HUE029228T2 - Eljárás polinukleotid-változatok szintézisére - Google Patents

Claims (5)

1. E1,,JÁRÁS FO!ΛNUKI..ROTORVÁLTÓZATOK. SZÍNTÉXISER.E SzahMaRmí igéöypoöiok !.. Eljárás egynél több pobnokleotid-válíozst szintézisére, amelyek mindegyike- legalább egy megbatározott nohleotkibars kidöOözik egy vonatkoztatási pohnokleoíid-szekveociátéi, ahol az eljárás tartalmazza; (aj vonatkoztatási polixinkleotlo-templàt ampllfíkálását kÄ-kioa egynél több előre és visses láncmdltópár rmadegyikévei, aW se egynél több előre és visses Jáneiaditőpár tartalmazza s megbatározott egyrxél több oukleottd-kölönbséget, és ahol minden: egyes pár olyan amphkoxn hős létre, amely olyas szekvenciát tartalmaz, amely képes legalább egyetlen másik amplikon. vele határos, átfedd szekvenelájához kapcsolódni, ezáltal ampi ikonok exntezhetö könyvtárat létrehozva, ahol. (i) az axtiplikonök kmyvtém tagokat tartalmaz - s vonatkoztatási pokmmieodd-szekveneiáhöz képest ineghatározoti mAieoliddvölösrbségeket tartalmazó - két vagy több különböző poll-nokleotld-változat összeszerelésére; és (il) a könyvár tagjai pozíciójuk tekintetében különböző helyeken varrnak elrendezve egy SAibsztráton; (b) amplikoook egynél több készletének· összeszerelését kölön-kölöru ahol minden egyes készlet olyan ampükonokat ianalmaz, atnelyek.nek velük határos, átfedő szekvenciájuk van, amelyek képesek kapcsolódni miáltal kialakítják a vonatkoztatási polinukleoüd-szekvetteia teljes hosszúságát; (e) az összeszerelt mnpllkonok egynél több készletének replikálásit, egálmi pobntncleoüd-väkozstok címezhető könyvtárának létrehozását, ahol a könyvtár tagat pozletőjuk tekintetében tnegkölőn-hüztetheiő helyen vannak elrendezve egy szubsztráton,
2. 2, Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol & vonatkoztatási polinnkleotid vonatkoztatási polipeptidet kódol, és az egynél több poikmkleodd-váttozaí mindegyike olyan pollpeptidet kódol, amely pollpeptidek legalább egyetlen aminosavszekyeneia-MlÖJíbséget írmtatnak. 3.. A 2. igénypoxh szerinti eljárás, ahol az ellátás tartalmazza továbbá az egynél több polinnkleotM-változat mindegyike evpressziós vektorba történő klórrozásánal lépését, 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol az eljárás tartalmazza továbbá sejtek eapresszlos vektorral történő mntszibrrnáiásáoák lépését. $. A 4. igénypont szerinti eljárás, ahol az eljárna tartalmazza továbbá a traaszíonnált sejtek szkrinelését a pohnukkotld-változaíok álla! kódolt poiipepddek aktivitására.
3. 6, Az S. igénypont szeri»ii eljMs;, ahol az eljárás tartalmazza továbbá legalább egyeben, a polîiiÂeoîM-vàltozatok által kódolt polipeptid izolálását,
4. 7. Az L igénypont szerinti eljárás, aboli (i) az: egynél több polinukleotid-változat tartalmaz legalább 10 különböző polinekleotid-váitozatot, vagy az egynél több poünukleoi id-vàltoœat tartalmaz legalább 40 különböző polínukieotiá-váUiO-zárót; (ii) az egynél több polhatkleoiid-vsitozai mindegyike tarialnxaz legalább 3, megbatározott pukleotié-kulönbséget a vonatkoztatási szekvenciához képest; (iü> az egynél több polinuMeolid-változat közti! legalább egy tartalmaz legalább 5, ő, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 2? vagy 30 megpiározod nuMeotklkilönbaéget a vonatkoztatási gollnokleottd--szekvea-ciához képest; (ív) az amplikonok egynél több készletének legalább egyike tartalmaz legalább 3 különböző ampin ként vagy az amplikonok egynél több készletének legalább egyike tartalmaz legalább 5 különböző ampHkons; (y) az ampbkonok egynél több készletének legalább egyike áthidaló poilratkleotidat tartalmaz, amely nem tartalmaz mtkfeotidkniőnbséget a vonatkoztatási polínuklebd-szekveneiához képest; fvi) az előre és vissza lanemdttók hossza legalább mintegy 20-50 noMeolü vagy az előre és vissza láneindltékkassza legalább mintegy 25-35 nskkotk!; (vii) a vonatkoztatási pobnnkleotid-szekvesela hossza legalább 500 bp, 750 bp, 1000 bp, 1250 bp vagy a vonatkoztatási pointukleoíid-szekvencia hossza legalább 1500 bp; esi vagy (vili) az egynél több előre és vissza, iánelnditopár tartalmaz legalább mintegy 6 és legfeljebb mintegy 50 különböző ollgonekleotldot vagy az egynél több előre és: vissza lánemdltőpár tartalmaz legalább mintegy é és legfeljebb mintegy 25 különböző oügonakleotidot. i. Az 1, Igénypont szerinti eljárás, ahol az egynél több előre és vissza láocmditószefcveaeia szekvenciáit a következő lépésekkel hozzuk létre; (i) egy első meghatározott különbség azonosítása a pokhtíldeoikl-változsi szekvenciájában a. vonatkoztatási szekvenciával Összdmsomkva, és a poMookleotib-szekvenoiábsn: legközelebb eső szomszédos meghatározott különbség preaimitásának a. megbalátozása; (ii) olyan előre lánélntlító kiválasztása, amelynek szekvenciája tartalmazza az első meghatározott niíkleotykülőabséget, és adok esetben magában foglal bánnely legközelebb eső szomszédos méghatározoO különbséget ngyanabbsn az előre lánemditdban, amennyiben az proxitnáiis az első rn egbatározott nnkleotldkőlönbséghez; (ili) egy kővetkező megbatározott különbség azonosítása a poli oukleotid-változat szekvenoiáiábrm a vonatkoztatási szekvenciával összehasonlítva, és a legközelebbi szomszédos megbatározott kn~ lönbség proximiíásánák: meghatározása .a pollnrAleotid-szekvrtídábao, vagy aanak azonosítása, hogy elértük a poíiuukleotid-változat végéi; (iv) vissza láneinditó kiválasztása, amelynek szekvenciája tartalmazza a. kővetkező meghatározott nukkoikik'üiönfeségcC, és adott esetben magában. foglal bármely legközelebb eső szomszédos .meghatátozott .különbséget ugyanabban a vissza lánemddéban, amennyiben proxintális a kővetkező meghatározott nnkieotidkőlönbséghez; és (v) . a (in) - (tv) lépések megismétlése a polimrkleeiid-váhozat szekvenciájában minden egyes megba tározott különbségre égy, hogy az Összes megímtározöíi különbségiéiért van a láneinditókon. 9. A 8.. igénypont szerinti eljárás, ahoi az eljárás tartalmazza továbbá olyan poKnukkoiid szeg-:measte specifikus sem mutagen vissza és előre oligonnkleotld-MncindM kiválasztását, amelyet nem határoz meg az (ii) és (iv) szerinti előre és vissza lánoindlíó,
5. 10, Az !, igénypont szerinti eljárás* amelyben az: aropbftkálás és a replikálás polimeráz-láne-reakcióval történik. ti. Amplikonok címezhető könyvtára, amely egynél több asnplkont tartalmaz, ahol az mnplikonkönyvtár minden egyes tagja tartalmaz legalább egy megbatározott tmklootidkülösfoséget égy vonatkoztatási pokntMeotidrtxekvesreiáboz képest, valamint átlód» vek határos régiót, amely képes kapcsolódni a könyvtárban legalább egy másik amplikon átfedő határos régiójához, ahol az egynél több ampiikon tartalmazza olyan atnplikonok egynél, több készletét, amelyek képesek,kapcsolódni és ezáltal kialakítani a vonatkoztatási poiinukleotid-szekvencia teljes bosszúságát, ahol az egynél több ampiikon tagokat tartalmaz, két vagy több különböző, teljes: hosszúságé poiieokieotkbvàltozât összeszerelésére, amelyek meghatározott: nnkleotlökülönbségekei tartalmaznak a yoríntkoztatási. polinukleotid^szckyoïtciâhoz képest, ahol (i) az egyse! több amphkonkészíd legalább egyike tagokat tartalmaz olyast pobnukbotid-váUoza· összeszerelésére, amely tartalmaz legalább S ntfeleotidkülörmséget a vonatkoztatás! polhmkleotid-szekveooiáboz képest; (ii) az egynél több anml ikonkészlet legalább egyike legalább 3 különböző amplíkont tartalmaz; vagy (ifi) a vonatkoztatási polinokteotidszekvencia: hossza legalább SÔÔ bp, és almi a könyvtár tagjai pozi- elöj-ik tekintetében megkülönböztethető helyen vannak elrendezve egy szuhxztráíou. 12. A 11. igénypont szerinti címezhető könyvtárt ahol a vonatkoztatási pohnakleotid-szekveneia vonatkoztatási polípepiidet kódol, és az: egynél több ampiikon tagokat tartalmaz, amelyek elegendőek az összes lehetséges mMeotidklilönbség összeszerelésére, amelyek kiválasztott, egynél több amino-sav-különbséget kódolnak.