CN107151648B - 一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，包括角质细胞无血清培养基，添加有胰岛素、氢化可的松、牛脑垂体提取物、上表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、角质细胞生长因子和12‑O‑十四烷酰佛波醇‑13‑乙酸酯，以及整合素α3β1。本发明培养基中含有的整合素α3β1和12‑O‑十四烷酰佛波醇‑13‑乙酸酯具有快速促进黑素细胞在基底膜上贴壁的作用，使黑素细胞固定存在于基底层，并与基底角质形成细胞以固定比例排列于基底层的特点，可使两种细胞均迅速增殖，黑色素细胞在皮肤基底层内散在分布，细胞突起伸入到角质形成细胞之间，银染法染色显示黑素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑素细胞增殖状态良好。

Description

一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基。背景技术
人类皮肤颜色的形成主要是黑素细胞产生并分泌的黑素小体到达角质形成细胞，并在角质形成细胞中重新分布。建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养模型可以为研究皮肤色素发生发展机制提供研究平台。生理情况下，黑素细胞可以通过树突与周围角质形成细胞发生接触和联系，角质形成细胞通过直接的细胞间连接控制黑素细胞的生长、形态、树突形成和抗原表达。
黑素细胞与角质形成细胞直接接触共培养分为单层细胞共培养和重建三位表皮结构的共培养，前者比较简便，能为研究黑素细胞和角质形成细胞提供较理想的体外模型，因而被大多数学者所采用，但这种模型并不能形成类似于皮肤的细胞复层化结构，与皮肤正常生理结构存在一定的差距。后者能够准确的模拟表皮黑素单元，为体外研究黑素细胞与角质形成细胞相互作用，色素的转移与分布提供了良好的模型基础。
目前含黑素重组人工皮肤存在的问题有基底层黑素细胞贴壁不牢，组织银染切片显示基底层黑素细胞缺失或黑素细胞量少，本应存在于基底层的黑素细胞漂移至角质层，导致重组出的人工皮肤与正常人皮肤黑素细胞存在位置不一致，虽然形成的重组人工皮肤有色素沉积的表观颜色，但不能形成类似于正常人皮肤的表皮黑素单元，为研究黑素细胞与角质形成细胞之间相互作用及色素转移等方面造成障碍。
CN03134539.5可调节色素分泌的组织工程皮肤及其构建方法、CN201510795792.0一种含黑色素的体外皮肤测试模型及其制备方法、美国专利US2009/0239254A1功能性色素沉积皮肤评价、日本专利JP2008029342(A)表皮黑素形成能力等同物的制备方法和用途，以及法国专利EP2103687B1功能性色素沉积皮肤替代物和韩国专利KR20130056956含黑素细胞的皮肤等同物的制备，以上专利均使用了黑素细胞和角质形成细胞共培养构建体外重组皮肤，但以上的培养基中均加入了血清，含血清有可能造成细胞污染，影响角质细胞生长，加速角质细胞分化，导致模型整体存活时限缩短。另一方面由于血清和成分不明的蛋白的存在，对细胞生物学、毒理学、病理学等基础研究形成干扰。
CN201410045511.5含黑色素细胞的皮肤模型、其构建方法及用途专利中并未对所用到的黑素细胞与角质形成细胞共培养的培养基成分做详细介绍。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种用于黑素细胞与角质形成细胞共培养的培养基。该培养基中含有的整合素α3β1和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯具有快速促进黑素细胞在基底膜上贴壁的作用，使黑素细胞固定存在于基底层，并与基底角质形成细胞以固定比例排列于基底层的特点。该培养基可使两种细胞均迅速增殖，黑素细胞树突多为3～5个，黑色素细胞在皮肤基底层内散在分布，细胞突起伸入到角质形成细胞之间，银染法染色显示黑素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑素细胞增殖状态良好。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种用于黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，其特征在于，包括角质细胞无血清培养基，每500mL角质细胞无血清培养基中添加有2μg～10μg胰岛素、10μg～500μg氢化可的松、10mg～100mg牛脑垂体提取物、20μg～1000μg上表皮生长因子、0.1μg～5μg碱性成纤维生长因子、5μg～10μg角质细胞生长因子和10ng～100ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加20μL～50μL。
上述的一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，其特征在于，每500mL角质细胞无血清培养基中添加有3μg～6μg胰岛素、100μg～300μg氢化可的松、20mg～50mg牛脑垂体提取物、100μg～600μg上表皮生长因子、1μg～2μg碱性成纤维生长因子、6μg～8μg角质细胞生长因子和20ng～50ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加25μL～35μL。
