehetséges B3, BIO, és A21 szubsztitúciókban megfelel a találmánynak.
A split (64)-proinzulin kifejezés olyan humán proinzulinra vonatkozik, melyben a Lys-64 és az Arg-65 közötti peptid-kötés (Arg-0, A-lánc) el van hasítva (lásd 1. és 2. ábra).
A split (64)-proinzulin-tri-arg analóg kifejezés olyan split (64) proinzulinra vonatkozik, melyben az egy vagy több, a jelen találmánynak megfelelő aminosav szubsztitúció a B3, a BIO, vagy az A21 helyeken található.
A dez (64)-proinzulin kifejezés olyan kifejezés olyan split (64)-proinzulinra vonatkozik, melyben a Lys-64 el van távolítva (lásd 1. és 2. ábra).
A dez (64)-proinzulin-tri-arg analóg kifejezés olyan dez (64)-proinzulinra vonatkozik, melyben az egy vagy több, a jelen találmánynak megfelelő aminosav szubsztitúció a B3, • · · · a · «
-9a BIO, vagy az A21 helyeken található.
A gyógyszerészetileg elfogadott nem-toxikus savaddiciós sók kifejezés mind a szerves, mind a szervetlen eredetű savaddiciós sókat felöleli, így például azokat, melyeket savból, így sósavból, fumársavból, kénsavból, szulfonsavból, tartársavból, brómsavból, glikolsavból, citromsavból, maleinsavból, foszforsavból, borostyánkősavból, ecetsavből, salétromsavból, benzoesavból, aszkorbinsavból, p-toluén-szulfonsavból, naftalénszulfonsavból, propionsavból, szénsavból, és hasonlókból, vagy sókból, így például ammónium-karbonátból állítottunk elő. Előnyös esetben a savaddiciós sókat sósavból, ecetsavból, vagy szénsavból állítjuk elő. A fenti sókat hagyományos eljárásokkal állíthatjuk elő.
A karboxiles savak sói kifejezés például az alábbiakat öleli fel: cink-, ammónium-, alkáli fém sók, így a nátrium, a magnézium, a kálium, a lítium, stb. sóit. Előnyös esetben a karboxiles savak sói cink-, és nátriumsók .
A jelen találmány számos humán inzulin analógra, és ezek proinzulinból, és proinzulin-tri-arg analógokból történő előállítására vonatkozik. A vegyületek általános szerkezete, ami szintén a találmány tárgyához kapcsolódik, az 1. ábrán látható, míg az aminosav szekvenciákat a SEQ ID NOS: 1-4 szemlélteti. A találmány szerinti vegyületek közé tartoznak azok gyógyszerészetileg elfogadott nem-toxikus savaddiciós sói, és gyógyszerészetileg elfogadott nemtoxikus karboxiles savak sói.
• · «4 • ·
-10Egy fontos dolog, ami számos előre nem várt, és előnyös tulajdonságot alakít ki a találmány szerinti vegyületen, a további három aminosav-gyök jelenléte. Kettő ezek közül a B-lánc karboxi-terminusán helyezkedik el (Arg-31 és Arg-32, lásd 1. és 2 . ábra), míg a további harmadik aminosav-gyök az A-lánc amino-terminusán helyezkedik el (Arg-0 A-lánc, lásd
1. ábra, és Arg-65, lásd 2. ábra). Ez a három arginin-gyök a természetes humán proinzulin szerkezetében is jelen van, de ugyanakkor nincs jelen természetben előforduló humán inzulin szerkezetében (lásd 2. ábra).
Jól ismert, hogy az inzulin B-lánc 3. helye (B3) más, a természetben előforduló aminosavval lehet helyettesítve, anélkül, hogy az inzulin szerkezetét ellentétes irányban befolyásolná, vagy megszüntetné annak biológiai aktivitását, így ezen a helyen a természetben előforduló aminosavak megfelelnek a találmánynak. Ugyanakkor az immunogenicitás csökkentésére az Asn előnyös, mivel az Asn a natív inzulinban ezt a helyet foglalja el.
A fentiek az A-lánc karboxi-terminális gyökére is változatlanul érvényesek (A21). így az A21 helyen valamely a természetben előforduló aminosav megfelel a találmánynak. Ugyanakkor az immunogenicitás csökkentésére az Asn előnyös, mivel az Asn a natív inzulinban az A21 helyet foglalja el.
A harmadik hely, ahol az aminosav szubsztitúció megtörténhet, a B-lánc 10. helye (BIO). A BIO helyen Glu-t vagy Asp-t tartalmazó inzulin analógokat az irodalomban már Ismertették, és fokozott hatékonyságukat is bemutatták (Bürke, G. T., és társai, Biochemical and Biophysical • »«e«
-11Research Communications, 173, 982-937 (1990)). így megalapozottnak tűnik, hogy a találmány szerint a BIO helyet Glu, Asp, és His foglalja el. Ugyanakkor az immunogenicitás lehetőségének csökkentésére a His előnyös, mivel a His a natív inzulinban a BIO helyet foglalja el.
A természetes humán inzulinhoz hasonlóan a tri-arg inzulinoknak, és a tri-arg inzulin analógoknak is három diszulfid-kötésre van szükségük kvaterner szerkezetük fenntartásához. Két diszulfid-kötés az A és a B-láncot köti össze (A7-B7, és A20-B19), és egy láncon belüli kötés van az A-láncban (A6-A11), amint az az 1. ábrán látható.
