CN114522182A - 一种治疗白癜风的毛囊黑素干细胞悬液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于白癜风治疗的毛囊黑素干细胞悬液制备的技术方法，该技术方法包括以下步骤：毛囊的提取与分离；通过将提取分离的含有毛囊黑素干细胞的完整外毛根鞘放入特殊培养液培养并获得毛囊黑素干细胞悬液；毛囊黑素干细胞悬液的移植，将毛囊黑素干细胞悬液注入白斑区特定层次。本发明通过对含有黑素干细胞的毛囊外毛根鞘进行体外培养，获得有活性的富含毛囊黑素干细胞的悬液，通过精准移植，实现白癜风点状型有毛皮肤毛囊口或粘膜皮脂腺开口复色，彻底解决了白癜风患处黑素细胞的来源问题，从而治愈白癜风。
Description
技术领域
本发明涉及毛囊移植技术领域，具体涉及毛囊黑素干细胞移植术治疗白癜风的新技术和治疗白癜风的毛囊黑素干细胞悬液的制备方法。
背景技术
1、白癜风流行病学调查
白癜风(vitiligo)是一种原发性的、局限性或泛发性的皮肤黏膜色素脱失症，我国古医书中称白癜风为“白驳风”。一般肤色越深的人发病率越高，黄种人介于白种人与黑种人之间。我国人群中患病率0.1%~2.7%，大约有2000万，全球大约有1亿白癜风患者。白癜风为常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病，主要是皮肤的黑素细胞功能消失引起的。虽然本病不影响患者的身体健康和生理活动，但由于影响外观容貌，给患者带来极大的精神压力和心理负担，对患者的生活学习工作等方面都带来负面影响，从而影响了病人的生活质量，甚至阻碍患者的社会交往与择业就业。因此，寻找一种安全、有效、快捷的白癜风治疗方法具有重要的社会和经济意义。
2、白癜风国内外治疗技术情况
近年来，随着分子生物学等基础学科的迅猛发展，西医在研究该病的病因、发病机理及诊治方面均取得了进步；但白癜风的发病机制至今仍不完全清楚。白癜风是一种以局部表皮黑素细胞减少,形成白斑为特征的后天性色素减退性皮肤病。其发病机理尚未阐明,遗传及免疫因素在发病中起重要作用。目前支持白癜风是自身免疫性疾病的证据：发现了与免疫功能或自身免疫性疾病密切相关的易感基因和候选基因,如SLEV1、AIS1、HLA等基因;体液免疫和细胞免疫机制均参与了白癜风发病;白癜风患者常合并其他自身免疫性疾病;临床上使用免疫调节疗法治疗白癜风取得了较好的疗效，但是易于复发。治疗方面，光化学疗法、皮质类固醇激素应用、自体表皮移植、皮肤磨削术、308mn准分子激光等新疗法不断出现，但大都疗效不确切或副作用较大且费用较高。尽管22年前已有单株毛囊移植术治疗白癜风的临床报导：Na 等采用单株毛囊移植对 21 例白癜风患者进行治疗，采用单株毛囊移植仅仅移植了外毛根鞘的微小片段，因此存在治疗速度偏慢的缺点，且供体毛囊来源有限，不能满足大面积白癜风的移植治疗需要。近期还有培养表皮黑素细胞悬液治疗稳定期白癜风患者的报导，但是因为皱褶和五官部位悬液无法固定，导致疗效不确定或者尚处于试验阶段副作用太大而不被患者接受；目前亦有人工组织工程治疗白癜风的报导，适用于大面积白癜风患者治疗，但是手术后复色不均匀，费用昂贵，易复发，故鲜有人采用。无论悬液还是组织工程的方法，移植区都需要对表皮进行磨削令患者痛苦不堪，故不能广泛应用于临床。有研究显示白癜风患者对各种疗法的无效率可高达50%以上。