上述的一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，其特征在于，每500mL角质细胞无血清培养基中添加有5μg胰岛素、250μg氢化可的松、35mg牛脑垂体提取物、500μg上表皮生长因子、1.25μg碱性成纤维生长因子、7μg角质细胞生长因子和40ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加30μL。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明的培养基中含有的整合素α3β1和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯具有快速促进黑素细胞在基底膜上贴壁的作用，使黑素细胞固定存在于基底层，并与基底角质形成细胞以固定比例排列于基底层的特点。
2、本发明的培养基不含血清，排除了血清中众多不明细胞因子，如抗原、抗体、激素等干扰，可提高药物或因子对表皮细胞影响研究的准确度和精确性，为体外美白测试准确性提供基础。
3、本发明的培养基可使两种细胞均迅速增殖，黑素细胞树突多为3～5个，黑色素细胞在皮肤基底层内散在分布，细胞突起伸入到角质形成细胞之间，银染法染色显示黑素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑素细胞增殖状态良好。
4、本发明的培养基不含维生素C，对于后期在黑素模型上进行美白评价的准确性具有重要意义。
5、本发明培养基培养出的重组黑素模型体外存活15天，存活时间较长，可用于化妆品美白功效检测。
下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
图1为采用本发明实施例1的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型经苏木精-伊红染色的透射电镜图。
图2为对照组培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型经苏木精-伊红染色的透射电镜图。
图3为采用本发明实施例1的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型经银染法染色的透射电镜图。
图4为对照组培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型经银染法染色的透射电镜图。
图5为采用本发明实施例1的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型与比色卡的表观照片。
图6为对照组培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型与比色卡的表观照片。
具体实施方式
实施例1
本实施例的黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，用500mL角质无血清培养基K-SFM为基础液，添加5μg胰岛素、250μg氢化可的松、35mg牛脑垂体提取物、500μg上表皮生长因子、1.25μg碱性成纤维生长因子、7μg角质细胞生长因子和40ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加30μL。
实施例2
本实施例的黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，用500mL角质无血清培养基K-SFM为基础液，添加10μg胰岛素、500μg氢化可的松、100mg牛脑垂体提取物、1000μg上表皮生长因子、0.1μg碱性成纤维生长因子、5μg角质细胞生长因子和100ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加50μL。
实施例3
本实施例的黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，用500mL角质无血清培养基K-SFM为基础液，添加3μg胰岛素、300μg氢化可的松、20mg牛脑垂体提取物、100μg上表皮生长因子、2μg碱性成纤维生长因子、6μg角质细胞生长因子和50ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加25μL。
实施例4
本实施例的黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，用500mL角质无血清培养基K-SFM为基础液，添加6μg胰岛素、100μg氢化可的松、50mg牛脑垂体提取物、600μg上表皮生长因子、1μg碱性成纤维生长因子、8μg角质细胞生长因子和20ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加35μL。
实施例5
本实施例的黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，用500mL角质无血清培养基K-SFM为基础液，添加2μg胰岛素、10μg氢化可的松、10mg牛脑垂体提取物、20μg上表皮生长因子、5μg碱性成纤维生长因子、10μg角质细胞生长因子和10ng12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加20μL。
采用本发明的培养基作为试验组的液下培养基进行黑素细胞与角质形成细胞共培养，以常规培养基作为对照组的液下培养基进行黑素细胞与角质形成细胞共培养，所述常规培养基用角质无血清培养基K-SFM 500mL为基础液，再加入5μg胰岛素，250μg氢化可的松，35mg牛脑垂体提取物，500μg上表皮生长因子，1.25μg碱性成纤维生长因子，7μg角质细胞生长因子；所用细胞的获取方式如下：