A tri-arg inzulinok, és a tri-arg inzulin analógok előállítása számos úton történhet, a jól ismert protein kémiai, és a rekombináns DNS technikát alkalmazó eljárásokkal. Az alábbi szemléltető felsorolásban számos alapvető utat ismertetünk a tri-arg inzulinok, és a tri-arg inzulin analógok szintetizálására. Részletes ismertetést nem adunk, mivel a vázlatok alapján számos változtatás tehető.
1. / A humán proinzulin tripszínnel, és karboxipeptidáz B-vel történő kezelése, amit az 1. példában ismertetünk.
2. / A humán proinzulin lizin-hasító endopeptidázzal • történő szelektív hasítása a Lys-64~, és az Arg-65-gyök között, enyhe tripszines hasítás az előnyben részesített Arg-32, és Glu-33 peptid-kötéseken, amit a 2. példában ismertetünk.
3. / Az A-lánc Arg-0, és a B-lánc Arg-31 rekombináns DNS technikával történő szintézise, majd azok összekapcsolása a jól ismert diszulfid kémia alkalmazásával. Lásd 4.421.685 • w · « ·· « • « « * · · · «··« * » · · · • ι· · e·· ···· számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, melyet itt az említett disjzulfid kémia részletes ismertetésére referenciaként említünk meg.
4. / Az A-lánc Arg-0, és a B-lánc Arg-31 kémiai szintézise, majd azok összekapcsolása, a jól ismert diszulfid kémia alkalmazásával.
5. / A B-lánc - Arg-31 - Arg-32 - Arg33- A-lánc peptid szekvenciát tartalmazó, egyedülálló láncú mini-proinzulin molekula előállítása rDNS technikával. A diszulfid képződése után a tripszín-szerű enzimek szelektíven, vagy némi elsőbbséggel elhasítják a peptid-kötést az Arg-32 és az Arg-33 között, és így tri-arg inzulin keletkezik.
6. / Az X - B-lánc - Arg - Arg - Y - Arg - A-lánc szerkezetű mini-proinzulin molekula előállítása, ahol X és Y valamelyik a természetben előforduló aminosav, kivéve az Arg vagy a Lys. A mini-proinzulin molekula előállítása rDNS technikával történik, és elrendeződése a helyes diszulfid elrendeződésnek felel meg. Ennek az egyedülálló peptid láncnak a tripszinnel történő elhasítása előrevárhatóan először az Arg - Y között történik meg. Ezután az X-nek és az Y-nak a B-, és az A-lánc terminusáról az Edman eljárással történő eltávolítása eredményeként tri-arg inzulin keletkezik.
A fenti vázlatok mindegyikében tehetők kisebb változtatások. A leginkább jelentősek azok, amelyekben a lehetséges aminosav szubsztitúciók a B3, a BIO, és az A21 helyen történnek.
Az 1. eljárást például úgy módosíthatjuk, hogy először • · · ·
-13kémiai, vagy rekombináns eljárással megszintetizáljuk a humán proinzulin-tri-analógot. Az elegyítés, és az összes lehetséges aminosav-szubsztitúció mindhárom pozícióba történő összeillesztése által közel 1200 különböző proinzulin-tri-analógot kapunk, melyekből a tri-arg inzulin analógot az 1. példa eljárásával állíthatjuk elő.
Az 1. eljárás módosításának másik lehetősége szerint először egy leader-szekvenciával rendelkező, a B-láncot kódoló DNS vegyületet hozunk létre. A transzláció után a keletkező peptid leader-szekvenciát enzimesen hasíthatjuk, és az eljárást a már ismertetett módon fejezzük be. Az eljárás módosítását úgy is megtehetjük, hogy trailingszekvenciát (követő) adunk a rendszerhez, melynek eredményeképpen egy elhasítható peptidet kapunk, és így hozzuk létre a tri-arg inzulint, vagy a tri-arg inzulin analógot.
A molekuláris biológia jelenlegi állása alapján könnyen megoldható, hogy a fehérje-szekvenciában valamely adott aminosavat egy másikra cseréljünk ki. A jól ismert eljárások, mint például a hely-specifikus mutagenezís alkalmazásával a proinzulint kódoló DNS szekvencia kívánság szerint módosítható, így a kiválasztott aminosav szubsztitúciók lehetősége nő. így jelenlegi ismereteink lehetővé teszik a proinzulin-tri-arg analógok előállítását. Az 1. eljárást a továbbiakban tri-arg inzulin analógok előállítására alaklmazhatjuk, melyek a találmány szerinti aminosav szubsztitúciókból egyet vagy többet tartalmaznak.
A kívánt aminosav szubsztitúciók létrehozása a három • · · ·
-14lehetséges helyen más módokon is elérhető. A szintetikus peptidek kémiája eljárásokat tesz lehetővé, így például a Merrifield eljárást, olyan peptidek szintetizálására, melyek az egyedülálló aminosavakból legalább 32 gyököt tartalmaznak. így a fenti 3. példa szerinti eljárás alkalmazásával az inzulin A-, és B-láncát úgy szintetizálhatjuk meg, hogy azok a változó helyeken a lehetséges aminosav-szubsztitúciókat tartalmazzák.
A tri-arg inzulin, és a tri-arg inzulin analógok előállítására alkalmazott eljárások és intermedierek szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. Az acetilezett tripszin és a karboxipeptidáz B hatásán keresztül az 1. példában bemutatott eljárással dez (64) proínzulint, mint intermediert állíthatunk elő, annak ellenére, hogy a dez (64) proinzulin önmagában hipoglikémiás aktivitással rendelkezik. Az 1. példában ismertetett eljárással, a megfelelő proinzulin-tri-arg analógból kiindulva, dez (64) proinzulin-tri-arg analóg intermediert állíthatunk elő.