近年来研究发现外毛根鞘内含有无色素性黑素细胞（amelanotic melanocyte，AMMC），黑素细胞干细胞和前黑素细胞统称为AMMC，而前黑素细胞是黑素细胞干细胞向黑素细胞的过度态。毛囊黑素细胞干细胞(melanocytestem cells，McSCs）定位于毛囊恒定部位(毛囊的上1/3)最下端的隆突区，多处于静息状态，具有慢周期性，具有维持自我更新的能力，是典型的再生型干细胞代表。2002年Nishimura 等通过对黑素母细胞的增殖进行研究，发现表皮表达的干细胞因子在外毛根鞘与表皮之间建立了一条通道，黑素母细胞沿着这条通道从毛囊迁移到表皮。因此如何将外毛根鞘中的毛囊黑素细胞干细胞从外毛根鞘中游离出来是本发明的核心。基于我们海口仁术皮肤科门诊部有限公司的发明“毛囊黑素细胞干细胞移植术治疗白癜风的技术方法”，发明人发现通过培养可获取毛囊黑素细胞干细胞悬液，并将悬液注射于表皮特定层次，并且无需磨皮，就可实现白癜风多毛囊口和皮脂腺开口周围复色，甚至毛囊复色，最终实现治愈白癜风。
本发明制备的黑素细胞干细胞悬液，定位后注射到适合黑素干细胞生长的特定层次（因与本发明无关，层次未公开，该层次是毛囊黑素细胞干细胞的天然培养基），彻底解决了白癜风黑素细胞的来源问题。该技术通过提取少量毛囊，就可培养出大量毛囊黑素干细胞，真正实现了提取少量毛囊治疗大面积白癜风的目的。适合手足、五官、体表粘膜、躯干等各处暴露部位的白癜风，其一次手术治愈率可高达90%以上。
发明内容
本发明的目的在于提供毛囊黑素干细胞移植术治疗白癜风所需要的毛囊黑素干细胞悬液的制备方法。采用本公司发明的白癜风毛囊提取器（专利证书号第11005086号）提取并分离出含有黑素干细胞的毛囊完整的外毛根鞘，放入特殊培养液1培养，促进毛囊黑素干细胞的分化与增殖，通过培育激活并提高毛囊黑素干细胞活性，促进黑素干细胞向成熟黑素细胞快速转化；再经过加入培养液2的培养生成富含黑素细胞干细胞悬液，将富含毛囊黑素干细胞的悬液精准移植于白癜风表皮特定层次，从而彻底解决了白癜风的黑素细胞来源问题，以解决上述背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
用于白癜风治疗的毛囊黑素干细胞的制备方法及步骤：
步骤S1，毛囊的提取，采用本公司发明的白癜风毛囊提取器（专利证书号第11005086号）提取一个毛囊单位，提取首选黑色单株毛囊；同时抽取患者40ml血液，分离出自体PRP和血清；
步骤S2，毛囊的分离，在2-15倍放大镜或电子显微镜下将所述毛囊单位分离出含有黑素干细胞的毛囊完整外毛根鞘。
步骤S3，黑素细胞干细胞的体外培养，将提取分离的单株毛囊放入特殊培养液1培养，达到增强毛囊黑素细胞干细胞活性，促进其分化增殖并向成熟黑素细胞转化。
步骤S4，毛囊黑素细胞干细胞悬液的制备，将分离出的含有毛囊黑素干细胞的毛囊完整的外毛根鞘，培养液1中加入培养液2继续培育生成富含黑素干细胞的悬液。
步骤S5，毛囊黑素干细胞悬液的移植，将黑素干细胞悬液抽入1ml注射器，在本公司发明的毛囊移植的种植定位针（专利证书号第11438879号）定位下，使用空心白癜风治疗用种植针（专利证书号第11440332号）注入白斑区特定层次，可以彻底解决白癜风黑素细胞的来源问题，从而达到治愈白癜风的目的。
进一步的，所述步骤S1的具体方法为，采用专利白癜风毛囊提取器，尽量提取枕部含有毛囊黑素干细胞的黑色单株毛囊；同时抽取患者40ml血液，分离自体PRP和血清。
进一步的，所述步骤S2中，采用专利白癜风毛囊提取器提取毛囊后，在放大镜或者电子显微镜下分离毛囊，在放大2-15倍的状态下分离出含有毛囊黑素干细胞部分的完整毛囊外毛根鞘，准确率高达100%，避免了分离过程中毛囊黑素干细胞和外毛根鞘受损。
进一步的，所述步骤S3中，采用专利白癜风毛囊提取器提取的含有毛囊黑素干细胞的单株毛囊，放入特殊培养液1培养，在24-26℃无菌状态下培养30-60分钟，培育前和培养中间用波长308NM准分子激光照射20-40秒，通过培养获得激活的功能状态的快速转化的毛囊黑素细胞干细胞和成熟黑素细胞；所述特殊培养液1的主要成分为补骨脂注射液、自体血清和低分子肝素钙注射液；