1、原代黑色素细胞的获取及传代培养：黑素细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见“构建含黑色素细胞组织工程皮肤的研究”,《中国修复重建外科杂志》,2003,17(6):501-503。
2、角质形成细胞的获取及传代培养：角质形成细胞可来源于包皮环切术的正常皮肤组织，其获取及传代详见“人表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定”,《中国实验诊断学》,2009 , 13 (2) :143-145。
将体外培养的角质形成细胞和黑素细胞以液下培养基为溶液配置成细胞悬液，按黑素细胞与角质形成细胞1:5～1:10的比例混合，将混合的细胞悬液按2.0×105个/cm2的密度接种于生物重组材料支撑膜表面，生物重组材料支撑膜的制备参照专利CN201019018002.2完成，加入共培养培养基使液面淹没支撑膜表面，培养2天，每天换液，形成皮肤雏形；再加入黑素细胞与角质形成细胞共培养的气液面培养基进行气液面培养皮肤雏形，培养13天，培养期间每天换液，最后一天收取皮肤模型完成含色素的体外重组人体皮肤表皮模型的制备；
对制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型采用苏木精-伊红染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型的结构分层以及分化状态，实验结果见图1和图2。图1为采用本发明实施例1的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型，从图1中可以看出，使用本发明的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型的结构完整，表皮各层分化明显，具有显著的基底细胞层、棘层细胞层、颗粒细胞层的区分，角质细胞层分化完全，细胞排列紧密，成紧凑的编花篮状交叉分布，与天然皮肤结构类似；图2为对照组培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型，从图2中可以看出，采用常规培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型虽然也具有表皮复层化结构，但基底层可见有细胞缺失空泡。
对制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型采用银染法染色，透射电镜和免疫组织化学分析法检测制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型的黑素分布状态，实验结果见图3和图4。图3为采用本发明实施例1的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型，从图3中可以看出，使用本发明的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型的黑素细胞均匀紧密的排布在基底层，黑素小体在整个切面均匀分布，并在角质层分布较多。图4为对照组培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型，从图4中可以看出，使用常规培养基培养的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型的黑素细胞基本在基底层没有分布，并且基底层有细胞缺失空泡，黑素小体在角质层有分布。
使用比色卡对制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型进行表观拍照，拍照结果见图5和图6。图5为采用本发明实施例1的培养基培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型，从图中可以看出，模型表面颜色均匀，表观完整，肉眼观察模型表面无明显的黑素细胞聚集；图6为对照组培养制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型，从图中可以看出，使用常规培养基培养的黑素模型表面具有色素沉积，但黑素分布不均匀并且整体亮度高于图5，存在色素分泌不足的现象。
综上所述，制备的含色素的体外重组人体皮肤表皮模型通过2天的液下及13天的气液面共15天的培养后观察表皮HE切片，结果显示，表皮层分层结构层次清晰，银染法染色显示基底层黑素细胞与支撑材料膜结合紧密，黑色素细胞内及重组皮肤切面有大量色素颗粒存在，黑色素细胞增殖状态良好，皮肤模型表面颜色黑褐色，可用于化妆品美白功效检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何限制，凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

Claims (1)

1.一种黑素细胞与角质形成细胞共培养用培养基，其特征在于，包括角质细胞无血清培养基，每500mL角质细胞无血清培养基中添加有5μg胰岛素、250μg氢化可的松、35mg牛脑垂体提取物、500μg上表皮生长因子、1.25μg碱性成纤维生长因子、7μg角质细胞生长因子和40ng 12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯，以及整合素α3β1，所述整合素α3β1的添加量为每1E6细胞添加30μL。
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