HU227723B1 - Autologous keratinocytes, melanocytes and fibroblast culturing technique and serum-free medium for use in human therapy - Google Patents

Autologous keratinocytes, melanocytes and fibroblast culturing technique and serum-free medium for use in human therapy Download PDF

Info

Publication number
HU227723B1
HU227723B1 HU0401385A HUP0401385A HU227723B1 HU 227723 B1 HU227723 B1 HU 227723B1 HU 0401385 A HU0401385 A HU 0401385A HU P0401385 A HUP0401385 A HU P0401385A HU 227723 B1 HU227723 B1 HU 227723B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
cells
cell
culture
cultured
skin
Prior art date
Application number
HU0401385A
Other languages
English (en)
Inventor
Lajos Dr Kemeny
Dr Bata Zsuzsa Dr Csoergoene
Gabor Dr Szabad
Original Assignee
Nagy Norbert Dr
Lajos Dr Kemeny
Dr Bata Zsuzsa Dr Csoergoene
Gabor Dr Szabad
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nagy Norbert Dr, Lajos Dr Kemeny, Dr Bata Zsuzsa Dr Csoergoene, Gabor Dr Szabad filed Critical Nagy Norbert Dr
Priority to HU0401385A priority Critical patent/HU227723B1/hu
Publication of HU0401385D0 publication Critical patent/HU0401385D0/hu
Priority to PCT/HU2005/000076 priority patent/WO2006005977A1/en
Priority to EP05763133A priority patent/EP1768716A1/en
Publication of HUP0401385A2 publication Critical patent/HUP0401385A2/hu
Publication of HU227723B1 publication Critical patent/HU227723B1/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3886—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells comprising two or more cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3813—Epithelial cells, e.g. keratinocytes, urothelial cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/60—Materials for use in artificial skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0626—Melanocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/80—Undefined extracts from animals
    • C12N2500/84—Undefined extracts from animals from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/091—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells melanocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/09—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells
    • C12N2502/094—Coculture with; Conditioned medium produced by epidermal cells, skin cells, oral mucosa cells keratinocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Aatöfúg keratlnudts, melsaacita és fíbrohísszt sej rtenyésztésr módszer ás szérum mentes tápkezeg hamán terápiában való alkalmazásra
A találmány az eukarióta sejt- és szövetieriyésztés területére tartozik. Közelebbről, a.találmány tárgyát képezi eljárás tesryészteít sejtek preparátumának előállhásám autológ bőrsejt traaszpteatációhoz hajas fejbőrből származó, a bulbális régiót tartalmazó felvastag metszetből, .az qhdermábs sejteket elkülönítésével és tenyésztésével ezáltal sejts zuszpetizló előállításával,, majd annak az érinteti börterület transzpfeníáeiöjára alkalmas preparátummá alakításával; a találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti eljárásokkal előállítható kerasinooíia és/vagy saelanocita és/vagy íibroblasz· sejteket tartalmazó -preparátumok.
A szöveííenyásztés orr--<?sí-bioteehaológiai alkalmazása magában foglalja az íh vitro előállítón implaníátumok, biomoiekulák, sejtek vagy szövetek kifejlesztését, elkészítését és módosítását a hiányzó- vagy sérült testrészek, szövetek pótlásához vagy működésűk kijavításához. Az egyik ilyen nagy terület az. úgynevezett auioióg iranszpiarttámmok előállítására koncentrál. Az alapelv az, hogy a transzplantációhoz szükséges sejteket a beteg egészséges szöveteiből ttyerjúk, az úgynevezett donor területről, és in vitro tenyésztjük. Az. in vítro tenyésztett sejteket használjuk a transzplantációhoz például oly módon, hogy egy megfelelő hordozóanyagba ágyazzuk a sejteket és a hordozóval együtt visszük fel ugyanazon beteg megfelelően előkészített fogadó testrészére,
A donor bőrminta származhat a beteg lágyékából teljes vastagságú mininként eltávolítva, vagy a combról, fenékről, karról vagy hajas fejbőrről fél-vastag bömnataként: eltávolítva. Az epiáernrális sejíszuszpenzió in vitro készül. Két-háro® hét alatt több tenyésztési ciklus után tiszta keratlsoeita kultúra állítható elő, amelyet & sebágyra transzplantálnak. A ksratmoekák kiíapaának a seb felszínre és a növekedési faktorok széles skáláját termelik, felgyorsítva ezzel a sebgyógyulást Mivel a transzplaniák keraímoátsk autológok, azaz a beteg saját sejtjei, immunológiai reakció «ess lép fel a módszer alkalmazásakor. Az in. vitro tenyésztési eljárás során több tenyésztési ciklusban növekszik a korátínoeiták száma. Mivel azonban a normál emberi keratínocíták osztódási képessége és élettartama véges, az in viiro tenyésztés során fellépő nagyszámú sejtosztódás a telomer régió rövidüléséhez vezet ami ennek megfelelően csökkenti, az autogtniíhsn lévő sejtek élettartamát. Emiatt rendkívül fontos, hogy az autológ transzplantációhoz a még nem difeereneiálóöotL úgynevezett bőr-őssejteket használjuk nagy számban. Ezek a bőr-őssejtek az epidermisz bazális rétegében és a szöríüszőkben találhatók igen nagy számban, ezért a hajas fejbőrből, mint donor területről származó teatisecka sejíkultóra differenciálatlan bőr-őssejtekben gazdag. A meghatározó előnye az Ilyen terápiának abba» áll, hogy a heterolog transzplantációknál gyakran fellépő Immnnt’éákcsó és fertőzés esélye igen csekély.
Az ilyen ssaíológ transzplantáíuntok előállítása elképzelhető más sejt- és szővatttpusok. esetén is, mint például: bőr, perc, csont, zsír és egyéb szövetek. A gyakorlatban a bőr azért is nagyon megfelelő, mert a test felszínén helyezkedik et ezért könnyen hozzáférhető. Számos olyas bőrgyógyászati eset létezik, amikor kiterjedt bőrmmszplantációra van szükség. Ebben a tekintetben különösképp az ég-fel sérülések és a nehezen gyógyuló fekélyeket kell megemlíteni, valamint a bőr festékhiásyát okozó betegségeket, mint például a vítiligot.
A találmány egy további célja olyan szémm-mentes tápközeg előállítása, mely a&almas keratinociíák és/vagy meianoekák és/vagy fíbroblasztek sejtfealtúráhan történő tenyésztésére, előállítására és fenntartására. Ez az új szérum-mentes tápkőzeg szintéit alkalmas az emberi bőrsejtek izolálására a keratisocíták, melanochák és fíbroblasztok találmány szerinti folyamatos tenyésztésére.
.A találmány további célja olyan elsődleges keratinoclta, meianociía és rtbroblaszt kultúrák előállítása, melyeknél nem alkalmazunk más tápláló sejteket. Ezek a kersttöociták, melauoeiták és fiferoblaszíek bőrpőílásra
100777-15445/SG s
JÍ· ~ ♦ «:♦
Aíáaasak.
A találmány álttóáaosságbaa az ssrtbcri kerstinoeíták in vitro növesztésével és áifisreacíáeíójávat kapcsolatos. Előnyősén, s találmány olyan anyagokra és módszerekre- vopstkozík, amelyek alkatessak. emberi szövetből történő, emberi epidermáiis keraiineciia elsődleges sejíknltúráfoak előállítására, valamint az életképes sejtek fogyasztva történő tárolására. A fagyasztva tárolt sejtek lehetővé teszik másodlagos sejtktdíürák létrehozását, illetve folyamatos szaporítását a sejteknek a bőt sértfiéscinek kezelésére szolgáló termék .létrehozásához, A taláímánynak további célja, hogy aasológ száma használatával csökkentse a hetoralog vérkészitotónyek okozta fertőzések átvitelének kockázatút.
SzÉ3s»S8kmssjáphagkg
Mai sejtbiológiái ismereteinket a normál emberi hős-sejteket ííletóen nagyrészt az in vwro sejt tenyésztési módszerek alkalmazásával nyertük. A normál emberi hőmejtek általános, ín vitro tenyésztésének módszere során, kémiai mifogéneket alkalmaznak, pi.; a tumor promoter i2-O-tetradecoml phorbol-13-aoeíá.t (TEA), ciklikus adenozin 3’, 5’ monofoszfút (cAMP) enharszer és a kolefatoxás (CT). Ezen anyagok használata egyértelműen sem fiziológiás köröfenényeket jelent a sejtek számára. .Kideígozmsk egy kémiai mitogénekfol mentes bőrsejt tenyésztő technikái, Aatoíóg humán szérum használata 2,5%-5% mennyiségben .képes as ESS, EGF és BEE kombinációjával azonos mértékű börsejt növekedés-serkentésí létrehozni. A kémiai mitogének mellőzése érdekében már Nielscn és Dont! (Níelseo HL, Don P. Culture of normái aduit humán mdanccytes-. Br 1 Dermatol 1984; 110: 569-80) is szaporítottak melanocítákat fibrahlaszt kondicionált médiumban, w 15% löszérumot es poiiamínokaí tartalmazott, de a mcianocitsk ehben a tapkőzegben nem voltak képesek a díBerescrácíójuk fenntartására, Donátion és mtsai. (Donátién P, Surlevc-Sazeille 1E, Thody AJ, Taíeb A Growth aaá dítfersnttstion of atsrasal humán melanocytes in a TPA-fiee, ehoíera toxín-free, iow-sentm médiám and ínSueuce of keraíinocyies, Arch Hermától Rés 1993; 285: 385-3927) leírtak egy emberi melanoeita tenyésztési módszert, mely során nem használtak nem-fiziológiás mitogéneket Ők dolgoztak ki egy módszert, mellyel az epidermáiis ksratisocitákat és mekmocirúkat együtt tenyésztik, de a keraimodták eltávolítása után. & meianoclták elveszettek a rájuk jellemző morfológiai jellemzőket.
EaíítesM&^sejígk
A. döntő lépés a sebgyógyalásbaa .az epidetmáiis regeneráció, re-epitelizáolö. A sérülés szelénél elhelyezkedő ioteribibkulárís keratinociták mellett a szőrtüszőkböl származó “onter ront sheet” (ÖRS) sejtek is fontos szerepet játszanak a folyamatban (Eises et si., 1 ísvest Dermatol 15: 143-156, 1955). A szőrtüsző ORSrégiójában elhsSyezkedő sejtek nagyrészt differenciálatlan sejtekből állnak, melyek körülveszik a megkeményedett belső rétegeket és a szőrszálat (Montagna und Parakkal, pp. Ϊ72-258 in ”Tbe Stracture and Fuuclíon of Skin“, c. 1974 by Academíc Press New York, N.Y,). A legújabb kutatások leírják, hogy az ÖRS sejtek kevésbé differenciáltak, mint a bazális interfóikkuíáris sejtek (Cottfombe et ai., 3 Coll Bso; 109: 2295-2312, 1989; Limát et aí., Exp Cell Rés 194: 218-227, 1991; Limát et al, Cell Tissue Rés 275: 1Ó9-I76, 1994). Mind állatokban mind az emberi -ÖRS régióban található bníháris régióban nagy számban találhatók ilyen. dff&readáíar?aj5 sejtek, amik vtdőszínSsíthetoen a bőr-őssejteket képviselik (Cotssarelis et al, Cell ói: 1329-1337, 1990 Robayushs et ai., Proc Nad Acad Sd USA 90; 7391-7395,1993; Yang el ai., 1 Ísvest Dermatol 105: 14-21, 1993; S.ochat et ah, Cell 76: 1073-1076, 1994; Mell, J lavest Dermatol 105: 14-21, 1995). A kitépett szórtüszökhől elkülönített emberi ÖRS sejtek gyorsan osztódnak in vitro (Weteríngs et sl. Brit .1 Dermatol 104: 1-5, 1981; bánni and Noser, J levest Dermatol 87;: 485-488, 19SÚ; Inrcke et al., J At» Acad Dermatol 17: 779-786, 1987; Limai et al., 1 füvest Dermatol 92: 758-762, 1989). A megszokott aiúmerőiő sejtkuliúrakban az ORS-sejtek az i&terfoílíkalám· « 0
4»«« 0* »»:.♦ «0 ** ♦♦ ·♦* kefatísoeitákra hasonlítani mind morfológiailag, «riad biokémiáikig (pl.; keratin profil) (Síark et al, Öifferenhation 35: 236-248. 1987; Limát et ai., J ínvest. Dexmstol 92; 758-762, 1989; Limát et al., Asn NY Acad Sei 642: 128-147, 1991). Az org;moíipikax ko--k»líárébam ahol óermáiís llbroblasztokkal együtt történik s tenyésztés. hasoníö körülményeket létrehozva ezzel, mint az epidermiszben, a keratinociták olyan elszarasoáé epitéliumot hoznak létre, ami hisztológiaiíag, immanhisztológiailag, ukrasünktúrájábítn és biokémiai jellemzőiben emlékeztei a regenerálódó epitélinmrs (Lenoiret ai., Dev Bioi 139: §10-620,1983; Limai ei al,, Exp Celi Rés 194; 218-227, 1991; Limai et ak, Arra NY Acad Sei 642: 125-147, 1991), Ha bőr nélküli egerekre transzpianíálünk ilyen orgauníipikus kultúrát, az ÖRS sejtek feonteosztatttóss kontroll alatt lévő szabályos neo-qtodermíszt hoznak létre (Limát et al, Trsnspiaotalion 59;: 1932-1038, 1995), A font leírtak alapján az emberi ORS-seítek különösen figyelemre méltók a klinikai felhasználást illetően.
Az elmúlt évtizedben az érdeklődés egyre inkább a tenyésztett epiteliális sejtek sebgyógyifásban történd felhasználása fele tolódott. Először föleg a harmadfokú égési sérülések fedésére használtak sikeresen tenyésztett fotertóRiteláris, autológ keraünocita sejteket (Ö’Connor et al, Láncét 1: 75-78,1981; Compton et al.,. Láb Invesí 60: §00-612, 1989). De alkalmazták epiderntolysis búbosa (Carter 'et al., í Aa Ae&d Deimatoi 17: 246-250, 1987), pyodenna gaagxenosum (Dean et al., Ano Flast Snxg 26: 194-195, 1991; Látnom aad.Mawo, J Hennától Surg Oncol 2.0; 333-836,1994), és sziámi ikrek elválasztása után is (Higgnxs et al, J R Soe Méd: 108-199,1994).
Az akut sérülések kezelésével ellentétben a krónikus sebek, mint például lábszárfekély esetén, a tenyészted keratmociták transzplantációja sem volt olyan sikeres. Az allograftok nem épültek be véglegesen (Pábre, Immtmól Lett 29: 161-166, 1991) ezért inkább hatékony, de drága biológiai ruhának nevezhetnénk (áttekintve Phillips ás mtsaí által., í Aa Acad Deremtől 21; 191-199,1989), A .kSfebözőképpen előállított és iranszpiantált autoiög kexatinoeíta kultúrák reprodukálható, bizonyított beépülése nem volt megfelelően dokumentálva pl.:: a csak néhány eixznrasodoít: sejtsort tartalmazó keratinecita sejtekből álló rétegek (Hefton et al, 3 Am. Acaá Dermatol 14; 399-405, 1986; Leigfe and Pártós, Clin .Exp Deremtől 11: 650-652, 1986; Leigh. et al, Brit J Demtatól 117: 591- 897, 1987; Philips et al,, ) Asn Acad Dermafel 23; 189-198, 1990; Giannotti eí al, G Ital Dersnatoi Vénéről 125; 161-167, 1990; Harrls et al, din Exp Dsrmaloi IS: 417-420, 1993), koliagéímeí bevont kötöző anyaghoz rögzített különálló tripszin kezeit keratiuocita sejtek (Brysk et al, J Asn. Acad Deremtől 25: 238 -2.44, 1991), és bőr ekvivalensek (Mól el al, J A® Acad Dermatoi 24: 77-82, 1991). Ugyanez mosdható el a frissen elkülőnitett isterfetiikuisris sejteket (Hunyadi et al, I Hennától S'axg Gaco.1 14; 78-78, 1988) és ÖRS sejteket (Moll et ai, Hautanst 46: 548-552,1995) íihrfe ragasztóval a sebágyra rögzítő módszerekről is.
A keratinok I-es és fi-es típusú közepes mérető íehérjeszálak, melyek az epiteliális sejtekben egy sejtváz hálózatot hoznak létre. Párban: expresszálóönak a sejtek diffsrencíációjának megfelelő módon. A K1 és KíÖ markerek a dsfeerenciáeíó korai fázisában lévő keretín»eitákra jellemzőek, melyek az epidermisz, szuprahaz&iís régiójában találhatók. A Ki és RIO keratinok expressziójá jelzi a dilferenciáció első fokát, ez az első lépés a sejtek terminális differettciációjásak folyamatában. A .Kl/JQÖ negatív sejtek jelenők a differenciálatlan, sejteket igen nagy osztódást és regeneratív kapacitással, ami igen fontos a sebgyógyulásban. Ezért a Sl/Rdö negatív sejtek magas aránya a transzpianiáií keratréoeiták közt meghatározó mind a rövid és hosszú iává klinikai eredmények tekintetében.
A TALÁLMÁNY RÖVID LEÍRÁSA
A találmány tárgya eljárás autológ bérseit tmoszplaaíáclöra, amely a követeső lépéseket foglalja magában: i) epídermális sejteket nyerünk olyan, személy hajas fejbőréből, akinek érintett börteralete van, ahol a félvastag hajas fejbőr legalább részben magában foglalja az ‘tonter root sbeet” és/vagy a bulbális régiéi,
-4** • ··♦ * «« »*« « · X ♦ fc * * « ··♦ fcfc «« *> ♦ íi) az eptáermális sejteket eiküiönltjök más: típusa sejtektől, legalább a dertttális őbrobfoszíoktol, ni) az epídormáiís sej leket arra tnegfeieíS tápközegben tenyésztjük, ív) a tenyésztett epidenrtálts sejteket feívisszük sz érintett bőrtemíetre,
Epidermális sejtek nyerhetők a halas fejbőr területéről feivaatag metszet formájáhsu, A módszer előnye, hogy a szörtüsző mátrixa és a hajhagyma érintetlen marad,, ezért a haj könnyen újra kinő a hiopszia helyén.
Előnyösen az epidemtális sejtek epidermábs os-sejtekeí foglalnak magokban.
Előnyösen az spiáermásis sejtek kenstínocítákat étvágy roeísascltákat tartalmaznak:.
Egy előnyös eljárás szerint a keratínocitákat és mekmooitákat együtt használjuk és tenyésztjük kevert kultúrában, olyan tápközegbe», amely mindkét sejttípus számára megfelelő körülményt biztosit.
Előnyösen a tenyésztő tápközeg mU KBM, mind AT.M-V tápközegeket tartalmaz.
A fent említett eljárások egy további előnyös megvalósítási módja szériái a keratísoeítákat és melanoeiíáknt tenyészthetjük és használhatjuk láslőn-külőn is, tiszta kultúrák formájában,
A. találmány egy további megvalósítási módja eljárás auíolőg hőrsejt írartszpfontációra, amely során végrehajtjuk a kővetkező lépéseket;
i) epidetmáíis sejteket nyerünk érintett bőrterülétü szentélyből, ahol az epidermális h&rssjtek mmá keratmockáhat, mind melanoeitáknt tartaltnaznak, ti) az epsdermáfe sejteket különítünk el más sejttípusoktól, legalább dertnáls fibrobfosztoktől, és elválasztjuk a keratísocítákst és a melanoekákat, m> a keraíinocitákaí és mefoneeitákai küiön-külön megfelelő táp.kőzegben tenyésztjük, iv) a tenyésztett ketatísoehákat és/ vagy mstaödtáfcat megfelelő arányban feivtsszök sz érinted börtedlfetre.
Ezek a sejikuitúrák a kezelendő bőrterüfet Igényeinek megfelelő arányban összeállíthatók. Például, amikor a sérülés a bőr mélyebb rétegeit is érinti, rendszerint több febroblasztra van szükség, míg felületi sérülések esetén a keradnocifok arányosak kell magasnak lenni, vítiligo esetén a melanoeiták arányát kell növelni,
A keFátiwcttók és mstoociták elválsszthntak egymástól a sejtek elkülönítése során, mivel különböző idő elteltével válnak le a tenyésztőífoska felöletéről. Előnyösen a sejtek elkülönítését tripszfenel végezzük.
Egy olyan eljárásban, amelyben a bbrebiasztokat elválasztjuk, és külön tenyésztjük, előnyösen a kővetkező lépések legalább egyikét végrehajtjuk:
aj a febroblaszt sejtkultúra felüiüszóját vagy annak egv·' részét hozzáadjuk az spídermsfe sejtkultúrahoz, vagy a keratinoeiták és/vagy reelanoeíták kultúrájához,
b) a tenyésztett őbroblítszfokat feívisszük az érintett bőrfelületre.
Az érintett bőrfélület lehet pl. a. kővetkezők közül bármelyik; különböző okok miatt kisfokait; krónikus fekélyek, égési sérülések, poszi-trauraás sérülések, vitiiige, naevoíd bőrelváltozások és hegek dermahrázió (horzsolás) uíám állapota.
A találmány egy további szempontja szerint olyan eljárásra vonatkozik, mely során tenyésztett sejteket állítunk elő autókig börsejt traítszpi-mfociéhoz;
1) egy személy hajas fejbőréből epídertnáiis sejteket nyerünk, és elkülönítjük szokat más sejttípösektóí,. legalább denaálís Sbrobhmzíckíöi, ahol a hajas fejbőr skalp legalább részben magában fogkttja az “outer r«ot sheet” és/vagy a bulbálts régiót, ti) az epidemrislis sejteket arra megfelelő fúpközegbsn fertyészijük, ezáltal egy sejíszuszpenziőt állítva elő, in) a sejtszuszpenziót tenyészett sejtek preparátumává alakújuk, amely érinteti: börlerülsí trattszpkmtáció*·»».« *χ * ♦* * χ *·♦· * * ♦ « * * * * X · * *** «« Λ* ** ** jára alkalmas.
Előnyősén az epidsrmális sejtek apidensálb ös-sejtekei tartalmaznak.
Előnyösen az epiöenaátis sejtek keratltmciíákaí és/vagy nselaaocítákat tartalmaznak.
.Egy előnyös megvalósitá»! méri szerint a keratmoeitákal és mekmoeitákat együtt basmálj-nk és tenyésztjük egy kevert kultúráiban, egy olya® tápkőzeghen, mely mindkét sejttípas számára megfelelő körülményeket biztosít. Előnyösen a tenyésztő tépkőzeg mind KBM, mind AIM-V tápközegeket tartalmaz.
Előnyösen a kenttóeeitákaí és tselsnoejiákst külős-kSISít tiszta kultúrák tótniájában tenyésztjük és használjuk.
Egy további ntegystósítási mód szerint, a találmány tárgyát képezi eljárás tenyésztett sejtek preparátumának .előállítására, autólóg itóreejt-lrsnszpianlációhoz:
Egy személy hajas fejbőréből epidennábs sejteket nyerünk, és elkülönítjük azokat más sejttípusoktől,. legalább dermális öbrobiasztofoól, ahol a hajas fejbőr skalp legalább részben magában foglalja az “outer root sheef ’ és/vagy a bulbális régiét, és ahol az epidermáíis sejtek mind keratinoeitákat. mind melaaceitákat tartalmaznak, ii) az epidermáks sejteket elkülönítjük más sejttípusoktól, de legalább a dermális fíbroblaszfokiól, és a keratmoeitákat és melanocitákat is elválasztjuk egymástői iíi) a keratmoeitákat és a melanocítákat külön-külön tenyésztjük megfelelő tápközegben» ezáltal egv sejíszuszpenziót állítva elő, tv) a sejiszuszperstót tenyészete sejtek preparátumává alakítjuk, amely érintett hőtterüief transzplantációjára alkalmas.
Ezek a sejtknltárák a kezelendő bőrterület igényelnek, megfelelő arányban összeállíthatók a kezelendő állapot függvényében, a fsat bírlak szerint
A .kerarinocwák és melanoelták elválaszthatók egymástól a sejtek izolációja során, mivel különböző Idő elteltével válnak te a teuyésztótoska léiületörői:,
Egy eljárásban, ahol a Ébre-bi&sztok&t elválasztjuk és külön tenyésztjük, legalább a következő· lépések egyikét végrehajtjuk;
a) a ííbrobhszt kultúra felülúszóját vagy egy részéi az epidermáíis sejtoitórához adjuk, vagy· a keratinocita és/vagy melanodta kultúrához,
b) a -tenyésztett ribrobiasztokból tenyésztett sejtek preparámmánt áiliijúk elő, amely bőrsejt transzplantációra alkalmas.
Egy további szempont szerint a találmány tárgyát képezi tesiyészíeít sejtek preparátuma, mely egy személy aatökág bőrsejt transzplantócíéjára alkalmas, és amely a személyből veit sejtekből tenyésztett' keratinoeiiákat és/vagy melasoelíákat tartalmaz, ahol a .preparátum a találmány szerinti eljárások bármelyiké vel állítható elő, és tesyésztete sejtek ptepsrsímsm, mely egy szentólyben autelóg bőrsejt transzplantációra alkalmas, és amely a személyből vett sejtekből tenyésztett Ebroblasztókat tartalmaz, ahol a preparátum a találmány szériád eljárások bármelyikével állítható elő.
Egy további szempont szerint a találmány tenyésztett sejtek preparátumának készletére vonatkozik, amely egy személy astólóg börs>2ji-írajiszplamá<lóiár3 alkalmas, amely külön tartéedényekbea a áonomzemélybSl a találmány -szerinti eljárások bármelyikével előállítható, tenyésztett meiasoc'ítákat,. keraísnocltákaí és ribrofealasztokat tartalmaz, amelyek a transzplantálandő terület által megkívánt, megfelelő arányban állíthatok
Össze a tTanszpíantádóhoz.
Egy előnyös megvalósítási mód szerint bármely, sejttenyésztéshez használt tápközsg tartalmaz sutolőg szérumot, és aem tartalmaz bizonyos növekedési faktorokat, különös tekintettel az EGF, SPE és/vagy PBS-m.
Egy különösen előnyős megvalósítást mód szerint a tenyésztő tápközeg nem tartalmaz mesterséges mdögént és mesterséges növekedési faktorokat,
AZ ÁBRÁK. RÖVID LEÍRÁSA
A hajas fejbőrből frisses' elkülönített kemtinocsták vizsgálata egyértelműen mutatja, hogy a Rl/KIö negatív sejtek mennyisége szigtúnkánsan több (52,63 £ 10.21 %), mint a íágyékból elválasztott kerafinocilák esetén (35.3? ±4.47 %), vagy mint a combból elválasztottak esetéti <36.11 ± 3.24 %) íl.a-c ábrák). Ezenfelül, a hajas fejbőrből több epidenuális sejtet lehet elkülöníteni azonos mérető bördsrahból.
2, ábra
Az MTT-vizsgálafok matatják az egyes növekedési faktorok eltávolításának listását a mesterséges mitogén mentes tápoláatból (50¾ A1M-V and 5Ö% KÖM)
2,a ábra
Az A oszlop mutatja az EGF, BPE é>s FBS tartalmú tápoldat ΜΤΓ mérés eredményeit, B oszlop: EGE nélküli; C oszlop:: BPE nélküli; D oszlop: EGF és BPE nélküli; E oszlop: FBS nélküli és F oszlop: EOF, BEE és FŐS nélküli tápoldatok hatását a sejtosztódásra,
2, h ábra
Az optimális FBS koncentráció meghatározásának M.TT eredménye EGF és BPE jelenlétében,
3, ábra
Az MTI-vizsgálatok mutatják, az egyes növekedési faktorok eltávolításának hatását a mesterséges miíogén mentes tápoldaihól (5ő% AIM-V and 50% KBM autókig szérummal kiegészítve) H oszlop: A sejtek EGE és BPE tartalmú, 2,5 % autológ szérummal (FBS· helyen) kiegészített tápoldatban nőitek;. I oszlop: EGF nélkül; J oszlop: BPE nélkül (L táblázat 1); <3 oszlop: csak. 2,5%· autókig szérumot tartalmazó íöpoidat (EGE, BPE és FŐS· nélkül); A oszlop: EGE, BPE és FBS tartalmú tápoldat,
4, ábra
Keraímociták és melanociták elválasztása.
Inpsziníííi emésztéssel nyeri tiszta keratinociia kultúra, ő. ábra
Krónikus lábszárfekély gyógyulási folyamata, antolőg ksrahnoeitti transzplantáció után. Ugyanazon a lábszáron elhelyezkedő fekély rsedtáíis része transzpíamálva leli (bal oszlop, g-d), síig a laterális oldalon nem (jobb oszlop, e-h). A két fekély egyébként ugyanazt a kiegészítő kezelést kapta.
a) - Operáció előtti klinikai állapot; b) és f) - a kezelt és a nem kezelt fekély ? hét elteltévé!; c) és g) - a kezelt és a nem kezelt fekély 10 hét elteltével; d) gyógyult fekély egy Mmszplantáciöt. kővető 13. héten; h) kezeletlen fekély 16 hét elteltével; e) a kezelt és kezeletlen fekély aránya.
7-a ábra
Félvastug fejbőr minta készítése
?.b ábra
Keratinodra kultúra
-7 ♦ *
í. PÉLDA feMÍE©£Ím.§assjfeks^íimása
A paciensekből a bíopsziákat azután vettük, hogy a Szegedi Egyetem Etikai Bizottsága elfogadta a biopszíáról és tta-ttszplantáetőról szóló protokollt, Minden beteget tájékoztattunk az etjárásröl és minden beteg: aláírta a beleegyező nyilatkozatot. A mintákat a betegek különböző tesitájairöi vettük: félvastag halas fejbőr, teljes vastagságú btepszla a lágyekbói és ielvastag metszet a combból Minden bőmühía 0,25 :tnm vastagságú és 9cm? területű volt, Mindegyik betegnek (ói-74 évesok) krónikus lábszártekéiye vök. legalább lö éve. A bormintái először mrhbkttikumokkal és anílmíkotskamokksl. kiegészített izotöuiá» oldattal mostuk ÍSiGMA). A dertmsz és az epidermisz elválasztásához 4°C~on xnkabátek egy éjszakán át Dísp&se oldatban (Grsde B, Rockéi. A következő napon tnég 2 órát ínknbáltuk a bőrdaj-afeot STOon, igy az epidermisz leválasztható a dermiszröl. Az epidermiszt csszedsruhoituk, 0,25%-os tripszss (ülbc.o) oldatban 3ö percig 37oC-ön. ínkobáltuk, majd erőteljesen mostuk, a sejtek kiszabadítása érdekében. Az epidermábs sejtezuszpenziót ÍŐö gm nylon szűrőn (SloDesigs) szűrtük, •a sejteket centtifegálással elválasztottuk az oldattól: 1ÍÖÖ tpm, lö percig, áAl'-os. A frissen elkülönített Kl/Klőttegattv keratinoeftákaí a hajas fejbőrből, (ágyékból és a combból elkülönített btopsziákből fiow cytométer segítségévei analizáltuk (Bats-Csorgo H&mroerberg C,, Voorhees 1. í,, Cooper K. D. Flow cytometric ideatifieatiott of prolrferative sabpopulaiions wiíhin norma! humán epldermís aad the locailzatíon of the prímary hyperprokfefalive popniaíion in psonasís. 3 Exp Med. 1993 1:1?8'{4): 1271 1
A hajas fejbőrből frissen elkülönített keratfoocfták vizsgálata egyérteímúen mtiíátja, hogy & K17K1Önegatív sej tek mennyisége szignifikánsafí nagyobb (52,63 á 1Ő.2Í %), mint a lágyékfeól szeparált kemtmocíták esetén. (35.37 -i 4,47 %), vagy mint a combból szeparáltak esetén (36.11 ± 3.24 %) (La-c ábrák). Ezen felül a hajas fejbőrből több epldermálís sejtet tehet elkülöníteni azonos mérető bőrdarablsöl (1 .d ábra).
2. PÉLDA
Az spidérmáKs sejtteoyésztS alaptápkőzeg AÍM-V szérum mentes íim&cita tápközeg (GÍBCO) keratmocíta bazális íápkőzeg (Cambtex) 1:1 arányú keveréke, L-glutarninnái és strsptomtcya, penicillin és anrfetericin 8 andbíottkuruokkal, anhnukotiktrmokkal kiegészítve (Sigma).
Sehek dválívzíÁSít
A bőrmintát először arstibfotiferoakfcal és: attttmík&dkHínokkííl kiegészített Izoíóníás oldattal mostuk (S1GMA). A öenrasz egy részét és a szubeuíísí mechanikai úton elválasztjuk. A áermísz és az epidermisz elválasztásához 4β€:-οη Inkubáljuk egy éjszakán át Dsspase oldatban (Grade 11, Rocké). A kővetkező napon még 2 órát mkubáltuk a bőrdarafeot JV'-'C-oti, így az epidermisz leválasztó & áenniszrol. Az epidermiszt össsedarabpltuk, majd í),2:S%-os íripszin (Gibco) oldatban 30 percig 3?°C-on ínkubáhuk, majd erőteljesen mostok, a sejtek kiszabadítása érdekében, Az epidentöális sejtszuszpenzíőt lööum nylon szőrős (Rtöltesigttj szűrtük, a sejteket ceaísifiigálással elválasztottuk az oldattok 1 löö rpm, 10 percig, 4°Con. Az cpidétznális sejíszsszpenzióban meghatároztuk az élő sejtek számát, és 75 cnC alapterületű tenyésztő fiasfcáfeaa, 15 ml tápoldstttü, 5x10* seit/ml fcoacentmcíőhtm oltottuk, be a tenyészetet. ík tenyészetet 12- IS óra 37 ®C~08 történő inkubáció elteltével PBS oldattal mostak, a ic nem tapadt sejtek eltávolítása érdekében:, A kultúrákat ezután 37°C-on 5%· COj gáztartates® átélted, míg a flaska alját a sejtek 9ö%~osan. be nem nőtték, azaz: szufefconEuenssé nem vált a kultúra. A íápoldatot körülbelül 2-3 naponta friss tápoldutea cseréltük, A sejlíeuyészetek átlagosan 7-9 nap alatt tettek szabkonűuessek. Ezeket a kultúrákat 0,5% EDTA tartalmú PBS oldattal mostak, majd 0,G.l%~os íripszin oldatban inkubálíuk 2 η * χ»«4 ** *» ~ ~ * * 9 * * » χ ♦ ** ♦** » » * * ♦.♦.·« ♦ ♦ *·♦ #* #-* ** percig, hogy a sejtek elváljanak egymástól és a fíaska aljától. A kapott sejtszusjpemziót kétfelé osztottuk, és két újabb kultúrát fodltoííunk a fest leírt módos.
A kémiai mitogéoektől mentes íágoldathoz adható küiőabözö· növekedési faktorok szerepéitek taeghatározásához egy sor MTF vizsgálatot (Mosmann T. Rapid coloriasetrie sssay fór ceilofer grcnvtlr aad sumval: applicaiiea ío proliferatlon ané eytotoxicity assays, J immunoi Meihods 1983; 65 (1~2): 55-63) végeztünk a különböző összetételű tenyésztő tápoldstokkai a következőképpen: A sejteket 96 lyukú ,,piaié’-ékbe helyeztek 5xl05 sGőlyuk söröségben és különböző összetételű iápöldatb&rt növesztettük 72 órán keresztöl, majd iOpl 5 ntg/mi koncentrációjú .PBS-bea. feloldott DÓHefcil-tiuzos-íebnzrdi&m (MIT) oldatot adtaak Jtsinden lyukba, 3 óra 37aC-öis történő inkubálás után az oldatot óvatosa»: eltávolítottak, és lÜÖpl áiffietil-szaiíbxjd-ot mértünk a lyukakba, 30 perc elteltével a szinreakciő intenzitását spektrofotométerre) mértük 550 ormen ős 650 tas refereoctaIrüllámfeosszon.
Az EOF eltávolítása s tápoldatból (1, táblázat B) 143á-kal csökkentette a sejíssámot. (2a Ábra. B oszlop), 8FE nélkül (1. táblázat C) a sejtek növekedése 22%-kal csökkent (2,a ábra, C oszlop). Az BGE-ct és BPE-í sem tartalmazó tápközegben (1. táblázat D) a sejtszám 25%-kal csökkent (2,a ábra, D oszlop). Csák az: FBS-t kihagyva a tápoiáatből (í. táblázat E) 31%-kal csökkent a sejtszám (ka ábra, B oszlop). Hs egyik összetevő sem volt 8 tápkozegben (EGE, 8PE és FBS, 1. táblázat F), a sejtszám 38%-kal csökkent (2,a ábra, F oszlop).
Egy másik tnóréssorozatban határoztuk meg az FBS optimális koncentrációját EGF-et és BPE-í is tartalmazó tápoldat esetén, Habár a sejtek FBS nélkül is remekül szaporodnak, magasabb ESS menayiség (7%-!ö%) jelentősen növeli a sejtek osztódó képességét (2,b ábra).
A következő kísőrtetoorozatban kihagytak a tápközegből az állati eredetű összetevőket Az FBS-t autológ hamsa. szérumra cseréltük (1, táblázat G,H,i,J). Á sejtek ebben az esetben EG.F, BPE' és 2,5% autológ humán szérum .mellett nőitek. Ebben az esetben is jelentősen nőtt a sejtek osztódó képessége (3. ábra H oszlop). Ebben a sorozatban Is szisztematikusan elhagytak az egyes tápoldat kiegészítőket Az EGE eltávolítása a tápoldatből (1. táblázat 1) jelentőseit csökkentette a sej (számot, (3, ábra, 1 oszlop). BPE nélkül (1. táblázat J) is számottevően csökkent a sejtek növekedése (3. ábra, J oszlop). A csak: 5,5%: autológ humán szérumot tartalmazó ÁlM-V és Reratinocíta-Bazálls-Tápközeg 1:3 arányé keverékében a sejtek ugyanúgy nőttek, mint az EGF-et, BPE-t és FBSt tartalmazó azonos alap-tápoláatban (j. táblázat G és A, 3. ábra G és A oszlop).
SáKrumelkészítése
A plasztikai sebészet paciensei önkéntes alapon szolgáltatták vérmintájukat a kísérletekhez. Minden önkéntest informáltunk a kisérteíekről és a beleegyező nyilatkozataikat az intézeti IblügYelö-bizoiíság elfogadta. A vérmintákat a normál módon gyűjtöttük be vákuumcsövekbe. 30 perccel a vérvétel után 15 percig 130Ö rpat-meí cenírtfugáltBk, Az elválasztó gél föle került szérumot tároltuk.
«« ♦·♦·«·.*
Tápközeg .AlM-V SBM EGF BEE FBS AS
A 58% 50%« ·· -f- -0 -
B 58% 58% 4' + -
€ 50% 58% ’x’ -
D 58% 5854 - -
E 58% 59% -r + -
E 58% 5854 - - - -
G 58% 58% « Τ'
H 50%« 59% ·*· - *
I 58%« 58% - ?í? -
3 5854 58% 4- - 4-
AlM-V Szárúm mentes sápodat (AIM-V); kertósocöa szérum mentes sápodat (K.BM); epidémia! grovvth. faetör (EOF) ~ 5 ng/rnl; bovhse pitoitary extraot (BEE) - 58pg/mk íóetal bovsne sorúm (FBS) ~ 2.5%; aatolog szérum (AS) - 2.5%
3. PÉLDA
Az autoíóg Inasán szérum a dertnáhA fíbrofetesztokra: is serkentő hatással vas. A humán antológ szérum minimális szükséges mennyiségét MTT m&lszerml mérhík meg, A bőrmintát: először anrtbiotikamokkal és asitmikotikximokkal kiegészítést ízetőmás oldattal mostuk (SIGMA). A dermisz egy részét és a sofeeasist mechanikai úton elválaszíjuk. A dermisz és az epidermisz elválasztásához 4°€~οη mkufeáiink egy éjszakán ás DIspase oldatban (Grade IL Roche), A következő napon még 2 órát inkubáliuk a bőrdamhoí 37%’-om így az epidermisz leválasztható a demiiszrol. A dermiszí mechanikai úton őszedarabolíud maid enzim oldatban <9,8 ml RPMí 4 108 μί ln>M-os Na pimvát -E löö μί HEPES -v 1 mg DNase + 2.7 mg Collsgenase -t 12,5 mg I-Iynlonmidase) inkubáliuk 3 órát 37nC-on, Az, enzimes emésdés után erőteljesen moslak a mintát, hogy a sejtek kiszabaduljanak a mátrixból, A dermális sejiszuszpenziót löőtsm nyit® szőrön (BioDesign) szűrtük, a sejteket cenirímgáiássd elválasztottuk az oldattól: 1 löö rpm, 10 percig, 4°C-om A dermálís sejtszöszpeoziéban meghatároztuk aa élő sejtek számát, és 75 cnL alapterületű tenyésztő (laskában (Corning Cortar Corporation), 15 mi 5% antolog széπηηοί tartalmazó tápoldsttal, 5xlÖ& sejdml koneeaírácíőban oltottuk be. .a.tenyészetet Magasabb IMS kösrujeatrá» 'Λ « ♦ * ♦ *»* «* »♦ * i Λ?~ ♦ « ν ♦ * * « * ♦ ««« χ *Φ ΦΛ» * » ♦ φ ♦ * ♦ * «»» Μ« «♦ «χ * * cíot (?%-?0%) alkalmazva a tápoldsíban: a sejtek életképességét nem növelte számottevő mértékben. A tenyészőt«< Í2-Í8 óra 37 ftC-on történő inkubáció elteltével PBS-oMsttal mostuk,. a le nem tapsát sejtek: eltávolítása érdekében. Ezek után a minden lépésben olyan tápísldatet használtunk, asai csak'2,5% Hnmaa autológ szérumot tar·» rátoazstt. 2,5%-nál magasabb HAS koncentráció (5%, 7%, 10%) alkalmazása a sejtek letapadása után nem :nővelte a sejtek osztódó képességét. A kultúrákat ezután 37°C-on 5% CO> gásíartnlom mellett, míg a fíaska alját a sejtek 90%-osa» be nem nőtték, azaz sznbkonfíasnssé nem vált a kultúra. A tápoldatot körülbelül 2-3 naponta friss tápoídatra cseréltük. A tenyésztés ötödik napjától kezdve a ísbroblaszl sejttenyússsetek felölósaófát összegyűjtöttük és megfelelő mennyiségben. adagolva íúpoldat kiegészítőként alkalmaztuk az epidermálís sejttenyészetekben, vagy -.2ö°C-on lefagyasztottak és későbbi felhasználásig tároltak -20cC-on. A sejttenyészetek átlagosan 7-9 nap alatt lettek szubkouíluensek. A 9ő%-osan konfíuens kaitúrákat Ő,5% ΕΠΤΑ tartalmú FBS oldattal mostak, Rá 0,01%-es tripszhs oldatban inkubáhuk. 2 percig, hogy a sejtek elváljanak: egymástól és a rbsks aljától. A kapott sejtszuszpenzíőt kétféle osztottuk, és két újabb kultúrát indítottunk a feat leírt módon.
4. PÉLDA.
Az epídermális sejt tenyésztő alaptápközeg AIM-V szérum mentes íimíoeita rápközeg (G.IBCO) és keratmocita bazália tápközeg (Cambrsx) 1:1 arányú keveréke, L-ghnanmmal és strepíomieyn, penicillin és amfotericin B antifeiotikuínokkak aníírmkoíikumokkal kiegészítve· (Sigma); amint az: a 2. példában leírtuk. A tápoldatot 2,5% autológ humán szérummal és különböző mennyiségű fíbroblaszt kondicionált tápközeggel egészítettük: ki. A flbroblasztokaí a 3. példában leírtak szerint tenyésztettük, A Ebrobbszt tenyésztés ötödik napjától a :frbrt>bbszí tenyészetek tápoldatsí összegyűjtöttük. Ezt nevezzük Fíbroblaszt Kondicionált Médiumnak <FKM). A sejtnövekedésre optimális hatást kifejtő FKM koncentráció meghatározásához MTÍ méréseket végeztünk olyan sejteken, melyek 2,5% autológ szérum és különböző mennyisúgú fö%~25%) FKM tartalmú tápoldatban nőttek. A legmagasabb osztódási sebességet 10% FKM mellett tapasztaltak. Magasabb F&M tartalom; 15%, 20% és 255·« nem növelte mérhető mértékben a sejtek osztódási sebességét. A későbbi tenyésztések során ezért mmdtg 10%-nyí FKM-mel elkészítettük ki az epidermális ssjtkulíúrákat,
S. PÉLDA * 13
Aatolőe
Az alap epídermálís sejt tenyésztő tápokíai AIM-V szérum mentes ümíoeita tápközeg (GIBCÖ) keratinoeíta bazális tápkőzeg (Cámbrex) 1:1 arányú keveréke, L-gluísrnmo&i és slrepiomic-yn, peniciliis és amíóterfein B aníibiotikumolíkal, antimikoíikumokkal kiegészítve (Sigma). Az- epidertnális sejteket az 1. példában leírtak szerint szeparáltuk. A főként keratinocífákaí és mehumokákat tartalmazó epídensáiis sejt sznszpesziőbél 5x106 sejtet oltottunk egy 75 cm7'-es tenyésztő flaskába (Corning), AiM-V: KSM (1:1) keverék tápközegjxy amit kiegészítettünk 1% L-gfetammsal {SÍGMAj, 1% AB-AM oldattal (SIGMA) és 5% autológ szérummal, 1213 óra inkubáció után, az elpusztult ás te nem tapad! sejtek eltávolítása érdekében a tápoldatot. lecseréltük friss tápoidatrs, ami 1% I.-glutamint, 1% AB-AM oldatot: és 2,5% autológ szérumot tartalmazóit. A kultúrákat ezután 3?eC-on 5% CTA gáztartalom mellett növesztettük, míg & fíasks alját a sejtek 98%-osaa be nem nőtték, azaz. sxöbkonöueossé nem vált a kultúra. A íúpoldstot körülbelül 2-3 naponta friss lápoldatra cseréltük. A sejttenyészetek átlagosan 7-9 nap alatt tettek szubkcnfiuensek. A tenyésztés hatodik napjától a rápoídatoí kiegészítettük még lObö őbroblaszt kosdleionáh. médiummal. A konSaess .kultúrákat 0,5% EDTA tartalmú PBS oldattal mostuk, majd 0,0154-os tripszin oldatban infcufeáltök 2 percig, hogy a sejtek elváljanak egymástól és a flaska aljától.
-πφφ φ·♦.♦·
X Φ*Φ Φ ** φ Φ » X X Φ * « φφφ φφ «» φφ φφ
A kapott sejtszuszpenziót kétfelé osztottak, és két ójsbb kultúrát indítottunk & feni leírt módos. ΑΤΜ-V-, KBM (i :l) keverék tápközegbe, mait kiegészjtebünk 1% L-gbstotínuaí (SIGMA), 1% AB-A&t oldattal (SIGMA) és
2,5% aotológ szérummal és lö % FKM-tnal.
6, PÉLDA
A bőrbiopszíáí az 5. példában leírtak szerint készítetik ei. Az eptáemálts sejtek elsődleges keltóráját, amely iőfeg keratmocitákaí és roefönoeitákaí tartalmazott, KBM+AIMV+Lglu^AS-M4+2,5 % HAS4ÍÖ% FKM összefeíela tápközegben tenyésztettük. A stásodik passzázstól a kemfeodtákaí és mefenttelíákat elválasztottak, mivel a tripsziaael történő kezelésre ktltönbözöképpen reagúlnsk, Tiszta tnel&escíta kultúra létrehozásához a keratinodiákai az első két passzázs során folyamatosan eltávolítottnk. A keratínociták és a melanodíák különböző erősséggel tapadnak & tenyésztő flssks felületére. Trlpszines kezelés során a meianoeteák 2.-3 perccel hamarabb válnak le, mmt a keratmociták, igy elválaszthatók egymástól. (4. ábra). Ezzel az egyszerű dválastrtási technikával 1-2 tenyésztési ciklus-után tiszta keralinodta és tiszta meíanocife, kultúra áll rendelkezésünkre, ($. ábra). A kultúrákat 37%>οη páradús, S% COj-ot tartalmazó atmoszféra alatt inkubálluk. A sejteket több mint 3-9 paszszázson keresztül tenyészthetjük így, anélkül, hogy a sejtekre jellemző jegyeket elvesztenék. Ezzel a módszerrel egy 9-12 cart-es fciopszlából maximálisan 1 as3 sebfedőiét befedésére elegendő sejtet tersyésztheíünk.
?. PÉLDA
A 6, példában leírt módon keraifeísdtákat tenyésztettünk. .2 hét elegendő volt .a megfelelő számú sejt előállításához (3sdtp sejt/ lOöcnrt), A beteget autológ keraimocitákkaí transzpiantáltuk a Baxter eég Tissu«oFM' rendszerét felhasználva. Az egyik reprezentatív betegről készük, képeket a 6. ábrán mutatjuk be. A 74 éves nő betegnek 15 éve van láfessárfekélye a bal lábszárának mindkét oldalán. Csak egyszer transzpiantáltnik a mediáhs oldalon lévő fekélyt Mindkét oldali fekélyen phmimetríát végeztünk. A sejt transzplantációt kivéve mindkét oldalt azonos módon kezeltük. Míg as aulológ sejtekkel trssszpiwált fekély 96 «sp alatt teljesen meggyógyult, a sem transzpbntáít oldal nem mutatott lényeges javulást
Összefoglalásként kijelenthetjük, hogy a találmány tárgyát képező auiológ sejt transzplantációs módszer nemcsak egyszerűbben kivitelezhető, mint más módszerek, hanem ezen fölül jelentősen megnöveli a transzplantáció sikerességét, nemcsak a keratiaociták esetén, hanem ni. a vhiíigo gyógyításában a melanoeiták transzplantációjánál is.

Claims (5)

  1. SZABAD ALMI ÍGÉNYPONTÖK
    1. Eljárás tenyésztett sejtek preparátumának előállítására anfológ borsejt transzplantációhoz, azzal jellemezve, hogy
    1} epidenöáíis sejteket nyerünk egy kezelesáo b&rteriüetö személy hajas fejbőréből felvastag metszet formájában, ahol a hajas fejbőr félvastag metszete magában foglalja a bulbális régiói,.
    11} az epídermúlls sejteket olkölönítjsk a hajas fejbőr más típusú sejtjeitől, köztük a derrsálls fibroblaszioktóí, hí) az epiáermslis sejteket arra megfelelő tápközegbes tenyésztjük, ezáltal sejtszuszpeuzlót állítva elő, iv) a sejtsauszpenzíós tenyészett sejtek preparátumává alakítjuk, amely a kezdendő, érintett bőrterület transzplantációjára alkalmas,
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol az epiáermáks sejtek keratinocitákat és/vagy naeíanocitskat tartalmaznak, és· a keratinocitákat és melanocttákat együtt tenyésztjük egy kevert kultúrában, egy olyan tápközegben, mely mindkét sejttípus számára megfelelő tenyésztési körülményeket biztosít.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a keraiínooitákát és mehnocttákat elválasztjuk, és kalöss-kníön előnyösen tiszta kultúrák formájában - tenyésztjük.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, .azzaljellemezve, hogy a keratmesena és mekmooita kultúrákat később egyesítjük a kezelendő, érintett bőrfefeieí adott állapota által megkívánt arányban.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, íjzzs/ jellemezve, hogy a ftforobíaszíokaí elválasztjuk és külön tenyésztjük, és legalább a következő lépések egyikét végrehajtjuk:
    a) & fíbroblaszl kultúra feíülúszéját, vagy egy részét az epiásrmáhs sejtkultúrához és/vagy a keratinodra élvagy melasixúta kultúrához,
    b) a tenyésztett íibrohlasziokból tenyésztett sejtek preparátumát állítjuk elő, amely börsejt transzplantáció* ra alkalmas .
    ő. Tenyésztett sejtek preparátuma, mely egy személy autelóg börsejt transzplaotációjára alkalmas, és amely tenyésztett keratmocitákat és/vagy melanocitákat -és/vagy übrobl.asztofcat tartalmaz,, ahol a. preparátum az 1-5. igénypontok szerinti eljárások bármelyikével állítható eló.
HU0401385A 2004-07-09 2004-07-09 Autologous keratinocytes, melanocytes and fibroblast culturing technique and serum-free medium for use in human therapy HU227723B1 (en)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU0401385A HU227723B1 (en) 2004-07-09 2004-07-09 Autologous keratinocytes, melanocytes and fibroblast culturing technique and serum-free medium for use in human therapy
PCT/HU2005/000076 WO2006005977A1 (en) 2004-07-09 2005-07-11 Novel method for culturing keratinocytes, melanocytes and fibroblasts for skin grafting
EP05763133A EP1768716A1 (en) 2004-07-09 2005-07-11 Novel method for culturing keratinocytes, melanocytes and fibroblasts for skin grafting

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU0401385A HU227723B1 (en) 2004-07-09 2004-07-09 Autologous keratinocytes, melanocytes and fibroblast culturing technique and serum-free medium for use in human therapy

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU0401385D0 HU0401385D0 (en) 2004-09-28
HUP0401385A2 HUP0401385A2 (en) 2006-09-28
HU227723B1 true HU227723B1 (en) 2012-01-30

Family

ID=89985359

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0401385A HU227723B1 (en) 2004-07-09 2004-07-09 Autologous keratinocytes, melanocytes and fibroblast culturing technique and serum-free medium for use in human therapy

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1768716A1 (hu)
HU (1) HU227723B1 (hu)
WO (1) WO2006005977A1 (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008083223A1 (en) * 2006-12-28 2008-07-10 Isolagen Technologies, Inc. Methods for culturing dermal cells for treatment of skin injuries such as burns
DE102007049402A1 (de) 2007-10-15 2009-04-16 Euroderm Gmbh Kosmetisches Verfahren zum Erhöhen der Pigmentierung von Haut unter Verwendung von Melanozytenvorläuferzellen
JPWO2009051213A1 (ja) * 2007-10-19 2011-03-03 国立大学法人 東京大学 白斑治療剤および色素沈着促進方法
GB2483622A (en) * 2009-08-03 2012-03-21 Univ Durham Fibroblast feeder cells
GB0916370D0 (en) * 2009-09-18 2009-10-28 Avecia Biolog Ltd Compositions
JP2013520163A (ja) * 2010-02-23 2013-06-06 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル ヒト多能性幹細胞からヒトメラノサイトを調製するための方法
DE102010009572A1 (de) * 2010-02-26 2011-09-01 Euroderm Gmbh Verfahren zum Begünstigen der Heilung von Hautwunden unter Verwendung der Zellen der Haarwurzelscheide, Präparat und Herstellverfahren
DE102010009571A1 (de) * 2010-02-26 2011-09-01 Euroderm Gmbh Verfahren zum Begünstigen der Wiederherstellung einer Körperfunktion unter Verwendung von Zellen der Haarwurzelscheide, Präparat und Herstellverfahren
CN103003415B (zh) * 2010-05-21 2017-02-08 罗德里戈·福西翁·索托帕雷哈 通过用自体血清培养自体角质形成细胞和成纤维细胞来生产用于生成皮肤的自体皮肤片或敷料的方法
JP6101066B2 (ja) * 2012-12-10 2017-03-22 日本メナード化粧品株式会社 メラノサイト集団の調製方法
CN107151648B (zh) * 2017-06-18 2023-07-21 广东博溪生物科技有限公司 一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基
WO2019112327A2 (ko) * 2017-12-06 2019-06-13 주식회사 이뮤노맥스 세포독성 t 세포 생성방법 및 이의 용도
CN114522182A (zh) * 2020-11-07 2022-05-24 海口仁术皮肤科门诊部有限公司 一种治疗白癜风的毛囊黑素干细胞悬液的制备方法
CN115227876B (zh) * 2022-07-28 2023-08-29 福建省海西细胞生物工程有限公司 一种组织工程表皮的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19958693C2 (de) * 1999-12-06 2002-07-18 Biotissue Technologies Gmbh Verfahren und Zusammensetzungen zur Herstellung von Zelltransplantaten

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0401385A2 (en) 2006-09-28
WO2006005977B1 (en) 2008-12-24
EP1768716A1 (en) 2007-04-04
HU0401385D0 (en) 2004-09-28
WO2006005977A1 (en) 2006-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU227723B1 (en) Autologous keratinocytes, melanocytes and fibroblast culturing technique and serum-free medium for use in human therapy
US6365405B1 (en) Compositions of chondrocytes, preparation and utilization
CN106109496A (zh) 人脐带间充质干细胞提取物冻干粉及制备方法
CN101755046A (zh) 采用间充质干细胞制备真皮乳头组织的方法
US7419661B2 (en) Dermal sheath tissue in wound healing
CN102344906B (zh) 一种毛囊干细胞的分离培养方法
WO2008083223A1 (en) Methods for culturing dermal cells for treatment of skin injuries such as burns
CN105132358B (zh) 培养获得组织工程表皮的方法及其应用
CN104988110A (zh) 脐带间充质干细胞转化为胰岛细胞的方法
NZ572055A (en) Methods to maintain, improve and restore the cartilage phenotype of chondrocytes
CN112592890A (zh) 一种促进肌肉干细胞增殖的方法
CN102335459A (zh) 一种以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础的毛囊重建方法
CN104087551A (zh) 一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法
CN108865986A (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN105255822A (zh) 临床治疗级细胞治疗用毛囊干细胞细胞外基质筛选培养方法
KR20010072553A (ko) 살아있는 키메릭 피부 대체물
EP0980270B1 (en) Dermal sheath tissue in wound healing
RU2428996C2 (ru) Биотрансплантат для коррекции дефектов мягких тканей (варианты), способ получения биотрансплантата (варианты) и способ коррекции дефектов мягких тканей
CN113667632B (zh) 细胞培养基添加剂、细胞培养基及细胞体外扩增的方法
Prunieras Recent advances in epidermal cell cultures
CN117858733A (zh) 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物
CN110951675B (zh) 一种橘色双冠丽鱼黑色素细胞分离和培养方法
CN116875537B (zh) 一种构建毛囊类器官的方法
CN116970554A (zh) 一种肺动脉平滑肌肉瘤细胞系及其制备方法和应用
CN110951674A (zh) 一种橘色双冠丽鱼黄色素细胞分离和培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees