HUT54704A - Process for producing 2'-desoxi-2'-fluoro-ribonucleosides of anti-viral effect and pharmaceutical preparatives containing them as active substance - Google Patents

Description

A találmány tárgya ezen vegyületeket tartalmazó antivirális hatású gyógyszerkészítmények, valamint eljárás a vegyületek és készítmények előállítására.

A találmány tárgya továbbá ismert 2'-dezoxi-2'-fluor-ribonukleozidokat tartalmazó inluenza-elleni hatású gyógyszerkészítmény, illetve eljárás ennek előállítására.

VW30

KÉPVISELŐ:

DANUBIA SZABADALMI ÉS

VÉDJEGY IRODA KFT

BUDAPEST

KÖZZÉTÉTELI λ

PÉLDÁNY V

547 04 -

előállítására

THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED, London, Nagy-Britannia Feltalálók:

TISDALE Silvia Margaret, Beckenham, Kent, Nagy-Britannia

TUTTLE Joel Van^Durham, North Carolina, USA

SLATER Martin John^Beckenham, Kent, Nagy-Britannia

DALUGE Susan Mary, Chapel Hill, North Carolina, USA

MILLER Wayne Howard^Apex, North Carolina, USA

KRENITSKY Thomas Anthony, Chapel Hill, North Carolina, USA

KOSZALKA George Walter, Chapel Hill, North Carolina, USA

A bejelentés napja: 1990. 09. 10.

Elsőbbsége:

1989. 09. 11. (8920534-8) Nagy-Britannia

70800-881-TEl/KmO

A találmány tárgya eljárás fertőzések ellen ható kémiai vegyületek és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, különösen parazita és vírus megbetegedések kezelésére alkalmas készítmények előállítására. A találmány közelebbről a 2'-dezoxi-2’-fluor-ribonukleozidok, ezek származékai, valamint ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik.

A vírusellenes kemoterápia terén kevés olyan gyógyszer létezik, amely magát a vírust győzné le, ez annak a következménye, hogy nehézségekbe ütközik a vírus megtámadása, és a gazdasejtek egyidejű károsodásának elkerülése. Az utóbbi időben megállapították, hogy a vírus életciklusának bizonyos szakaszai, amelyek fajról fajra változóak, magára a vírusra jellemzőek. Azonban a vírus és a gazdasejt funkcióinak nagymértékű hasonlósága következtében a hatékony kezelés nehézségekbe ütközik.

A vírus patogéneknek egy olyan csoportja, amely az embert már ősidőktől fogva megtámadja, és amely a századok során az emberek millióinak haláláért felelős, az influenza vírusokat foglalja magában. Ezek a vírusok, különösen az influenza A és B vírus napjainkban is világszerte a legfőbb okozói az akut légzőszervi megbetegedéseknek.

Az influenza vírusok a negatív szálú Orthomyxoviridae vírusok családjának tagjai. Egy másik, ugyancsak az egészséget jelentősen károsító negatív szálú vírus a légzőszervi syncytiális vírus (RSV), amely egy a Paramyxoviridae családba tartozó pneumovírus nemzetség. Az RSV a legfőbb oki tényező a csecse mőkorban és gyermekkorban előforduló alsó légúti betegségek esetén.

Vírus és parazita fertőzések kezelésére korábban fluorozott nukleozidokat javasoltak. Például a 287 313 számú európai szabadalmi leírásban a 2'-helyzetben fluoratommal helyettesített 2',3’-didezoxinukleozidokat ismertetnek, és humán immunhiány vírus kezelésére javasolják. A 0 219 829 számú európai szabadalmi leírásban 2'-dezoxi-2'-fluor-B-D-arabinofuranozilnukleozidokat javasolnak antiparazita szerekként, különösen Leischmania-fertőzés ellen. Uesugi és mtsai [(Nucleosides and Nucleotides 2, 373, 1983) és Ikehara és mtsai., (Chem. Pharm. Bull. 29, 1034, 1981)] bizonyos 2'-fluor-2'-dezoxiribonukleozidok előállítási eljárását ismertetik.

Arra a felismerésre jutottunk, hogy az (I) általános képletű vegyületek és gyógyászati célra alkalmas sóik fertőzések ellen ható szerek, különösen hatásosak vírusok ellen. Például az (I) általános képletű vegyületek hatékonyak influenzavírusokkal, különösen influenza A és B vírussal, továbbá RSV fertőzésekkel, valamint bizonyos protozoákkal szemben, például hatásosak Trichomonas vaginalis és Giardia lamblia ellen.

Az (I) általános képletben

Y jelentése hidrogénatom vagy -NH₂;

X jelentése -NR³R⁴ csoport, ahol R³ és R⁴ azonos vagy különböző, jelentésük hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, 2-6 szénatomos alkenilcsoport, 3-7 szénatomos cikloalkilcsoport, az előbbi csoportok mindegyike adott esetben egy vagy több halogénatommal helyettesített lehet, vagy X jelentése -Z-R⁵ csoport, ahol Z jelentése oxigénvagy kénatom és R⁵ jelentése az R³-ra megadott, vagy X jelentése halogénatom vagy hidrogénatom; és

R¹ és R² azonos vagy különböző, jelentésük hidroxilcsoport, -OCOR⁶H csoport, ahol R⁶ jelentése kétértékű csoport, amely lehet egyenes vagy elágazó láncú 1-6 szénatomos alkiléncsoport, 2-6 szénatomos alkeniléncsoport vagy 3-7 szénatomos cikloalkiléncsoport, az előbbi csoportok mindegyike adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesített lehet;

-OCO2R⁷H csoport, ahol R⁷ jelentése kovalens kötés, vagy az R⁶ csoportra megadott jelentések valamelyike,

-OCOR⁶-COOR⁸ csoport, ahol R⁶ jelentése az előzőekben megadott, R⁸ jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy 1-6 szénatomos alkenilesöpört, amely csoportok mindegyike adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesített lehet;

-OCOR⁷-Z-Ar csoport, ahol R⁷ jelentése az előzőekben megadott, Z jelentése kovalens kötés vagy oxigénatom és Ar jelentése aromás gyűrű, például monociklusos arilcsoport (például fenilcsoport) vagy heteroarilcsoport (például piridin), amely csoportok adott esetben egy vagy több halogénatommal, 1-6 szénatomos alkilcsoporttal vagy 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesítettek;

-OR⁶H csoport, ahol R⁶ jelentése az előzőekben megadott;

- OR⁶-Z-Ar csoport, ahol R⁶, Z és Ar jelentése az előzőekben megadott

-0C0CHR⁹NR¹⁰R^1:L csoport, ahol R¹⁰ és R¹¹ jelentése az előzőekben R⁸ helyettesítőre megadott, és

R⁹ jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú 1-4 szénatomos, adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal, merkaptocsoporttal, 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal vagy 1-3 szénatomos alkiltio-csoporttal helyettesített alkilcsoport,

-R¹²-A csoport, ahol R¹² jelentése adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkiléncsoport és A jelentése -COOH, -CONH₂, -NH₂ vagy -NH-C(NH)NH₂ csoport, vagy A jelentése 4- 11-tagú aromás vagy nem-aromás gyűrűs vagy heterogyűrűs rendszer, amely

3-10 szénatomot és 0, 1, 2 vagy 3 gyűrű-nitrogénatomot tartalmaz, a gyűrű szénatomok és/vagy nitrogénatomok adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesítettek lehetnek,

-OCO-R¹³ csoport, ahol R¹³ jelentése 4- 7-tagú heterogyűrűs csoport, amely 3-6 szénatomot és 0, 1 vagy 2 nitrogénatomot tartalmaz, és a gyűrű-szénatomok és/vagy -nitrogénatomok adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesítettek lehetnek, vagy

-mono-, di- vagy trifoszfát-észtercsoport.

A találmány tárgya a fenti (I) általános képletű vegyületek, sóik, valamint ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítása is. Az -OCOCHR⁹NR¹⁰R¹¹ és -OCO-R¹³ képlettel jellemezhető észtercsoportok közül előnyösek azok a természetes előfordulású α-aminosavak, amelyek a fenti deffinícióba foglalhatók. Különösen előnyös -OCOCHR^NRÍOr¹¹ észtercsoportok azok, amelyekben R⁹ jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport, és R¹⁰ és R¹¹ jelentése hidrogénatom, például a valin vagy az' alanin.

Megjegyezzük, hogy az (I) általános képletű vegyületek különféle tautomer formákban létezhetnek, és ha X jelentése

hidroxilcsoport, ez	előfordulhat oxocsoport formában is.	Az
(I) általános képletű	vegyületek	és	sóik	létezhetnek a-	vagy	B-
anomer formákban. A	találmány	oltalmi	körébe ezért	az	(I)

általános képletű vegyületeknek mind az α-, mind a B-anomerjei, valamint ezek elegyei is beletartoznak.

Az (I) általános képletű vegyületeket és gyógyászati célra alkalmas sóikat a továbbiakban a találmány szerinti vegyületeknek nevezzük. Hatóanyag megjelölésen - ha a szövegösszefüggés mást nem kíván - a találmány szerinti vegyületeket értjük.

A hatóanyagok influenza A és B vírusok elleni aktivitása nem volt ismert, így a találmány tárgyát képezi az (I) általános képletű vegyületeket vagy gyógyászati célra alkalmas sóikat tartalmazó gyógyászati készítmények, különösen influenza A vagy B vírusoknak emlősökben és emberben való szaporodását gátló gyógyászati készítmények előállítása. A találmány szerint a hatóanyagot és egy szilárd hordozóanyagot tartalmazó szilárd készítményeket vagy a hatóanyagot és belélegezhető folyékony hordozóanyagot tartalmazó belélegezhető készítményeket állítunk elő.

A találmány szerint előállított készítmények vírusfertőzések, különösen influenzavírus vagy RSV fertőzések vagy protozoa fertőzések, például Trichomonas vaginalis vagy Giardia lamblia gazdaszervezetben, például emlősben, beleértve az embert és az egeret, való kezelésére vagy megelőzésére alkalmasak. A kezelést vagy megelőzést a találmány szerint előállított vegyület hatásos, nemtoxikus mennyiségét tartalmazó dózissal végezzük.

Az (I) általános képletű vegyületek és sóik egy része új, ezen új vegyületek és sóik előállítása ugyancsak a találmány tárgyát képezi. Az előzőekben ismertetett (I) általános képletű vegyületek újak, kivéve azokat, amelyekben R¹ és R² mindegyike hidroxilcsoport vagy R¹ jelentése mono-, di- vagy trifoszfát 5'-észter és R² jelentése hidroxilcsoport vagy R¹ jelentése hidroxilcsoport és R² mono-, di- vagy trifoszfát-3'-észter és vagy a) X jelentése hidroxilcsoport és Y jelentése aminocsoport vagy hidrogénatom, vagy b) X jelentése aminocsoport és Y jelentése hidrogénatom.

A találmány szerint előnyösek azok a vegyületek, amelyekben r1 é_s r2 mindegyike hidroxilcsoport, vagy R¹ jelentése monofoszfát és R² jelentése hidroxilcsoport, Y jelentése hidrogénatom vagy aminocsoport és X jelentése -NR³R⁴, ahol R³ és R⁴ azonos vagy különböző, jelentésük hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, vagy X jelentése -Z-R⁵, ahol z jelentése oxigén- vagy kénatom és R⁵ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, vagy X jelentése halogénatom vagy hidrogénatom.

Különösen előnyösek azok az (I) általános képletű vegyületek, amelyekben R¹ és R² mindegyike hidroxilcsoport, Y jelentése aminocsoport és X jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport, aminocsoport vagy -Z-R⁵, ahol Z jelentése oxigénatom és R⁵ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport.

A következőkben az (I) általános képletű vegyületek néhány előnyös képviselőjét mutatjuk be:

(1) 2,6-diamino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin, (2) 2-amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin, (3) 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin, (4) 2-amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-6-metoxi-9H-purin.

Az új (I) általános képletű vegyületek és gyógyászati célra alkalmas sóik előállítására a találmány szerint úgy járunk el, hogy (A) egy (Pu)H általános képletű purin bázist - a képletben X és Y jelentése az előzőekben megadott - vagy sóját egy (II) általános képletű vegyülettel reagáltatunk - a képletben R¹ és R² jelentése az előzőekben megadott, W jelentése egy foszfát-észter vagy sója, vagy egy, a fenti (Pu) egységtől eltérő purin vagy pirimidin egység, vagy (B) egy (III) általános képletű vegyületet - ahol X^a, Y^a, R^la és R^2a jelentése az X, Y, R¹ és R² helyettesítőkre megadott jelentések valamelyike vagy ezen csoportok prekurzora, például az ilyen csoportok védett formája, azzal a megkötéssel, hogy X, Y, R¹ és R² közül legalább egy prekurzor formában van jelen - a prekurzor csoportot vagy csoportokat a kívánt csoporttá vagy csoportokká átalakítani képes reagenssel reagáltatunk, és kívánt esetben

i) egy olyan (I) általános képletű vegyületet, amelyben R¹ és R² helyettesítők közül legalább az egyik hidroxilcsoport, egy megfelelő, a hidroxilcsoportot R¹ és/vagy R² jelentésében álló más csoporttá alakítani képes reagenssel reagáltatunk, vagy

ü) egy olyan (I) általános képletű vegyületet, amelyben R¹ és/vagy R² jelentése hidroxilcsoporttól eltérő, olyan reagenssel reagáltatunk, amely az R¹ és/vagy R² helyén álló csoportokat hidroxilcsoporttá alakítja.

Az (A) eljárás, amely különösen alkalmas az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyekben R¹ és R² mindegyike hidroxilcsoport és Y jelentése hidrogénatom vagy aminocsoport, végrehajtható enzimesen, (Pu)H általános képletű purin bázisnak - X és Y jelentése az előzőekben megadott - vagy sójának egy (II) általános képletű vegyülettel - a képletben R¹ és R² jelentése az előzőekben megadott, W jelentése foszfát-észter vagy sója, vagy egy a (PU) egységtől eltérő purin vagy pirimidin egység - legalább egy foszforiláz enzim, például purin-nukleozid-foszforiláz és timidin-foszforiláz és egy szervetlen foszfát vagy sója vagy egy transzferáz enzim, például N-dezoxiribozil-transzferáz jelenlétében való reagáltatásával. A reakció szempontjából előnyös, ha a purin vagy pirimidin egység B-helyzetű, és a foszfát-észter vagy sója a-helyzetű.

A megfelelő (PuH) általános képletű purin bázisok kereskedelmi forgalomban, például a Pacific Chemical Laboratories vagy a Sigma Chemical Company-tól beszerezhetők, vagy szakember számára ismert módon, vagy a kémiai irodalomból könnyen megtalálható

- 10 eljárással előállíthatók. Például azok a purin bázisok, amelyeknek 2-helyzetű helyettesítőjük aminocsoport vagy hidrogénatom és

6-helyzetű helyettesítőjük aminocsoport vagy metil-tio-csoport, kereskedelmi forgalomban beszerezhetők. Azok a purin-bázisok, amelyeknek 2-helyzetű helyettesítőjük aminocsoport és 6-helyzetű helyettesítőjük metil-amino-csoport, előállíthatók Montgomery és Holum [J.A.C.S. 80. 404, 1958] eljárásával. Azok a purinok, amelyekben a 2-helyzetű helyettesítő aminocsoport és a 6-helyzetű helyettesítő alkoxicsoport, például metoxicsoport, Balsiger és Montgomery eljárásával [J. Org. Chem. 20. 1573 (1960)] állíthatók elő.

A (II) általános képletű vegyületek szakember számára jól ismert, vagy a kémiai irodalomban könnyen hozzáférhető eljárásokkal állíthatók elő. Például az 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracil előállítható Codington és mtsai. [J. Org. Chem. 29, 558, (1964)] eljárásával. A 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin előállítható S. Uesugi és mtsai., [Nucleosides and Nucleotides 2, 373 (1983)] eljárásával.

A (B) eljárásban, amely különösen az (I) általános képletű vegyületeknek olyan (III) általános képletű vegyűletekből való előállítására alkalmasak, amelyekben R^la és R^2a mindegyike hidroxilcsoport, a (III) általános képletű vegyület védett X^a, Y^a, R^^a és R^2a csoportjai szokásos hidroxil- és amino-védőcsoportokkal védettek lehetnek, alkalmasak például az acilcsoportok, például az alkanoilcsoport, így az acetilcsoport, az aroilcsoportok, így a benzoilcsoport, az aralkilcsoportok, így a benzilcsoport; a trialkil-szilil-csoportok, például a terc-butil-di11

metil-szilil-csoport. Az adott esetben konkrétan alkalmazott védőcsoport függ a védendő csoport természetétől.

A későbbiekben a védőcsoport savas vagy lúgos hidrolízissel, hidrogenolízissei vagy enzimesen eltávolítható. Az acilcsoportokat jellemzően lúgos hidrolízissel, a szililcsoportokat savas hidrolízissel vagy fluoridionnal távolítsuk el. Az aralkilcsoportok, például a benzilcsoport, előnyösen távolíthatók el katalitikus hidrogenolízissel, jellemzően katalizátor, például szénhordozós palládiumkatalizátor jelenlétében, vagy redukálással, például alkálifémmel, így nátriummal megfelelő oldószerben, például folyékony ammóniában. Azt találtuk, hogy a benzil védőcsoport alkalmazása különösen előnyös az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása során, amelyekben X jelentése hidroxilcsoport vagy aminocsoport.

Az olyan (I) általános képletű vegyületek (B) eljárás szerinti előállítása során, amelyekben R¹ és/vagy R² jelentése -OCOCHR⁹NR¹⁰R¹¹ általános képletű csoport, az R^la és/vagy R^2a csoportok védhetők például 9-fluorenil-metil-oxi-karbonil-csoporttal (FMOC), terc-butil-oxi-karbonil-csoporttal (tBOC) vagy benzil-oxi-karbonil-csoporttal (CBZ), és a védőcsoport ismert módon való eltávolítása után a -CHR^NR^Or¹¹ aminosav nyerhető.

A (III) általános képletű kiindulási anyagok célszerűen a megfelelő (IV) általános képletű purin-bázisból vagy sójából állíthatók elő - a képletben X^a és Y^a jelentése az előzőekben megadott - olyan pirimidin-nukleoziddal való reagáltatással, amely a megfelelő cukor maradékot tartalmazza, például l-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt tartalmaz. A reagálta• · • · · · · «· ·««*·« 4

- 12 tást egy vagy több foszforiláz enzim, például purin-nukleozid-foszforiláz és timidin-foszforiláz vagy egy transzferáz enzim, például N-dezoxiribozil-transzferáz jelenlétében végezzük.

Más módon a (III) általános képletű kiindulási anyagok kémiai úton előállíthatók a (IV) általános képletű vegyületek - a képletben X^a és Y^a jelentése az előzőekben megadott - vagy szililezett származéka vagy sója egy (II) általános képletű vegyülettel - a képletben R¹ és R² jelentése az előzőekben megadott vagy hidroxilcsoportnak más védett formái és W jelentése kilépő csoport, például halogénatom, így klóratom, acil-oxi-csoport, így acetoxicsoport, alkoxicsoport, így metoxicsoport - katalizátor, például ón(IV)-klorid vagy trimetil-szilil-triflát jelenlétében megfelelő oldószerben, például acetonitrilben való reagáltatásával.

A (IV) általános képletű purinbázisok az olyan megfelelő purinbázisokból állíthatók elő, amelyek 6-helyzetű helyettesítője megfelelő kilépőcsoport, például halogénatom, így klóratom, az említett csoport nukleofil kicserélődése révén. így az olyan (IV) általános képletű purin bázis, amelyben X^a jelentése benzil-oxi-csoport, előállítható például a megfelelő 6-klór-purinnak egy alkohollal, például benzil-alkohollal egy bázis, például nátrium-hidrid jelenlétében, megfelelő oldószerben, például tetrahidrofuránban való reagáltatásával. Az olyan (IV) általános képletű purin-bázis, amelyben R^a jelentése benzil-amino-csoport, előállítható a megfelelő 6-klór-purinnak egy aminnal, például benzil-aminnal bázis, például egy amin, így trietil-amin jelenlétében, megfelelő oldószerben, például metanolban való reagáltatásával. Az ilyen, kiindulási anyagul alkalmazott purin-bázisok • · · ·

- 13 kereskedelmi forgalomban beszerezhetők (Aldrich Chemical Company) vagy szakember számára ismert, vagy a kémiai szakirodalomban könnyen hozzáférhető eljárásokkal előállíthatók.

A (III) általános képletű vegyületek előállítására szolgáló pirimidin-nukleozidok szakember számára ismert, vagy a kémiai szakirodalomban könnyen hozzáférhető eljárásokkal állíthatók elő. Például az l-(2-dezoxi-2-fluor-fi-D-ribofuranozil)-pirimidinek, így az 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracil előállíthatók Codington és mtsai., [J. Org. Chem. 29: 558 (1964)] eljárásával.

Megjegyezzük, hogy a (III) általános képletű vegyületek jelenthetnek egy találmány szerinti vegyületet, például X^a jelentése lehet -NR³R⁴, ahol R³ és R⁴ jelentése az előzőekben megadott. Az ilyen vegyületek dezamináz enzimmel kezelhetők, például adenozin-dezaminázzal, és így olyan (I) általános képletű vegyületté alakíthatók, amelyben X jelentése hidroxilesöpört.

Egy olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben R¹ és/vagy R² mindegyike hidroxilcsoport, átalakítható a megfelelő, az előzőekben megadott gyógyászati szempontból elfogadható észterekké megfelelő észterezőszerrel ismert módon reagáltatva, például Martin és mtsai., [J. Pharm. Sci. 76, 180 (1987)] eljárása szerint. így a megfelelő karbonsav-észterek előállítására az R¹ és/vagy R² helyén hidroxilcsoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyület reagáltatható savanhidriddel vagy sav-halogeniddel, például olyan QCOOH általános képletű karbonsavnak megfelelő kloriddal, amelyben Q jelentése -R⁶H, -OR⁷H, -R⁶COOOR⁸, -R⁷-Z-Ar, -CHR⁹NR1°r11 vagy -R¹³, ahol R⁶, R⁷, R⁸, R⁹, RÍ0, Rⁿ, R¹³, Z és Ar jelentése az előzőekben megadott, megfelelő bázis, ·♦ ·» · • » 4· • * *4 • · · V 4 » ♦ • · «·· ·4 például trietil-amin jelenlétében. Más eljárás szerint a QCOOH általános képletű sav reagáltatható az R¹ és/vagy R² helyén hidroxilcsoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyülettel kapcsolószer, például diciklohexil-karbodiimid jelenlétében is.

A fenti olyan (II) általános képletű kiindulási anyagok, amelyekben R¹ és/vagy R² jelentése hidroxilcsoport, reagáltathatók egy észterezőszerrel, és a kapott vegyület reagáltatható az (A) eljárás szerint a (Pu)H általános képletű purin-bázissal.

Azok a találmány szerinti vegyületek, amelyekben R¹ és/vagy R² jelentése mono-, di- vagy trifoszfát-észter, előállíthatok az olyan (I) általános képletű vegyületből, amelyben R¹ és/vagy R² jelentése hidroxilcsoport, a mono-, di- és trifoszfát-származékokon át haladó fokozatos foszforilezés útján szokásos kémiai eljárással vagy enzimes eljárással, például nukleozid-kináz vagy foszfotranszferáz alkalmazásával nukleotid-trifoszfát, például ATP jelenlétében.

Az olyan (I) általános képletű vegyületek, amelyekben R¹ és/vagy R² jelentése hidroxilcsoport, a megfelelő, gyógyászati célra alkalmas éterszármazékokká alakíthatók, amelyeket az előzőekben ismertettünk, oly módon, hogy az R¹ és/vagy R² helyén hidroxilcsoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületet ismert módon megfelelő alkilezőszerrel reagáltatjuk, például Q¹Hal általános képletű vegyülettel, ahol Q¹ jelentése -R⁶H vagy -R⁶-Z-Ar, ahol R⁶ és Ar jelentése az előzőekben megadott, Hal jelentése halogénatom, például jódatom.

Más megoldás szerint az ilyen alkilezőszerek reagáltathatók egy (V) általános képletű cukorral - a képletben V jelentése «

»· · » <y * · · ···· • · ··«· ·

-15alkoxicsoport, például metoxicsoport vagy acil-oxi-csoport, például acetoxicsoport -; így a megfelelő 3'-, 5'- vagy 3',5'-diétert nyerjük [Bessodes. M. és mtsai., Synthesis (1988) 560], ezt az étert a megfelelő (Pu)H általános képletű purin-bázissal kondenzálhatva egy nukleozidot állítunk elő, amelyről a védőcsoportokat az előzőekben ismertetett (B) eljárás szerint távolítsuk el.

Ha a fenti eljárás első lépésében kapott termék egy monoéter, például egy 5'-éter, a másik hldroxilcsoport reagáltatható egy karbonsavval vagy származékával, például savanhidriddel vagy sav-halogeniddel, például egy QCOOH általános képletnek megfelelő karbonsav kloridjával, ahol Q jelentése az előzőekben megadott, így a cukor mono-éter-mono-észterét nyerjük, például egy 3'-észter-5’-éter-cukrot. Ezt a cukrot az előzőekben említett módon vagy Codington J.F. és mtsai [Carbohyd. Rés. (1966) 1,455] eljárásával a megfelelő purinnal reagáltatva egy nukleozidot nyerünk.

A találmány szerinti vegyületek előállíthatok az (I¹) általános képletű vegyületekből is, ahol az (I') általános képletű vegyület megfelel az olyan (I) általános képletű vegyületnek, amelyben R¹ és R² helyén eltérő védőcsoportok állnak. Ezek az eltérő védőcsoportok távolíthatók el vagy reagáltathatók úgy, hogy az előzőekben meghatározott RÍ és R² csoportokat nyerjük.

Az előzőek szerint előállított vegyületek az éter és/vagy észter védőcsoportok eltávolításával olyan találmány szerinti vegyületekké alakíthatók, amelyekben R¹ és/vagy R² jelentése hidroxilcsoport.

»»· ·· ·· *ν « ·♦· · ♦ ·4 • 44'444

- 16 A reakció körülményeitől és a kiindulási anyagoktól függően az (I) általános képletű végterméket szabad bázis vagy só formájában nyerjük. Mind a szabad bázis, mind a só előállítása a találmány oltalmi körébe tartozik. Előállíthatunk bázikus, semleges vagy vegyes sókat, továbbá hemi-, mono-, szeszkvi- vagy polihidrátokat. Az új vegyületek savaddíciós sói ismert módon alakíthatók szabad bázissá bázikus szerek, például lúgok vagy ioncserélő gyanta alkalmazásával. A kapott szabad bázisok szerves vagy szervetlen savakkal alakíthatók sókká.

A találmány szerint előállított vegyületek sói közül terápiás célra alkalmasak a gyógyászati célra alkalmas bázikus sók, például megfelelő bázisokkal, így alkálifémekkel, például nátriummal, alkáliföldfémekkel, például magnéziummal alkotott sók, ammónium- és NX₄-sók, ahol X jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport.

Az alábbi köztitermékek új vegyületek:

2-amino-6-benzil-amino-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9Hpurin,

2-amino-6-benzil-oxi-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9Hpurin és

2-amino-6-benzil-tio-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9Hpurin.

A találmány szerint előállított vegyületek a kezelendő lénynek, például emlősöknek, köztük embernek a kezelendő állapotnak megfelelő úton adagolhatók, ilyen megfelelő adagolási utak az orális, pulmonális, rektális, nazális, helyi (közte szájüregi és nyelv alatti), hüvelyi és parenterális (közte szubkután, ·· * • 9

- 17 intramuszkuláris, intravénás, intradermális, intrathekális és epidurális) adagolás. Megjegyezzük, hogy az előnyös adagolási út változó a kezelendő lény állapotától függően.

Egy adott hatóanyagnak a vírusfertőzés, közte influenza és RSV fertőzés kezelésére szükséges mennyisége számos tényezőtől függően változó, ezek közé tartoznak a kezelendő állapot súlyossága és a kezelendő lény, az adagolandó mennyiség meghatározása a kezelő orvos feladata. Általában megfelelő hatékony dózis a 0,1 100 mg/testtömeg kg/nap, előnyösen 5-30 mg/testtömeg kg/nap, még előnyösebben 10 - 20 mg/testtömeg kg/nap, legelőnyösebben mintegy 15 mg/testtömeg kg/nap (ha más megjelölés nem szerepel, a hatóanyag mennyiségét mindig az alapvegyületre számítva adjuk meg, sók és észterek esetén ezeket az értékeket arányosan növelni kell). A napi hatásos dózis adott esetben két, három, négy vagy több aldózis formájában adható be a nap folyamán megfelelő időközökben. Ezek az áldozisok adagolhatok egységdózisok formájában, például 1 - 2000 mg, előnyösen 20 - 500 mg, még előnyösebben 100 - 400 mg hatóanyagot tartalmazó egységdózis formájában.

A találmány szerinti vegyületek adagolhatok önmagukban vagy más terápiás szerekkel kombinálva, például amantidinnel vagy ribavirinnel kombinálva, amelyek ismert influenza-ellenes szerek; vagy analgetikummal, például kodeinnel, paracetamollal, aszpirinnel vagy ibuprofénnél kombinálva, továbbá gyulladásgátló szerekkel, például indometacinnal, mefenaminsavval, naproxennel vagy ibuprofénnél kombinálva, vagy bármely olyan hatóanyaggal kombinálva, amellyel alkotott kombináció a terápiás hatás szempontjából jótékony eredményű.

··· >

*· · • · · • · * ···· ···· ·

Bár a találmány szerinti vegyületek önmagukban is adagolhatok, előnyös, ha gyógyászati készítmények formájában adagoljuk. Ezek a készítmények legalább egy az előzőekben megnevezett hatóanyagot és egy vagy több gyógyászati célra alkalmas hordozóanyagot és adott esetben további terápiás összetevőket tartalmaznak. A hatóanyagnak elfogadhatónak kell lenni olyan értelemben, hogy a készítmény többi Összetevőjével kompatibilis legyen, és ne legyen káros a kezelendő lényre.

A találmány szerint előállított készítmények felölelik az orális, pulmonális, rektális, nazális, helyi (beleértve a szájüregi és nyelvalatti), hüvelyi vagy parenterális (beleértve a szubkután, intramuszkuláris, intravénás, intradermális, intrathekális és epidurális) kezelésre alkalmas készítményeket. A készítmények célszerűen egységdózisok formájában állíthatók elő, és elkészíthetők a gyógyszerkészítésben szokásos bármely ismert eljárással. Az ilyen eljárások közé tartozik például a hatóanyagnak a hordozóanyaggal - amely egy vagy több segédanyag összetételéből áll - való összekeverése. Általában a készítményeket a hatóanyagnak folyékony vagy finom eloszlású szilárd hordozóanyaggal vagy mindkettővel való egyeneletes és alapos elegyítésével végezzük, és kívánt esetben a terméket formáljuk. A találmány szerint előállított, orális adagolásra szolgáló készítmények lehetnek elkülönített egységek, például kapszulák, ostyás kapszulák vagy tabletták, amelyek mindegyike a hatóanyag előre meghatározott mennyiségét tartalmazza; lehetnek porok vagy granulumok, továbbá vizes vagy nemvizes folyadékban készült oldatok vagy szuszpenziók, olaj-a-vízben típusú vagy víz-az-olajban típusú folyé19 ·· ··· t · ·· ·

• · · • « • ···· ···· · kony emulziók. A hatóanyag formálható nagy pirulákká, pépekké is vagy lehet liposzómákba zárt formákban.

A tabletták készíthetők préseléssel vagy öntéssel, adott esetben egy vagy több segédanyag alkalmazásával. A préselt tabletták előállíthatok a hatóanyag szabadon folyó formájának, például porának vagy granulumának adott esetben egy kötőanyaggal (például povidonnal, zselatinnal vagy hidroxi-propil-metil-cellulózzal), csúszást elősegítő anyaggal, inért hígítóanyaggal, tartósítószerrel, szétesést elősegítő szerrel, (például nátriumkemény ítő-glikoláttal, keresztkötéses povidonnal, keresztkötéses nátrium-karboxi-metil-cellulózzal); felületaktív szerrel vagy diszpergálószerrel elegyített állapotában megfelelő gépen való préseléssel. Az öntött tabletták a porított hatóanyag inért folyékony hígítóanyaggal megnedvesített állapotban, megfelelő gépen való öntésével állíthatók elő. A tabletták adott esetben bevonattal láthatók el vagy bevésettek lehetnek, és formálhatók oly módon, hogy a hatóanyag lassan vagy szabályozottan szabaduljon fel belőlük, például a kívánt felszabadulási profil biztosítására különböző arányú hidroxi-propil-metil-cellulóz alkalmazható.

Kapszula készíthető a laza vagy préselt pornak megfelelő töltőgépen, adott esetben egy vagy több adalékkal együtt történő betöltésével. Ilyen megfelelő adalékok például a kötőanyagok, így a povidon és a zselatin; a csúszást elősegítő anyagok, az inért hígítószerek és a szétesést elősegítő szerek, mint a tablettáknál.

A kapszulák oly módon is formálhatók, hogy pelleteket vagy külön alegységeket tartalmazzanak, ezzel a hatóanyag lassú vagy szabályozott felszabadulását biztosítsák. Ez elérhető oly módon, hogy a hatóanyag és egy extrudáló segédanyag, például mikrokristályos cellulóz, továbbá egy hígítóanyag, például laktóz nedves elegyét extrudáljuk vagy gömbökké formáljuk. Az így kapott gömbök szemipermeábilis membránnal, például etil-cellulózzal, Eudragit WE30D-val vonhatók be, hogy nyújtott felszabadulással bírjanak.

Helyi adagolásra a találmány szerint előnyösen olyan kenőcsöket vagy krémeket állítunk elő, amelyek a hatóanyagot például 0,075 - 20 tömeg %, előnyösen 0,2 - 15 tömeg %, még előnyösebben 0,5 - 10 tömeg % mennyiségben tartalmazzák. Kenőcsök készítésénél a hatóanyagot használhatjuk egy paraffin vagy egy vízzel elegyedő kenőcs alappal együtt. Más megoldás szerint a hatóanyagot formálhatjuk - krémmé egy olaj-a-vízben típusú vagy egy víz-az-olajban típusú krém alap alkalmazásával.

Kívánt esetben a krém-alap vizes fázisa tartalmazhat például legalább 30 tömeg % polihidroxi-alkoholt, például olyan alkoholt, amely két vagy több hidroxilcsoportot tartalmaz, így propilénglikolt, bután-1,3-dióit, mannitot, szorbitot, glicerint és polietilénglikolt vagy ezek elegyeit. A helyi alkalmazásra szolgáló készítmények kívánt esetben tartalmazhatnak a hatóanyagnak a bőrön vagy más érintett felületen való abszorpcióját vagy áthatolását fokozó anyagokat. A bőrön való áthatolás fokozására alkalmasak például a dimetil-szulfoxid és analóg vegyületei.

A találmány szerinti emulziók olajos fázisa ismert összetevőkből, ismert módon készíthető. Míg ez a fázis állhat egyetlen emulgeálószerből, kívánatos azonban, hogy legalább egy emulgeáló • · · ·

- 21 szernek zsírral vagy olajjal vagy mindkettővel való elegyéből képezzük. Előnyösen egy hidrofil emulgeálószert egy lipofil emulgeálószerrel együtt alkalmazunk, amely utóbbi stabilizálószerként hat. Ugyancsak előnyös, ha az emulzió mind olajat, mind zsírt tartalmaz.

Az emulgeálószer (ek) egy vagy több stabilizálószerrel vagy anélkül képezik az úgynevezett emulgeáló viaszt, amely viasz az olajjal és/vagy zsírral együtt alkotja az úgynevezett emulgeáló kenőcs bázist, amely a krém készítmény olajos diszpergált fázisát alkotja.

A találmány szerinti eljárás során emulgeálószerekként és emulzió stabilizátorokként alkalmazhatunk például Tween 60-t, Span 80-t, cetosztearil-alkoholt, mirisztil-alkoholt, glicerinmonosztearátot és nátrium-lauril-szulfátot.

A készítmény előállítására alkalmas olajok vagy zsírok megválasztása a kívánt kozmetikai tulajdonságok elérésén alapszik, mivel a hatóanyag oldhatósága a legtöbb olyan olajban, amely a gyógyászati emulziós készítmények előállítására használható, igen alacsony. így a krém előnyösen egy nem-zsíros, nem-szinező, lemosható termék, amelynek megfelelő konzisztenciánja lehetővé teszi a tubusból vagy más tartóból való kifolyásának elkerülését. Egyenes vagy elágazó láncú mono- vagy dibázikus alkil-észterek, például diizoadipát, izocetil-sztearát, kókuszdió zsírsavainak propilénglikol-diésztere, izopropil-mirisztát, decil-oleát, izopropil-palmitát, butil-sztearát, 2-etil-hexil-palmitát vagy a Crodamol CAP néven ismert elágazó láncú észterek elegye alkalmazható, előnyös az utóbbi három észter. Ezek az észterek önmagukban vagy kombinációkban alkalmazhatók az elérni kívánt tulajdonságtól függően. Más megoldás szerint magas olvadáspontú lipidek, például fehér lágy paraffin és/vagy folyékony paraffin vagy más ásványi olajok alkalmazhatók.

A szem helyi kezelésére alkalmas készítmények körébe tartoznak a szemcseppek, amelyek esetén a hatóanyagot megfelelő hordozóanyagban, különösen vizes oldószerben oldjuk vagy szuszpendáljuk. A hatóanyag az ilyen készítményekben előnyösen 0,5 - 20 tömeg %, előnyösen 0,5 - 10 tömeg %, még előnyösebben 1,5 tömeg % mennyiségben van jelen. A szájban való helyi kezelésre szolgáló készítmények közé tartoznak a hatóanyagot ízesített alapanyagban, szokásosan szacharózban és akácmézgában vagy tragantgyantában tartalmazó gyógycukorkák, a hatóanyagot inért alapanyagban, például zselatinban és glicerinben, vagy szacharózban és akácmézgában tartalmazó pasztillák, valamint a hatóanyagot megfelelő folyékony hordozóanyagban tartalmazó szájvizek.

Rektális adagolásra megfelelő alapanyagban, például kókuszvajban vagy magasabb szénatomszámú zsíralkoholokban (például keményviaszban) (European Pharmacopoeia) vagy trigliceridekben és telített zsírsavakban (példái Witepsolban) kúpokat készítünk.

Nazális adagolásra alkalmasak azok a készítmények, amelyek hordozóanyaga durva por, például 20 - 500 mikron szemcseméretű por, ezeket a készítményeket szippantással, például az orron való gyors belélegzéssel adagoljuk egy az orrhoz közel tartott, a port tartalmazó tartályból. Nazális adagolásra megfelelők a folyékony hordozóanyagot tartalmazó készítmények, ezeket orrpermet vagy orrcseppek formájában alkalmazzuk, ezek a készít mények a hatóanyagot vizes vagy olajos oldatokban tartalmazzák.

Belégzéses adagolásra alkalmasak például azok a készítmények, amelyek a hatóanyagot finom por részecskék vagy ködök formájában tartalmazzák, és amelyek adagolóval ellátott, nyomás alá helyezett aeroszolok, ködösítők vagy belégző készülékek különböző típusaival hozhatók létre.

Pulmonális adagolásra szájon át jellemzően 0,5 - 10 gm, előnyösen 1 - 5 gm részecskeméretű porokat vagy cseppeket alkalmazunk, hogy biztosítsuk ezek eljutását a hörgőrendszerbe. Orron át való adagolásra előnyösen 10 - 500 gm részecskeméretet alkalmazunk, hogy az orrüregben való megmaradást biztosítsuk.

A mért dózist adagoló belégzők és nyomás alá helyezett aeroszolos adagolók a hatóanyag szuszpenzió vagy oldat formájú készítményét jellemzően cseppfolyósított hajtóanyagban tartalmazzák. Használat során a készülékekből a készítmény mért térfogatot kibocsátó szelepen át távozik, ez a térfogat jellemzően 10 - 150 gl, és a kibocsátott anyag a hatóanyagot finom permet részecskékben tartalmazza. A megfelelő hajtóanyagok közé tartoznak a propán és bután, bizonyos klór-fluorszénhidrogén-vegyületek, amelyeket szokásosan CFS vegyületek néven említenek, például a diklór-difluor-metán, a triklór-fluor-metán és a diklór-tetrafluor-etán vagy ezek elegyei. A készítmények tartalmazhatnak továbbá segéd-oldószereket, például etanolt, felületaktív szereket, például olajsav- vagy szorbitán-trioleátot, antioxidánsokat és/vagy megfelelő aromaanyagokat.

A ködösítők kereskedelmi forgalomban kapható eszközök, amelyek a hatóanyag oldatát vagy szuszpenzióját aeroszolos terá • *

- 24 piás köddé alakítják, ezt vagy egy komprimált gáznak keskeny Venturi-cső-szájadékon való gyorsulásával érik el, gázként jellemzően levegőt vagy oxigént alkalmaznak, vagy ultraszónikus keveréssel. A ködösítőkben való alkalmazásra megfelelnek azok a készítmények, amelyek a hatóanyagot folyékony hordozóanyagban tartalmazzák, a hatóanyag a készítményben legfeljebb 40 tömeg %, előnyösen legfeljeb 20 tömeg % mennyiségben van jelen. Hordozóanyagként jellemzően vizet vagy híg vizes alkoholos oldatokat alkalmazunk, amelyeket előnyösen a testfolyadékokkal izotóniássá teszünk, például nátrium-klorid adagolásával. Kívánt esetben, ha nem steril készítményeket állítunk elő, alkalmazhatunk a készítményekben tartósítószereket is, például metil-hidroxi-benzoátot, antioxidánsokat, ízesítőanyagokat, illóolajokat, pufferoló anyagokat és felületaktív szereket.

Belégzéses adagolásra megfelelő készítmények a finom eloszlású porok, amelyek bejuttathatók egy belégző készülékkel vagy bevihetők az orrüregbe szippantással. A belégző készülékbe a port kapszulában vagy hüvelyben helyezzük be, amely jellemzően zselatinból vagy műanyagból készül, és amelyet in situ aprítunk vagy nyitunk fel, és a port a belégzéskor a készüléken keresztülhajtott levegővel vagy más megoldás szerint manuálisan működtetett pumpával szállítjuk. A belélegeztető készülékben a hatóanyagot önmagában alkalmazzuk, vagy olyan porelegyként, amely a hatóanyagot és megfelelő por formájú hígítóanyagokat, például laktózt, továbbá kívánt esetben felületaktív szert tartalmaz. Az ilyen készítmények jellemzően 0,1 - 100 tömeg % hatóanyagot tartalmaznak.

A nyomás alatt álló aeroszolos, belégzésre szolgáló készítményeket előnyösen úgy készítjük el, hogy minden mért dózisuk 0,05 - 5 mg találmány szerinti vegyületet tartalmazzon. Hasonló módon a belégzésre szánt por készítményeket úgy készítjük, hogy egy dózisegység 0,5 - 50 mg hatóanyagot tartalmazzon. A ködképzésre szolgáló oldatokat vagy szuszpenziókat 1 - 1500 mg dózis szállítására alkalmas formába hozzuk. A találmány szerinti vegyületek vagy készítmények ezekkel a készülékkel naponta egyszer vagy többször adagolhatok egy vagy néhány dózisban, például 3 vagy 4 dózisban minden alkalommal.

A hüvelyi alkalmazásra szolgáló készítményeket formálhatjuk pesszáriumok, tamponok, krémek, gélek, pépek, habok vagy permetek formájában, amelyek mindegyike a hatóanyagon kívül szakember számára ismert megfelelő hordozóanyagokat tartalmaz.

A parenterális adagolásra szolgáló készítmények közé tartoznak a vizes és nemvizes steril injekciós oldatok, amelyek tartalmazhatnak antioxidánst, puffért, bakteriosztatikumot vagy olyan oldatanyagot, amely a készítményt a kezelendő lény vérével izotóniássá teszi, továbbá vizes vagy nemvizes steril szuszpenziók, amelyek tartalmazhatnak szuszpendáló- és súrítőszereket, liposzómák vagy más mikroszemcsés rendszerek, amelyek szerepe, hogy a hatóanyagot a vérkomponensekhez vagy egy vagy több szervhez eljuttassák. A találmány szerint előállított készítmények egységdózisok vagy több dózist tartalmazó tartályok lehetnek, például leforrasztott ampullák és fiolák, továbbá tárolhatók fagyasztva szárított (liofilizált) állapotban, ezekhez a készítményekhez közvetlenül felhasználás előtt steril folyékony hordo zóanyagot, például injekciós minőségű vizet kell adni. Az injekciós oldatok és szuszpenziók elkészíthetők a szükséges időben steril porokból, granulumokból és tablettákból, amelyeket az előzőekben ismertettünk.

Előnyös dózisegység készítmények azok, amelyek a hatóanyag napi dózisát vagy egységét, napi szubdózisát, ahogy azt az előzőekben említettük, vagy annak megfelelő töredékét tartalmazzák. Megjegyezzük, hogy a találmány szerint előállított készítmények az előzőekben ismertetett összetevőkön kívül más, az ilyen típusú készítményekben szokásosan alkalmazott anyagokat is tartalmazhatnak, például orális adagolás esetén tartalmazhatnak ízes ítőanyagokat.

A következőkben a találmányt nem korlátozó példákban mutatjuk be.

1. Példa

9-(2-dezoxi-3,5-di-0-propionil-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin előállítása

170 mg, 0,6 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)guanin, 8 mg DMAP (4-dimetil-amino-piridin) és 0,41 ml, 5 ekvivalens trietil-amin 4 ml DMF-ban (N,N-dimetil-formamid) készült oldatához szobahőmérsékleten, keverés közben hozzáadunk 0,16 ml, 2,1 ekvivalens propionsavanhidridet. 20 óra elteltével az elegyhez 2 ml metanolt adunk. 1 órával később az elegyet vákuumban bepároljuk, és a visszamaradó anyagot szilicium-dioxidon flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként kloroform és metanol 10:1 arányú elegyét, majd 6:1 arányú elegyét alkalmazzuk. így a cím szerinti vegyületet fehér, szilárd anyag formájá• · • ·

- 27 bán nyerjük.

Op.: 198 - 200 °C.

Elemzési eredmények a 0,2-hidrátra:

számított: C % = 47,93, H % - 5,13, N % = 17,47; talált: C % = 48,22, H % = 4,94, N % = 17,0 .

2. Példa

9-(2-dezoxi-3,5-di-O-acetil-2-fluor-B-D-ribofuranozil)guanin és 9-(2-dezoxi-2-fluor-3,5-di-0-acetil-B-D-ribofuranozil)-2-N-acetil-guanin előállítása

160 mg, 0,56 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)guanin, 8 mg DMAP és 400 μΐ, 5 ekvivalens trietil-amin 4 ml DMFban készült oldatához keverés közben, szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,16 ml, 2,5 ekvivalens ecetsavanhidridet. 22 óra múlva a sárga oldatot vákuumban bepároljuk, majd etanollal és toluollal együtt bepároljuk, majd a visszamaradó anyagot szilicium-dioxidon flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként kloroform és metanol 6:1 arányú elegyét alkalmazzuk. Az elsőként lejövő komponenst bepároljuk, és toluollal ismét bepároljuk, így a cím szerinti triacetil vegyületet nyerjük fehér hab formájában. Elemzési eredmények a 0,1 toluátra:

számított: C % = 47,69, H % = 4,51, N % = 16,65; talált: C % = 47,47, H % = 4,37, N % = 16,82.

A másodikként eluált vegyületet tartalmazó frakciók összegyűjtésével és bepárlásával nyerjük a diacetil vegyületet fehér, szilárd anyag formájában.

Op.: 232 - 234 °C (bomlik)

- 28 Elemzési eredmények a 0,25 etanolátra:

számított: C % = 45,73, H % = 4,63, N % = 18,39;

talált: C % = 46,02, H % = 4,34, N % = 18,19.

3. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-3-0-pivaloil-B-D-ribofuranozil) -guanin, és 9-(2-dezoxi-2-fluor-3,5-di-0-pivaloil-B-D-ribofuranozil)-guanin előállítása

200 mg (0,70 mmól) 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin, 10 mg DMAP és 0,5 ml trietil-amin 6 ml DMF-ban készült oldatához szobahőmérsékleten hozzáadunk 160 μΐ, 1,1 ekvivalens trimetil-ecetsavanhidridet, és az oldatot 24 órán át keverjük. Ezután az elegyhez további 80 μΐ trimetil-ecetsavanhidridet adunk, és a keverést még 5 napig folytatjuk. A reakcióelegyhez ezután 1 ml metanolt adunk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott fehér, szilárd anyagot szilicium-dioxidon flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként kloroform és metanol 15:1, majd 10:1, 6:1 és végül 4:1 arányú elegyét alkalmazzuk.

A harmadikként eluálódó UV elnyelő frakció a 3',5'-bisz(pivalát-észter), ezt éterrel eldörzsölve viaszos szilárd anyagot nyerünk.

Op.: 250 - 252 °C (bomlik).

Elemzési eredmények a C H FN 0 .0,5H 0 képlet alapján:

28 5 6 2 számított: C % = 51,94, H % = 6,32, N % = 15,15; talált: C % = 51,99, H % = 6,23, N % = 14,83.

A negyedikként eluálódó UV elnyelő frakció a 3'-pivalát-észter, ezt fehér porként nyerjük ki. A termék olvadáspontja fokozatos sötétedés mellett 260 - 320 °C.

- 29 • ·· · · ·· · ·

Elemzési eredmények a C H FN Ο 0.7H O képlet alapján:

20 5 5 2 számított: C % = 47,17, H % = 5,65, N % = 18,34; talált: C % = 47,10, H % = 5,36, N % = 17,93.

4. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-3,5-di-0-pivaloil-fl-D-ribofuranozil) -adenin, 9- (2-dezoxi-2-fluor-3-0-pivaloil-B-D-ribofurano zil)-adenin és 9-(2-dezoxi-2-fluor-5-0-pivaloil-B-D-ribofuranozil)-adenin előállítása

250 mg, 0,93 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)adenin, 10 mg DMAP és 0,65 ml trietil-amin 7 ml száraz DMF-ban készült oldatához szobahőmérsékleten, keverés közben hozzáadunk 226 pl, 1,2 ekvivalens trimetil-ecetsavanhidridet. 24 óra múlva az elegyhez további 60 μΐ trimetil-ecetsavanhidridet adunk, majd újabb 24 óra múlva további 20 μΐ-t adunk hozzá. 1 nap múlva a reakcióelegyhez metanolt adunk, majd vákuumban bepároljuk, etanollal együtt bepároljuk, majd szilicium-dioxidon flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként kloroform és metanol 18:1, 15:1, majd végül 10:1 arányú elegyét alkalmazzuk. Az elsőként eluálódó UV elnyelő frakció a 3’,5'-biszészter, ezt az eluátumnak éterrel való eldörzsölése után fehér, szilárd anyag formájában nyerjük.

Op.: 157 - 158 °C.

Elemzési eredmények a C H FN 0 .0,3H 0 képlet alapján:

28 5 5 2 számított: C % = 54,24, H % = 6,51, N % = 15,82; talált: C % = 54,40, H % = 6,33, N % = 15,48.

A másodikként eluálódó UV elnyelő frakció a 3'-pivalát

-észter, ezt fehér, szilárd anyagként nyerjük ki. A kapott termék

- 30 olvadáspontja 204 - 205 °C.

Elemzési eredmények a C H FN 0 ,0,3H 0 képlet alapján:

20 5 4 2 számított: C % - 50,22, H % = 5,79, N % = 19,53; talált: C % = 50,25, H % = 5,58, N % = 19,31.

A harmadikként eluálódó UV elnyelő frakció az 5’-pivalát-észter, ezt fehér hab formájában nyerjük.

Op.: 130 - 134 °C.

Elemzési eredmények a C H FN 0 ,0,2H 0 képlet alapján:

20 5 4 2 számított: C % = 50,46, H % = 5,76, N % = 19,62; talált: C % = 50,57, H % = 5,65, N % = 19,45.

5. Példa

9-(2-dezoxi-2-fluor-3,5-di-0-valeril-B-D-ribofuranozil)-adenin, 9-(2-dezoxi-2-f luor-3-0-valeril-fl-D-ribofuranozil) -adenin és 9-(2-dezoxi-2-fluor-5-0-valeril-B-D-ribofuranozil)-adenin előállítása

300 mg, 1,11 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)adenin, 10 mg DMAP és 0,9 ml trietil-amin 8 ml száraz DMF-ban készült oldatához szobahőmérsékleten, keverés mellett hozzáadunk 263 μΐ, 1,2 ekvivalens valeriánsavanhidridet. 24 és 48 óra múlva további 30 μΐ-es valeriánsavanhidrid adagokat adunk az elegyhez. Az utolsó adagolást követően 1 nap múlva az elegyhez metanolt adunk, majd kromatografálással feldolgozzuk a pivalát-észterek kinyerésére. Az elsőként eluálódó UV-abszorbeáló komponens a 3¹,5¹-biszészter, amely éterrel való eldörzsöléskor fehér tűkristályokként kristályosodik.

Op.: 96 - 98 °C.

• · • *· · »· ··

- 31 Elemzési eredmények a C H FN 0 képlet alapján:

28 55 számított: C % = 54,91, H % = 6,45, N % = 16,01; talált: C % = 54,93, H % = 6,49, N % - 15,89.

A másodikként eluálódó UV-abszorbeáló komponens a 3'-valerát-észter.

Op.: 182 - 183 °C.

Elemzési eredmények a C H FN 0 képlet alapján:

20 54 számított: C % = 50,98, H % = 5,71, N % = 19,82; talált: C % = 50,91, H % = 5,82, N % = 19,46.

A harmadikként eluálódó UV-abszorbeáló komponens az 5'-valerát-észter, amely éterrel való eldörzsöléskor kristályosodik. Op.: 115 - 117 °C.

Elemzési eredmények a C H FN 0 képlet alapján:

20 54 számított: C % = 50,98, H % = 5,71, N % = 19,82; talált: C % = 50,76, H % = 5,81, N % = 19,44.

6. Példa

2,6-Diamino-9- (2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -9H-purin előállítása

0,8 g, 4,8 mmól 2,6-diamino-purint (Pacific Chemical Laboratories) és 0,4 g, 1,6 mmól l-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [előállítható J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558 (1964) eljárásával] 50 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0es, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 3850 N. E. timidin-foszforilázt és 3760 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a

381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] • ·

- 32 adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 12. napon a reakcióelegyet leszűrjük, a szűrletet 1,5 x 15 cm-es anioncserélő gyanta (hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 oszlopra visszük. Az oszlopot víz és metanol 7:3 arányú elegyével mossuk, majd a terméket víz és metanol 1:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és az oldatról az oldószert vákuumban lepároljuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet elemzés szerint 1/2 hidrát formájában kapjuk.

Op.: 124 °C, UV A_max nm (e x 10³) : O,ln HC1, 291 (10,2), 252 (11,8); pH = 7, 278,5 (10,3), 255 (9,69); 0,ln NaOH, 279 (10,6), 255 (9,69).

Elemzési eredmények aC H FNO .1,2 H 0 képlet alapján:

13 6 31 2 számított: C % = 39,27, H % = 5,07 N % = 27,48 F % = 6,21;

talált: C % = 39,22, H % = 5,09, N % = 27,39, F % = 6,45.

^XH-NMR (80 MHZ, Me₂SO-d₆) : <5 = 7,94 (S, 1H, H-8) ; 6,74 és 5,79 (2 széles s, 4H, 2-NH₂ és 6-NH₂); 6,04 (dd, 1H, H-l', JF, 1' = 16,5 Hz, J = 3,4 Hz); 5,64 (m, 1,5H, 0,5 (H-2') és 3'-OH); 5,25 (t, 1H, 5'-0H, J = 5,5 Hz); 4,98 (m, 0,5H, 0,5 (H-2')); 4,41 (m, 1H, H-3') ; 3,93 (m, 1H, H-4'); 3,65 (m, 2H, Ha-5' és HB-5’).

7. Példa

9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin előállítása

0,20 g, 0,64 mmól, a 6. példa szerint előállított 2,6diamino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purint 15 ml vízben oldunk. Az oldathoz 4 N. E. borjú bél adenozin-dezaminázt (Boehringer Mannheim) adunk, és az oldatot 37 °C hőmérsékleten 4 napig inkubáljuk. Ezután az oldatot 4 °C hőmérsékletre hűtjük, 3 • ·

- 33 • · · · · • · · ···* ·· ««.»· · óra múlva a szuszpenziót szűrjük, ezzel a termék kristályos formájú első nyeredékét kinyerjük. A szűrlet térfogatát vákuumban lecsökkentjük, és a szuszpenziót 4 °C hőmérsékletre hűtjük. A szuszpenziót ismét szűrjük a termék második kristályos nyeredékének elkülönítésére. A kristályos termék nyeredékeket egyesítjük, vízben szuszpendáljuk, majd liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet elemzés szerint 1,3 hidrát formájában nyerjük.

Op.: >250 °C (bomlik)

UV }max nm (e x 10“³) : 0,1 n HC1, 257 (12,2), 280 (váll), 0,1 n

NaOH, 257 - 264 (10,9)

Elemzési eredmények a C H FN 0 1,3

12 54

38,91, H % = 4,77, számított:

6,16;

talált

N % = 22,51,

6,44

ÍH-NMR (80

MHz,

Me₂SO-d₆) : S = 10,63 (széles s, 1H,

Nl-H) ; 7,94 (s, 1H, H-8); 6,51 (széles s, 2H, 2-NH₂); 6,00 (dd, 1H, H-l', JF, 1' = 16,5 HZ, J = 2,9 Hz), 5,59 (m, 1,5H, 0,5 (H-2') és 3'-0H);

5,10 (t, 1H, 5'-0H, J = 5,6 Hz); 4,90 (m, 0,5H, 0,5 (H-2')); 4,37 (m, 1H, H-3·); 3,90 (m, 1H, H-4'); 3,65 (m, 2H, Ha-5' és HB-5').

8. Példa

9-(2-dezoxi-2-fluor-fi-D-ríbofuranozil)-adenin előállítása

0,8 g, 5,9 mmól adenint (Mann Research Laboratores, Inc.) és 0,4 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amely J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával előállítható] 20 ml 10 mmól/l-es, pH = 7,0-ás, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 2400 N. E. timidin-foszforilázt és 3900 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A.

« · • · · • ·

- 34 és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 6. napon a reakcióelegyet 100 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0-ás, 0,04 tömeg/tér f ogat % kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel meghígítjuk. A 17. napon a szuszpenziót szűrjük és a szűrletet bepároljuk. A visszamaradó anyagot meleg vízben szuszpendáljuk. A szuszpenziót szűrjük, a szűrletet 1,5 x 12 cm-es, anioncserélő gyantával (hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2) töltött oszlopra visszük. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk belőlük. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd liofilizáljuk. A kapott cím szerinti vegyületet elemzés szerint 0,6 hidrát formájú.

Op.: 225 - 227 °C (bomlik).

UV ?|max nm (e χ 10^-3): 0,ln HC1, 257 (14,6); 0,ln NaOH, 260 (14,9) .

Elemzési eredmények aC H FN 0 .0,6 Η O képlet alapján:

		10 12	5	3	2
számított:	C % =	42,89, H %	=	4,57	, N	% = 25,01, F	% - 6,78;
talált:	C % =	42,94, H %	=	4,76	, N	% = 24,98, F	% = 6,89.
ÍH-NMR (250	MHz,	Me2SO-dg):	5	= 8,	35 é	íS 8,14 (2s,	2H, H-8 és
H-2); 7,36 |	[s, 2H	, 6-NH2); 6,	21	(dd,	IH,	H-l', JF, 1'	= 16,8 Hz,

J = 3,0 Hz); 5,71 (d, IH, 3'-0H, J = 6,0 Hz); 5,42 (ddd, IH,

H-2 ' , JF, 2 ' = 53,0 Hz, J1' , 2 · = 3,0 Hz, J2',3 · = 4,5 Hz); 5,25 (t, IH, 5'-0H, J = 5,6 Hz), 4,47 (m, IH, H-3') , 3,97 (m, IH,

H-4'); 3,74 (rn, IH, Ha-5'); 3,56 (m, IH, HB-5').

· « • · · ♦»·· ·· · · · ♦ *

9. Példa

2-Amino-9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -9H-purin előállítása

0,4 g, 3,0 mmól 2-amino-purint (Vega Biochemicals) és 0,2 g, 0,71 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt, [amely előállítható J.F. Codington és mtsai, J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 35 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0-ás, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 1930 N. E. timidin-foszforilázt és 1880 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 ’C hőmérsékleten keverjük. A 24. napon a reakcióelegyet 200 ml vízzel meghígítjuk, és 1390 N. E. timidin-foszforilázt és 1880 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 35. napon a szuszpenziót bepároljuk. A visszamaradó anyagot víz és metanol 7:3 arányú elegyében oldjuk, majd 1,5 x 15 cm-es, anioncserélő gyantával (hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2) töltött oszlopra visszük. A terméket az oszlopról víz és metanol 7:3 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk belőlük. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, és liofilizáljuk. A kapott cím szerinti vegyület elemzés szerint 0,6 hidrátot tartalmaz. Op.: 151-153 ’C.

UV max nm (e x 10³): 0,ln HC1, 313 (4,00), 240-245; pH 7, 304 (7,00), 243; 0,ln NaOH, 304 (7,30), 243.

- 36 Elemzési eredmények aC H FNO 0,6HO képlet alapján:

12 5 3 2 számított: C % = 42,89, H % = 4,75, N % = 25,01, F % = 6,78;

talált: C % = 43,02, H % = 4,71, N % = 25,12, F % = 6,58.

I-H-NMR (80 MHz, Me₂SO-d₆): δ = 8,62 és 8,31 (2s, 2H, H-8 és H-6) ;

6,62 (széles s, 2H, 2-NH₂); 6,16 (dd, IH, H-l', JF,1' « 16,7 Hz,

J = 2,7 HZ); 5,71 (m, 1,5H, 3'-OH és 0,5 (H-2')); 5,12 (m, 1,5H, 5' -OH és 0,5 (H-2·)); 4,40 (m, IH, H-3') ; 3,97 (m, IH, H-4');

3,66 (m, 2H, Ha-5' és HŰ-5').

10. Példa

2-Amino-6-ciklopropil-amino-9H-purin-hidrogén-klorid előállítása

4,66 g, 27,5 mmól 2-amino-6-klór-purin (Aldrich Chemical Company) és 12,5 g, 220 mmól ciklopropil-amin (Aldrich Chemical Company) 100 ml metanolban készült oldatát 18 órán át 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután a reakcióelegyhez 50 ml 2-metoxietanolt adunk, és további 6 órán át az elegyet 70 °C hőmérsékleten tartjuk. Az elegyet lehűtjük, a kis mennyiségben jelenlévő reagálatlan kiindulási anyagot kiszűrjük belőle, a szűrletet bepároljuk, és szilikagél oszlopon kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként kloroform és 5 és 10 % között növekvő koncentrációjú metanol elegyét alkalmazzuk. A kapott terméket metanolból kétszer, etanolból egyszer átkristályosítjuk. így 23 %-os hozammal 1,45 g terméket nyerünk hidrogén-klorid-sója formájában. A kapott termék olvadáspontja 253 - 257 °C.

¹H-NMR (Me₂so-d₆): δ = 6,70-6,82 (m, 4, CH₂CH₂), 3,04 (széles s, 1, CHN), 7,35-7,55 (széles s, 2, NH₂), 8,13 (s, 1, CH) , 9,49 (széles s, 1, NHCH), 13,0-13,3 (széles s, 2, NH₂ ⁺).

·· ·

- 37 Elemzési eredmények a C Η N .HC1.1..H O képlet alapján:

10 6 2 számított: C % = 41,57, H % = 5,01, N % = 36,35, Cl % = 15,34; talált: C % = 41,55, H % = 5,01, N % = 36,28, Cl % = 15,4.

2-Amino-6-(ciklopropil-amino)-9-(2-dezoxi-2-fluor-fi-D-ribofuranozil)-9H-purin előállítása

0,3 g, 1,3 mmól 2-amino-6-(ciklopropil-amino)-9H-purinhidrogén-kloridot és 0,4 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai J. Org. Chem. 29. 558, (1964) eljárásával] 20 ml 5 mmól/literes, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben oldunk. Az oldathoz 2000 N. E. timidin-foszforilázt és 5540 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és az elegyet 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az 5. napon 2000 N.E. timidin-foszforilázt és 5540 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk az elegyhez. A 21. napon az elegyet 2,5 x 8 cm-es, anioncserélő gyantával (hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2) oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd a terméket víz és metanol 7:3 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban lepároljuk róla. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, és liofilizáljuk. A kapott termék elemzés szerint 0,6 hidrát.

A termék olvadáspontja 120 °C (részleges olvadás 80 °C-nál).

UV hmax nm (e χ 10³): 0,ln HCl, 295,5 (14,3), 254 (12,7); pH 7,

282 (14,8), 262 (váll); 0,lnNaOH, 292 (15,2), 262 (váll).

J = 3,3 Hz); 5,88 (széles s, 2H, 2-NH) ; 5,62 (d, 1H, 3'-0H,

J = 5,9 Hz); 5,30 (látszólagos dt, 1H, H-2 ·, JF,2 53,7 Hz,

J = 3,8 Hz); 5,23 (t, 1H, 5'-0H, J = 5,4 Hz); 4,38 (m, 1H, H-3');

3,92 (m, 1H, H-4 ’) ; 3,69 (in, 1H, Ha-5'); 3,59 (m, 1H, HB-5') ;

3,10 (m, 1H, N-CH); 0,62 (m, 4H, CH₂CH₂).

11. Példa

9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-6-metoxi-9H-purin előállítása

0,8 g, 5,3 mmól 6-metoxi-purint (Sigma Chemical Company) és

0,4 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai, J. Org. Chem. 29. 558, (1964) eljárásával] 20 ml 10 mmól/literes, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben oldunk. Az oldathoz 2400 N. E. timidin-foszforilázt és 3900 N. E.

purin-nukleotid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 6. napon a reakcióelegyet 100 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel meghígítjuk. A 16. napon 2640 N. E. timidin-foszforilázt és 4360 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk az elegyhez. A 45. napon a reakcióelegyet bepároljuk. A ··

V • ·· • · ·· visszamaradó anyagot meleg metanolban szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót szűrjük, és a szűrletet bepároljuk. A visszamaradó anyagot meleg vízben oldjuk és 2,5 x 7 cm-es, anioncserélő gyantával (hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2) töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd a terméket metanol és víz 9:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldatból az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd liofilizáljuk.

A cím szerinti	vegyületet elemzés	szerint 0,3	hidrát formájában
nyerjük.
Op.	: 182 °C
UV	X max nm	(e	x 10“3): 0,1 n HC1,	250	(8,72),	250	(váll); pH 7,
248	(8,95),	259	(váll); 0,ln NaOH,	250	(9,14),	259	(váll).

Elemzési eredmények aC H FN 0 .0,3 H 0 képlet alapján:

13 4 42 számított: C % = 45,61, H % = 4,73, N % = 19,34, F % =6,56;

talált: C % = 45,72, H % = 4,66, N % = 19,47, F % =6,72.

^XH-NMR (300 MHz, Me₂SO-d₆): <5 = 8,63 és 8,58 (2s, 2H, H-8 és

H-2); 6,34 (dd, 1H, H-l', JF, 1' = 17,1 Hz, J = 2,4 Hz); 5,76 (d,

1H, :	3 '-OH, J = 6,1 Hz) ;	5,45	(ddd,	1H, H-2', JF,	2' = 52,7 HZ,
Jl',	2' = 2,4 Hz, J21,3'	= 4,	4 Hz) ;	5,17 (t, 1H,	5'-OH, J = 4,1
Hz) ;	4,50 (m, 1H, H-3');	4,11	(s, 3H	O-CH3); 4,00	(m, 1H, H-4');
3,75	(m, 1H, Ha-5'); 3,62	(m,	1H, HB-	•5').

12. Példa

2-Amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-6-metoxi-9H-purin előállítása

0,8 g, 4,8 mmól 2-amino-6-metoxi-purint [amelyet előállíthatunk R.W. Balsiger és J.A. Montgomery; J. Org. Chem. 25, 1573 (1960) eljárásával] és 0,4 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-Dribofuranozil)-uracilt [amelyet előállíthatunk J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 20 ml 10 mmól/1es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 2400 N.E. timidin-foszforilázt és 3900 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20. 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 6. napon a reakcióelegyet 100 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel meghígítjuk. A 10. napon a reakcióelegyet 200 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó káliumfoszfát-pufferrel meghígítjuk. A 16. napon az elegyhez 2640 Ν. E. timidin-foszforilázt és 4360 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk. A 24. napon a reakcióelegyet leszűrjük és a szűrletet bepároljuk. A visszamaradó anyagot metanolban szuszpendáljuk. A szuszpenziót szűrjük, a szűrletet bepároljuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, és 2,5 x 7 cm-es, anioncserélő gyantával (hidroxid-formájú Bio-Rad AG1X2) töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, a terméket metanol és víz 9:1 arányú elegyével eluáljuk. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a • ·

- 41 visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd liofilizáljuk. Elemzés szerint a cím szerinti vegyületet 0,5 hidrát formájában nyerjük. Op.: 200 - 202 °C.

UV hrnax nm (e x 10³): 0,ln HC1, 288 (7,85), 244,5 (6,43); pH 7,

279,5 (8,09), 248 (8,85); 0,lnNaOH, 280 (8,40), 248,5 (8,59).

Elemzési eredmények a C 11	H FN 0 0,5 14 5 4	H 0 képlet alapján:
számított: C % = 42,86,	H % = 4,90,	N	% = 22,78,	F % = 6,16;
talált: C % = 42,81,	H % = 4,92,	N	% = 22,69,	F % = 6,29.
XH-NMR (300 MHZ, Me2SO-d6) : δ = 8,12	(s	, 1H, H-8);	6,57 (széles
S, 2H, 2-NH2); 6,11 (dd,	1H, H-l', JF	,1'	= 16,6 Hz,	J = 2,7 Hz);
5,69 (d, 1H, 3'-OH, J =	6,10 Hz); 5,	31	(ddd, 1H,	H-2’, JF,2* =
53,0 Hz, Jl',2' = 2,7 Hz	;, J2 ’ ,3' = 4	,4	Hz); 5,17	(t, 1H, 5ΌΗ,
J = 4,2 Hz); 4,40 m, 1H,	H-3'); 3,95 (	m,	4H, H-4' és O-CH3); 3,74

(m, 1H, Ha-5'); 3,58 (m, 1H, HB-5').

13. Példa

6-Ciklopropil-amino-9H-purin előállítása

4,23 g, 27 mmól 6-klór-purin (Aldrich Chemical Company) és

12,5 g, 22 mmól ciklopropil-amin (Aldrich Chemical Company) 100 ml metanolban készült oldatát 48 órán át 50 °C hőmérsékleten tartjuk. Ezután az elegyből az oldószert eltávolítjuk, és a kapott nyersterméket szilikagél oszlopon tisztítjuk. Eluensként 5 % metanolt tartalmazó kloroformot alkalmazunk. így 5,90 g krémszínű; szilárd anyagot nyerünk. Ezt az anyagot metanolból átkristályosítva két nyeredéket kapunk, 2,69 g és 1,16 g mennyiségben. Az össz-hozam 81,4 %. A termék olvadáspontja 237 - 240 °C.

^XH-NMR (Me₂SO-d₆): δ = 0,6-0,71 (m, 4, CH₂CH₂), 3,03 (széles s, 1, CHNH), 7,73 (d, 1, NH), 8,05 (s, 1, CH), 8,18 (s, 1, CH) , 12,7 (széles, 1, NH).

Elemzési eredmények a C Η N képlet alapján:

9 5 számított: C % = 54,85, H % = 5,18, N % = 39,97; talált: C % = 54,69, H % = 5,22, N % = 39,87.

6-(Ciklopropil-amino)-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin előállítása

0,2 g, 1,1 mmól 6-(ciklopropil-amino)-9H-purint és 0,4 g,

I, 6 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amelyet

J. F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával állíthatunk elő] 20 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk. Az elegyhez 2000 Ν. E. timidin-foszforilázt és 5540 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. Az ötödik napon a szuszpenzióhoz 0,2 g 6-ciklopropil-amino)-purint és 2000 Ν. E. timidin-foszforilázt, továbbá 5540 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk. A kilencedik napon az elegyhez 0,2 g 6-(ciklopropil-amino)-purint adunk, és az elegy pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk. Az elegyhez 2000 Ν. E. timidin-foszforilázt, továbbá 5540 Ν. E. purinnukleozid-foszforilázt adunk. A 20. napon a reakcióelegy pH-ját ammónium-hidroxiddal 9,4-re állítjuk, majd az elegyet 2,5 x 8,5 cm-es, anioncserélő gyantával (hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2) töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, a terméket víz és metanol 7:3 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tártál43 mazó frakciókat egyesítjük, az oldatból az oldószert vákuumban lepároljuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd liofili záljuk. A kapott termék elemzés szerint 0,4 hidrát formájú.

Op.: 207-208 °c

UV λ max nm (e x 10^-3):

0,ln HC1, 264 (19,1); pH 7, 268 (18,2);

0,ln NaOH, 268 (18,6).

Elemzési eredmények a C számított:

C % = 49,33,

H

H

FN 0 .0,4

3 = 5,35, képlet alapján:

% = 22,13,

F % = 6,00;

talált:

C % = 49,33,

5,33, % = 22,11, fH-NMR (220

MHz, Me₂SO-d₆):

8,35 és

8,24 2s, 2H,

H-8 és

H-2);

7,98 (széles d,

IH, 6-NH, J = 4,10 Hz),

JF,1'

16,8 Hz, J

2,9 Hz); 5,68 (d, IH,

3ΌΗ, J = 5,9 Hz);

5,42 (ddd, IH,

H-2

HZ); 5,20 (t,

IH, 5-0H, J = 5,6 Hz); 4,46 (m, IH, H-3'); 3,97 (m,

IH, H-4');

3,73 (m, IH, Ha-5'); 3,55 (m, IH, HB-5'); 3,04 (m, IH,

N-CH); 0,66 (m, 4H, CH₂CH₂).

14. Példa

2-Amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-6-etoxi-9H-

-purin előállítása

0,8 g, 4,5 mmól 2-amino-6-etoxi-purint [amely előállítható R.W. Balsiger és J.A. Montgomery; J. Org. Chem. 25, 1573 (1960) eljárásával] és 0,5 g, 2,1 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29., 558, (1964) eljárásával] 50 ml 5 mmól/l-es, pH =

7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját káliumhidroxiddal 7,0-ra állítjuk. Ezután 4000 N. E. timidintimidin44 foszforilázt, továbbá 14000 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a

381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk hozzá, és az elegyet 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 4. napon az elegyhez 2000 N. E. timidin-foszforilázt és 6980 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk, majd 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfátpufferrel 250 ml térfogatra hígítjuk. A 14. napon az elegyből az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben szuszpendáljuk, majd metanolt adunk hozzá a protein kicsapására. A szuszpenziót szűrjük, majd a szűrletet bepároljuk. A visszamaradó anyagot meleg vízben oldjuk, és 1,5 x 15 cm-es, anioncserélő gyantával (hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2) töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd a terméket metanol és víz 1:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és az oldószert az oldatból vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet elemzés szerinti 0,7 hidrát formájában kapjuk.

op.: 85 °C (részleges olvadás 50 °C-nál).

UV ?[max nm (e x 10“³) : 0,ln HC1, 288 (8,78), 244,5 (7,19); pH 7, 280 (8,96), 247,5 (9,55); 0,lnNaOH, 280 (9,25), 249 (9,15). Elemzési eredmények aC H FNO 0,7HO képlet alapján:

16 5 4 2 számított: C % = 44,23, H % = 5,38, N % = 21,49, F % = 5,83;

talált: C % = 44,30, H % = 5,43, N % = 21,39, F % = 5,81.

ÍH-NMR (200 MHz, Me₂SO-d₆): δ = 8,09 (S, 1H, H-8) ; 6,49 (széles s, 2H, 2-NH₂); 6,08 (dd, 1H, H-l', JF,1' = 16,4 Hz, J = 2,7 Hz);

5,67 (d, 1H, 3’-0H, J = 6,1 Hz); 5,42 (m, 0,5 H, 0,5 (H-2 ·)) ; 5,15 (m, 1,5H, 0,5 (H-2·) és 5’-OH); 4,44 (q, 2H, 6-0H₂, J = 7,0 Hz); 4,40 (m, 1H, H-3·); 3,92 (m, 1H, H-4·); 3,73 (m, 1H, Ha-5’); 3,56 (m, 1H, HB-5·); 1,34 (t, 3H, -CH₃, J = 7,0 Hz).

15. Példa

2-Amino-6-klór-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9Hpurin előállítása

1. reakció: 0,8 g, 4,7 mmól 2-amino-6-klór-purint (Sigma Chemical Company) és 0,4 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 50 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó káliumfoszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját káliumhidroxiddal 7,0-ra állítjuk. Az elegyhez 3850 N. E. timidinfoszforilázt és 6500 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20. 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 22. napon a reakcióelegyet 100 ml-re hígítjuk 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat* kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel, majd 1270 N. E. timidin-foszforilázt és 2180 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 32. napon a reakcióelegyet 200 ml-re hígítjuk 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat* kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel, majd 2540 N. E. timidin-foszforilázt és 4360 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 61. napon a reakcióelegyet szűrjük. A szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot 4 ’C hőmérsékleten • · · ·

- 46 tároljuk.

2. reakció: 0,8 g, 4,7 mmól 2-amino-6-klór-purint (Sigma Chemical Company) és 0,4 g l-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt 25 ml 10 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térf ogat % kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 4000 N. E. timidin-foszforilázt és 6500 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk, és 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 10. napon a reakcióelegyet 100 ml-re hígítjuk 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel. A 20. napon a reakcióelegyet 200 ml-re hígítjuk, 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel, és 2640 N. E. timidin-foszforilázt és 4360 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. Az 53. napon a reakcióelegyet szűrjük. A szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot 4 °C hőmérsékleten tároljuk. Az 1. és 2. reakciókból származó visszamaradó anyagokat egymással kombinálva vízben szuszpendáljuk. A szuszpenziót megmelegítjük, majd szűrjük. A szűrletben lévő terméket kromatografálással tisztítjuk, 7,5 x 90 cm-es, Biogel P-2 (Bio-Rad) töltetű oszlopon, kifejlesztőszerként n-propanol és víz 3:7 arányú elegyét alkalmazva, majd 5 x 90 cm-es Sephadex G-10 (Pharmacia LKB) töltetű oszlopon kromatografáljuk, kifejlesztőszerként n-propanol és víz 3:7 arányú elegyét alkalmazzuk. A kizárólag a terméket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, és az oldatból az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben szuszpendáljuk, majd liofilizáljuk. így a cím szerinti vegyületet nyerjük (első nyeredék). A Sephadex G-10 oszlopról lejövő, terméket és • · · · ♦ ·· * · • * 9 - · · · * • · · · · · ·

- 47 szennyeződéseket együttesen tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldatról az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot víz és MeCN 49:1 arányú elegyében oldjuk, majd a terméket C18 szilicium-dioxidon (Hi-Chrom Prep-40-ODS, Regis Chemical Co.) fordított fázisú kromatográfiás eljárással tovább tisztítjuk. Kifejlesztőszerként víz és MeCN 49:1 arányú elegyét alkalmazzuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 0,2 /xm pórusú nylon szűrőn át szűrjük a szilicium-dioxid maradék eltávolítására. A szűrletből az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot vízben oldjuk és 0,22 mikron pórusú membránszűrőn (Millipore GS) szűrjük. A szűrletet liofilizáljuk. így a cím szerinti vegyületet nyerjük (második nyeredék), amely elemzés szerint 0,5 hidrát formájú.

Άζ 1. nyeredék adatai:

Op.: 212 °C (részleges olvadás 205 °C-nál).

UV max nm (e x 10“³): 0,ln HC1, 309 (6,00), 247 (5,60); pH 7,

307,5 (6,30), 247 (5,80); 0,lnNaOH, 307 (6,40), 247 (5,30). Elemzési eredmények a C H Cl FN O képlet alapján:

11 53 számított: C % = 39,55, Η X = 3,65, N % = 23,06, Cl % = 11,67, F % = 6,26;

talált: C X = 39,69, H % = 3,82, N X = 22,84, Cl X = 11,64, F X = 6,14.

^XH-NMR (300 MHZ, Me₂SO-d₆): 6 = 8,37 (s, 1H, H-8) ; 7,07 (széles S, 2H, 2-NH₂); 6,12 (dd, 1H, H-l', JF, 1' = 16,6 Hz, J = 2,0 Hz); 5,72 (d, 1H, 3'-OH, J = 6,4 Hz); 5,34 (ddd, 1H, H-2 · , JF, 2' =

52,9 Hz, Jl',2' = 2,0 Hz, J2 · , 3' = 4,2 Hz); 5,19 (t, 1H, 5'-OH,

J = 5,3 Hz); 4,42 (m, 1H, H-3·); 3,96 (m, 1H, H-4'); 3,76 (m, 1H, Ha-5'); 3,61 (m, 1H, HB-5').

» · • · · · · • * · · · · ♦ • · · · · · ·

- 48 A 2. nyeredék adatai:

Op.: 215 °C,

UV ^max nm (e x 10”³): O,ln HC1, 309,5, 246,5; p 7, 307,5, 247. o,ln NaOH, 307,5, 247.

Elemzési eredmények aC H C1FN0 .0,5HO képlet alapján:

11 53 2 számított: C X = 38,41, H X = 3,87, N % = 22,40, Cl % - 11,34, F X = 6,08; talált: C X = 38,73, Η % = 3,79, Ν X = 22,14, Cl X = 11,16, F X = 6,10. 1H-NMR (80 MHZ, Me₂so-d₆): δ = 8,36 (s, 1H, H-8); 7,03 (széles S, 2H, 2-NH₂); 6,13 (dd, 1H, H-l', JF, 1', 16,8 Hz, J = 3,2 Hz);

5,68 (m, 1,5H, 0,5 (H-2') és 3'-OH); 5,15 (m, 1,5H, 0,5 (H-2') és 5'-OH); 4,35 (m, 1H, H-3') ; 3,90 (m, 1H, H-4') ; 3,72 (m, 2H,

Ha-5' és HB-5').

16. Példa

2-Amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-6-metil-amino-9H-purin előállítása

0,51 g, 3,1 mmól 2-amino-6-metil-amino-purint [J.A.

Montgomery és L.B. Holum, J.A.C.S. 80, 404 (1958)] és 0,52 g, 2,1 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 50 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 4000 Ν. E. timidin-foszforilázt és 14 000 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, majd a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 6. napon az elegyet 5 mmól/l-es, pH = • ·

- 49 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát pufferrel 250 ml-re hígítjuk és 0,49 g 2-amino-6-metil-amino-purint, 4000 N. E. timidin-foszforilázt és 14 000 N. E. purinnukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 14. napon a reakcióelegyet bepároljuk. A visszamaradó anyagot metanol és víz elegyében szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót szűrjük. A szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot vízben oldjuk és 2,5 x 13 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, a terméket metanol és víz 1:1 arányú elegyével eluáljuk. Az eluátumból az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd 0,22 gm pórusú membránszűrőn szűrjük. A szűrletet liofilizáljuk. A kapott cím szerinti vegyület elemzés szerint 0,5 hidrátot tartalmaz.

Op.: 172 °C,

UV )lmax nm (e x 10³) : 0,ln HC1, 292,5 (11,5), 255 (12,1); pH 7,

279,5 (13,4), 263 (váll); 0,	In NaOH,	280 (13,7), 263	(váll).
Elemzési eredmények a C H 11 15	FN 0 0,5 6 3	H^O képlet ala	pján:
számított: C % = 43,00, H	% = 5,25,	N % = 27,35,	F % = 6,18;
talált: C % = 42,99, H	% = 5,28,	N % = 27,33,	F % = 6,16.
ÍH-NMR (200 MHz, Me2SO-d6):	S = 7,92	(S, 1H, H-8) ;	7,28 (széles
s, 1H, 6-NH); 6,13 (dd, 1H,	H-l’, JF	,1' = 16,3 HZ,	J = 3,3 Hz) ;
5,91 (széles s, 2H, 2-NH2);	5,64 (d,	1H, 3'-OH, J =	5,8 Hz); 5,29
(ddd, 1H, H-2' , JF,2' = 53,	0 Hz, Jl1	',2* = 3,3 Hz,	J2',3' = 4,4

HZ); 5,27 ((t, 1H, 5'-OH, J = 5,5 Hz); 4,37 (m, 1H, H-3') ; 3,92 (m, 1H, H-4') ; 3,72 (m, 1H, Ha-5') ; 3,60 (m, 1H, HB-5') ; 2,86 (széles s, 3H, N-CH₃).

·· ·· * • · · · • · · · · « * · ···· • · · · · · ·

17. Példa

9—(2—dezoxi—2—fluor—β-D—ribofuranozil)-hipoxantin előállítása

0,29 g, 1,0 mmól, a 8. példa szerint előállított 6-amino-9(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purint 100 ml vízben oldunk. Az oldathoz 4 Ν. E. borjú bél adenozin-dezaminázt (Boehringer Mannheim) adunk, és az oldatot 37 °C hőmérsékleten 24 órán át inkubáljuk. Ezután az oldatról az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot víz és n-propanol 7:3 arányú elegyében oldjuk, majd az oldatot 5 x 90 cm-es, Sephadex G-10 (Pharmacia LKB) töltetű oszlopon kromatografáljuk. Eluensként víz és n-propanol 7:3 arányú elegyét alkalmazzuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldatról az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk és liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet hidrát formájában nyerjük. Op.: 175 °C (részleges olvadás 125 °C-nál)

UV Λ max nm (e χ 10^-3): 0,ln HC1, 249 (11,8); pH 7, 248,5 (12,0); 0,ln NaOH, 253 (13,0) .

Elemzési eredmények a C H FN Ο H 0 képlet alapján:

	10 11 44 2
számított:	C	% = 41,67,	H % =	4,55,	N	% = 19,44,	F	% = 6,59;
talált:	C	% = 41,72,	H % =	4,58,	N	% = 19,46,	F	% = 6,37.

ÍH-NMR (200 MHz, Me₂SO-d₆) : <5 = 8,33 és 8,09 (2s, 2H, H-8 és

H-2); 6,21 (dd, IH, H-l', JF,1' = 16,8 Hz, J = 2,4 Hz); 5,75 (széles s, IH, 3'-0H), 5,36 (ddd, IH, H-2 ·, JF,2' = 52,7 Hz,

Jl',2' = 2,4 Hz, Jl',3' = 4,4 Hz); 5,20 (széles s, IH, 5'-0H);

4,43 (látszólagos d, m, IH, H-3', JF,3* = 18,9 Hz); 3,97 (m, IH, H-4'); 3,75 (m, IH, Ha-5·); 3,59 (m, IH, HB-5’).

• t • · · · • * · · · * * · · · · * • · ·*·* ·

18. Példa

2-Amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-6-propoxi-9Hpurin előállítása

0,3 g, 1,6 mmól 2-amino-6-propoxi-purint [amelyet R.W. Balsiger és J.A. Montgomery; J. Org. Chem. 25, 1573 (1960) eljárásával állíthatunk elő] és 0,52 g, 2,1 mmól 1-(2-dezoxi-2fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amelyet J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával álíthatunk elő] 50 ml 2 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk. A szuszpenzióhoz 4000 N. E. timidin-foszforilázt és 14 000 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és az elegyet 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 6. napon az elegyet 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel 250 ml-re hígítjuk és 4000 N. E. timidin-foszforilázt és 14 000 N. E.

purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 14. napon az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot metanol és víz elegyében szuszpendáljuk, a szuszpenziót szűrjük. A szűrletet bepároljuk, majd a visszamaradó anyagot meleg vízben oldjuk, és

2,5 x 13 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, a terméket metanol és víz 1:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazú frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban bepároljuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, majd liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet 0,9 hidrát formájában nyerjük.

• · · ·

- 52 Op.: 93 °C (részleges olvadás 65 °C-nál)

UV λmax nm (e x 10“³): O,ln HCl, 289 (9,05), 245 (7,37); pH 7,

280 (9,28), 248 (9,82); 0,ln NaOH, 280,5 (9,67), 249,5 (9,55).

számított:

FN 0 0,9 H 0 5 4 2

N

4 ’ % = 5,78, képlet alapján:

talált:

C % = 45,75, H % = 5,61,

ÍH-NMR (200

MHz, Me₂SO-d₆):

<5 = 8,09 (s, 1H, H-8);

6,49 (széles s,

2H, 2-NH₂); 6,08 (dd, 1H,

H-l, JF,1' = 16,4 HZ,

J = 2,7

Hz) ;

5,65 (d, 1H, 3'-OH, J = 6,0

Hz); 5,42 (látszólagos t, 0,5H,

0,5 (m, 3H,

5'-OH);

4,36

H-3' ; és 6-OCH₂); 3,92 (m, 1H, H-4') ; 3,69 (m, 1H,

Ha5'); 3,60 (m, 1H, HB-5·); 1,75 (látszólagos szextett, 2H, CH₂, J= = 7,1 HZ); 0,95 (t, 3H, CH₃, J = 7,4 Hz).

19. Példa

2-Amino-9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -6-jód-9H-purin előállítása

0,8 g, 3,1 mmól 2-amino-6-jód-purint [amely előállítható R.T. Koda és mtsai.; J. Pharm. Sci. 57. 2056, (1968)] eljárásával] és 0,39 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai,; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 20 ml 10 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját kálium-hidroxiddal 7,2-re állítjuk, majd 2000 N. E. timidin-foszforilázt és 3250 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20. 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk hozzá, és a szuszpenziót 37 tt · • ♦

- 53 °C hőmérsékleten keverjük. A 12. napon a reakcióelegy pH-ját ecetsavval 6,8-ra állítjuk és 2000 N. E. timidin-foszforilázt és 3250 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 26. napon az elegyet 5 mmól/l-es, pH = 7, 0,04 tömeg/térfogat% káliumazidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel 500 ml-re hígítjuk, és 2000 N. E. timidin-foszforilázt és 3250 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 40. napon az elegyet szűrjük, a szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot víz és n-propanol 7:3 arányú elegyében szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót szűrjük. A szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot metanolban szuszpendáljuk, majd szűrjük. A szűrletben lévő terméket kromatografálással 5 x 90 cm-es Biogel P-2 (Bio-Rad) töltetű oszlopon tisztítjuk. Eluensként víz és n-propanol 7:3 arányú elegyét alkalmazzuk, majd az eluátumot 5 x 90 cm-es, Sephadex G-10 (Pharmacia LKB) töltetű oszlopon kromatografáljuk, és víz és n-propanol 7:3 arányú elegyével eluáljuk. Az oldószert az elátumból vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot vízben szuszpendáljuk és liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet elemzés szerint 0,6 hidrát formájában nyerjük.

Op. : 135 °C (részleges olvadás 108-110 °C-nál).

UV λmax nm (e x 10“³): 0,ln HC1, 318 (7,94); pH 7, 315 (8,30); 0,ln NaOH, 315 (8,36).

Elemzési eredmények a C H FIN 0 ·0,6 H 0 képlet alapján:

11 5 3 2 számított: C X = 29,59, Η X = 3,03, N X - 17,25, F X = 4,68, I X = 31,26; talált: C X = 29,69, Η X = 3,06, N X = 17,22, F X = 4,44, I X = 31,47.

^XH-NMR (300 MHz, Me₂SO-d₆) : δ = 8,33 (s, 1H, H-8) ; 6,96 (széles s, 2H, 2-NH₂); 6,09 (dd, 1H, H-l', JF,1' = 16,7 Hz, J = 2,4 Hz);

• · *····>

» » · *«·< •τ ·♦·· ·

5,69 ((d, ΙΗ, 3'-0H, J = 6,3 Hz); 5,33 (ddd, 1H, H-2', JF,2‘ 52,8 Hz, Jl',2' = 2,4 Hz, J2 ' , 3 ' = 4,2 Hz); 5,16 (t, 1H, 5'-0H, J =

5,3 Hz); 4,42 (m, 1H, H-3') ; 3,95 (m, 1H, H-4 ' ) ; 3,77 (m, 1H, Hűt-5') ; 3,60 (m, 1H, HB-5').

20. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -6-metil-amino-9Hpurin előállítása

0,8 g, 5,4 mmól 6-metil-amino-purint (Sigma Chemical Company) és 0,39 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964)] eljárásával] 20 ml lo mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 2400 N. E. timidin-foszforilázt és 3900 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 ’C hőmérsékleten keverjük. A 6. napon a reakcióelegyet 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel 100 ml-re hígítjuk. A 17. napon a reakcióelegyet leszűrjük, a szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot metanolban szuszpendáljuk, majd szűrjük. A szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot vízben oldjuk és 2,5 x 7 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük. A terméket vízzel eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk az oldatból. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, és 0,2 gm pórusú membránszűrőn szűrjük. A szűrletet liofilizáljuk.

·· a ··· • * « ·* 4 c • ·· * · így a cím szerinti vegyületet nyerjük.

Op.: 140 °C (65 °C-nál zsugorodik, részleges olvadás 110 °C-nál).

UV A max nm (e x 10³): 0,ln HC1, 261,5 (16,2); pH 7, 265,5 (15,0); 0,ln NaOH, 266 (15,3).

Elemzési eredmények a C H FN O képlet alapján:

		11	14	5	3
számított:	C % =	46,64,	H %	=	4,98,	N %	= 24,72,	F % =	6,71;
talált:	C % =	46,48,	H %	=	5,07,	N %	= 24,63,	F % =	6,93.
XH-NMR (300	MHz,	Me2SO-d6) :	δ	= 8,37 és	8,25 (2s,	2H,	H-8 és
H-2); 7,86	(széles	S, 1H,	6-NH);	6,24	(dd,	1H, H-l' ,	JF,1'	= 16,8

Hz, J = 3,2 Hz); 5,74 (d, 1H, 3'-OH, J = 6,1 Hz); 5,44 (ddd, 1H, H-2', JF,2' = 53,0 Hz, J1' , 2' = 3,2 Hz, J2 ' , 3 ' = 4,4 Hz); 5,28 (t, 1H, 5'-OH, J = 5,6 Hz); 4,49 (m, 1H, H-3') ; 3,99 (m, 1H, H-4'); 3,75 (m, 1H, Ha-5'); 3,58 (m, 1H, HB-5'); 2,95 (széles s, 3H, N-CH₃).

21. Példa

9- (2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -6-etoxi-9H-purin előállítása

0,2 g, 1,2 mmól 6-etoxi-purint (Sigma Chemical Company) és 0,4 g, 1,6 mmól 1-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amelyet előállíthatunk J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29. 558, (1964) eljárásával] 20 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk, majd 2000 N. E. timidin-foszforiláz és 5540 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk hozzá, és a szuszpenziót 37 • ··

* · · · °C hőmérsékleten keverjük. Az 5. napon további 2000 Ν. E. timidin-foszforilázt és 2770 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk az elegyhez. A 9. napon 0,2 g 6-etoxi-purint adunk az elegyhez, majd az elegy pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk és 2000 Ν. E. timidin-foszforilázt és 5540 N.E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 28. napon a szuszpenziót szűrjük, a szűrletet

2,5 x 8,5 cm-es, hidroxid formájú, Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, a terméket metanol és víz 3:7 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és az oldószert vákuumban lepároljuk az oldatról. A visszamaradó anyagot kromatográfiás eljárással tovább tisztítjuk, először 2,5x90 cm-es, Biogel P-2 (Bio-Rad) töltetű oszlopon kromatografáljuk, eluensként víz és metanol 8:2 arányú elegyét alkalmazzuk, majd 2,5 x 50 cm-es szilikagél oszlopra visszük, amelyről acetonitril és víz 49:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, és liofilizáljuk. A cím szerinti vegyületet elemzés szerint 0,5 hidrát formájában nyerjük.

Op.: 85 - 87 ^eC (részleges olvadás 60 °C-nál).

UV A max nm (e x 10“³): 0,ln HC1, 249 (11,4); pH 7, 248 (11,7); 0,ln NaOH, 249 (12,0).

Elemzési eredmények aC H FNO 0,5H0 képlet alapján:

15 4 4 2 számított: C % = 46,91, H % = 5,25, N % = 18,23, F % = 6,18;

talált: C % = 46,80, H % = 5.23, N % = 18,21, F % = 6,65.

iH-NMR (200 MHz, Me₂S0-d₆) : 8 = 8,59 és 8,53 (2s, 2H, H-8 és

H-2); 6,31 (dd, IH, H-l', JF,1' = 17,0 Hz, J = 2,5 Hz); 5,70 (d, ·· 9 • · ·«· · * * · · ···« 9Λ ·«·· «

- 57 1Η, 3'-0H, J = 6,3 Hz); 5,43 (ddd, 1H, H-2 ’ , JF,1' = 52,9 Hz, Jl',2' = 2,5 Hz, J2' , 3 ’ = 4,4 Hz); 5,12 (t, 1H, 5'-0H, J = 5,4 Hz); 4,59 (q, 2H, 6-OCH₂, J = 7,0 Hz); 4,51 (m, 1H, H-3'); 3,98 (m, 1H, H-4’); 3,73 (m, 1H, Ha-4’); 3,61 (m, 1H, HB-5'); 1,40 (t, 3H- CH₃); J = 7,0 Hz).

22. Példa

2-Amino-9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -6-metil-tio-9H-purin előállítása

0,6 g, 3,3 mmól 2-amino-6-metil-tio-purint (Sigma Chemical Company) és 0,3 g, 1,2 mmól l-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amelyet előállíthatunk J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 200 ml 5 mmól/l-es pH =

7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-puf ferben szuszpendálunk, és a szuszpenzióhoz 4000 Ν. E. timidin-foszforilázt és 6500 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20. 3615 (1981) és a

381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 14. napon a reakcióelegyet 5 mmól/l-es pH = 7,0, 0,04 tömeg/térf ogat % kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel 400 ml-re hígítjuk, és 8000 Ν. E. timidin-foszforilázt és 6500 N.E. purinnukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 25. napon az elegy pH-ját kálium-hidroxiddal 6,9-re állítjuk. A 39. napon a reakcióelegyet szűrjük, a szűrletet 2,5 x 13 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük, és a terméket metanol és víz 3:7 arányú elegyével eluáljuk. Az eluátumból az oldószert vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó

- 58 anyagot vízben szuszpendáljuk, és liofilizáljuk. A kapott cím szerinti vegyület elemzés szerint 0,5 hidrát tartalmú.

Op.: 85 - 87 °C.

UV λ rnax nm (e x 10^-3): 0,ln HC1, 327 (11,6), 250 (11,2) , 263 (váll); pH 7, 311 (12,8), 257 (váll), 246 (15,1); 0,ln NaOH, 311 (13,3), 257 (váll), 246 (14,8).

Elemzési eredmények aC H FNOSO,5HO képlet alapján:

14 5 3 2 számított: C % = 40,74, Η X = 4,66, N X = 21,59, F % = 5,80, S X = 9,89;

talált: C %= 40,79, H X = 4,66, N X = 21,55, F X = 5,89, S X = 9,84.

ÍH-NMR (80 MHz, Me₂SO-d₆) : δ = 8,17 (s, IH, H-8) ; 6,57 (széles s, 2H, 2-NH₂); 6,14 (dd, IH, H-l', JF,1' = 16,4 Hz, J = 3,2 Hz);

5,64 (m, 1,5 H, 0,5 (H-2') és 3'-OH); 5,11 (m, 1,5H, 0,5 (H-2') és 5'OH); 4,40 (m, IH, H-3 ') ; 3,95 (m, IH, H-4 ' ) ; 3,65 (m, IH,

Hct-5 ’ és Ηβ-5') ; 2,58 (s, 3H, -SCH₃) .

23. Példa

9-(2-dezoxi-2-fluor-fl-D-ribofuranozil)-6-jód-purin előállítása θ/7 g, 2,7 mmól 6-jód-purint (Sigma Chemical Company) és 0,4 g, 1,7 mmól l-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -uracilt [előállítható a J.F. Codington és mtsai; J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 20 ml 10 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 2640 N. E. timidin-foszforilázt és 4360 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 21. napon a reakcióelegyet 5

- 59 ·· · ·· « · ··· Ο • · · ·· ···· ···· mmól/l-es, pH = 7, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel 50 ml-re hígítjuk, és 4000 N. E. timidin-foszforilázt és 6500 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 43. napon az elegyet vízzel 250 ml-re hígítjuk, és 2000 N. E. timidin-foszforilázt és 3250 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. Az 57. napon az elegyet szűrjük, a szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot meleg metanolban szuszpendál juk, majd szűrjük. A szűrletet bepároljuk, a visszamaradó anyagot víz és n-propanol 7:3 arányú elegyében oldjuk, majd 7,5 x 90 cm-es, Biogel P-2 (Bio-Rad) oszlopra visszük, eluensként víz és n-propanol 7:3 arányú elegyét alkalmazzuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot forró metanolban oldjuk, és csapadék képződéséig vizet adunk hozzá. A metanolt vákuumban eltávolítjuk. A szuszpenziót éjszakán át állni hagyjuk, majd szűrjük. A szűrőpogácsa tartalmazza a termék zömét. A szűrletet bepároljuk, és a fenti eljárást megismételjük, hogy további terméket csapjunk ki. A szűrőpogácsákat egyesítjük és vízben szuszpendál juk. Liofilizálás után a cím szerinti vegyületet nyerjük.

Op.: 198 - 200 °C (bomlik).

UV λ max nm (e x 10^-3): 0,ln HC1, 275 (11,1), 257 (váll); pH 7, 275 (11,1), 258 (váll); 0,ln NaOH, 276 (9,98), 257 (váll), 303 (Váll).

Elemzési eredmények a C H FIN 0 képlet alapján:

10 43 számított: C X = 31,60, Η X = 2,65, N X = 14,74, F X = 5,00, I X =33,39;

talált:

C X = 31,70, Η X = 2,70, N X = 14,69, F X = 4,96, 1 X = 33,48.

· *

- 60 iH-NMR (80 MHz, Me₂SO-d₆): <5 = 8,87 és 8,66 (2s, 2H, H-8 és H-2) ; 6,35 (dd, 1H, H-l', JF,1' = 17,0 Hz, J = 2,0 Hz); 5,76 (m, 1,5H, 0,5 (H-2') és 3’-OH); 5,14 (m, 1,5H, 0,5 (H-2') és 5’-OH); 4,51 (m, 1H, H-3'); 3,99 (m, 1H, H-4'); 3,70 (m, 2H, Ha-5' és HB-5').

24. Példa

9— (2—dezoxi—2—f luor-5—O—L—valinil-β—D—ribofuranozil) -adenin és bisz(hidrogén-klorid)-sójának előállítása

500 mg, 1,86 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin, 820 mg, 1,3 ekvivalens FMOC-L-valin és 10 mg DMAP 14 ml száraz DMF-ban készült oldatához 0 ’C hőmérsékleten, keverés mellett hozzáadunk 2 ml diklór-metánban oldott 520 mg, 1,35 ekvivalens DCC-t (diciklohexil-karbodiimid). Az elegyet hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, 90 percig keverjük, majd vákuumban bepároljuk. Etanollal való bepárlás után a visszamaradó anyagot kloroform és metanol 9:1 arányú elegyében felvesszük, majd szűrjük. A szűrletet bepároljuk, és szilicium-dioxidon flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként 5 és 10 % között növekvő etanol gradienst alkalmazunk kloroformban.

Az elsőként eluált frakció a 3',5·-bisz-észter, ennek mennyisége 230 mg, némi diciklohexil-karbamidot tartalmaz. A másodikként eluálódó frakció a 3'-monoészter, és a harmadikként eluálódó frakció az 5'-monoészter (190 mg).

Az 5'-FMOC-védett valinát-észtert 1 ml piperidinnek 4 ml DMF-ban készült oldatával reagáltatjuk szobahőmérsékleten 5 percig, majd vákuumban bepároljuk, a visszamaradó anyagot 25 ml vízben oldjuk, majd 30 ml kloroformmal mossuk. Az elegyből a vizet kidesztilláljuk, így színtelen gumiszerű anyagot nyerünk, amelyet vizes ecetsavban veszünk fel, bepároljuk, majd etanollal és éterrel együtt bepároljuk. így 100 mg 5'-O-valinát-észtert nyerünk higroszkópos amorf szilárd anyag formájában.

Elemzési eredmények aC H FNO 1,5 C CO H. 1,5 H0 képlet

15	21	6 4	3	2 2
alapján:
számított: C % = 44,53,	H %	= 6,23,	N	% = 17,32;
talált: C % = 44,38,	H %	= 6,32,	N	% = 16,94.
Op.: 150 °C fölött bomlik

A bisz(hidrogén-klorid)-sót úgy készítjük, hogy az 5'-O-valinát-észtert izopropanolban feloldjuk, majd gén-klorid gázzal telített izopropanolt adunk oldószert lepároljuk. A kapott fehér, szilárd előzetesen hidroaz elegyhez, és az anyagot metanolban felvesszük, és éterrel 0 °C hőmérsékleten kicsapjuk. Szűrés után nyerjük a bisz(hidrogén-klorid)-sót.

talált:

C % = 40,26,

H FN 0 .2HC1 6 4 = 5,37,

H % = 5,19,

0,5

H^0 képlet alapján: = 18,67;

Op.: 210-213 ’C (bomlik).

25. Példa

2-Amino-9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -9H-purin-bisz-hidrogén-klorid-só előállítása

300 mg, 1,11 mmól 2-amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin 20 ml metanolban készült oldatához 2,5 ml, előzetesen hidrogén-klorid gázzal telített izopropanolt adunk. Az oldathoz 15 ml acetont adunk, majd szobahőmérsékleten vákuumban közel szárazra pároljuk. A visszamaradó anyagot 15 ml etilacetáttal eldörzsöljük. Fehér, szilárd anyag képződik, amelyet kiszűrünk és éterrel mosunk.

• » ·

- 62 képlet alapján:

Op.: 160 - 163 °C (bomlik)

Elemzési eredmények a C

C % = 35,01,

N 0 .2 HC1 5 3 = 4,12, számított:

talált:

C % = 34,79, = 4,23,

5,66.

26. Példa

2,6-Diamino-9-(2-dezoxi~2-f luor-B-D-ribofuranozil) -9H- purin-bisz(hidrogén-klorid)-só előállítása

300 mg, 1,06 mmól 2,6-diamino-9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin 30 ml metanolban készült oldatához 2 ml, előzetesen hidrogén-klorid gázzal telített izopropanolt adunk.

Az oldatot kis térfogatra, mintegy ml-re pároljuk be szobahőmérsékleten, majd 15 ml etanol hozzáadásával kicsapjuk a bisz(hidrogén-klorid)-sót.

Fehér, szilárd anyagot nyerünk.

Op.: 165 - 168 °C (bomlik)

Elemzési	eredmények a C	H	FN 0 .
	10	13	6 3
számított	: C % = 33,62,	H	% = 4,23
talált:	C % = 33,54,	H	% = 4,24

2HC1 r

képlet alapján:

27. Példa

9—(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -guanin-nátrium-só előállítása mg, 0,175 mmól 9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-guaninhoz 7 mg nátrium-hidroxid 2 ml vízben készült oldatát adjuk, és az elegyet enyhén melegítjük tiszta oldat nyeréséig. Az oldatot ezután liofilizáljuk, így a cím szerinti vegyületet fehér, szilárd anyag formájában nyerjük. Op.: 185 - 190 °C (bomlik)

Elemzési eredmények a C H FN 0 N, 1,75 H 0 képlet alapján:

		10	11	5 4		2
számított:	C	% = 35,45,	H %	= 4,31,	N	% = 20,67;
talált:	C	% = 35,59,	H %	= 4,33,	N	% = 20,64.

28. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -guanin-hidrogén-klorid előállítása

300 mg, 1,05 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin 200 ml metanolban készült oldatához 2 ml, előzőén hidrogén-klorid gázzal telített izopropanolt, majd 50 ml acetont adunk. Az oldatot kis térfogatra, mintegy 30 ml-re bepároljuk, 150 ml acetont adunk hozzá, majd ismét kis térfogatra bepároljuk. Ezt a műveletet megismételjük úgy, hogy a végső térfogat 10 ml legyen. Az anyaghoz 20 ml etanolt, majd 40 ml etil-acetátot adunk. Állás közben az elegyből a termék fehér, szilárd anyagként csapódik ki.

Op.: 192 - 193 °C (bomlik)

Elemzési eredmények aC H FNO 0,4H0 képlet alapján: 10 12 5 4 2 talált:

C % = 36,50, H % = 4,54,

N % = 21,36, F % = 10,90.

29. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-fi-D-ribofuranozil) -adenin-hidrogénklorid előállítása

500 mg, 1,86 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin 40 ml metanolban készült oldatának és 10 ml víznek az elegyéhez 15 ml, előzőleg hidrogén-klorid gázzal telített izopropanol-oldatot adunk. Az oldatot vákuumban szobahőmérsékleten bepároljuk, majd 25 ml etil-acetáttal eldörzsöljük. így a cím szerinti vegyületet nyerjük fehér, szilárd anyag formájában.

Op.: 205 - 210 °C (bomlik)

Elemzési eredmények a C H FN 0 HC1 képlet alapján:

		10	12	5 3
számított:	C	% = 39,29,	H %	= 4,29,	N	% = 22,91,	Cl	% = 11,60;
talált:	C	% = 39,36,	H %	= 4,34,	N	% = 22,89,	Cl	% = 11,52.

30. Példa

9- (2-dezoxi—2-fluor-B-D-ribofuranozil) -adenin-5' -monofoszfát előállítása

0,47 g, 1,7 mmól, a 8. példa szerint előállított 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenint 7 ml 1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)-pirimidinonban oldunk. Az oldatot -8 °C hőmérsékletre hűtjük jég/metanol fürdőben, majd erős keverés mellett 0,64 ml, 7 mmól foszfor-oxi-kloridot adunk hozzá. 3 perc múlva a reakciót 10 ml hideg víz hozzáadásával leállítjuk. Az elegyet 15 percig jégfürdőben tartjuk, majd ammónium-hidroxiddal pH = 8-ra semlegesítjük.

A reakcióterméket DEAE Sephadex A-25 anioncserélőn való kromatografálással különítjük el. Az elegyet 600 ml vízzel hígítjuk, majd előzetesen 50 mmól/l-es ammónium-hidrogén-karbonáttal egyensúlyba hozott 80 ml DEAE Sephadex Α-25-t tartalmazó kromatográfiás oszlopra visszük. Az oszlopot 2,5 liter 50 mmól/les ammónium-hidrogén-karbonáttal mossuk a szervetlen foszfát eltávolítására. A nukleotidokat 2 liter 50 és 500 mmól/1 közötti gradiensű ammónium-hidrogén-karbonáttal eluáljuk. Elsőként a 9(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin-5'-monofoszfát eluálódik, majd ezt követi a 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -adenin-3 ', 5 ¹ -bif oszf át . Mindkét nukleotidot tartalmazó frakciókat gyűjtjük és vákuumban szárítjuk a víz és az ammónium-hidrogén-karbonát eltávolítására.

A 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -adenin-5 ' -monofoszfátot a fenti reakcióval ammóniumsó formájában nyerjük, de gyógyászati szempontból a nátriumsó kívánatos ebben az esetben. Az ammóniumsót Dowex 50 ioncserélő gyanta alkalmazásával nátriumra cseréljük. 1,3 mmól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) adenin-5’-monofoszfátot 10 ml vízben felveszünk, és 10 ml nátrium formájú BioRad AG50W-X8 ioncserélő gyantát tartalmazó oszlopra visszük. A gyantát alkalmazás előtt vízzel hozzuk egyensúlyba. A nukleotidot vízzel eluáljuk. A 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin-5'-monofoszfátot tartalmazó frakciókat egyesítjük, és liofilizáljuk. így 72 %-os hozammal 0,49 g, 1,2 mmól terméket nyerünk.

¹H-NMR d (d₆-DMSO): δ = 8,0 (IH, s, H-2), 7,7 (IH, s, H8), 5,7 és 5,9 (IH, d, H-l', hasítás H-2'-vel, F), 4,8 és 5,0 (IH, dd, H-2’, hasítás H-l’-vei, F), 4,1 (IH, m, H-3'), 3,9 (IH, m, H-4'), 3,6 (2H, m, H-5’) ¹H-NMR d (P₂_0) ; «5 8,5 (IH, s, H-2), 8,2 (IH, s, H8) , 6,3 és 6,5 (IH, d, H-l', hasítás H-2'-vei), 5,3 és 5,6 (IH, d, H-2', hasítás H-l'-vei, F), 4,7 (IH, m, H-3'), 4,4 (IH, m, H-4'), 4,1 (2H, m, H-5')

31P NMR d (D₂_O) δ = 1,46 (s)

UV spektrum: 0,1 mól/l-es, HCl-ban, max 256 nm-nál; 400 mmól/1es ammónium-foszfátban, pH 5,5 max 259 nm-nél; 50 mmól/l-es kálium-foszfátban, pH 7,0 max 259 nm-nél; 0,1 mól/l-es NaOH A max 259 nm-nél.

- 66 Tömegspektrum alapján két fő csúcsot észlelünk 270 és 136 molekulaion fragmens tömegnél, amelyek a 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adeninnek felelnek meg.

A nukleozid teljes hasítását észleljük 5'-nukleotidázzal (Sigma) való inkubálást követően.

A bázis/foszfát arány = 1,00/1,03. Az össz-foszfát koncentrációt Ames, B.N. [Methods in Enzymology 8. kötet, 115-118. old., 1966] módszerével határozzuk meg. A nukleobázis koncentrációját a nukleozid UV ektinkciós koefficiensének alkalmazásával határozzuk meg.

31. Példa

9-(2—dezoxi—2—fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin-5·-monofoszfát (FMAP) előállítása

1,2 mg, 4,3 Mmól, a 8. példa szerint előállított 9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -adenint 22 Mmól p-nitro-fenilfoszfátot (1 mól/l-es törzsoldat ecetsavval pH = 5,4-re állítva) és 0,05 ml Serratia marcescens nukleozid-foszfotranszferázt [A. Fyfe és mtsai., J. Bioi. Chem. 253. 8721-8727 (1978) és a 4 136

175 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, 1979. január 23] vízzel 0,22 ml végtérfogatra elegyítünk. Az elegyet éjszakán át 37 °c hőmérsékleten inkubáljuk. A teljes reakcióelegyet cellulóz preparatív vékonyrétegkromatográfiás lemezre viszszük fel, kifejlesztőszerként n-propanol: 15 mól/l-es ammóniumhidroxid:víz 6:3:1 arányú elegyét alkalmazzuk. A lemez megszárítása után a nukleotidot tartalmazó területeket lekaparjuk és a nukleotidot a cellulózról vízzel eluáljuk. így 25 %-os hozammal 1,1 Mmól 9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-adenin-5 ’ « · «

- 67 -monofoszfátot nyerünk.

UV spektrum vízben: fi max 257 nm-nél.

Ezt a vegyületet lúgos foszfatázzal és 5 · -nukleotidázzal teljesen hasítjuk, a 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin nukleozidot nyerjük.

Bázis/foszfát arány = 1:8, ez az érték szervetlen foszfáttal való szennyezettséget jelöl.

32. Példa

9-(2-Dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-adenin-3·,5'bifoszfát előállítása

A 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -adenin-3 ' , 5 ' -bifoszfátot ammóniumsó formájában nyerjük a 30. példában ismertetett, az ioncserélő oszlopról lejövő frakciók bepárlásával. 20 %-os hozammal 0,35 mmól terméket nyerünk.

A terméket Pl nukleázzal (Boehringer Mannheim) lúgos foszfatázzal (Boehringer Mannheim), 3-nukleotidázzal (Sigma) és 5'-nukleotidázzal való inkubálás után vékonyrétegkromatográfiás lemezen adott foltjainak mintájával jellemezzük. A lúgos foszfatáz a 9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -adenin-3 ', 3 ' -bifoszfátot teljesen hasítja az alap nukleozidra, a nukleáz Pl és a 3-nukleotidáz 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -adenin-5' -monofoszfáttá hasítja, az 5'-nukleotidáz nem hasítja. Az eredmények megegyeznek azzal, ami ezekről az enzimekről, valamint más, ismert nukleozid-foszfát analógokról tudott.

UV spektrum: 400 mmól/l-es ammónium-foszfátban pH = 5,5 max 259 nm-nél.

• · ·

33. Példa

9-(2-Dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -guanin-5 ’ -monofoszfát előállítása

0,9 mg, 2,9 μπιόΐ, a 7. példa szerint előállított 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanint, 15 Mmól p-nitro-fenilfoszfátot (1 mól/l-es törzsoldat ecetsawal pH = 5,4-re állítva) és 0,04 ml Serratia marcescens eredetű nukleozid-foszfotranszferázt [Fyfe és mtsai., J. Bioi. Chem. 253. 8721-8727 (1978) és a 4 136175 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] vízzel elegyítünk és 0,15 ml végtérfogatra egészítünk ki. Az elegyet éjszakán át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A teljes reakcióelegyet preparatív vékonyrétegkromatográfiás lemezre visszük, kifejlesztőszerként n-propanol 15 mól/l-es ammónium-hidroxid:víz 6:3:1 arányú elegyét alkalmazzuk. A lemez megszáradása után a nukleotidot tartalmazó területet lekaparjuk, és a nukleotidot a cellulózról vízzel eluáljuk. 11 %-os hozammal 0,33 Mmól 9-(2dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin-5'-monofoszfátot nyerünk. UV spektrum: vízben, max 248 nm-nél, váll 267 nm-nél.

Ezt a vegyületet lúgos foszfatáz teljesen hasítja, 5’-nukleotidáz hatására a 9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-guanin nukleozid képződik.

Bázis/foszfát arány = 1:30, ez szervetlen foszfát szennyeződés jelenlétére utal.

34. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -guanin-5 · -monof osztat (FGMP) előállítása

0,0158 g, 5,2 x 10”⁵ mól 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofurano • ·

- 69 zil)-guanint 0,2 ml trietil-foszfátban oldunk és -8 °C hőmérsékletre hűtjük. Az oldathoz keverés közben, egyszerre hozzáadunk 0,015 ml, 1,6 x 10^-4 mól foszfor-oxi-kloridot, és a reakcióedényt alumínium fóliával fedjük, hogy a reagenseket a fénytől védjük. Az elegy hőmérsékletét hagyjuk 0 ’C-ra emelkedni, és az elegyet 4 órán át keverjük. A reakciót ezután jég hozzáadásával, majd a pH értéknek 1 n nátrium-hidroxiddal 7-re való állításával leállítjuk. A vizes oldatot 2 x 2 ml diklór-metánnal extraháljuk. A vizes oldat pH-ját ezután visszaállítjuk 7,5-re.

A vegyületet a 30. példában a 2'-FAMP esetén megadotthoz hasonlóan DEAE Sephadex kromatográfiás úton tisztítjuk, de 50 és 600 Mmól/1 közötti ammónium-hidrogén-grádienst alkalmazunk. 40 %os hozammal 9 mg, 0,02 mól diammónium-sót nyerünk.

UV spektrum: 0,1 mól/l-es HCl-ban max 254 nm-nél, váll 275 nmnél.

A vegyületet lúgos foszfatáz teljesen hasítja, 5’-nukleotidázzal 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin nukleozidot nyerünk.

Bázis/foszfát arány = 1,0/0,90.

35. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -guanin-5 * -trifoszfát (FGTP) előállítása

A trifoszfátot enzimes szintézissel állítjuk elő az 5'-monofoszfátból. 5 mg, 12 Mmól, a 34. példa szerint előállított 2’-FGMP-t 37 °C hőmérsékleten 2 ml végtérfogatban a következő anyagokkal inkubálunk (a koncentrációk a végtérfogatra vonatkoznak) : 10 mmól/1 adenozin-trifoszfát, 50 mmól/1 kálium-PIPES pH = ·· ·· • · · · • · ♦ • · · · ·

- 70 6,8, 10 mmól/1 magnézium-klorid, 12,5 mmól/1 foszfoenol-piruvát,

N.E./ml nukleozid-difoszfát-kináz (Boehringer Mannheim), 0,77 N. E./ml guanilát-kináz (Boehringer Mannheim) és 20 N. E./ml piruvát-kináz (Boehringer Mannheim). Analitikai ioncserélő kromatográfiás eljárással kevés 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin-5'-difoszfát (FGDP) jelenlétét észleljük, de a termék túlnyomó része 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -guanin-5 ’ -trifoszfát. Ez utóbbit preparatív ioncsererélő nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással Whatman Partisii SAX Magnum 9 oszlopon izoláljuk, és 10 mmól/1 és 1 mól/1 közötti grádiensű, pH = 3,5 kálium-foszfáttal eluáljuk. A 2'-FGTP tartalmú frakciókat DEAE Sephadex gyantán a 30. példában leírt módon tovább tisztítjuk. A frakciók megszárítása után 7 mg 2'-FGTP-t nyerünk diammónium-só formájában. 80 %-os hozammal 10 gmól terméket nyerünk .

UV spektrum: 0,1 mól/l-es HCl-ben |\ max 254 nm-nél, váll 275 nm-nél; 0,1 mól/l-es NaOH-ban (( max 255 - 262 nm-nél.

Bázis/foszfát arány = 1,0/2,5.

36. Példa

9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -guanin-5 · -trif oszfát előállítása mg, 120 gmől, a 34. példa szerint előállított 2'-FGMP-t 37 °C hőmérsékleten 20 ml végtérfogatban a következő anyagokkal inkubálunk (a koncentrációk a végtérfogatra vonatkoznak): 10 mmól/1 adenozin-trifoszfát, 50 mmól/1 kálium-PIPES, pH = 6,8, mmól/1 MgCl₂, 12,5 mmól/1 foszfoenol-piruvát, 4 N. E./ml nukleozid-difoszfát-kináz (Boehringer Mannheim), 0,77 N. E./ml • 4 • · · 4 ·

4 · · · · 4

4 « 4 4 4 4

- 71 guanilát-kináz (Boehringer Mannheim) és 20 N. E./ml piruvát-kináz (Boehringer Mannheim). Analitikai ioncserélő nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással kevés 9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-guanin-5'-difoszfát jelenlétét észleljük, de a termék fő tömegét as 9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-guanin-5 ' -trifoszfát teszi ki. Ezt a terméket preparatív ioncserélő nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással Whatman Partisii SAX Magnum 9 oszlopon elválasztjuk, és 10 mmól/1 és 1 mmól/1 közötti grádiensű, pH = 3,5 kálium-foszfáttal eluáljuk. A 2'-FGTP tartalmú frakciókat a 30. példában leírt módon DEAE Sephadex oszlopon tisztítjuk. A frakciók megszárítása után 50 mg 2*-FGTP-t nyerünk diammónium-só formájában, de ez adenozin-difoszfáttal, 2'-FGDPtal és adenozin-trifoszfáttal szennyezett. Ismételt tisztítást végzünk preparatív nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárással DEAE Sephadex oszlopon. 50 %-os hozammal 36 mg, 63 μπιόΐ triammónium-sót nyerünk.

UV-spektrum: 0,1 mól/l-es HCl-ben max 254 nm-nél, váll 275 nm-nél.

Bázis/foszfát arány = 1,0/2,9.

37. Példa

2,6-Diamino-9-(2-dezoxi-2-f luor-3,5-di-0-pivaloil-fl-D-ribofuranozil)-9H-purin és 2,6-diamino-9-(2-dezoxi-2-fluor-5-Opivaloil-B-D-ribofuranozil)-9H-purin előállítása

100 mg, 0,35 mmól 2,6-diamino-9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin 3 ml DMF-ban készült oldatához és 0,3 ml Et₃N-hez 78 μΐ trimetil-ecetsavanhidridet adunk, és az oldatot szobahőmérsékleten éjszakán át keverjük. További 80 μΐ trimetil72 • · ·« * • · · · • · · · · • · · ·· · • · · · · 9 · ecetsavanhidrid hozzáadása után az elegyet további 3 napon át keverjük. Ezután az elegyhez metanolt adunk, vákuumban bepároljuk, majd szilicium-dioxidon flash-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Eluensként kloroform és metanol (30:1), (20:1), (10:1), (6:1), (4:1) és végül (3:1) tömeg/térfogat arányú elegyét alkalmazzuk. Éterrel való eldörzsölést követően 74 mg biszésztert nyerünk színtelen, félszilárd anyag formájában.

A kapott termék olvadáspontja 143 - 145 °C (bomlik).

Nagy felbontású tömegspektrum (E.I.):

A C^5 H₂i FNg O₄ képlet alapján számított: 368,1608, talált: 368,1612.

A megfelelő frakciók összegyűjtésével és bepárlásával 16 mg mono-5'-pivalát-észtert is nyerünk.

A kapott termék olvadáspontja 123 - 125 °C.

Nagy felbontású tömegspektrum (E.I.):

A C₂q H₂9 FNg O5 képlet alapján számított: 452,2183, talált: 452,2181.

38. Példa

2-Amino-6-benzil-amino-9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin előállítása

0,2 g, 0,83 mmól 2-amino-6-benzil-amino-purint és 0,244 g, 1 mmól 1- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -uracilt 10 ml 10 mmól/l-es pH = 6,8 kálium-foszfát-puf f errel elegyítünk. Az elegyhez 8200 egység timidin-foszforilázt és 7850 egység purinnukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20. 3615 (1981) és a 4 381 444 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és az elegyet 45 °C hőmérsékleten 40

órán át keverjük. A termék elkülönítését 15 ml metanol hozzáadásával végezzük. Az elegyből a szilárd anyagot kiszűrjük, a szűrletből a metanolt 10 ml szilikagél jelenlétében lepároljuk. A száraz gélt 5 x 23 cm-es, szilicium-dioxiddal töltött oszlop tetejére visszük, és a terméket kloroform és metanol 99:1 arányú elegyével eluáljuk. Azokat a frakciókat, amelyek kizárólag a terméket tartalmazzák, egyesítjük, az oldatból az oldószert vákuumban eltávolítjuk. így 0,087 g 2-amino-6-benzil-amino-9-(2dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purint nyerünk.

ÍH-NMR (200 MHz): 6 7,95 (s, 1 Η, H8), 7,85 (b, 1H, NH), 7,2-7,5

(m,	5H,	fenil), 6,	04 (dd,	1H,	«1',J,l*	= 16,4 HZ, J = 3,1 HZ)
5,93	C b,	2H, NH2),	5,64 (d,	1H,	OH, J =	5,9 Hz) , 5,44, 5,17 (dt,
1H,	h2) ,	5,26 (t,	1H, OH5	') ,	4,64 (b,	2H, CH2), 4,38 (m, 1H

H₃.), 3,9 (b, 1H, H₄«), 3,5-3,75 (m, 2H, H₅i).

A fenti vegyület redukálását V.du Vigneaud és O.K. Behrens [J. Bioi. Chem. 117. 27 (1937)] eljárásával végezzük.

39. Példa

2-Amino-6-benzil-tio-9-(2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) 9H-purin előállítása

0,8 3,1 mmól 2-amino-6-benzil-tio-purint (Sigma Chemical

Company) és 0,4 g, 1,7 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [amely előállítható J.F. Codington és mtsai, J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 20 ml 10 mmól/l-es pH = 7,0,

0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 2640 N. E. timidin-foszforilázt és 4360 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a 4 381 344 számú • · ·

- 74 amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, és a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten keverjük. A 21. napon a reakcióelegyet 150 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferrel meghígítjuk és 4000 N. E. timidin-foszforilázt és 290 N. E. purin-nukleozidfoszforilázt adunk hozzá. A 43. napon a reakcióelegyet vízzel 250 ml-re hígítjuk, majd 2000 N. E. timidin-foszforilázt és 3250 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá. A 69. napon az elegy pH-ját kálium-hidroxiddal 7,1-re állítjuk. A 77. napon a reakcióelegyet bepároljuk. A visszamaradó anyagot forró metanol és víz elegyében oldjuk, majd 2,5 x 7 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantára visszük, a terméket metanol és víz 9:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldatból az oldószert vákuumban lepároljuk. A visszamaradó anyagot acetonitril és víz 49:1 arányú elegyében oldjuk, és 2,5 x 20 cm-es, szilikagél 60 (EM Science) töltetű oszlopra visszük. A terméket acetonitril és víz 49:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és az oldószert lepároljuk az oldatról. A visszamaradó anyagot vízben szuszpendáljuk és liofilizáljuk. így 0,201 g cím szerinti vegyületet nyerünk, amely elemzés szerint 0,1 hidrátnak bizonyul. Op.: 180 °C.

UV Amax nm (€ x 10~³): 0,ln HC1, 322,5 (11,8), 250 (10,6); pH 7,

311,5 (14,2), 247 (14,3); 0,ln NaOH, 312 (14,0), 247 (13,5).

Elemzési eredmények aC H FNOS.O,1HO képlet alapján:

18 5 3 2 számított: C X = 51,93, Η X = 4,66, N X = 17,81, F X = 4,83, S X = 8,15;

talált:

C X = 51,96, Η X = 4,66, N X = 17,86, F X = 4,68, SX=8,15.

• · *· ·· ·· • · • · * · • « · • · ··»· »

- 75 ^XH-NMR (300 MHz, Me₂SO-d₆) : <5 = 8,19 (s, IH, H-8) , 7,47 (látszólagos d, 2H, Ar, J = 7,6 Hz), 7,28 (m, 3H, Ar) , 6,74 (széles s,

2H, 2-NH₂), 6,10 (dd, IH, H-l', JF, 1' = 16,6 Hz, J = 2,4 Hz),

5,68 (d, IH, 3'-OH, J = 6,4 Hz), 5,32 (ddd, IH, H-2’, Jp.2’ =

53,0 Hz, Ji»_/2· = 2,4 HZ, J₂ · , 3 · = 4,4 Hz, 5,15 (t, IH, 5'-OH,

J = 6,0 Hz, 4,55 (ab kvartett, 2H, 6-SCH₂» , geminális J = -13,7 Hz), 4,41 (m, IH, H-3·), 3,94 (m, IH, H-4'), 3,74 (m, IH, Ha-5'), 3,58 (m, IH, HB-5').

40. Példa

2,6-Diamino-9- (2-dezoxi-2-f luor-B-D-ribofuranozil) -9H-purin előállítása

2,0 g, 12,7 mmól 2,6-diamino-purint (Pacific Chemical Laboratories) és 0,8 g, 3,3 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [előállítható J.F. Codington és mtsai, J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 500 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0,

0,04 tömeg/térfogat% kálium-azid tartalmú kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 41 700 Ν. E. timidinfoszforilázt és 83 300 Ν. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a

381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, az enzimeket 10,5 g, 25 ml DEAE-cellulózon abszorbeált állapotban alkalmazzuk, majd a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten rázzuk. 24 óra múlva a szuszpenzióhoz 2,0 g 1,6-diamino-purint adunk, majd a hőmérsékletet 50 °C-ra emeljük. További 24 óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük. A szűrőpogácsát vízzel mossuk, a szűrleteket egyesítjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot forró vízben oldjuk, a pH-t 9,4-re állít• · «e · ·«· ···* *

juk ammónium-hidroxiddal. Az oldatot 2,5 x 13 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd a terméket metanol és víz 9:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldatról az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot az előzőek szerint kezeljük. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk és liofilizáljuk. így 0,89 g cím szerinti terméket nyerünk, amely elemzés szerint 0,5 hidrát formájú.

Op.: 125 - 127 °C.

UV T. max nm (€ χ 10³): pH 7, 279,5 (9,52), 256 (9,06);

eredmények

képlet alapján f

talált

igazoltuk

41. Példa

2-Amino-9-(2—dezoxi—2—f luor-B-D-ribofuranozil) -9H-purin előállítása

3,0 g, 22,2 mmól 2-amino-purint (Pacific Chemical Laboratories) és 0,5 g, 2,0 mmól 1-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -uracilt [előállítható J.F. Codington és mtsai, J. Org. Chem. 29, 558, (1964) eljárásával] 25 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 41 700 N. E. timidinfoszforilázt és 83 300 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20, 3615 (1981) és a • » « ♦ ··· * 9 · · ·«·« ·· ···· e

- 77 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, az enzimeket 10,5 g, 25 ml DEAE-cellulózon abszorbeált formában alkalmazzuk, majd a szuszpenziót 37 °C hőmérsékleten rázzuk. 24 óra múlva az elegyhez 3,0 g 2,6-diamino-purint adunk, majd az elegy hőmérsékletét 50 °C-ra emeljük. További 24 óra múlva a reakcióelegyet szűrjük. A szűrőpogácsát vízzel mossuk, a szűrleteket egyesítjük, és az oldószert a szűrletből vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot vízben szuszpendáljuk és szűrjük. A szűrőpogácsát 25 °C hőmérsékletű vízzel extraháljuk, amíg termék már nem marad benne. A szűrleteket egyesítjük, az egyesített szűrletek pH-ját ammónium-hidroxiddal 9,4-re állítjuk, majd az oldatot 2,5 x 20 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd a terméket metanol és víz 9:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldatból az oldószert vákuumban eltávolítjuk. A visszamaradó anyagot kloroform:metanol:víz 75:25:4 arányú elegyében oldjuk, és az oldatot 5 x 25 cm-es, szilikagél 60-nal töltött oszlopra visszük. A terméket kloroform:metanol:víz 75:25:4 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és az oldószert vákuumban lepároljuk. A visszamaradó anyagot forró vízben oldjuk, majd 0,22 gm pórusú membránszűrőn szűrjük. A szűrletet liofilizáljuk, így 0,50 g cím szerinti vegyületet nyerünk, amely elemzés szerint 0,5 hidrát formájú. Op.: 153 - 155 °C.

UV Amax nm (ε x 10³) : pH 7, 304 (6,35), 243,5 (5,95) • 9 ·· * ··

képlet alapján

Elemzési eredmények a C % = 43,17, számított: C

H FN 0 .0,5

3 = 4,71,

H % talált

4,74, % = 25,11, F % = 6,89

A termék szerkezetét

ÍH-NMR vizsgálattal igazoltuk

42. Példa

2-Amino-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -6-metoxi-9H-purin előállítása

2,0 g, 12 mmól 2-amino-6-metoxi-purint [előállítható R.W. Balsiger és J.A. Montgomery; J. Org. Chem. 20, 1573 (1960)] eljárásával] és 0,88 g, 3,6 mmól l-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-uracilt [előállítható J.F. Codington és mtsai, J. Org. Chem. 29. 558, (1964)] eljárásával] 250 ml 5 mmól/l-es, pH = 7,0, 0,04 tömeg/térfogat% kálium-azidot tartalmazó kálium-foszfát-pufferben szuszpendálunk. A szuszpenzió pH-ját kálium-hidroxiddal 7,0-ra állítjuk. A szuszpenzióhz 41 700 N. E. timidin-foszforilázt és 83 300 N. E. purin-nukleozid-foszforilázt [Krenitsky T.A. és mtsai, Biochemistry, 20. 3615 (1981) és a 4 381 344 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás] adunk, az enzimeket

10,5 g, 25 ml DEAE-cellulózon abszorbeált formában alkalmazzuk, és a szuszpenziót 37 ^eC hőmérsékleten rázzuk. 24 óra múlva 1,0 g 2-amino-6-metoxi-purint és 250 ml fenti puffért adunk az elegyhez, és hőmérsékletét 50 ’C-ra emeljük. További 24 óra múlva a reakcióelegyet leszűrjük. A szűrőpogácsát vízzel mossuk, a szűrleteket egyesítjük és az oldószert vákuumban lepároljuk róluk. A visszamaradó anyagot meleg vízben oldjuk, az oldat pH-ját ammónium-hidroxiddal 9,4-re állítjuk. Az oldatot 2,5 x 15 cm-es, hidroxid formájú Bio-Rad AG1X2 anioncserélő gyantával töltött *· ·

V ♦ ·

- 79 oszlopra visszük. Az oszlopot vízzel mossuk, majd a terméket metanol és víz 9:1 arányú elegyével eluáljuk. A terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban lepároljuk. A visszamaradó anyagot meleg víz és metanol elegyében oldjuk, majd 0,22 μιη-es pórusú nylon membránszűrőn szűrjük. A szűr letet liofilizáljuk. így 0,91 g cím szerinti vegyületet nyerünk, amely elemzés szerint 0,5 hidrát formájú.

Op.: 200 °C

UV 2\max nm (e x 10³): pH 7, 279,5 (9,24), 247,5 (9,99).

Elemzési eredmények aC H FN O .0,5 H 0 képlet alapján:

14 5 42 számított: C % = 42,86, H % = 4,90, N % = 22,72, F % =6,16;

talált: C % = 42,93, H % — 4,90, N % = 22,73, F % =6,15.

A termék szerkezetét l-H-NMR vizsgálattal igazoltuk.

43. Példa

2-Amino-6-benzil-oxi-9- (2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -9H-purin előállítása

2,5 g, 10,3 mmól 2-amino-6-benzil-oxi-purint és 2,64 g, 10,8 mmól 2’-dezoxi-2’-fluor-uridint 50 ml 10 mmól/l-es, pH = 6,8 kálium-foszfát-pufferben elegyítünk, és 8000 egység timidin-foszforilázt és 21 600 egység purin-nukleozid-foszforilázt adunk hozzá, és az elegyet 45 ^eC-on keverjük. 5 nap múlva az elegyhez további 16 000 egység timidin-foszforilázt és 21 600 egység purin-nukleozid-foszforilázt adunk, és az elegyet 45 °C hőmérsékleten 48 órán át keverjük. A termék többségét a csapadék tartalmazza, amelyet az elegyből kiszűrünk és metanolban oldjuk. A terméket kromatográfiás eljárással szilicium-dioxidon tisztítjuk, eluensként etil-acetát:kloroform:metanol 8:1:1 arányú elegyét • · ··· « e • · · ···· ·♦ ···· ·

- 80 alkalmazzuk. A kizárólag a terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük, és az oldószert lepároljuk az oldatról. így 1,44 g 2-amino-6-benzil-oxi-9-(2-dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil) -9H-purint nyerünk.

iH-NMR (200 MHz, DMSO): δ = 8,11 (s, ΙΗ, H8), 7,3-7,5 (m, 5H, fenil), 6,59 (b, 2H, NH₂), 6,09 (dd, 1H, Hp, J_F/1. = 16,5 Hz, J = 2,6 HZ), 5,66 (d, 1H, OH, J = 6,1 Hz), 5,48 (s, 2H, CH₂), 5,25,

5,53 (szeles d, 1H, H₂), 5,20 (m, ΙΗ, OH51), 4,3-4,5), m, 1H, H₃.), 3,9 (b, 1H, H₄i), 3,5-3,8 (m, 2H, H₅i).

A 7. példa szerinti vegyületet 2-amino-6-benzil-oxi-9-(2dezoxi-2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purinból állítjuk elő El Amin és mtsai., J. Org. Chem., 44, 3442 (1979) eljárásával.

A következőkben gyógyászati készítmények előállítását ismertetjük.

Az alábbi formálási példákban hatóanyag megjelölésen bármely (I) általános képletű vegyületet vagy gyógyászati célra alkalmas sóját értjük, például a 6., 7., 9. vagy 12. példák szerint előállított vegyületeket.

1. Formálási példa

Tabletták készítése

Az alábbi A, B és C példákban az összetevőket Povidone oldattal nedvesen granuláljuk, majd az elegyhez magnézium-sztearátot adunk és préseljük.

	ma/tabletta	ma/tabletta
A készítmény
(a) Hatóanyag	250	250
(b) Laktóz B.P.	210	26
(c) Povidone B.P.	15	9
(d) Nátrium-keményítő-glikolát	20	12
(e) Magnézium-sztearát	5	3
300	300
	mer/tabletta	ma/tabletta
B készítmény
(a) Hatóanyag	250	250
(b) Laktóz B.P.	150	-
(c) Avicel PH 101	60	26
(d) Povidone B.P.	15	9
(e) Nátrium-keményítő-glikolát	20	12
(f) Magnézium-sztearát	5	3
500	300
	ma/tabletta
C készítmény
Hatóanyag	100
Laktóz B.P.	200
Keményítő	50
Povidone	5
Magnézium-sztearát	4
	359

Az alábbi D és E példákban az egymással elegyített összetevőket közvetlenül préseljük.

D készítmény mg/kapszula

Hatóanyag

250

Előzselatinizált keményítő NF15

150

400

E készítmény mq/kapszula

Hatóanyag

250

Laktóz

150

Avicel

100

500 készítmény (szabályozott felszabadulású készítmény) készítményt az alábbi összetevőknek povidone oldattal való nedves granulálásával, majd a granulumhoz magnézium-sztearát hozzáadásával és az elegy préselésével készítjük.

mg/tabletta

(a)	Hatóanyag	500
(b)	Hidroxi-propil-metil-cellulóz	112
	(Methocel K4M Prémium)
(c)	Laktóz B.P.	53
(d)	Povidone B.P.C.	28
(e)	Magnézium-sztearát	__7
		700

A hatóanyag felszabadulása mintegy 6-8 óra alatt történik, a teljes felszabadulás 12 óra alatt történik meg.

- 83 2. Formálási példa

Kapszulák készítése

A készítmény

A kapszula készítményt az 1. formálási példa D készítményének összetevőiből készítjük, az összetevőket elegyítjük, és kétrészes keményzselatin kapszulába töltjük.

B készítmény mq/kapszula

(a)	Hatóanyag	250
(b)	Laktóz B.P.	143
(c)	Nátrium-keményítő-glikolát	25
(d)	Magnézium-sztearát	2 420

A kapszulákat a fenti összetevők elegyítésével, és kétrészes keményzselatin kapszulába töltésével készítjük.

C készítmény mq/kapszula (a) Hatóanyag 250 (b) Macrogol 4000 BP 350

600

A kapszulákat úgy készítjük, hogy a Macrogol 4000 B.P.-t felolvasztjuk, a hatóanyagot az olvadékban diszpergáljuk, majd az olvadékot kétrészes keményzselatin kapszulákba töltjük.

- 84 D készítmény

Hatóanyag

Lecitin

Földimogyoróola j mq/kapszula

250

100

100

450

A kapszulákat úgy készítjük, hogy a hatóanyagot lecitinben és földimogyoróolajban diszpergáljuk, majd a diszperziót lágy, rugalmas zselatin kapszulákba töltjük.

E készítmény (szabályozott felszabadulású készítmény)

Az alábbi szabályozott felszabadulású kapszula készítményt az (a) , (b) és (c) összetevőknek extruderen való extrudálásával, majd az extrudátumok gömbökké alakításával és szárításával, ezt követően a száraz szemcséknek a felszabadulást szabályozó (d) membránnal való bevonásával, és a készítménynek kétrészes keményzselatin kapszulába való töltésével állítjuk elő.

mq/kapszula

(a) Hatóanyag	250
(b) Mikrokristályos cellulóz	125
(c) Laktóz BP	125
(d) Etil-cellulóz	13

513

- 85 3. Formálási példa

Injektálható készítmények előállítása

A készítmény
Hatóanyag		0,200 g
0,1 mól/l-es	HC1 oldat	4,0-7,0-ra
0,1 mól/l-es	NaOH oldat	4,0-7,0-ra
Steril víz	kiegészítésül 10 ml-re

A hatóanyagot a víz zömében 35 - 40 °C hőmérsékleten oldjuk, az oldat pH-ját hidrogén-kloriddal vagy nátrium-hidroxiddal 4,0 és 7,0 közé állítjuk. Az elegy térfogatát vízzel a kívánt értékre egészítjük ki, majd steril mikropórusos szűrőn steril 10 ml-es borostyánszínű üvegfiolákba (1 típus) szűrjük, és a fiolákat steril zárással és borítózárással látjuk el.

B készítmény

Hatóanyag 0,125 g

Steril, pirogénmentes pH 7 foszfátpuffér, kiegészítésül 25 ml-re

4. Formálási példa

Intramuszkuláris injekciós készítmények előállítása

Hatóanyag 0,20g

Benzil-alkohol 0,10g

Glikofurol 75 1,45g

Injekciós minőségű víz kiegészítésül 3,0 ml-re

A hatóanyagot a glikofurolban oldjuk, majd hozzáadjuk és oldjuk a benzil-alkoholt, majd az elegy térfogatát vízzel a kívánt értékre egészítjük ki. Az elegyet ezután steril mikropórusos szűrőn szűrjük, és sterilen 3 ml-es borostyánszínű üveg fiolákba (1. típus) zárjuk.

5. Formálási példa

Szirup készítése

Hatóanyag	0,25 g
Szorbit oldat	1,50 g
Glicerin	2,00 g
Nátrium-benzoát	0,005 g
Aroma, őszibarack 17.42.3169	0,0125 ml
Tisztított víz kiegészítésül	5,00 ml-re

A hatóanyagot a glicerin és a tisztított víz zömének elegyében oldjuk. Az oldathoz a nátrium-benzoát vizes oldatát adjuk, majd a szorbitoldatot, végül az aromaanyagot. Az elegy térfogatát tisztított vízzel a kívánt értékre egészítjük ki és elegyítjük.

6. Formálási példa

Por-kapszulák készítése inhalálásra

Hatóanyag (0,5-0,70 μιη-es por) 4 mg

Laktóz (30-90 μιη-es por) 46,0 mg

A porokat homogenitásig keverjük, majd megfelelő méretű keményzselatin kapszulákba töltjük, kapszulánként 50 mg elegyet alkalmazunk.

7. Formálási példa

Inhalálásra szolgáló aeroszol készítése

Hatóanyag (0,5-7,0 μιη-es por) 200 mg
Szorbitán-trioleát	100 mg
Szaccharin-nátrium	(0,5-7,0 μιη-es por) 5 mg
Metanol	2 mg
Triklór-fluor-metán	4,2 mg
Diklór-fluor-metán	kiegészítésül 10,0 ml-re

- 87 A szorbitán-trioleátot és a mentolt a trifluor-metánban oldjuk. Az oldatban a szacharin-nátriumot és a hatóanyagot diszpergáljuk, majd az elegyet megfelelő aeroszolos készülékbe visszük és a szeleprendszeren át beinjektáljuk a difluor-metánt. Ez a készítmény 100 μΐ dózisban 2 mg hatóanyagot tartalmaz.

Vírusellenes aktivitás

Influenza A és B törzseket vizsgáltunk egyrétegű primer csirkeembrió sejteken soklyukú tálcán. A vizsgálandó vegyületek aktivitását a hozam-csökkenéses vagy a plakk-csökkenéses vizsgálatban határozzuk meg, amelyben egy egyrétegű sejttenyészetet influenza vírus szuszpenzióval fertőzünk meg, majd ezt felülrétegezzük folyékony tápközeggel (hozamcsökkenés) vagy gél formájában lévő tápagarózzal, hogy vírus ne terjedhessen át a tenyészeten (plakk-csökkenés). A felülrétegzésre használt tápközegbe vagy tápagarózba ismert molaritású vegyületből készült koncentrációsort viszünk be. Az egyes koncentrációknak megfelelő vírushozamot vagy plakk számot a kontroll százalékában fejezzük ki, és felvesszük a dózis - hatás görbét. Ebből a görbéből határozzuk meg az 50 %-os gátlásnak megfelelő koncentrációt (IC₅₀). Légzési Syncytialis vírust (RSV) vizsgálunk BS-C-1 sejtekben (afrikai zöld majom vesesejtjei) hasonló plakk/góc csökkenési vizsgálattal. Eredményeinket az I. és II. táblázatokban ismertetjük.

Influenza A és B törzsek in vivő gátlására vonatkozó vizsgálatot végeztünk egérben intranazális/tüdő modellben. Ebben a vizsgálatban az egereket a vírussal zárt dobozban aeroszollal kezelve fertőzzük be, majd a befertőzéstől számított különböző

időkben és különböző módokon kezeljük a vizsgálandó vegyületekkel, például orális, intraperitoneális vagy aeroszollal végzett kezelést alkalmazunk. Az egereket 24 óra elteltével leöljük és 10 %-os tüdőszuszpenziót készítünk, ezt vírus jelenlétére titráljuk. Eredményeinket a kezeletlen kontrolihoz hasonlítva mint vírusszaporodás csökkenést jegyezzük fel.

A fenti vizsgálatokat az alábbi szakirodalmi helyeken leírt eljárásokkal végezzük: Appleyard, G. és Maber, H.B., Plaque Formation by Influenza Viruses in the Presence of Trypsin, J. Gén. Virol. 25, 351-357. (1974). Collins, P. és Bauer, D. J. ,

Relatíve Potencies of Anti-Herpes Compounds. Ann. N.Y. Acad. Sci. 284. 49-59 (1977), Hayden, F.G., Cotek, M. és Douglas, R.G., Plaque Inhibition Assay fór Drug Susceptibility Testing of Influenza Viruses. Antimicro Agents and Chemo. 17, 865-870.

(1980). Tisdale, M. and Bauer, D.J. A comparision of test methods in influenza chemotherapy. J. Antimicrobio. Chemother. 1, suppl. 55-62 (1975).

I. Táblázat

A példa Vegyület Influenza elleni aktivitás

száma	R1	R2	X	Y	CE sejtek IC50, Mmól/l	Egér loglO csökkenés a vírus titérben (5 egér átlaga)
6.	OH	OH	nh2	nh2	0,6	+ (2,1)
7.	OH	OH	OH	nh2	0,8-2	+ (2,4)
8.	OH	OH	nh2	H	4	+(2,3)
9.	OH	OH	H	NH2	-	+ (1,6)
12.	OH	OH	OMe	nh2	0,4	+(1/9)

A példa száma

7.

• · · · · • · · * · · · • · · · · · *

II. Táblázat

Vegyület Légzőszervi syncytiális vírus elleni aktivitás

BS-C-1 sejtek

IC₅₀ gumói/1

OH OH OH NH₂ 26,2

12.

OH OH OMe NH₂

Claims (7)

1. Eljárás az (I) általános képletű vegyületek vagy gyógyászati szempontból elfogadható sóik előállítására - a képletben Y jelentése hidrogénatom vagy -NH₂;

X jelentése -NR³R⁴ csoport, ahol R³ és R⁴ azonos vagy különböző, jelentésük hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport, 2-6 szénatomos alkenilcsoport, 3-7 szénatomos cikloalkilcsoport, az előbbi csoportok mindegyike adott esetben egy vagy több halogénatommal helyettesített lehet, vagy X jelentése -Z-R⁵ csoport, ahol Z jelentése oxigénvagy kénatom és R⁵ jelentése az R³-ra megadott, vagy X jelentése halogénatom vagy hidrogénatom; és

R¹ és R² azonos vagy különböző, jelentésük hidroxilesöpört, -0C0R⁶H csoport, ahol R⁶ jelentése kétértékű csoport, amely lehet egyenes vagy elágazó láncú 1-6 szénatomos alkiléncsoport, 2-6 szénatomos alkeniléncsoport vagy 3-7 szénatomos cikloalkiléncsoport, az előbbi csoportok mindegyike adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesített lehet;

-OCO₂R⁷H csoport, ahol R⁷ jelentése kovalens kötés, vagy az R⁶ csoportra megadott jelentések valamelyike,

-OCOR⁶-COOR⁸ csoport, ahol R⁶ jelentése az előzőekben megadott, R⁸ jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy 1-6 szénatomos alkenilcsoport, amely csoportok mindegyike adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesített lehet;

• ·

- 91 -OCOR⁷-Z-Ar csoport, ahol R⁷ jelentése az előzőekben megadott, Z jelentése kovalens kötés vagy oxigénatom és Ar jelentése aromás gyűrű amely csoportok adott esetben egy vagy több halogénatommal, 1-6 szénatomos alkilcsoporttal vagy 1-6 szénatomos alkoxicsoporttal helyettesítettek;

-OR⁶H csoport, ahol R⁶ jelentése az előzőekben megadott;

- OR⁶-Z-Ar csoport, ahol R⁶, Z és Ar jelentése az előzőekben megadott ,

-OCOCHR^NrI-Or¹¹ csoport, ahol R¹⁰ és R¹¹ jelentése az előzőekben R⁸ helyettesítőre megadott, és

R⁹ jelentése hidrogénatom, egyenes vagy elágazó láncú 1-4 szénatomos, adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal, merkaptocsoporttal, 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal vagy 1-3 szénatomos alkil-tio-csoporttal helyettesített alkilcsoport, -R¹²-A csoport, ahol R¹² jelentése adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesített 1-4 szénatomos alkiléncsoport és A jelentése -COOH, -CONH2, -NH2 vagy -NH-C(NH)NH₂ csoport, vagy A jelentése 4- 11-tagú aromás vagy nemaromás gyűrűs vagy heterogyűrűs rendszer, amely

3-10 szénatomot és 0, 1, 2 vagy 3 gyűrű-nitrogénatomot tartalmaz, a gyűrű-szénatomok és/vagy nitrogénatomok adott esetben egy vagy több hidroxilcsoporttal helyettesítettek lehetnek,

-OCO-R¹³ csoport, ahol R¹³ jelentése 4- 7-tagú hetero• · · ·

- 92 - gyűrűs csoport, amely 3-6 szénatomot és 0, 1 vagy 2 nitrogénatomot tartalmaz, és a gyűrű-szénatomok és/vagy nitrogénatomok adott esetben egy vagy több hidroxileső-

portai helyettesítettek lehetnek, vagy

-mono-, di- vagy trifoszfát-észter-csoport -, azzal jellemezve, hogy

A) θ9Υ (Pu)H általános képletű purin bázist - a képletben X és Y jelentése az előzőekben megadott - vagy sóját egy (II) általános képletű vegyülettel reagáltatunk - a képletben R¹ és R² jelentése az előzőekben megadott, W jelentése egy foszfát-észter vagy sója vagy egy, a fenti (Pu) egységtől eltérő purin vagy pirimidin egység, vagy (B) egy (III) általános képletű vegyületet - ahol X^a, Y^a, R^la és R^2a jelentése az X, Y, R¹ és R² helyettesítőkre megadott jelentések valamelyike vagy ezen csoportok prekurzora, például az ilyen csoportok védett formája, azzal a megkötéssel, hogy X, Y, R¹ és R² közül legalább egy prekurzor formában van jelen - a prekurzor csoportot vagy csoportokat a kívánt csoporttá vagy csoportokká átalakítani képes reagenssel reagáltatunk, és kívánt esetben ezt követően vagy ezzel egyidejűleg az alábbi átalakítási lépések közül egyet vagy többet végrehajtunk:

i) egy olyan (I) általános képletű vegyületet, amelyben R¹ és R² helyettesítők közül legalább az egyik hidroxilcsoport, egy megfelelő, a hidroxilcsoportot R¹ és/vagy R² jelentésében álló más csoporttá alakítani képes

- 93 reagenssel reagáltatunk, vagy ii) egy olyan (I) általános képletű vegyületet, amelyben R¹ és/vagy R² jelentése hidroxilcsoporttól eltérő, olyan reagenssel reagáltatunk, amely az R¹ és/vagy R² helyén álló csoportokat hidroxilcsoporttá alakítja.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyekben R¹ és R² közül legalább az egyik hidroxilesöpört, vagy R¹ jelentése monofoszfát és R² jelentése hidroxilcsoport, Y jelentése hidrogénatom vagy aminocsoport és X jelentése -NR³R⁴ csoport, ahol R³ és R⁴ azonos vagy különböző, jelentésük hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkilcsoport vagy X jelentése -Z-R⁵, ahol Z jelentése oxigénvagy kénatom és R⁵ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, vagy X jelentése halogénatom vagy hidrogénatom, valamint ezen vegyületek gyógyászati szempontból elfogadható sói, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás az olyan (I) általános képletű vegyületek vagy gyógyászati szempontból elfogadható sóik előállítására, amelyekben R¹ és R² jelentése hidroxilcsoport, Y jelentése aminocsoport és X jelentése hidrogénatom, hidroxilcsoport, aminocsoport vagy -Z-R^, ahol Z jelentése oxigénatom és R⁵ jelentése 1-6 szénatomos alkilcsoport, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás 2,6-diamino-9-(2-dezoxi2-fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin és gyógyászati szempontból elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő « · • ···· • ••4 · • · · kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás 2-amino-9-(2-dezoxi-2fluor-B-D-ribofuranozil)-9H-purin és gyógyászati szempontból elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

6. Az 1. igénypont szerinti eljárás 2-amino-9-(2-dezoxi-2fluor-B-D-ribofuranozil)-6-metoxi-9-purin és gyógyászati szempontból elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk.

7. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű vegyületet vagy gyógyászati célra alkalmas sóját - a képletben a helyettesítők jelentése az 1. igénypontban megadott - gyógyászati célra alkalmas hordozó- és/vagy segédanyagokkal összekeverjük, és készítménnyé alakítjuk.