进一步的在培养液1中加入培养液2，在26℃无菌状态下培养，电镜下视成熟黑素细胞增殖出现倍增后继续培养24小时，培育过程中308准分子激光间断照射，总时长5-15分钟。特殊培养液2的主要成分为自体新鲜血液提取的PRP、地塞米松磷酸钠注射液、适量自体血清和低分子肝素钙注射液。
进一步的，所述步骤S4中，在培养过程中可以生成大量黑素干细胞沿着外毛根鞘迁移，移行中更易与培养液中高浓度血小板集聚，进入培养液，形成富含黑素细胞干细胞的悬液。其悬液有效成份为：毛囊黑素细胞干细胞、成熟黑素细胞、新鲜血液提取的PRP、地塞米松磷酸钠注射液和自体血清、补骨脂注射液、低分子肝素钙注射液等。
进一步的，所述步骤S5中，毛囊黑素干细胞悬液的移植，将黑素干细胞悬液抽入1ml注射器，在本公司发明的毛囊移植的种植定位针（专利证书号第11438879号）定位下，使用本公司发明的空心白癜风治疗用种植针（专利证书号第11440332号）注入白斑区特定层次，可以彻底解决白癜风黑素细胞的来源问题，从而达到治愈白癜风的目的。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明通过独特的毛囊黑素细胞干细胞体外培养技术而获得毛囊黑素干细胞悬液。
2、本发明通过专利设备将毛囊黑素细胞干细胞悬液注入表皮特定层次，无需磨皮，减轻了患者痛苦和缩短了恢复时间，2天后可以正常洗澡；减少了提取的毛囊数量，实现了提取少量毛囊治疗大面积白癜风的需求。毛囊黑素干细胞悬液移植彻底解决了白癜风黑素细胞的来源问题。
3、本发明经过提取得到的毛囊黑素干细胞，具有不受机体内分泌以及激素影响的特性，相当于在白斑区植入了黑素细胞的原料库和加工厂，可以源源不断的产生黑素细胞，保证了术后疗效。不仅促进了黑素干细胞的增殖与分化，而且激活了白斑区无功能状态毛囊黑素干细胞向功能状态转变，可实现多毛囊口或皮脂腺开口复色，从而达到祛白目的。
4、本发明无需磨皮，适用于所有暴露部位的白癜风治疗，达到了手术微创，术后无创伤，显著优于目前黑素细胞移植技术；不仅可以治疗有毛部位（毛囊开口口）的白癜风，还可以治疗粘膜部位（皮脂腺开口）无毛区的白癜风。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的具体实施方式一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为本发明的毛囊黑素干细胞体外培养技术方法的流程图：
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行详细说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明的技术关键点：1、毛囊黑素细胞干细胞的体外培养技术：采用白癜风毛囊提取器提取含有毛囊黑素干细胞的单株毛囊，分离出完整外毛根鞘，放入特殊培养液1培养，在24-26℃无菌状态下培养30-60分钟，培育前和培养中间用波长308NM准分子激光照射20-40秒，通过培养获得激活的功能状态的快速转化的毛囊黑素细胞干细胞和成熟黑素细胞；所述特殊培养液1的主要成分为补骨脂注射液、自体血清和低分子肝素钙注射液；
2、培养液1中加入培养液2，在26℃无菌状态下培养，电镜下视成熟黑素细胞增殖出现倍增后培养24小时，培育过程中308准分子激光间断照射，总时长5-15分钟。特殊培养液2的主要成分为自体新鲜血液提取的PRP、地塞米松磷酸钠注射液、低分子肝素钙注射液和适量自体血清；在培养过程中生成的大量黑素干细胞沿着外毛根鞘移行过程中，更易与集聚的高浓度血小板黏合进入培养液中，形成富含黑素干细胞的悬液。
实施例一：
如图1所示，本发明提供一种技术方案：用于治疗白癜风的毛囊黑素干细胞悬液制备的技术方法，该技术方法包括以下步骤：