A 2. példában ismertetett eljárással, a humán proinzulin lizin-endopeptidázzal történő kezelése során split (64)-proinzulin intermediert állíthatunk elő. Az eljárással a megfelelő proinzulin-tri-arg analógból kiindulva a megfelelő split (64)-proinzulin-tri-arg analógot állíthatjuk elő. A split (64)-proinzulin önmagában is hipoglikémiás aktivitással rendelkezik.
Az endopeptidáz-Lys-C egy lizin endopeptidáz, melyet számos általánosan elérhető forrásból szerzhetünk be, így például az alábbiakból: Lysobacter enzymogenes (Boehringer-15• · · ·> -ν » · ••••· ·· · ·
Mannenheim; Indianapolis, IN), Pseudomonas aeruginosa (Promega; Madison, WI), és Achromobacter Lyticus (Wako Pure Chemical; Dallas, TX). Az enzim a lizin-gyök karboxiterminusán specifikusan hasít. Ahhoz, hogy proinzulinból nagy mennyiségű split (64)-proinzulint állíthassunk elő, a Lys-29 karboxi-terminusának hasítása előtt a Lys-64 karboxi-terminusának elhasítása szükséges. Úgy találtuk, hogy a Pseudomonas aeruginosából származó endopeptidáz-Lys-C egy előnyös forrás, míg a Lysobacter Enzymogenesből származó enzim a leginkább előnyös forrás.
Az alábbi példák a találmány megértéséhez és kivitelezéséhez nyújtanak segítséget. Ezeket a példákat csak a szemléltetést céljából mutatjuk bez de a találmányt semmilyen módon nem korlátozzák.
-16ι,.....példaTri-arq-lnzulin dez (64) humán proinzulin intermedieren keresztül történő előállítása
Az E. coliban termelt rekombináns humán proinzulint sertés karboxipeptidáz B-vel (Promega; Madison, WI), és acetilezett szarvasmarha tripszinnel (az European J. Biochem., 2, 215-223 (1967) leírása szerint) kezeltük, az enzim:szubsztrát arány a tömegre vonatkoztatva 1:1000 és 1:20.000 volt, 20 mM glicin pufferben, pH 8 mellett. A reakciót, melyet 8°C-on körülbelül 27 órán keresztül hagytunk lejátszódni, egy térfogatnyi 7 M urea hozzáadásával állítottuk le. Az így kapott elegyet ezután Q-Sepharose Fást Flow gyantával töltött oszlopra vittük fel, melyet előzőleg 7 M ureával, 10 mM Tris-szel (tris-hidroxi-metil)aminometán; Sigma; St. Louis, MO), és 1 mM káliumtetrationáttal, pH 8.1, ekvilibráltunk. Az oszlopot ugyanezzel a pufferrel mostuk, mely még 25 mM nátriumkloridot tartalmazott, majd 25-65 mM nátrium-kloridot tartalmazó ekvilibráló puffer lineáris gradiensével eluáltuk. Az eluált frakciókat összegyűjtöttük, és közvetlenül az összegyűjtés után jégecettel megközelítőleg pH 4 értékre titráltuk.
Az analitikai HPLC alkalmazásával meghatározott dez (64) proinzulint tartalmazó frakciókat pooloztuk, és Amicon S1Y3 spirálisan tekercselt feltét (spirál wound cartridge)
-17(Amicon; Danvers, MA) alkalmazásával betöményítettük. A visszatartott anyagot 1 M ecetsavval szemben,- megközelítőleg pH 2.5, 5θ0-οη diafiltráltuk. A keletkező elegyet azonos térfogatú vízzel hígítottuk, 0.2 μ átmérőjű szűrőn leszűrtük, és vákumban száradásig liofileztük.
Környezeti hőmérsékleten 2.91 g dez (64)humán proinzulint 0.02 M CaCl2-t tartalmazó, 291 ml mennyiségű 0.05 M Tris pufferben oldottunk fel, és a pH-t 1 N HCl-al 8 értékre állítottuk be. Az elegyhez 364 μΐ mennyiségű, 1 mg/ml-es sertés tripszint (vízzel) (Sigma; St. Louis, MO) adtunk, így tömeg szerint 1:8000 enzim:szubsztrát arányt kaptunk. Az elegyítés után az oldatot 5°C-on tároltuk.
A reakciót 4.5 óra után 10 ml 1 N HC1 hozzáadásával állítottuk le. A teljes tiszta oldatot 5.5 X 30 cm C-18 Vydac HPLC oszlopra vittük. Vízzel történő mosás után a fehérjét 2.5 ml/min folyadékáram mellett eluáltuk, 22.5-42.5 % acetonitril gradiensben, 0.5 % trifluorecetsavban (TFA), 24 órán keresztül. Az eluens ellenőrzése 276 nm-es abszorbancián történt. 20 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, és számos frakciót ellenőriztük analitikailag, HPLC-vel, C-8
TM
Zorbax oszlop alkalmazásával, 0.1 M Na2HPO4-ben, acetonitril gradiens mellett, pH 2.1.
A tri-arg inzulint tartalmazó frakciókat (116—128) pooloztuk, és liofileztük, így 0.94 g terméket kaptunk, melynek analitikai tisztaságát HPLC-vel 87 %-nak találtuk. A termék szerkezetét aminosav analízissel igazoltuk, Nterminális szekvencia analízissel, és gyors atombombázó tömegspektroszkópiával (fást atom bombardment mass
-18spectroscopy; FAB-MS).
2. példa
Tri-arq-inzulin split (64) humán proinzulin Intermedieren keresztül történő előállítása
Humán proinzulint (800 mg) 25 mM Tris-t és 1 mM EDTA-t tartalmazó, 80 ml mennyiségű pufferben oldottunk fel, pH 7.7. Ugyanazzal a pufferrel 0.1 mg/ml koncentrációjú Pseudomonas aeruginosa eredetű endopeptidáz-Lys-C-t (Promega; Madison, WI) készítettünk, és 200 ml-t adtunk a proinzulin oldathoz, így tömeg szerint 1:40.000 enzim:szubsztrát arányt kaptunk. A reakcióelegyet jól összekevertük, majd 9.5 órán keresztül 37°C-on inkubáltuk. 1 N HCl-al az oldat pH-ját 3.0 értékre állítottuk, majd 5.5 X
TM cm C-18 Vydac HPLC oszlopra vittük, melyet előzőleg 0.5 % TFA-val ekvilibráltunk. A tisztított fehérjét 20 óra alatt eluáltuk, 0-40 % acetonltril gradiensben, 0.5 % TFA-ban. A split (64) humán proinzulinnak megfelelő frakciókat pooloztuk, és líofileztük, így 237 g terméket kaptunk. A termék szerkezetét aminosav analízissel, N-terminális szekvencia analízissel, és FAB-MS-el igazoltuk.
A split (64) humán proinzulin arányát 1 mg/ml értékre állítottuk be 25 mM Tris-t és 1 mM EDTA-t tartalmazó pfferben, pH 7.7, és ugyanezzel a pufferrel 0.1 mg/ml koncentrációjú szarvasmarha tripszint (Sigma; St. Louis, MO)
-19készítettünk. A split (64) humán proinzulin 700 μΐ mennyéségéhez 7 μΐ tripszin oldatot adtunk, így tömeg szerint 1:1.000 enzim:szubsztrát arányt kaptunk. A reakcióelegyet környezeti hőmérsékleten 30 percig kevertük.
*TM
A reakciótermék HPLC analízisét 4.6 x 250 mm C-8 Zorbax oszlop alkalmazásával hajtottuk végre, 0.1 M nátriumfoszfátban, enyhe acetonitril gradiens mellett, pH 2.1. Az analízis eredményei azt mutatták, hogy az összes split (64) proinzulint feltártuk, és a főtermék trí-arg inzulin volt.
3. Példa
Asp(A21)-tri-arg inzulin analóg előállítása
Az 1. példa eljárása szerint tri-arg inzulint állítottunk elő (40 mg), és 4 ml 0.01 N HCl-ben feloldottuk, majd környezeti hőmérsékleten 12 napig tároltuk. Az elegyet ezután további 16 napig 37°C-on inkubáltuk. A végső oldat fő komponensét preparatív HPLC alkalmazásával tisztítottuk meg. A kapott oldat Öt részletét (egyenként 0.5-1.0 ml) 21.5 x 250 mm C-8 Zorbax oszlopra vittük, melyet előzőleg 26 % acetonitrilt tartalmazó 0.1 M nátrium-szulfát pufferrel ekvilibráltunk, pH 2.3. A minta-komponenseket nátriumszulfát pufferben készült, 26-30 %-os acetonitril gradienssel eluáltuk. Az öt futtatásból származó, a fő komponenst tartalmazó eluált frakciókat elegyítettük, azonos
TM térfogatú vizel hígítottuk, és C-18 Sep-Pak feltétű
-20oszlopon (Millípore; Bedford, MA) kisóztuk. A tisztított peptidet eluáltuk, 50 % acetonitril és 50 % TFA puffer (0.5 %) elegyében koncentráltuk, majd liofileztük. A tisztított termék szerkezetét aminosav analízissel, FAB-MS-el, és az • A-lánc, illetve a B-lánc HPLC analízisével igazoltuk. Az analitikai HPLC eredménye szerint 95 %-os tisztaságú Asp(A21)-tri-arg inzulin analógot kaptunk.
4, példa
A tri-aro inzulinok biológiai aktivitása
2-4 ml térfogatú 40 IU/ml tri-arg inzulin oldatokat állítottunk elő 0.05 M nátrium-acetát pufferben, megközelítőleg 2.0 mg/ml végső fehérje koncentrációval. Az oldatokat különböző cink-koncentrációk mellett (0-2.4 mg/ml) készítettük el, cink-kloríd formájában. Az egyes oldatokat jégecettel tettük oldhatóvá, a végső pH 4-6 között volt. A humán inzulin becsült 70 %-os biopotenciáljára (inzulin receptor kötés), és humán inzulinra nézve 28.85 U/mg • standardizált értékre alapozva a vizsgálandó oldatok készítéséhez az alábbi képletet alkalmaztuk:
mg/ml X 28.85 U/mg fehérje X 70 %-os bíopotenciál = 40 U/ml
A vizsgálatokhoz New Zealand fehér nyulakat
alkalmaztunk, többségük nőstény volt, tömegük 2.7-4 kg között, koruk 0.5-4 év között, és a kezelés előtt 16 napig koplaltattuk őket. 10 nyúlba szubkután úton, nyakuk hátsó felén, 0.2 U/kg dózisban 40 U/ml mennyiségben tri-arg inzulint, Asp(21)-tri-arg inzulin analógot, split (64)proinzulint (pH 7.35), dez (64)-proinzulint (pH 7.46), diarg inzulint (Zeuzem és társai eljárása szerint állítottuk elő, Dlabetologia, 33, 65-71, (1990)), Humulin L™-t (Lente humán inzulin, közbenső időhatás, Éli Lilly & Co.;
TM
Indianapolis, IN), vagy Humulin U -t (ultralente humán inzulin, elnyújtott időhatás, Éli Lilly & Co.; Indianapolis, IN) injekcióztunk.
Különböző időpontokban 100 μΐ mennyiségű vért vettünk a nyulak fülének szélső eréből (marginal ear vein), 900 μΐ térfogatú antikoagulánssal elegyítettük (EDTA - nátriumfluorid), és glükóz tartalmát meghatároztuk. A glükóz értékeket a minták beinjekciőzása előtti eredeti vércukor érték százaléka szerint standardizáltuk. Az eredményeket az
1. táblázatban foglaltuk össze.
« «
1. táblázat
Az eredeti vércukorszint százaléka n=10
Idő (Óra) a mintabevitel után Cink
| Inzulin | mg/ml | 1 | 2 | 4 | 6 |
| Humulin L | 0 | 58.2 | 48.0 | 90.6 | 96.2 |
| Humulin U | 0 | 53.4 | 55.3 | 85.3 | 92.5 |
| Tri-Arg | 0 | 51.1 | 56.0 | 86.9 | 95.3 |
| Asp(21)-Tri-Arg | 0 | 67.4 | 84.2 | 94.8 | 89.8 |
| Dez (64) HPI | 0 | 63.1 | 70.5 | 90.6 | 90.0 |
| Split(64) HPI | 0 | 61.7 | 83.8 | 94.8 | 94.1 |
| Di-Arg | 0 | 60.6 | 85.4 | 98.1 | 99.8 |
| Tri-Arg | 0.014 | 43.3 | 50.3 | 90.5 | 94.9 |
| Tri-Arg | 0.05 | 51.4 | 57.7 | 88.2 | 95.1 |
-23Az eredeti vércukorszínt százaléka n=10
Idő (Óra) a mintabevitel után Cink
| Inzulin | mg/ml | 1 | 2 | 4 | 6 |
| Tri-Arg | 0.14 | 61.6 | 52.1 | 76.1 | 96.5 |
| Tri-Arg | 0.33 | 76.2 | 67.7 | 88.5 | 91.9 |
| Tri-Arg | 0.5 | 71.8 | 65.0 | 88.4 | 86.9 |
| Tri-Arg | 1.4 | 83.7 | 71.1 | 75.3 | 91.4 |
| Tri-Arg | 2.4 | 79.2 | 71.1 | 74.5 | 70.1 |
| Asp (21) -Tri· | -Arg 2.4 | 84.2 | 70.3 | 84.4 | 91.9 |
| Di-Arg | 2.4 | 76.3 | 73.4 | 95.5 | 96.7 |
5, példa
A tri-arg inzulin és a di-arg inzulin százalékos oldhatóságát optikai denzitásuk (O.D.) alapján hasonlítottuk össze, 276 nm hullámhosszon. 1 mg/ml tri-arg inzulin oldatot (előállítása az 1. példa szerint), vagy di-arg inzulin oldatot (Zeuzem, S., és társai, Diabetologia, 33, 65-71 (1990)) állítottunk elő 2 mM borát-citrát-glicin pufferben, pH 9.5. Az egyes oldatok mintáit különböző pH értékre állítottuk be 5 N HC1 vagy 5 N NaOH cseppenkénti adagolásával, és digitális pH mérővel mértük. Az egyes mintákat 30 percig centrifugáltuk, megközelítőleg 10.000 rpm mellett. A felülúszót eltávolítottuk, és 276 nm-en spektofotométerrel megmértük az O.D. értékeket. A koncentrációkat az O.D. értékek alapján határoztuk meg, 1 mg/ml oldatnál 0.98 értékre alapozva. Az oldható anyag százalékos mennyiségét úgy határoztuk meg, hogy a centrifugálás után a kapott értéket elosztottuk az eredeti koncentrációval. Az eredményeket a 2. táblázatban foglaltuk össze.
2. táblázat
Di-Arg inzulin
Tri-Arg inzulin pH Százalékos oldhatóság pH Százalékos oldhatóság
| 3.46 | 95.2 | ||
| 4.08 | 82.9 | - | - |
| 4.51 | 73.0 | 4.94 | 87.4 |
| 5.56 | 19.0 | 5.56 | 53.8 |
| 5.93 | 8.1 | 5.92 | 25.3 |
| 6.47 | 10.1 | 6.56 | 10.5 |
| 7.02 | 22.2 | 6.99 | 9.1 |
| 7.54 | 44.4 | 7.53 | 10.7 |
| 8.06 | 102.0 | 8.05 | 21.2 |
• ·
-26A fenti adatok .szerint a tri-arg inzulin a készítménykívánt pH értékénél (pH 5-6) magasabb oldhatósággal rendelkezik, de a fiziológiai pH érték mellett, a szubkután injekció után (pH 7.4) kisebb az oldhatósága. Ezért a triarg inzulin készítmények magasabb, és így előnyösebb pH értékek mellett állíthatók elő, mint a di-arg inzulinok. így a tri-arg inzulinok oldhatósági tulajdonságai a szubkután injekció után várhatóan elnyújtják a hatásidőt a di-arg inzulinokhoz képest.
• * • · « 4 ·♦« • · 4 « · ·» • · · * » 4 » 4« ♦ ·· 4 ··« ···»
-27SZEKVENCIA JEGYZÉK (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓK:
(1) FELTALÁLÓK: Hoffmann James A. Lambooy Peter K.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: TRI-ARGININ INZULINOK (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 4 (iv) PONTOS CÍM:
(A) CÍM: Éli Lilly and Company (B) UTCA: Lilly Corporate Center (C) VÁROS: Indianapolis (D) ÁLLAM: Indiana (E) ORSZÁG: Amerikai Egyesült Államok (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 46285 (V) A SZÁMÍTÓGÉP ÁLTAL OLVASHATÓ FORMÁTUM:
(A) ÁTVITEL TÍPUSA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, 1.25 verzió (Vi) A JELEN TALÁLMÁNY ADATAI:
| (A) | SZABADALOM | SZÁM: |
| (B) | KÖZZÉTÉTEL | SZÁMA: |
| (C) | OSZTÁLY: |
(Vili) JOGI MEGHATALMAZOTT/MEGBÍZOTT ADATAI:
(A) NÉV: Boné Ph. D., Dávid E.
(B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 27.857 (C) REFERENCIA/JEGYZÉK SZÁM:
(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:1-RÖL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 7..8 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cys7 (a tri-arg inzulin B-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin Cys8-hoz.
(ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 19..20 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cysl9 (a tri-arg inzulin B-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin Cys21-hez.
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:1:
• <»44
| Phe 1 | Val | Xaa | Gin | His 5 | Leu Cys | Gly Ser | His 10 | Leu | ||
| Val | Glu | Alá | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| 15 | 20 | |||||||||
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | |
| 25 | 30 |
(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:2-RÖL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 7..8 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cys7 (a tri-arg inzulin B-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin Cys8-hoz.
(ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS:-keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 19..20 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cysl9 (a tri-arg inzulin B-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin A-láncának Cys21-éhez.
(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:2:
| Phe 1 | Val | Xaa | Gin | His 5 | Leu | Cys | Gly | Ser | Asp 10 | Leu |
| Val | Glu | Alá | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| 15 | 20 | |||||||||
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | |
| 25 | 30 |
(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:3-RÓL:
(í) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris • 9 ···· f «» • · · · ·ί ·
9 9 9 9 9 9
9999 9 9 9 9 9
99 9 999 ««·<
-32(ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 7..8 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cys7 (a tri-arg inzulin B-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin Cys8-hoz.
(ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 19..20 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cysl9 (a tri-arg inzulin B-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin Cys21-hez.
···· ·· »
-33(xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:3:
• · · · » · 4 < 4 · « ···· · « « · .
• ·· · ··· ····
| Phe 1 | Val | Xaa Gin | HÍS 5 | Leu | Cys | Gly Ser | Glu 10 | Leu | ||
| Val | Glu | Alá | Leu | Tyr | Leu | Val | Cys | Gly | Glu | Arg |
| 15 | 20 | |||||||||
| Gly | Phe | Phe | Tyr | Thr | Pro | Lys | Thr | Arg | Arg | |
| 25 | 30 |
(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:4-RÖL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 22 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: diszulfid-kötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 7..12 • · · · (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 8..9 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cys8 (a tri-arg inzulin A-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin B-láncában a Cys7-hez.
(ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: keresztkötés (B) ELHELYEZKEDÉS: 21..22 (D) EGYÉB INFORMÁCIÓK: /jel = keresztkötés/ megjegyzés = a szekvenciában Cys21 (a tri-arg inzulin A-lánca) diszulfid-kötéssel kapcsolódik a tri-arg inzulin B-láncban a Cysl9-hez.
| (xi) SZEKVENCIA | LEÍRÁS: | SEQ | ID NO:4: | |||||
| Arg Gly | Ile | Val | Glu | Gin | Cys Cys | Thr | Ser | Ile |
| 1 | 5 | 10 | ||||||
| Cys Ser | Leu | Tyr | Gin | Leu | Glu Asn | Tyr | Cys | Xaa |
-351. Eljárás az alábbi általános képlettel rendelkező tri-arg inzulin analógok előállítására,
Claims (3)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK
ahol X-et és Z-t az alábbi csoportból választjuk ki: Alá, Arg, Asx, Cys, Glx, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, vagy Val, és Y- -t az alábbi csoportból választjuk : ki: His, Asp, vagy Glu, azzal jellemezve, hogy: (A) (a) a humán proinzulin tri-arg analógot tripszinnel és karboxipeptidáz B-vel hozzuk • · · ·-36kapcsolatba, így dez (64) humán proinzulin tri-arg analóg keletkezik;(b) izoláljuk a dez (64) humán proinzulint proinzulin tri-arg analógot;(c) a dez (64) humán proinzulin tri-arg analógot tripszinnel hozzuk kapcsolatba; és (d) izoláljuk a tri-arg inzulin analógot.(B) (a) a humán proinzulin tri-arg analógot lizinendopeptidázzal hozzuk kapcsolatba, olyan körülmények között, melyek kedvezően hasítják el a humán proinzulinban a Lys-64 és az Arg-65 közötti peptid-kötést, és így hasított split (64) humán proinzulin tri-arg analóg keletkezik;(b) izoláljuk a hasított (split) 64 humán proinzulin tri-arg analógot;(c) a split (64)humán proinzulint tripszinnel hozzuk kapcsolatba; és (d) izoláljuk a humán tri-arg inzulin analógot. - 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás tri-arg inzulin előállítására, azzal jellemezve, hogy a humán proinzulin tri-arg analóg humán proinzulin, a dez (64) humán proinzulin tri-arg analóg dez (64) humán proinzulin, a split (64) humán tri-arg analóg split (64) humán proinzulin, és a humán triarg inzulin analóg humán tri-arg inzulin.
- 3. Eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy a tri-arg inzulin analógot, a tri-arg inzulint, a dez (64) humán proinzulin tri-arg analógot, a dez (64) humán proinzulint, a split (64) humán proinzulin analógot, vagy a split (64) humán proinzulint egy, vagy több gyógyszerészetileg elfogadott hordozóval, hígítóval, vagy kötőanyaggal elegyítjük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80116391A | 1991-11-26 | 1991-11-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT63457A true HUT63457A (en) | 1993-08-30 |
Family
ID=25180362
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203688A HUT63457A (en) | 1991-11-26 | 1992-11-24 | Process for producing triarginine insulins |
| HU9203688A HU9203688D0 (en) | 1991-11-26 | 1992-11-24 | Tri-arginine-insuline |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203688A HU9203688D0 (en) | 1991-11-26 | 1992-11-24 | Tri-arginine-insuline |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5491216A (hu) |
| EP (1) | EP0544466A1 (hu) |
| JP (1) | JP3304442B2 (hu) |
| KR (1) | KR930009591A (hu) |
| CN (1) | CN1072723A (hu) |
| AU (1) | AU2857692A (hu) |
| BR (1) | BR9204542A (hu) |
| CA (1) | CA2083360A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ342492A3 (hu) |
| FI (1) | FI925343A (hu) |
| HU (2) | HUT63457A (hu) |
| IL (1) | IL103849A0 (hu) |
| MX (1) | MX9206724A (hu) |
| NO (1) | NO924525L (hu) |
| NZ (1) | NZ245170A (hu) |
| TW (1) | TW224471B (hu) |
| ZA (1) | ZA928916B (hu) |
Families Citing this family (27)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996026218A1 (en) * | 1995-02-20 | 1996-08-29 | Amrad Operations Pty. Ltd. | Immunoreactive and immunotherapeutic molecules which interact in subjects with insulin-dependent diabetes mellitus (iddm) |
| DK0821006T3 (da) * | 1996-07-26 | 2004-08-16 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivater med öget zinkbinding |
| US6444641B1 (en) | 1997-10-24 | 2002-09-03 | Eli Lilly Company | Fatty acid-acylated insulin analogs |
| US6933272B1 (en) | 1998-09-22 | 2005-08-23 | Erik Helmerhorst | Use of non-peptidyl compounds for the treatment of insulin related ailments |
| WO2001072323A2 (en) | 2000-03-24 | 2001-10-04 | Genentech, Inc. | Use of insulin for the treatment of cartilagenous disorders |
| US20050014679A1 (en) * | 2001-12-20 | 2005-01-20 | Beals John Michael | Insulin molecule having protracted time action |
| AU2004234345A1 (en) * | 2003-04-29 | 2004-11-11 | Eli Lilly And Company | Insulin analogs having protracted time action |
| WO2007081824A2 (en) * | 2006-01-06 | 2007-07-19 | Case Western Reserve University | Fibrillation resistant proteins |
| JP5550338B2 (ja) | 2006-07-31 | 2014-07-16 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | ペグ化持続型インスリン |
| CN101541830A (zh) | 2006-09-22 | 2009-09-23 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 蛋白酶抗性的胰岛素类似物 |
| WO2008043033A2 (en) * | 2006-10-04 | 2008-04-10 | Case Western Reserve University | Fibrillation-resistant insulin and insulin analogues |
| ES2563038T3 (es) | 2007-04-30 | 2016-03-10 | Novo Nordisk A/S | Método para secar una composición proteica, una composición proteica seca y una composición farmacéutica que comprende la proteína seca |
| EP2910571B1 (en) | 2008-03-18 | 2016-10-05 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
| US8993516B2 (en) * | 2008-04-14 | 2015-03-31 | Case Western Reserve University | Meal-time insulin analogues of enhanced stability |
| AU2009240636A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Case Western Reserve University | Isoform-specific insulin analogues |
| US9200053B2 (en) | 2008-07-31 | 2015-12-01 | Case Western Reserve University | Insulin analogues containing penta-fluoro-Phenylalanine at position B24 |
| KR20120129875A (ko) | 2008-07-31 | 2012-11-28 | 케이스 웨스턴 리저브 유니버시티 | 염소화 아미노산을 갖는 인슐린 유사체 |
| US8399407B2 (en) * | 2009-09-17 | 2013-03-19 | Case Western Reserve University | Non-standard insulin analogues |
| CN102762589A (zh) | 2009-12-11 | 2012-10-31 | 卡斯西部储备大学 | 带有氯化氨基酸的胰岛素类似物 |
| JP2014509603A (ja) * | 2011-03-15 | 2014-04-21 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | システイン置換を含むヒトインスリン類似体およびヒトインスリン誘導体 |
| CA2870313A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Novo Nordisk A/S | Insulin formulations |
| WO2015052088A1 (en) | 2013-10-07 | 2015-04-16 | Novo Nordisk A/S | Novel derivative of an insulin analogue |
| CN104017809A (zh) * | 2014-06-05 | 2014-09-03 | 山东省农业科学院生物技术研究中心 | 改造的人Insulin蛋白表达基因及表达方法 |
| BR112017004544A2 (pt) | 2014-10-06 | 2018-01-23 | Univ Case Western Reserve | insulina de cadeia simples, composição farmacêutica e método para tratar diabetes mellitus |
| US10627415B2 (en) | 2015-03-12 | 2020-04-21 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Compositions and methods for diagnosing, monitoring, and treating an autoimmune disease |
| US20180291077A1 (en) * | 2015-09-24 | 2018-10-11 | Hanmi Pharm. Co., Ltd | Method of insulin production |
| MX2019006463A (es) | 2016-12-16 | 2019-08-14 | Novo Nordisk As | Composiciones farmaceuticas que contienen insulina. |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3326473A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-01-31 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Pharmazeutisches mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| DE3326472A1 (de) * | 1983-07-22 | 1985-02-14 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Neue insulin-derivate, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung sowie pharmazeutische mittel zur behandlung des diabetes mellitus |
| US4569791A (en) * | 1984-06-14 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Anti-diabetic compounds |
| US4569792A (en) * | 1984-06-14 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Anti-diabetic compounds |
| US4581165A (en) * | 1984-06-14 | 1986-04-08 | Eli Lilly And Company | Anti-diabetic compounds |
| US5008241A (en) * | 1985-03-12 | 1991-04-16 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin peptides |
| DK129385A (da) * | 1985-03-22 | 1986-09-23 | Novo Industri As | Peptider og fremstilling deraf |
| IL84110A (en) * | 1986-10-14 | 1992-11-15 | Lilly Co Eli | Process for transforming a human insulin precursor to a human insulin |
| US4992418A (en) * | 1987-07-17 | 1991-02-12 | Mount Sinai School Of Medicine | Superactive human insulin analogue-[10-Aspartic Acid-B]Human Insulin |
| ATE101620T1 (de) * | 1988-06-23 | 1994-03-15 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung. |
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DK134189D0 (da) * | 1989-03-20 | 1989-03-20 | Nordisk Gentofte | Insulinforbindelser |
| DE3936876A1 (de) * | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| US5130236A (en) * | 1989-12-07 | 1992-07-14 | Eli Lilly And Company | Process for producing des(64,65)-proinsulin |
| US5139716A (en) * | 1990-02-20 | 1992-08-18 | Loral Aerospace Corp. | Method of fabricating coolable ceramic structures |
-
1992
- 1992-11-18 CZ CS923424A patent/CZ342492A3/cs unknown
- 1992-11-18 TW TW081109247A patent/TW224471B/zh active
- 1992-11-18 ZA ZA928916A patent/ZA928916B/xx unknown
- 1992-11-18 NZ NZ24517092A patent/NZ245170A/xx unknown
- 1992-11-19 CA CA002083360A patent/CA2083360A1/en not_active Abandoned
- 1992-11-20 EP EP92310616A patent/EP0544466A1/en not_active Withdrawn
- 1992-11-23 IL IL103849A patent/IL103849A0/xx unknown
- 1992-11-23 MX MX9206724A patent/MX9206724A/es unknown
- 1992-11-24 NO NO92924525A patent/NO924525L/no unknown
- 1992-11-24 AU AU28576/92A patent/AU2857692A/en not_active Abandoned
- 1992-11-24 KR KR1019920022175A patent/KR930009591A/ko not_active Application Discontinuation
- 1992-11-24 HU HU9203688A patent/HUT63457A/hu unknown
- 1992-11-24 HU HU9203688A patent/HU9203688D0/hu unknown
- 1992-11-25 JP JP31483692A patent/JP3304442B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-11-25 BR BR9204542A patent/BR9204542A/pt not_active Application Discontinuation
- 1992-11-25 FI FI925343A patent/FI925343A/fi not_active Application Discontinuation
- 1992-11-25 CN CN92113309A patent/CN1072723A/zh active Pending
-
1993
- 1993-07-06 US US08/087,831 patent/US5491216A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-06 US US08/466,945 patent/US5698669A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MX9206724A (es) | 1993-05-01 |
| JPH05286998A (ja) | 1993-11-02 |
| EP0544466A1 (en) | 1993-06-02 |
| FI925343A0 (fi) | 1992-11-25 |
| CA2083360A1 (en) | 1993-05-27 |
| CZ342492A3 (en) | 1993-06-16 |
| HU9203688D0 (en) | 1993-03-29 |
| NO924525L (no) | 1993-05-27 |
| BR9204542A (pt) | 1993-06-01 |
| NZ245170A (en) | 1994-07-26 |
| IL103849A0 (en) | 1993-04-04 |
| US5491216A (en) | 1996-02-13 |
| JP3304442B2 (ja) | 2002-07-22 |
| FI925343A (fi) | 1993-05-27 |
| NO924525D0 (no) | 1992-11-24 |
| US5698669A (en) | 1997-12-16 |
| ZA928916B (en) | 1994-05-18 |
| AU2857692A (en) | 1993-05-27 |
| TW224471B (hu) | 1994-06-01 |
| KR930009591A (ko) | 1993-06-21 |
| CN1072723A (zh) | 1993-06-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT63457A (en) | Process for producing triarginine insulins | |
| AU744824B2 (en) | Improved process for obtaining insulin precursors having correctly bonded cystine bridges | |
| FI79786B (fi) | Foerfarande foer framstaellning ett farmaceutiskt medel foer behandling av diabetes. | |
| CA2363639C (en) | Covalently bridged insulin dimers | |
| MXPA04006084A (es) | Molecula de insulina que tiene una accion en el tiempo prolongada. | |
| US20030104981A1 (en) | Human insulin analogues | |
| TW200817432A (en) | Amidated insulin glargine | |
| JPH0691834B2 (ja) | インシュリン誘導体の製法 | |
| Büllesbach et al. | Functional importance of the A chain loop in relaxin and insulin. | |
| FI79853B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av insulinderivat. | |
| NO153061B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av et b30-threonininsulin | |
| TW200817511A (en) | Method for preparing insulin analogs with dibasic B chain end | |
| AU644032B2 (en) | Process for the enzymatic preparation of GRF(1-44) amide | |
| EP0519750A2 (en) | Insulin analogs | |
| JPH04295496A (ja) | インスリン活性を有する短ペプチド | |
| WO1992021700A1 (fr) | Nouvelle calcitonine, et production et utilisation de cette substance | |
| Shang-quan | Studies on structure and biological activity of insulin | |
| JPS6246560B2 (hu) | ||
| HU211312A9 (hu) | Májspecifikus inzulinanalógok Az átmeneti oltalom az 1-9. igénypontokra vonatkozik. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |