HUT58795A - Process for producing recombinant dns and chimera antibodys - Google Patents

Description

Az antitesteknek a terápiában való alkalmazása mind nagyobb jelentőséget nyer. így például az interleukin-2 (IL-2) receptor elleni antitesteknek immunszuppresszánsként nagy gyógyászati érdekességük van. Az ilyen antitestek in vivő hatásóssága állatkísérletek egész sorával támasztható alá. Ilyen példákat egéren végzett szívés bőrátültetésre [Kirkman et al., Transplantation Proceedings 19, 618-690 (1987) és T.Di amantstein et al., Transplantation Reviews 1, 177-196 (1987)], patkányon végzett szívátültetésre [J.W.Kupiec-Weglinski et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83., 2624 (1986)], patkányon végzett Langerhans-sziget-átültetésre [Hahn et al., Diabetologia 30.

(1987)] és emberszabású majmokon végzett veseátültetésekre [T.Diamantstein et al., Transplantation Reviews 1, 177-196 (1987)] írnak le. Emberek esetében is leírták az IL-2 receptor elleni patkány antitestek sikeres preventív alkalmazását veseátültetéseknél [J.P.Soulillon et al., J.of Autoimmunity 1, 655-661 (1988); D.Contarovitch et al., Am.J. of Kidney Disease 11, 101-106 (1988)].

Fennáll azonban az a hátrány, hogy egér és patkány antitestek emberekben való alkalmazás után erősen immunogének, ami a terápiás aktivitás semlegesítéséhez vezethet. Ezért nagy érdeklődés nyilvánul meg hibrid egér/ember antitestek vagy humanizált antitestek hozzáférhetősége iránt, amelyektől emberben lényegesen csökkent vagy teljesen kiküszöbölt immunogén hatás várható [S.L.Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 81. 6851-6855 (1984); P.T.Jones et al.,Natúré 321,522-525 (19861 1 .

Ilyenfajta hibrid antitesteket eddig többnyire megfelelő • · cDNS-ek géntechnológiai fúziójával és megfelelő gazdasejtekben való kifejezésével állítottak elő. Itt azonban az a probléma merül fel, hogy a hibrid antitestek szerkesztéséhez rendszerint először egy fág-génkönyvtárból izolálják a könnyű és nehéz láncok génjeit és jellemzik ezeket. Ezt követően történik a VJ-szakasz, illetve a VDJ-szakasz genomiális DNS-ének a könnyű és nehéz humán láncok konstans régióinak megfelelő genomiális DNS-ével való géntechnológiai fúzió [lásd erre vonatkozólag S.L.Morríson et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81, 6851-6855 (1984); S.H.Boulianne et al.,Nature 312,641-646(1984): L.K.Sun et al., Proc . Natl .Acad. Sci . USA 84., 214-218 (1987) ; Y.Nishimura et al.,Cancer Rés . ,4.7,999-1005 (1987) ; B.A.Brown et al., Cancer Rés., 47, 3577-3583 (1987)].

Mivel rendszerint 10θ plakkot kell megvizsgálni, amíg egy 1 kópiaszámmal rendelkező gént találunk, ez a módszer rendkívül munkaigényes. Ezért a genomiális izolátumok jellemzése (restrikció-térképezés, a szomatikus és ivari sejtekben levő génstruktúra megkülönböztetése, hibásan és helyesen elrendeződött gének megkülönböztetése) sok időt igényel.

A találmány célkitűzése az volt, hogy a kiméra antitestek előállítását megkönnyítsük.

A kitűzött feladatot a találmány szerint egy olyan rekombináns DNS-sel oldottuk meg, amely egy olyan antitest könynyű vagy nehéz láncát kódolja, melynek konstans régiói humán eredetűek, változó régiói pedig nem humán eredetűek, és amely antitestre az jellemző, hogy a transzkripció irányában haladva (a) egy, a változó nem-humán régiót kódoló cDNS-szekvenci

• · · · át, beleértve a J és adott esetben a D régiót, (b) egy intron-szekvenciát, amely 5'-végén egy splice-donor helyet tartalmaz és az 5'-végen egy nem-humán intron-rész-szekvenciából és a 3'-végen egy humán intron-rész-szekvenciából tevődik össze, és (c) egy humán konstans régiót kódoló genomiális DNS-szekvenciát tartalmaz.

A rekombináns DNS segítségével a kívánt specifitású kiméra antitestek könnyű illetve nehéz láncai meglepően magas kitermeléssel állíthatók elő. Emellett azonban az is egészen rendkívül előnyös, hogy a kívánt specifitású változó régió könnyen nyerendő cDNS-szekvenciája (az antitest-gén c-DNS-e könnyen előállítható, mivel a megfelelő mRNS hibridóma-sejtekben az össz-mRNS-hez viszonyítva nagy arányban van jelen) az intron-szekvencián keresztül kapcsolva lehet itt egy már szubklónozott genomiális DNS-szekvencíával, amely a konstans humán régiókat kódolja, és ezzel széles felhasználhatósággal rendelkezik. A találmány szerint lehetőség nyílik arra, hogy csekély ráfordítással állítsunk elő olyan rekombináns DNS-molekulákat, amelyek mindig a megfelelő specifitású DNS-szekvenciával rendelkeznek .

A találmány szerinti rekombináns DNS (a) cDNS-szekvenciája egy könnyű láncot kódoló régiót, a V- és J-régiókat, valamint a V- és J-régiók között még egy nehéz láncot kódoló régiót, a D-régiót is tartalmazza. A találmány szerinti rekombináns DNS (a), (b) és (c) elemeivel minden helyen — ahol antitest-génekben természetes esetben intronok vannak — • ·

- 5 megfelelő DNS-szekvenciákat tartalmaz, kivéve ott, ahol intronok minden könnyű és nehéz láncban a szignálszevenciában fordulnak elő. A találmány szerinti rekombináns DNS alkalmas gazdasejtekben való kifejezése a kiméra antitestek cDNS-expresszió alkalmazásával történő kifejezésére eddig ismert eljárásokkal összehasonlítva a kívánt antitestek sokkal jobb kifejeződéséhez vezet.

A találmány egy előnyös kiviteli formájában az (a) szekvencia, ugyanúgy, mint a (b) nem humán íntron-rész-szekvencia, rágcsáló (murine) eredetűek, és a (b) nem humán intron-rész-szekvencia 15 - 20 nukleotid hosszúságú.

Egy különösen előnyös kiviteli formában a (b) nem humán intron-rész-szekvencia az (a) szekvenciát természetesen, azaz mint a genomiális DNS-ben, követő intron-szekvencia egy része. A találmány keretén belül azonban más, nem humán, előnyösen ugyanabból a fajból és lehetőleg egy antitest-génből levezetett intron-szekvenciák is használhatók.

A találmány egy további előnyös kiviteli formájában a (b)-ben levő splice-donor hely a GT szekvenciát tartalmazza.

A találmány szerint az intron-szekvencia humán részében előnyösen egy olyan brach-site van, amely például az olyan ismert szekvenciák egyikének felel meg, amilyeneket például Sharp,P.A. ír le a Science 235, 766-771 (1987)-ben. A branch-site azonban lehet az intron rágcsáló (murine) részében is.

A rekombináns DNS lehetséges kifejeződési arányának fokozása céljából a rekombináns DNS 5'-végéhez előnyösen még • · · · • · ·« * • · · egy olyan promoter szekvenciát toldunk, amelynek kontrollja mellett az antitest-láncokat kódoló szekvenciák kifejezhetők. Ilyen célra például a természetes körülmények között, tehát mint a genomban, a rekombináns DNS megfelelő szekvenciája felett kontrollt gyakorló promoterek használhatók. Előnyösen azonban olyan promotereket használunk, amelyek erősebb, adott esetben szabályozható kifejezést tesznek lehetővé. Ilyen fajta promoterek a szakemberek által ismertek. Egy különösen előnyös kiviteli formában a rekombináns DNS a citomegalia vírus promoterét tartalmazza.

A találmány egy további előnyös kiviteli formája egy olyan rekombináns DNS, amelynek (a) szekvenciája egy, az interleukin-2-receptorral specifikusan kapcsolódni képes antitest könnyű vagy nehéz láncának változó régióját kódolja. Előnyös továbbá, hogy ha a találmány szerinti rekombináns DNS egy nehéz láncot kódoló (c) humán szekvenciája egy IgG típusú humán antitest nehéz láncának konstans régióját kódolja.

Ilyen rekombináns DNS-eket a pK chim. és a p chim. plazmidok tartalmaznak, ahol a pKchim. plazmid egy, a könnyű, nevezetesen a kappa-láncot kódoló DNS-szekvenciát, a pKchim.

plazmid pedig sú nehéz láncot kódoló rekombináns DNS-t tartalmaz, amelyek együtt egy olyan antitestet kódolnak, amelynek specifitása az interleukin-2-receptor alfa-láncára irányul, és amely IgG típusú.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy olyan expressziős vektor is, amely a találmány szerinti rekombináns DNS-ek egyikét, valamint ezen rekombináns DNS kifejezéséhez szüksé• · • · · · · ♦ · ·«·· · · · · · ·

- 7 ges összes elemet tartalmazza. Az ehhez szükséges vagy előnyösen alkalmazott elemek promoterek, regulátor-szekvenciák és hasonlók. Expressziós vektorok a szakemberek által jól ismertek, és például E.L.Winnacker Gének és klőnok c. könyvében (Gene und Klone, 1985, Verlag Chemie, Weinheim) találhatók részletesebben leírva. A találmány szerinti expressziós vektorral lehetővé válik, hogy egy találmány szerinti rekombináns DNS-t alkalmas gazdasejtekbe bevigyünk, és ott kifejeződésre hozzuk. Különösen előnyös olyan expressziós vektorok, amelyek találmányunk szerinti rekombináns DNS-t tartalmaznak, és szintén a találmány tárgyát képezik, a már említett pK chim. és p^chim. plazmidok.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy találmány szerinti rekombináns DNS előállítására szolgáló eljárás, amelynek során egy kívánt specitiású antitestet kiválasztó hibridóma-sejtvonalból poliA⁺RNS-t izolálunk, ehhez alkalmas vektorokban cDNS-könyvtárat készítünk, és az antitest konstans részét kódoló DNS-sel komplementer oligonukleotidokkal végzett hibridizálással kiszűrjük azokat a kiónokat, amelyek az antitestláncokat kódoló cDNS-t tartalmaznak, innen izoláljuk a V-, J- és adott esetben a D-szekvenciákat, majd ezután a mindenkori J-doménekhez kapcsolva a transzkripció irányába haladva egy splice-donor helyet, egy nem humán eredetű antitest-intronszekvencia egy részét és egy restrikciós hasítási helyet viszünk be, és a megfelelő restrikciós enzimmel végzett emésztéssel elválasztjuk a konstans régiót kódoló szekvenciáktól, és a kapott DNS-t egy olyan genomiális DNS-szekvenciti* · ával ligáljuk, amely egy humán antitest könnyű vagy nehéz láncának konstans régióját kódolja, és 5'-végén egy megfelelő humán Intronszekvencia vége van.

A poliA⁺RNS izolálását, ehhez a cDNS-szintézist, valamint ehhez egy cDNS-könyvtár szerkesztését önmagukban ismert módszerekkel végezzük, így például a Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1982, Cold Spring Harborban leírtak szerint. Az antitest-láncokat kódoló cDNS-klónok kiválogatását is ismert módon hajtjuk végre, amennyiben olyan kiónok után kutatunk, amelyek egy olyan oligonukleotiddal hibridizálnak, mely egy olyan DNS-sel komplementer, amely egy olyan antitest konstans régióját kódolja, mely ugyanezen hibridóma-sejt fajból származik.

A splice-donor hely és a restrikciós hasítási hely bevitelére alkalmas irányított mutagenezis is önmagában ismert, és a Morinaga és munkatársai által leírt módszerrel [Bio/Technology 2, 636-639(1984)] hajtjuk végre.

A találmány egy előnyös kiviteli formájában egy egérvagy patkány-hibridóma sejtet használunk. Az olyan hibridóma sejtek előállítását, amelyek a kívánt specifitású antitesteket választanak ki, a Köhler és Milstein által már leírt [Natúré 256.495(1975)1 és ezt követően továbbfejlesztett eljárással végezzük. Ezek a műveletek az ezen a területen járatos szakember által ismertek. A találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen egy olyan egér-hibrídóma sejtet használunk, amely a humán interleukin-2 receptor alfa-lánca elleni antitesteket választ ki.

·« · ·« «« · • · · ♦ · * · » ·«·· · · » · ·»·· «·*« · *· ·♦ ·

- 9 A nem humán eredetű intron-részszekvencia bevitelekor előnyösen egy 15 - 20 bázispár hosszúságú szekvenciát használunk. Különösen előnyösen használjuk Itt részben az autentikus génben levő intron-szekvenciát. Előnyös továbbá, ha splice-donor helyként a GT nukleotid-sort visszük be.

Előnyös továbbá egy olyan humán genomiális DNS-t használni, amelynek intron-részszekvenciája egy branch-site-ot tartalmaz.

Ahhoz, hogy olyan rekombináns DNS-t kapjunk, amely jól kifejezhető, a végül kapott DNS-szekvenciát előnyösen egy olyan promoter-szekvencia elé visszük be, vagy a találmány szerinti eljárásban szükséges manipulációkat eleve egy olyan vektorban hajtjuk végre, amely megfelelő helyzetben tartalmaz egy promotert. Különösen előnyös, ha a citomegalia-virus genom promoterét használjuk.

A találmány egy további, szintén előnyös kiviteli alakjában egy nehéz láncot kódoló rekombináns DNS előállítására egy olyan humán genomiális DNS-szekvenciát használunk, amely egy IgG típusú antitest nehéz láncának konstans régióját kódolja.

A találmány tárgya továbbá egy találmány szerinti expreszsziós vektor előállítására szolgáló olyan eljárás, amelynek során egy idegen gén kifejezésére alkalmas vektorba egy találmány szerinti rekombináns DNS-t inszertálunk. Amint már az előbbiekben kifejtettük, ilyen vektorokat a szakemberek ismernek, és ezek tartalmazzák az összes szükséges elemet, például rekombináns DNS inszertálásához szükséges polilinkert, a re«* « 44 99· • * 9 I 9♦ · » *··· ♦ · · ···· ··*· W ·· ·9·

- 10 kombináns DNS-eket tartalmazó telepek felismeréséhez szükséges antibiotikum-rezisztencia géneket, replikációs origót, szabályzó elemeket, promotert, amennyiben már a rekombináns DNS nem tartalmaz ilyet, valamint adott esetben további elemeket, például szuppresszor-géneket.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás olyan kiméra antitest előállítására, amelynek változó régiói nem humán eredetűek, konstans régiói pedig humán eredetűek, amely eljárás során alkalmas gazdasejtekbe egy olyan expreszsziós vektort viszünk be, amely egy találmány szerinti olyan rekombináns DNS-t tartalmaz, mely az antitest nehéz láncát kódolja, a stabil transzformánsokat izoláljuk, és a sejtek tenyészetének felülúszójából önmagukban ismert módszerekkel kinyerjük az antitesteket. Gazdasejtként előnyösen egy Non-producer hibridóma sejtet használunk, különösen előnyösen az Sp2/0 sejtvonalat. A találmány szerinti eljárásban a vektorok bevitelét előnyösen elektroporációval végezzük [Nucl.Acids Rés., 15., 1311-1326 (1987); Bio Techniques £, 742-751 (1988)], adott esetben linearizált DNS-molekulákkal. Alkalmazhatók azonban a gazdasejtek transzfektálásra a szakemberek által ismert más eljárások is.

A találmány szerinti eljárás lehetővé teszi, hogy egyszerű módon állítsunk elő legkülönbözőbb specifitású olyan antitesteket, amelyek terápiás alkalmazásukkor emberre nem vagy csak nagyon kevéssé immunogének, mivel a konstans régiók humán eredetűek. Jelenleg viszonylag egyszerűnek számító módszerrel, például olyan egér-hibridóma sejtek előállításával, • ·

- 11 amelyek kívánt specifitású antitesteket választanak ki, és ezekből cDNS izolálásával, ez a találmány szerinti cDNS a találmány szerinti eljárással könnyen bevihető már előkészített vektorokba, amelyek már tartalmazzák a könnyű illetve nehéz lánc konstans régióihoz a genomiális humán részeket. így lehetővé válik, hogy a kívánt cDNS-fragmnesnek a megfelelően előkészített vektorokba való egyszerű integrálásával, mindkét vektor rekombináns DNS-ének egy gazdasejtben való kifejeződése után kiméra antitesteket kapjunk. Az előállítás nemcsak sokkal egyszerűbb, mint az eddig ismert módszerek, hanem sokkal magasabb kitermelést is eredményez.

A találmány további tárgyát képezik még a MÁK 179, MÁK 215 és MÁK 447 kiméra antitestek is, amelyeknek a könnyű és nehéz láncokat kódoló szekvenciáit az 1 - 6. számú szekvenciavázlatokon mutatjuk be [megadjuk a változó régiók szekvenciáit; a konstans régiók szekvenciái ismertek, és például a Sequences of Proteins of Immunological Interest; E.Kábát, T.Wu, M.Reid-Miller, H.Perry and K.Gottesmann, US Department of Health and Humán Services, 1987, 282 - 325.old. írja le ezeket], és előállításáukat a példákban ismertetjük. Mind a három antitest a humán IL-2 receptor alfa-láncára specifikus.

A találmányt részletesebben a következő példákkal, valamint az ezekhez kapcsolódó szekvenciavázlatokkal és ábrákkal szemléltetjük.

A szekvenciavázlatok és ábrák magyarázata a következő:

1.számú szekvenciavázlat: a MÁK 179 könnyű lánca változó régiójának DNS- és aminosav-szekvenciáját mutatja be.

• · • ·

2. számú szekvenciavázlat: a MÁK 447 könnyű lánca válto- zó régiójának DNS- és aminosav-szekvenciáját mutatja be.

3. számú szekvenciavázlat: a MÁK 215 könnyű lánca válto- zó régiójának DNS- és aminosav-szekvenciáját mutatja be.

- 6.számú szekvenciavázlatok: a nehéz láncok mindenkori változó régióinak ide tartozó szekvenciái.

1. ábra: A könnyű immunglobulin-lánc változó régióját kó- doló, rágcsáló (murine) eredetű cDNS-fragmens izolálásának vázlata és az irányított mutagenezis végrehajtása.

2. a) ábra: A rágcsáló (murine) eredetű változó régió inszer- tálása egy expressziós vektorba.

2. b) ábra: A könnyű láncot kódoló rágcsáló (murine) és humán eredetű antitest-kódoló szekvenciák összekapcsolásának vázlata.

3. és 4.a), valamint 4.b) ábrák: A nehéz immunglobulin lán- cokat kódoló rágcsáló (murine) és humán eredetű szekvenciák összekapcsolásának vázlata.

1.példa:

MÁK 179, 447 és 215 könnyű és nehéz láncainak klónozása és szekvencia-analízise.

A MÁK 179, 447, illetve 215 monoklonális antitesteket kiválasztó hibridóma sejtekből RNS-t preparálunk [Cleary et al., Cell 44. 97 - 106 (1986)], és ebből egy oligo-dT-cellulóz oszlopon (Collaborative Research, Bedford, MA) poliA⁺RNS-t izolálunk (Maniatis,T. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold • « • ·

Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). A Pharmacia cég cDNS klónozó készletével (kit) a gyártó előírásai szerint [Gubler,U. und Hoffmann, G.J.: Gene 25, 263 (1983) analógiájára] minden egyes hibridóma-sejtvonal esetében egy cDNS-könyvtárat készítünk. Ez minden egyes hibridóma-vonal esetében körülbelül 10.000 rekombinánst jelent.

A kappa-lánc kiónjai szerinti szűréshez az

5’ CCCGACTACGACGT 3' prímért használjuk.

^-lánc (J1 és^2b) klónjai szerinti szűréshez az

5' CAGATAGGTGACCGG 3’ prímért használjuk.

Ezzel a primerrel az egér immunglobulin-gének összes nehéz láncát megkötjük [Sablitzky,F. and Rajewski,K., EMBO J.2,3005 - 3012 (1984)].

A cDNS-könyvtárat a pT7T318U vektorban (Pharmacia) szerkesztjük meg. Ezáltal lehetővé válik, hogy az inszertumokat EcoRI fragmensként újból visszanyerjük. A restrikciós endonukleázokkal végzett analízis eredménye azt mutatja, hogy a MÁK 179, 447 és 215 kiónok könnyű és nehéz láncait kódoló DNS-eket teljes hosszban nyerjük. A megfelelő régiókat M13 vektorokban szubklónozzuk és szekvenáljuk [Sanger,F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, 5436 - 5467 (1977) ] .

A változó régiók szekvenciáit az 1 - 6. számú szekvenciavázlatokon mutatjuk be. Ebből az derül ki, hogy a MÁK 179 és 447 ugyanazokat a V-szegmenseket használják a könnyű és a nehéz láncokhoz .

ti ·

- 14 Mindkét kappa-lánc a J1 régiót használja, és a VJ átmeneteknél azonos nukleotidok vannak, ami a két kappa-gén VJ régióinak közös eredetére utal. Mindkét láncban ugyanaz a D régió, ugyanaz a J régió (J_H3) és azonos VDJ rekombinációk vannak, ami a két gén VDJ régióinak közös eredetére enged következtetni .

A kappa-láncok aminosavszekvenciáinak összehasonlításakor a MÁK 179 és MÁK 447 kappa cDNS-ének V régióiban 3 aminosav-cserét találunk. Ezek a cserék a következők: (Thr Ser-re, 20.aminosav), (Lys Arg-ra, 45.aminosav), (Asn Lys-re, 53.aminosav).

A MÁK 179 és 447 VJ régióiban levő aminosavak 98%-a azonos.

A MÁK 179 és MAK447 ^cDNS-ének V régióiban 6 aminosav-csere van. Ezek az aminosav-cserék a következők: (Val Ala-ra, 23. aminosav), (Gly Ser-re, 56.aminosav), (Ile Val-ra, 65.aminosav), (Gin Glu-ra, 82.aminosav).

A MÁK 179 és 447 VJ régióiban levő aminosavk 94%-a azonos.

Az adatok arra utalnak, hopgy a MÁK 179 és MÁK 447 aminosavszekvenciáiban levő különbségek szomatikus mutációkra vezetendők vissza.

A MÁK 179 és 447 kappa- és cDNS-ét ábrázoló szekvenciavázlatokban megadjuk a szignálszekvencia startját jelző (Met) iniciációs kodont. Ugyancsak megadjuk a J, illetve D,J régiókat, valamint az illető konstans régiók kezdetét.

A (az IL-2 megkötésére nézve) nem inhibitor jellegű MÁK 215 antitest kappa- és ^2b ¹ ánca változó régióinak szekvenciáit a

3. és 6.számú szekvenciavázlatokon adjuk meg.

A kappa-lánchoz a J4 régióra van szükség. Egy olyan V-szeg» · menst alkalmazunk, amely a MÁK 179 és 447 könnyű láncaiétól erősen különbözik.

A MÁK 179 V-szegmensével összehasonlítva az aminosavak 51%-a azonos.

-lánc szekvenciáját a 6.számú szekvenciavázlaton mutatjuk be. Itt egy olyan V-szegmenst használunk, amely a MÁK 179 és MÁK 447 kiónok nehéz láncaiétól világosan különbözik. Ugyancsak megadjuk (a hét aminosavat tartalmazó) D régiót, valamint a J régiót (J_H3) és a konstans régió kezdetét. A MÁK 179 klón nehéz láncának V-szegmensével összehasonlítva az aminosavak 57%-a azonos.

2.példa:

A MÁK 179 könnyű láncának kimerizálása és expressziós vektor szerkesztése a kimerizált könnyű lánc részére.

a) Splice-donor-, intron- és Notl-szekvenciák bevitele a

MÁK 179 kappa-láncának VJl-régiójába (l.ábra).

A rágcsáló (murine) MÁK 179 könnyű láncát kódoló cDNS-t EcoRI-Hpal fragmensként pUC18-ban [Yanisch- Perron,C. et al.: Gene 33., 103-109 (1985) ] szubklónozzuk, mikor a pUCk plazmid keletkezik. Mutagenezissel egy EcoRI- és Notl-végeken keresztül klónozható (hordozható) EcoRI-Notl-fragmenst hozunk létre, amely a VJ1 régiót az egér kappa-láncok genomiális szerveződésének megfelelően tartalmazza. Ehhez csatlakozik 20 nukleotid intronszekvencia az egér kappa-lánc [Max,E.E. et al., J.Bioi.Chem., 256, 5116 -5220 (1981) ] genomiális Jl-szegmensének GT splice-donor szekvenciájával kezdődően és a NotI restrikciós endonukleáz részére egy GCGGCCGC felimerési szekvencia. A mutagenezist (lásd ·*·· alább) Morinaga és munkatársai [Bio/Technology 2, 636 - 639 (1984)] szerint végezzük.

A mutagenezishez felhasznált oligonukleotid-szekvencia a következő:

splice-donor-szekvencia

5' GCAAATCAAAC GTAAGTAGAATCCAAAGTCT GCGGCCGC GGGCTGATGCT 3'

J1 J1 latron NotI egér kappa konstans régió

Heteroduplex képzéshez pUCk-ból két fragmenst izolálunk.

A-fragmens: pUCk-t az EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel hasítjuk, a két fragmenst gélelektroforetikusan (agaróz-gél) elválasztjuk, és a nagy EcoRI-BamHI fragmenst izoláljuk a gélből. Ez a fragmens nem tartalmaz egér kappa-szekvenciákat.

B-fragmens: pUCk-t Nael-gyel kezelünk (egyedüli hasítási hely a pUC-részben), az 5'-foszfátcsoportot alkalikus foszfatázzal végzett kezeléssel eltávolítjuk, és utána a fragmenst kétszer tisztítjuk 0,7%-os agaróz-gélen.

A heteroduplex képzéshez 500 - 500 fmol A-fragmenst és

B-fragmenst és 80 fmol oligonukleotidot elegyítünk, és 50 mmol/1 nátrium-klorid, 10 mmol/1 7,5 pH-jú trisz.HCl, 10 mmol/1 magnézium-szulfát tartalmú oldatban három percig 100°C-on inkubáljuk, majd utána jégben lehűtjük. Ezt követően a DNS-t 20 percig 60°C-on végzett kezeléssel renaturáljuk. A helyreállító (reparatur) szintézishez 0,25 mmol/1 dezoxinukleozid-trifoszfátot, 1 mmol/1 ATP-t, 100 mmol/1 nátrium-kloridot, 6,5 mmol/1

7,5 pH-jű trisz«HCl-t, 8 mmol/1 magnézium-kloridot, lmmol/1 • ····· ·· ····· ···· · ·· ·· ·

- 17 β-merkapto-etanolt, 0,125 egység/μΐ elegy E.coli DNS-polimeráz Klenow-fragmenst és 0,1 egység/μΐ elegy T4 ligázt tartalmazó reakcióelegyet állítunk össze, és 4 óra hosszat inkubáljuk 16°C-on. Utána a reakcióeleggyel E.coli HBlOl-et transzformálunk, és a telepeket 50 /zg/ml ampicillin-tartalmú agarlemezeken szelektáljuk. A telep hibridizációs technika segítségével [Maniatis et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold. Spring Harbor, NY, 1982] azonosíthatók azok a telepek, amelyek plazmid DNS-ébe beépült a fentebb leírt oligonukleotid. A jellemzés ezután a restrikciós endonukleázokkal végzett analízissel történik. Utána a szekvencia kívánt változását szekvenálással erősítjük meg [Sanger,F. et al.: Proc.Natl.Acad.Scí.USA 7.4/ 5463 - 5467 (1977)].

b) Expressziós vektor szerkesztése a MÁK 179 kimerizált kappa-láncához (2.a és 2.b ábra).

Kiindulási plazmádként a pcDNSl [Invitrogen, San Diego; Aruffo,A. and Seed,B., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84.,8573 - 8577 (1987)] szolgál. Ez az emberi citomegalia-vírus promoterét, a T7 és az SP6 fágok promotereit, egy polilinkert, SV40 spliceés poliadenilációs szekvenciáit, szelekcióhoz egy supF tRNS-t, valamint M13, ColEl, SV40 és polióma replikációs origóit tartalmazza. Klónozási okokból a beírt Ndel helyet egy megfelelő linker beligálásával egy Pvul hellyé alakítjuk át ( = pcDNSI-Pvul). Az utóbbi plazmidot polilinkerben EcoRI-gyel és Notl-gyel hasítjuk, és az (a) pont szerint kapott DNS-nek (kb. 400 bp) a MÁK 179 kappa VJ1 régióját és intron-szekven• ·

- 18 ciáit tartalmazó EcoRi-NotI fragmensét a vektorba ligáijuk. A ligációs elegyet az E.coli MC1061/P3 törzsbe [Aruffo,A. and Seed,B.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84., 8573 - 8577 (1987); Seed,B.: Nucl.Acids Rés. 11, 2427 - 2445 (1983)] transzfektáljuk, és agar lemezeken ampicillin rezisztens kiónokat Izolálunk. A keletkező plazmidot pcDNSk-nak nevezzük. A pcDNSk-t utána Pvul-gyel és Notl-gyel hasítjuk, és a rövidebb fragmenst egy alacsony hőmérsékleten olvadó agaróz-gélen izoláljuk.

A pl0195 plazmidot (előállítás az EP-A 0 378 175 számú nyilvánosségra hozott európai szabadalmi bejelentés szerint) szintén Notl-gyel és Pvul-gyel hasítjuk, és a nagyobb fragmenst (2.b ábra) egy alacsony hőmérsékleten olvadó agaróz gélen izoláljuk. A pl0195 az egérnek a kappa-láncot kódoló intron szekvenciáit tartalmazza, valamint a konstans humán kappa régió kódoló és nem-kódoló tartományait.

A pcDNSk és pl0195 két fragmensét T4 ligázal kezeljük, MC1061/P3-ba transzfektáljuk, és ampicillin rezisztens telepeket izolálunk. A keletkezett plazmidot pk chim. plazmádnak nevezzük. A hibrid-gént (VJl-egér-C^appg-humán) a humán CMV-promoter (citomegalia-vírus promoter) kontrollja alatt fejezzük ki. A (pl0195-ből a pk chim.-be bevitt) foszfotranszferáz neo-t kifejező expressziós kazetta szolgál a G418 rezisztens telepeknek emlős sejtekbe való transzfektálás utáni szelekciójára [Southern,P. and Berg,P.: J. Mól .Appl. Génét1., 327 - 341 (1982) ] .

··· ·· ··· ······· • ··«·· · · ····· ···· · · · · · ·

3.példa :

A MÁK 179 nehéz láncának kimerizálása és expressziós vektor szerkesztése a kimerizált nehéz lánc részére.

a) Splice-donor, intron és NotI szekvenciák bevitele MÁK 179^ láncának VDJ₃ régiójába (3.ábra).

A ^-láncot kódoló cDNS-t (5'-helyzetű nem kódoló régió és a kódoló régió a konstans régióban levő BamHI-helyig ) EcoRI-BamHI fragmensként pUC18-ban szubklónozzuk [ Yanisch-Perron,C. et al.: Gene 33., 103 - 109 (1985) ] = pUC^ plazmid.

Mutagenezissel egy hordozható EcoRI-NotI fragmenst hozunk létre, amely a VDJ3 régiót az egér ^-lánc genomiális elrendeződésének megfelelően, ezt követően az egér ^-lánc genomiális J3 szegmense [Sakano et al., Natúré 286, 676 - 682 (1980)] GT splice-donor szekvenciájával kezdődően 20 nukleotídból álló intron szekvenciát és ez után a NotI restrikciós endonukleáz GCGGCCGC felismerési helyét tartalmazza. A mutagenezist Morinaga és munkatársai [Bio/Technology 2, 636 - 639 (1984)] szerint végezzük.

A mutagenizáláshoz használt oligonukleotid szekvenciája a következő:

splice-donor-szekvencia

Λ

5' GTCTCTGCAG GTGAGTCCTAACTTCTCCCA GCGGCCGC TGCCTGGTCA 3'

J1 J1 intron NotI egér 1 konstans régió

Heteroduplex képzéshez pUC 1-ből két fragmenst izolálunk.

• ·

- 20 C-fragmens: pUC^l-et az EcoRI és BamHI restrikciós enzimekkel hasítunk, a két fragmenst 1%-os agaróz-gélen gélelektroforetikusan elválasztjuk, és a nagy EcoRI-BamHI fragmenst izoláljuk a gélből. Ez a fragmens nem tartalmaz egér ^1-szekvenciákat.

D-fragmens: pUC^l-et Nael-gyel hasítunk (egyedüli hasítási hely a pUC-részben), az 5'-foszfát-csoportokat alkalikus foszfatázzal végzett kezeléssel eltávolítjuk, és utána a fragmenst 0,7%-os agaróz-gélen kétszer tisztítjuk. A C- és D-fragmensek (500 - 500 fmol) és 80 fmol oligonukleotid összekeverése után a mutagenezist a 2.példában leírtak szerint hajtjuk végre. A telep hibridizáció segítségével (Maniatis et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) azonosíthatók az olyan telepek, amelyek plazmid DNS-ébe beépült az előbb leírt oligonukleotid. A jellemzés ezután restrikciós endonukleázokkal történik. A szekvencia kívánt változását végül szekvenálással erősítjük meg [Sanger,F. et al.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, 5463 - 5467 (1977)]. A kívánt EcoRI-NotI fragmens előállítását vázlatosan a 3.ábra mutatja be.

b) Expressziós vektor szerkesztése MÁK 179 kimerizált ^i láncához (4.a és 4.b ábrák).

A pcDNSl vektorban [Invitrogen, San Diego; Aruffo,A. and Seed,B., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84, 8573 - 8577 (1987)] levő egyedüli Ndel hasítási helyet egy megfelelő linker betoldásával Pvul hasítási hellyé alakítjuk át. A keletkező plazmidot pcDNSI-Pvul-nek nevezzük el.

·«

A pcDNSI-Pvul-et EcoRI-gyel és Notl-gyel hasítjuk, és a pUC^l-Mut-nak a 3.ábrán vázolt (a ^1 VDJ3 és intron-szekvenciáit tartalmazó) EcoRI-NotI fragmensébe ligáljuk. A keletkező plazmidot pcDNS^l-nek nevezzük.

A pll201 plazmidot (előállítás az európai szabadalmi bejelentés szerint) hasítjuk, a túllógó végeket Klenow-val

EP-A 0 378 175 számú

Notl-gyel és BamHI-gyel feltöltjük, Notl-linkerhez ligáljuk, Notl-gyel újból hasítjuk, és a 4.b ábrán bemutatott fragmenst alacsonyan olvadó agaróz-gélen izoláljuk. Ez a fragmens az egér nehéz lánc intron szekvenciáit, a humán nehéz lánc intron szekvenciáit, valamint a humán ^1 gén konstans régiójának genomiális ekvivalensét tartalmazza. Ezt a fragmenst a pcDNS^l vektor egyetlen NotI helyére ligáljuk. A helyes orientációt restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással ellenőrizzük. A MAK179 kimerizált ^1 láncát kódoló, keletkező expressziós vektort p^chim.-nek nevezzük.

Ezen elv alapján szerkeszthetők meg más izotípusok (példáulul μ, X'2, Y 4, al, a2, 5, e) kimerizált láncai is.

4.példa:

Non-producer hibridómák permanens sejtvonalainak transzformálása elektroporáció segítségével a MÁK 179 kimerizált láncait kódoló expressziós plazmídokkal.

A pK chim. és p$l chim. plazmidokat egyenlő menyiségekben összekeverjük, és elektroporációval (BioRad Gene-Pulser) az Sp2/0-Ag-14 immunglobulin Non-producer hibridóma sejtvonalba (ATCC CRL 8923) [Ochi,A. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80, • · • ···· · · · 99···

99 9 9 99 99 ·

- 22 6351 - 6355 (1983)] transzfektáljuk. Ugyanígy megfelelnek más Non-immunglobulin-producer hibridóma sejtvonalak is, például P3X63-Ag8.653 (ATCC CRL 8735). A transzfekció előtt mindkét plazmidot a Pvul restrikciós endonukleázzal linearizáljuk. Az elektroporáció kivitelezését a Nucleic Acids Rés.15.1311-1326 (1987)-ben, illetve a Bio Techniques 6., 742 - 751 (1988)-bán írják le. Centrifugálás után a sejteket hideg HeBS-pufferral ( 20 mmol/1 7,05 pH-jú HEPES, 137 mmol/1 nátrium-klorid, 5 mmol/1 kálium-klorid, 0,7 mmol/1 dinátrium-hidrogén-foszfát, 6 mmol/1 glükóz ) mossuk, HeBS-pufferral reszuszpendáljuk, beállítjuk 10 sejt/ml koncentrációra, és jégbe helyezzük.

A plazmid hozzáadása után pulzáljuk ( körülmények: 500 f/F kapacitás és 240 és 280 V közötti feszültségtartomány vagy 160 //F és 200 - 240 V) . A sejteket a pulzálás után körülbelül 10 percig jégben tartjuk, és utána I táptalajon (RPMI 1640, 10% borjú magzatszérum, 2 mmol/1 glutamin, 1 mmol/1 nátrium-piruvát, 0,1 mmol/1 nem-esszenciális aminosavak) 37°C-on inkubáljuk. A transzfekció után 30 órával a táptalajt cseréljük, és I táptalaj + 800 ^g/ml G418 elegyével inkubáljuk, miután 96 vájatos mikrotiter lemezek egyes vájataiba körülbelül 10 sejtet adagolunk. Összesen 10 mikrotiter lemezt (egyenként 96 vájattal) töltünk meg. A kiadagolás után 7-10 nappal a vájatokbán G418 rezisztens telepek azonosíthatók. Ezek tenyészetének felülúszóit a következő példában leírtak szerint rekonstituált kimerizált MÁK 179-re vizsgáljuk. A legjobb termelő sejteket I táptalajban tömegtenyészetben szaporítjuk.

• · • ···· · · · · ···· ···· · ·· ·· ·

5.példa :

A humán 11-2 receptorok elleni rekonstituált antitestek meghatározása.

Először egy mikrotitráló lemezre humán Fc^elleni poliklonális antitesteket rétegezünk. Utána a mikrotitráló lemezbe vájatonként 2,5 /zg humán Fc^(IgG) elleni poliklonális antitest 200 /zl 9,5 pH-jú 0,2 mólos karbonát/hidrogén-karbonát pufferral készített elegyét adagoljuk, és éjszakán keresztül 4°C-on vagy 1 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A vájatokba kiszívás után 300 /zl olyan oldatot adunk, amely 50 mmol/1 HEPES-t, 0,15 mol/1 nátrium-kloridot, 1% Crocein C-t tartalmaz és pH-ja 7,0, majd szobahőmérsékleten 30 - 60 percig inkubálunk. Ezt követően 200 /zl vakpróbát vagy transzfektált sejtek tenyészetének felülúszóját adunk a vájatokba, és szobahőmérsékleten rázás közben (500 ford/perc) 1 óráig vagy szobahőmérsékleten rázás nélkül 90 percig inkubálunk. A kalibrációs görbét egy modell-kimérával (előállítva egy humán IgG MÁK és MÁK 179 Fab-fragmenseinek kémiai áthidalásával) vesszük fel. A vájatokat kiszívás után kétszer mossuk 300 - 300 μΐ inkubációs pufferral [ 50 mmol/1 7,0 pH-jú HEPES, 0,15 mol/1 nátrium-klorid, 0,2 mol/1 dinátrium-tartarát, 1% Crocein C, 0,75% polietilénglikol (PEG) 40.000 (Serva), 0,5% Pluronic F68 (Boehringer Mannheim) , 0,01% fenol]. Utána 200 /zl IL-2-receptor-POD-antitest-konjugátum-komplex oldatot (készítése alább leírva) adunk hozzá, és szobahőmérsékleten rázás közben (500 ford/perc) 1 óra hosszat vagy rázás nélkül 90 percig inkubáljuk. Az előzetesen képzett komplex oldható interleukin-2 re-

ceptorból és IL-2-receptor MÁK 215 POD-jelzett Fab-fragmenseiből áll.

A komplex oldat összetétele: 20 μΐ a MÁK 215 POD-jelzett Fab-fragmenséből (150 egység/ml) + 19,5 ml inkubációs puffer (összetétele az előbb megadottal azonos) + 3 ml oldható IL-2 receptor standard (6400 egység/ml; az egységek a Sciences T-sejt standardján keresztül definiálva). Az oldható IL-2 receptort tenyészet felülúszókból nyerjük a Shimizu és munkatársai által leírt egér-fíbroblaszt sejtvonalból [Mól. Bioi. Med., 3, 509 - 520 (1986)].

Az inkubáció végrehajtása után háromszor mosunk az előbb leírt mosó pufferral, és utána a POD-aktivitást ABTS-oldattal [ 2,2'-azino-di-3-etil-benztiazolin-szulfonát ] + hidrogén-peroxiddal határozzuk 45 - 60 perc szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a 405 nm-en mérhető extínkció ELISA-leolvasón való megállapításával. Ezzel a módszerrel magas (10 ^g/mlig terjedő) expressziójú kiónokat határozunk meg.

Claims (30)

Szabadalmi igénypontok

1. Rekombináns DNS, amely egy olyan antitest könnyű vagy nehéz láncát kódolja, melynek konstans régiói humán eredetűek, változó régiói pedig nem humán eredetűek, azzal jellemezve, hogy a transzkripció irányába haladva (a) egy, a változó nem-humán régiót kódoló cDNS-szekvenciát, beleértve a J és adott esetben a D régiót, (b) egy intron-szekvenciát, amely 5'-végén egy splice-donor helyet tartalmaz és az 5'-végen egy nem-humán intron-rész-szekvenciából és a 3'-végen egy humán intron-rész-szekvenciából tevődik össze, és (c) egy humán konstans régiót kódoló genomiális DNS-szekvenciát tartalmaz.

2. Az 1.igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az (a) szekvencia és a nem humán (b) intron-rész-szekvencia rágcsáló (murine) eredetűek.

3. Az 1. vagy 2.igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a nem humán (b) intron-részszekvencia az (a) szekvenciát természetes esetben követő intron-szekvenciának felel meg.

4. Az 1. vagy 2.igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a nem humán (b) intron-rész-szekvencia 15 - 20 bázispár (bp) hosszúságú.

5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a (b)-ben levő splice-donor hely az 5'-GT-3' szekvenciát tartalmazza.

• ·

6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a (b) humán intron-rész-szekvencia egy branch-site-ot tartalmaz.

7. Az előző igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a még egy olyan promotert is tartalmaz, amelynek kontrollja alatt az antitest láncokat kódoló szekvenciák kifejezhetők.

8. A 7. igénypont szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a citomegalia-vírus (CV) promoterét tartalmazza.

9. Az előző igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy az (a) szekvencia egy, a humán interleukin-2 receptorral specifikus kötődésre képes antitest könnyű vagy nehéz láncának változó régióját kódolja.

10. Az előző igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS, azzal jellemezve, hogy a (c) szekvencia egy IgG típusú humán antitest nehéz láncának konstans régióját kódolja.

11. Az 1 - 10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-t tartalmazó expressziós vektor.

12. pK chim plazmid.

13. p chim plazmid.

14. Eljárás az 1 - 10. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a kívánt antitestet kiválasztó hibridóma-sejtvonalból poliA⁺-mRNS-t izolálunk, ehhez alkalmas vektorokban cDNS-könyvtárat készítünk, és az antitest konstans részét kódoló DNS-sel komplementer oligonukleotidokkal végzett hibridizálással kiválasztjuk azokat a kiónokat, amelyek az antitest-láncokat kódoló cDNS-t tartalmazzák, in·« ·

15. A 14.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy egér- vagy patkány-hibridóma-sejtvonalat használunk.

16. A 15.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan egér-hibridóma-sejtét használunk, amely egy, az interleukin-2-receptor elleni antitestet választ ki.

17. A 14., 15. vagy 16.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy 15 - 20 bázispár hosszúságú, nem humán eredetű antitest intronszekvenciát viszünk be.

18. A 14 - 17.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nem humán eredetű genomiális DNS-szekvenciában autentikusan következő intron egy részét visszük be.

19. A 14 - 18.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy splice-donor helyként a GT nukleotidszekvenciát visszük be.

20. A 14 - 19.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan humán intron-DNS-t használunk, amely egy brach-site-ot tartalmaz.

• ···« · · * · ··· ···· V ·» ·ν ·

21. A 14 - 20.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a végül kapott DNS-szekvencia 5'-végéhez egy olyan promoterszekvenciát toldunk, illetve egy olyan vektorba való bejuttatás manipulációját hajtjuk végre, amely alkalmas helyzetben egy promotert tartalmaz.

22. A 21.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy promoterként a citomegalia-vírus-genomot használjuk.

23. A 14 - 22.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy olyan humán genomiális DNS-szekvenciát használunk, amely egy IgG típusú antitest nehéz láncának konstans régióját kódolja.

24. Eljárás expressziós vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy idegen gén kifejezésére alkalmas vektorba egy, a 14 - 23.igénypontok bármelyike szerint előállított, az 1 - 10.igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-t inszertálunk.

25. Eljárás olyan kiméra antitest előállítására, amelynek változó régiói nem humán eredetűek, konstans régiói viszont humán eredetűek, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas gazdasejtbe egy olyan expressziós vektort, amely egy a 14 - 23.igénypontok bármelyike szerint előállított, az 1 - 10.igénypontok bármelyike szerinti olyan rekombináns DNS-t tartalmaz, mely az antitest könnyű láncát kódolja, és egy másik olyan expressziós vektort viszünk be, amely egy a 14 - 23.igénypontok bármelyike szerint előállított, az 1 - 10.igénypontok bármelyike szerinti olyan rekombináns DNS-t tartalmaz, mely az antitest nehéz láncát kódolja, izoláljuk a stabil transzformánsokat, és az antitestet ismert módszerek szerint kinyerjük a sejttenyészet felülúszójából.

···» *

Λ» ·· ·

W · « • · · ·♦·· ···· · ·» «· «

26. A 25.igénypont szerinti eljárás kiméra antitestek előállítására, azzal jellemezve, hogy gazdasejtekként Non-producer-hibridómasejteket használunk.

27. A 25.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 8923) sejtvonalat használjuk.

- 27 nen izoláljuk a V-, J- és adott esetben D-szekvenciákat, amennyiben irányított mutagenezíssel a mindenkori J-doménhez a transzkripció irányába haladva egy splice-donor helyet, egy nem humán eredetű antitest-intronszekvencía egy részét és egy restrikciós hasítási helyet viszünk be, és a megfelelő restrikciós enzimmel végzett emésztéssel elválasztjuk a konstans régiót kódoló szekvenciáktól, majd a kapott DNS-t egy olyan genomiális DNS-szekvenciával ligáljuk, amely egy humán antitest könnyű vagy nehéz láncának konstans régióját kódolja, és 5'-végén egy megfelelő humán intron-szekvencia egy részét tartalmazza.

28. A 25 - 27.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejtbe a pK chim. és p ^chim.

vektorokat visszük be.

29. A 25 - 28.igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektorokat elektroporációval visszük be.

30 . MÁK 179 kiméra antitest. 31 . MÁK 215 kiméra antitest. 32 . MÁK 447 kiméra antitest.