步骤S1，毛囊的提取，采用白癜风提取器提取一个毛囊单位；
步骤S2，毛囊的分离，在电子显微镜下将所述毛囊单位分离出毛囊完整的外毛根鞘；
步骤S3，提取的含有毛囊黑素细胞干细胞的完整外毛根鞘，放入特殊培养液1培养，在24-26℃无菌状态下培养30-60分钟，培育前和培养中间用波长308NM准分子激光照射20-40秒；
步骤S4，培养液2加入培养液1，在26℃无菌状态下培养，电镜下视成熟黑素细胞增殖出现倍增后培养24小时，培育过程中308准分子激光间断照射，总时长5-15分钟。将分离出的含有毛囊黑素干细胞的完整毛囊外毛根鞘，放入特制培养液2进行培养，在培养过程中可以生成大量黑素干细胞沿着外毛根鞘移行增殖，向成熟黑素细胞转化，移行过程中更易与集聚的高浓度血小板黏合进入培养液中，形成富含黑素细胞干细胞的悬液；
步骤S5，毛囊黑素干细胞的悬液的移植，将黑素干细胞悬液抽入1ml注射器，在本公司发明的毛囊移植的种植定位针（专利证书号第11438879号）定位下，使用本公司发明的白癜风治疗用种植针（专利证书号第11440332号）注入白斑区特定层次。
在本实施例中，所述步骤S1的具体方法为，采用白癜风毛囊提取器，提取头部含有毛囊黑素细胞干细胞的黑色毛囊。
在本实施例中，所述步骤S2中，提取毛囊后，在电子显微镜下分离出含有黑素干细胞的完整毛囊外毛根鞘，在放大2-15倍的状态下进行分离，准确率高达100%，避免了分离过程中外毛根鞘受损。
在本实施例中，所述步骤S3中，提取的含有毛囊黑素细胞干细胞的毛囊外毛根鞘，放入特殊培养液1在24-26℃无菌状态下培养30-60分钟，培育前和培养中间用波长308NM准分子激光照射20-40秒。
在本实施例中，所述步骤S4中，培养液2加入培养液1中，继续对分离出的含有毛囊黑素细胞干细胞的完整外毛根鞘进行培养，在26℃无菌状态下培养，电镜下视成熟黑素细胞增殖出现倍增后再培养24小时，培育过程中308准分子激光间断照射，总时长5-15分钟。在培养过程中可以生成大量黑素细胞干细胞沿着外毛根鞘移行，移行过程中更易与集聚的高浓度血小板黏合进入培养液中，形成富含黑素细胞干细胞的悬液。
在本实施例中，所述步骤S5中，毛囊黑素干细胞的悬液的移植，将黑素干细胞悬液抽入1ml注射器，在毛囊移植的种植定位针（专利证书号第11438879号）定位下，使用空心白癜风治疗用种植针（专利证书号第11440332号）注入白斑区特定层次。
实施例二：
本发明提供的毛囊黑素细胞干细胞移植术治疗白癜风的技术方法，通过实施例一中的技术方法，移植毛囊黑素干细胞悬液到白斑特定区域，促进黑素细胞的增殖与分化及黑色颗粒的形成，实现多毛囊口或皮脂腺开口复色，从而达到快速祛白目的。
在本实施例中，通过毛囊黑素干细胞悬液移植术治疗白癜风的治愈率达到90%以上。
本发明的技术难点
富含黑素干细胞悬液的制备方法是本发明的技术难点，如何培育出对人体无害且有活性的黑素干细胞悬液是本发明的核心；只有精准移植于白斑表皮特定层次，才能实现多毛囊口或皮脂腺开口复色，形成白斑复色，彻底治愈白癜风。
本发明的原理：本发明借助WOOD灯和皮肤镜成像精准数据报告，分析患者黑色素脱失程度及细胞活性，经过特殊培养液培养获得含有丰富黑素干细胞的悬液，移植于白斑表皮特定层次，促进黑素细胞的增殖与分化，实现多毛囊口或皮脂腺开口复色，从而达到治愈白癜风的目的，该技术可重建患者白斑区免疫功能，解决黑素细胞失活难题，使白癜风治疗进入微创手术时代。本发明中的黑素细胞干细胞与黑素干细胞同义，黑素细胞干细胞是黑素干细胞的早期形态。
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。本发明中的黑素细胞干细胞与黑素干细胞同义，黑素细胞干细胞是黑素干细胞的早期形态。白癜风的特定层次真实存在，不在本发明公开和保护中。
Claims (3)
1.一种治疗白癜风的毛囊黑素干细胞悬液的制备方法，其特征在于，该技术方法包括以下步骤和技术方法：
步骤S1，毛囊的提取，采用本公司发明的白癜风毛囊提取器（专利证书号第11005086号）提取一个毛囊单位，提取时提取黑色单株毛囊；同时抽取患者40ml血液，分离出自体PRP和血清；
步骤S2，毛囊的分离，在2-15倍电子显微镜或放大镜下将所述毛囊单位分离出含有黑素干细胞的毛囊完整外毛根鞘；
步骤S3，黑素细胞干细胞的体外培养，将提取分离的毛囊完整的外毛根鞘放入特殊培养液1培养，达到增强毛囊黑素细胞干细胞活性，促进其分化增殖并向成熟黑素细胞转化，放入特殊培养液1培养，在24-26℃无菌状态下培养30-60分钟，培育前和培养中间用波长308NM准分子激光照射20-40秒，通过培养获得激活的功能状态的快速转化的毛囊黑素细胞干细胞和成熟黑素细胞；所述特殊培养液1的主要成分为补骨脂注射液和自体血清和低分子肝素钙注射液；
步骤S4，毛囊黑素细胞干细胞悬液的制备，将分离出的含有毛囊黑素干细胞的毛囊完整的外毛根鞘，加入培养液2培育生成富含黑素干细胞的悬液，在培养液1中加入培养液2，在26℃无菌状态下培养，电镜下视成熟黑素细胞增殖出现倍增后继续培养24小时，培育过程中308准分子激光间断照射，总时长5-15分钟，特殊培养液2的主要成分为自体新鲜血液提取的PRP、地塞米松磷酸钠注射液、低分子肝素钙注射液和适量自体血清；所述步骤S4中，在培养过程中可以生成大量黑素干细胞沿着外毛根鞘迁移，移行中更易与培养液中高浓度血小板集聚，进入培养液，形成富含黑素细胞干细胞的悬液，其悬液有效成份为：毛囊黑素细胞干细胞、成熟黑素细胞、新鲜血液提取的PRP、地塞米松磷酸钠注射液、自体血清、补骨脂注射液和低分子肝素钙注射液等；
步骤S5，毛囊黑素干细胞悬液的移植，将黑素干细胞悬液抽入1ml注射器，在本公司发明的毛囊移植的种植定位针（专利证书号第11438879号）定位下，使用本公司发明的白癜风治疗用种植针（专利证书号第11440332号）注入白斑区特定层次，可以彻底解决白癜风黑素细胞的来源问题，从而达到治愈白癜风的目的。
2.根据权利要求1所述的一种治疗白癜风的毛囊黑素干细胞悬液的制备方法，其特征在于步骤S3毛囊黑素干细胞的体外培养：所述步骤S3，黑素细胞干细胞的体外培养，将提取分离出的具备完整外毛根鞘的毛囊放入特殊培养液1培养，在24-26℃无菌状态下培养30-60分钟，培育前和培养中间用波长308NM准分子激光照射20-40秒，通过培养获得有活性的功能状态的快速转化的毛囊黑素细胞干细胞和成熟黑素细胞，达到增强毛囊黑素细胞干细胞活性，促进其分化增殖并向向成熟黑素细胞转化的目的；所述特殊培养液1的主要成分为补骨脂注射液、自体血清和低分子肝素钙注射液。
3.根据权利要求2所述的一种治疗白癜风的毛囊黑素干细胞悬液的制备方法，其特征在于步骤S4：所述步骤S4，毛囊黑素细胞干细胞悬液的制备，培养液1中加入培养液2在26℃无菌状态下培养，电镜下视成熟黑素细胞增殖出现倍增后再培养24小时，培育过程中308准分子激光间断照射，总时长5-15分钟；特殊培养液2的主要成分为自体新鲜血液提取的PRP、地塞米松磷酸钠注射液、低分子肝素钙注射液和适量自体血清；在培养过程中可以生成大量黑素干细胞沿着外毛根鞘迁移，移行中更易与培养液中高浓度血小板集聚，进入培养液，形成富含黑素细胞干细胞的悬液，其悬液主要成份为：毛囊黑素细胞干细胞、成熟黑素细胞、新鲜血液提取的PRP、地塞米松磷酸钠注射液以及自体血清、补骨脂注射液和低分子肝素钙注射液等。
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