CN117858733A - 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 - Google Patents
一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117858733A CN117858733A CN202180087453.0A CN202180087453A CN117858733A CN 117858733 A CN117858733 A CN 117858733A CN 202180087453 A CN202180087453 A CN 202180087453A CN 117858733 A CN117858733 A CN 117858733A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- bone
- cells
- bmsc
- tissue
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 147
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 72
- 210000001944 turbinate Anatomy 0.000 title claims abstract description 53
- 210000002805 bone matrix Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 18
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 92
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 56
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 31
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 29
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 27
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 claims description 26
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 24
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 16
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 16
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 16
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 14
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims description 2
- 210000003692 ilium Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 210000000614 rib Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 8
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 8
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 8
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 7
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 6
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 5
- 210000002850 nasal mucosa Anatomy 0.000 description 5
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 description 5
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 210000003928 nasal cavity Anatomy 0.000 description 4
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 4
- 230000004819 osteoinduction Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 206010049811 Extraskeletal ossification Diseases 0.000 description 3
- 208000034970 Heterotopic Ossification Diseases 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000010478 bone regeneration Effects 0.000 description 3
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 210000001331 nose Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 3
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 3
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 2
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 2
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 2
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003844 B-cell-activation Effects 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010013954 Dysphoria Diseases 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101000668058 Infectious salmon anemia virus (isolate Atlantic salmon/Norway/810/9/99) RNA-directed RNA polymerase catalytic subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000687343 Mus musculus PR domain zinc finger protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010051208 Nasal mucosa atrophy Diseases 0.000 description 1
- IZJUDHRCPPLENF-UHFFFAOYSA-N P(=O)(=O)OCC(C(=O)O)O Chemical compound P(=O)(=O)OCC(C(=O)O)O IZJUDHRCPPLENF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 206010061363 Skeletal injury Diseases 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 229930003316 Vitamin D Natural products 0.000 description 1
- QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N Vitamin D3 Natural products C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@H](C)CCCC(C)C)=C/C=C1\C[C@@H](O)CCC1=C QYSXJUFSXHHAJI-XFEUOLMDSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012237 artificial material Substances 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013329 compounding Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008451 emotion Effects 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 230000000642 iatrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000022119 inability to concentrate Diseases 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000537 nasal bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000000492 nasalseptum Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 238000001637 plasma atomic emission spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052573 porcelain Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 229960002901 sodium glycerophosphate Drugs 0.000 description 1
- REULQIKBNNDNDX-UHFFFAOYSA-M sodium;2,3-dihydroxypropyl hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OCC(O)COP(O)([O-])=O REULQIKBNNDNDX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000019166 vitamin D Nutrition 0.000 description 1
- 239000011710 vitamin D Substances 0.000 description 1
- 150000003710 vitamin D derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046008 vitamin d Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/3608—Bone, e.g. demineralised bone matrix [DBM], bone powder
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
- A61L27/3645—Connective tissue
- A61L27/365—Bones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
- A61L27/3695—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the function or physical properties of the final product, where no specific conditions are defined to achieve this
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3821—Bone-forming cells, e.g. osteoblasts, osteocytes, osteoprogenitor cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3895—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells using specific culture conditions, e.g. stimulating differentiation of stem cells, pulsatile flow conditions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/40—Composite materials, i.e. containing one material dispersed in a matrix of the same or different material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
本发明提供了一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物。具体地，本发明提供了一种组织工程化骨移植物，其含有在脱钙骨基质上生长的骨髓基质干细胞(BMSC)；所述组织工程化骨移植物用于下鼻甲重建。本发明的组织工程骨移植物能够有效重建下鼻甲，并且无免疫原性、安全性高。
Description
本发明属于生物医学组织工程领域，具体涉及一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物。
空鼻综合征(empty nose syndrome,ENS)是鼻甲过分切除导致的一种医源性并发症。表现为继发性鼻腔黏膜萎缩及一系列伴发症状，包括鼻腔咽部干燥感，注意力无法集中，疲劳、烦躁、焦虑、抑郁等。大约20％的下鼻甲切除术患者会发展出ENS。由于治疗效果不佳，患者及其家属对手术医生、医院存在着敌对情绪,甚至发生激烈矛盾，给社会带来一定的不安定因素。
为了治疗ENS，学者们尝试采用了各种填充材料，如硅胶，自体或异体骨、软骨，人工真皮、羟基磷灰石或其复合物。虽然上述方法能达到一定的治疗效果，但存在排异、过敏、组织相容性等问题。
综上所述，本领域迫切需要开发一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物。
发明内容
本发明提供了一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物。
在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化骨移植物，它包括：
(a)脱钙骨基质载体；
(b)人骨髓基质干细胞(BMSC)细胞；其中，
所述脱钙骨基质载体的脱钙程度为95-85％；和/或
所述脱钙骨基质载体的厚度为3-8mm。
在另一优选例中，所述脱钙骨基质载体的脱钙程度为92％-86％。
在另一优选例中，所述脱钙骨基质载体的厚度为4.5-5.5mm。
在另一优选例中，所述的BMSC为自体细胞。
在另一优选例中，所述的BMSC来源于松质骨。
在另一优选例中，所述的松质骨包括：髂骨、胸骨、肋骨。
在另一优选例中，所述移植物为固态细胞材料复合物，且BMSC在复合材料 中的浓度为1×10
7个细胞/cm
3-1×10
8个细胞/cm
3，优选2×10
7细胞/cm
3-7×10
7细胞/cm
3。BMSC在复合材料中的含量为1×10
7个细胞/g-1×10
8个细胞/g，优选2×10
7细胞/g-7×10
7细胞/g。
在另一优选例中，所述组织工程化骨移植物形状与人体需要移植的下鼻甲缺损部位形状相符。
在本发明的第二方面，提供了一种制备如本发明第一方面所述骨移植物的方法，包括步骤：
(1)提供一自体BMSC细胞，所述BMSC细胞来自自体骨髓；
(2)通过含有碱性成纤维生长因子(bFGF)的培养液体外扩增培养BMSC细胞；
(3)接种BMSC细胞于脱钙骨基质载体，体外成软骨诱导培养，形成组织工程化骨(BMSC-脱钙骨复合物)。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述体外培养液为低糖培养基。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述扩增培养BMSC至第2-5代。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述体外培养液中bFGF的浓度为0-10ng/mL；优选2-5ng/mL。
在另一优选例中，步骤(2)中，所述扩增的BMSC细胞为长梭形，细胞体积小，增殖活性强。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述BMSC的接种浓度为1×10
7细胞/g-1×10
8细胞/g；优选为2×10
7细胞/g-7×10
7细胞/g；更优选地，为3.5×10
7细胞/g-5×10
7细胞/g。
在另一优选例中，步骤(3)中，所述体外成软骨诱导培养0.5-8周；优选0.5-4周。
在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述骨移植物的用途，用于制备一种修复下鼻甲缺损部位的药物。
在另一优选例中，所述的药物为包含活细胞的材料。
在另一优选例中，所述下鼻甲缺损部位选自下鼻甲基底、下鼻甲周边组织、鼻腔外侧壁。
在另一优选例中，所述组织工程化骨移植物还用于增大下鼻甲体积、缩小鼻 腔容积，改善鼻腔通气功能。
在本发明的第四方面，提供了一种修复下鼻甲缺损部位的方法，将如本发明第一方面所述的骨移植物施用给有需要的受试者。
应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
图1显示了培养基中有无成纤维生长因子(bFGF)对BMSC细胞生长的影响；其中，A图中“+bFGF”为添加bFGF培养，“-bFGF”为未添加bFGF培养；B图中的折线图中，纵坐标为CCK-8检测结果的OD(optical density)值，横坐标为培养天数(d)。
图2显示了脱钙骨样品图。
图3显示了BMSC-复合脱钙骨体外成骨诱导4周后形成的组织工程骨。
图4显示了BMSC接种聚羟基乙酸/聚乳酸支架材料体外培养8周形成软骨样移植物的示意图，其中，A图为软骨样移植物，B、D、F图分别为该移植物的组织学、蕃红-O、和II型胶原免疫组化染色(比例尺为1mm)，C、E、G图分别为B、D、F图中黑框内容的放大(比例尺为100μm)。
图5显示了BMSC接种聚羟基乙酸/聚乳酸支架材料形成的组织工程软骨植入皮下环境12周后取材的示意图。其中，A图为BMSC-聚羟基乙酸/聚乳酸组织的软骨样移植物在裸鼠皮下继续发育形成的组织工程骨，B图为A图的组织学染色(比例尺为100μm)。
图6显示了BMSC-脱钙骨复合物移植到裸鼠皮下环境中形成的组织工程骨组织。
图7显示了BMSC-脱钙骨复合物的组织学染色。
图8显示了BMSC-脱钙骨复合物植入空鼻症患者鼻腔外侧壁相当于下鼻甲部位术前术后MRI影像。
本发明人通过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于特定材质的脱钙骨基质，复合BMSC细胞构建的组织工程骨，本发明的组织工程骨特别适用于修复下鼻甲缺损。本发明中的脱钙骨基质具有特定的硬度、厚度：合适的厚度有利于支撑下鼻甲部位，便于BMSC细胞负载；特定的硬度便于修剪，同时提供下鼻甲支撑时所需强度。此外，材料上负载的BMSC有利于鼻腔粘膜修复。具体地，本发明人通过优化脱钙骨载体材料的厚度和脱钙程度、BMSC体外培养条件，构建了一种特殊的组织工程骨移植物材料，便于下鼻甲重建。在此基础上完成了本发明。
本发明基于微创取少量的BMSC细胞，通过体外培养，高密度接种于特定规模大小和厚度的脱钙骨材料后，通过培养得到一种有生物活性的BMSC细胞-脱钙骨材料复合物，依靠自体组织细胞的成骨作用及生物材料的降解吸收，最终形成新生的下鼻甲骨。
术语
如本文所用，本发明的“下鼻甲重建的组织工程骨移植物”、“本发明的组织工程化软骨/骨移植物”、“本发明的软骨/骨移植物”可以互换使用，皆指本发明第一方面述及的用于下鼻甲修复的组织工程骨移植物。
一般地，可选用脱钙骨-明胶复合支架，聚羟基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)，聚己内酯(PCL)，或者聚己内酯复合羟基磷灰石作为组织工程骨的支架材料。
术语“诱导”指提供特殊的生化环境，将具有多向分化能力的干细胞等细胞群体转变为另一种功能特性不同的细胞群体的过程。
术语“接种”指将细胞均匀分布于三维支架材料上的过程。
术语“自体移植”指将所需生物活体材料(如骨髓基质干细胞)从某个体中取出并再施用于同一个体的过程。
在本发明的一个优选例中，选用的组织工程载体的材料为脱钙骨基质。
脱钙骨基质
脱钙骨基质(DBM)是由同种异体骨或异种骨经脱钙处理，能降低免疫原性的骨移植材料。脱钙程度不同对应的机械强度也不同。具有良好的生物学特性、骨诱导性和骨传导性和生物降解性，促进新骨形成及骨组织矿化，进而加速骨愈合，可以单独或与自体骨、其它生物材料、生长因子联合有效修复骨损 伤，是比较理想的骨组织工程支架材料。
在另一优选例中，所述脱钙骨材料的长度为10-40mm，优选为34.5-35.5mm；宽度为5-15mm，优选为9.5-10.5mm。
在本发明的一个实施例中，脱钙骨材料的长、宽、高分别为35mm、10mm、5mm。
应理解，本发明的组织工程化骨移植物大小可以根据不同患者的情况来定制。例如，可以根据不同患者下鼻甲缺损的部位进行修剪，已满足实际要求。
为了在下鼻甲这一特定位置起支撑作用，本发明的组织工程骨移植物中的脱钙骨材料需要一定厚度。厚度过大，不利于干细胞接种和细胞悬液的充分渗透，并且培养的细胞材料复合体会出现中空现象，影响植入后的修复效果；厚度过小，无法满足力学强度要求，导致接种时细胞悬液流失，进而无法有效的负载细胞，降低接种效率。
本发明人优化了脱钙骨材料的厚度，在一优选例中，本发明的脱钙骨材料厚度为1-8mm；更佳地，厚度为2-5mm。
脱钙程度
可用于本发明组织工程载体的骨组织来源没有特别限制，可以是来源于人的同种异体骨组织，也可以是来源于动物(如猪、牛、羊、狗等)的异种骨组织。优选的是来源于猪、牛的异种骨组织。
在同样的处理条件下，脱钙程度较小时材料韧性较低，在修剪材料时会导致材料较易发生碎裂现象，增加操作难度，同时会延长材料在体内的降解时间；但脱钙程度过大时，材料强度不足，难以符合修复下鼻甲所需的强度，影响患者预后。
在本发明的一个实施例中，本发明的脱钙骨材料所述脱钙骨基质载体的脱钙程度为95-85％，优选为92％-86％。即，本发明中的脱钙骨材料的含钙量应控制在5-15％左右，优选为8-14％。
脱钙的方法
将骨组织浸入液氮中5min，随后置于75％乙醇溶液中进行脱脂处理；随后加入0.5M的HCL溶液中进行脱钙处理，HCL溶液每两小时更换一次，共更换3次；使用去离子水洗涤3次后加入0.05％胰酶溶液置于37℃恒温摇床消化2h进行脱 细胞处理；最后经冷冻干燥制成脱钙骨基质，干燥箱储存备用。
脱钙程度的测定
使用等离子发射光谱分析法测量。取0.5g冻干脱钙骨，充分研磨制成脱钙骨基质粉末粉末，置入100ml容量瓶，加入5ml浓HNO
3，微波190℃消解18分钟，定容至100ml；取溶液1.5ml加入等离子发射光谱仪(ICP)进行检测，读取数值；重复三次，取平均值。
骨髓基质干细胞
骨髓基质干细胞(bone marrow stromal cell，BMSC)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞,在体内外适当的诱导环境下可以分化为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱及韧带等多种组织细胞。该细胞群来源充足,取材方便,增殖能力强。
在本发明的一个实施例中，直接以成骨诱导液扩增BMSC，待细胞达到一定数量之后，接种于脱钙骨或其他组织工程支架材料，继续以成骨诱导液培养1-3周。
在另一优选例中，以含bFGF的低糖培养基扩增BMSC。bFGF可显著提高BMSC增殖活性，有利于维持其干细胞特性，进而节省所需BMSC的数量并且提高成骨活性。
在另一优选例中，以高浓度的BMSC接种于脱钙骨材料，依患者下鼻甲萎缩程度决定脱钙骨大小，形成组织工程化骨(BMSC-脱钙骨复合物)。
本发明用于接种的BMSC浓度通常为1×10
7细胞/g-8×10
7细胞/g，较佳地为2×10
7细胞/g-5×10
7细胞/g。通常，以培养液调整种子细胞浓度，然后与本发明的组织工程载体混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以本发明载体能够吸附的培养液最大量为准。
在本发明的移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持细胞表型、促进细胞生长或基质合成能力等，或者促进组织生长、血管、神经长入等。
形成的骨移植物，可直接植入体内骨缺损处等部位，修复骨组织缺损或填充骨组织。
hBMSC-脱钙骨复合物
本发明中hBMSC-脱钙骨复合物的细胞接种浓度通常约为1×10
7细胞/g-8×10
7细胞/g或更高。材料为脱钙骨材料或者其他固体性材料，固、液体复合材料。以培养液调整细胞浓度，然后与脱钙骨材料混合，其中混合时培养液与脱钙骨材料的比例没有特别限制，但是以该脱钙骨材料所能够吸附培养液的最大量为准。当支架材料为特殊三维形状时，如下鼻甲时，按实际体积的大小来进行计算。
制备方法
本发明的组织工程化软骨移植物制作简便。
在一个具体实施例中，先以含bFGF的低糖培养基扩增BMSC，待细胞达到一定数量之后，接种于脱钙骨或其他组织工程支架材料，再以专利(ZL201110268830.9)中实施例6所公开的体外成软骨诱导液培养1-8周，形成软骨样移植物。
本发明的主要优点包括
(1)本发明的脱钙骨基质材料能够有效重建下鼻甲。
(2)本发明所需干细胞取材于自体，无免疫原性，安全性高。
(3)BMSC微环境有利于鼻腔的黏膜修复。
(4)本发明仅需微量干细胞，取材过程为常规操作，不损伤正常组织。
(5)可按照组织缺损形状制备移植物大小，以达到精确修复。
(6)体外培养方法简便易学，便于推广，易形成产业化产品。
(7)本发明的组织工程化软骨/骨移植物具有较好的可塑性及一定的机械强度，容易加工成所需的形状并有支撑作用，满足下鼻甲特定位置的要求。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
成骨条件培养液
培养液为DMEM(delbecco's modified eagle medium)，加入β-磷酸甘油钠10nmol/L，地塞米松0.1μmol/L，L-α-磷酸抗坏血酸50μmol/L，L-谷氨酰胺300mg/L，1.25(OH)
2VD
3 10nmol/L和10％胎牛血清(hyclone，USA)，未注明试剂均为Sigma公司，USA。
体外成软骨诱导液
如专利(ZL 201110268830.9)中实施例6所公开的体外成软骨诱导液。
BMSC的扩增培养基(含bFGF的低糖培养基)：
用于扩增BMSC的培养基每升液体含低糖DMEM培养基10g，L-谷氨酰胺300mg，维生素C 50mg，碳酸氢钠3.7g。优选地，加入2-5ng/mL的碱性成纤维生长因子(bFGF)。
成骨诱导液
高糖DMEM培养液中含10％FBS，β-磷酸甘油10mM，维生素D310nM，地塞米松0.1μM。
实施例1：BMSC的获取和培养
从患者髂前上棘经穿刺取骨髓3～5ml，置于PercoII分离液上(密度1.073g/L)行梯度密度离心，骨髓与分离液比例为1:2。2550r/min离心30分钟，吸取中间云雾状细胞层，磷酸缓冲液(PBS)洗1次。1550r/min离心后弃上清获取有核细胞，以2×10
7细胞/cm
2接种培养皿，进行体外细胞扩增，以成骨条件培养液予成骨诱导。
原代细胞接种后48小时换液，细胞达80％～90％融合后，采用0.25％胰酶消化，2×10
3细胞/cm
2传代培养，置于37℃，5％CO
2培养箱培养至第3代，收集细胞并计数。
实施例2：BMSC培养条件的优化
以含bFGF的低糖培养基扩增BMSC。用于扩增BMSC的培养基中，每升液体含低糖DMEM培养基10g，L-谷氨酰胺300mg，维生素C 50mg，碳酸氢钠3.7g。培养基中添加0ng、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)。分别以上述培养基培养BMSC。
结果显示，在表明含bFGF的培养基中，bFGF浓度范围为2-5ng/mL左右最佳。
添加(+bFGF)与未添加(-bFGF)bFGF培养的细胞形态结果如图1A所示：添加bFGF培养的BMSC更能维持长梭形，且细胞体积较小；而未添加bFGF培养的普通体系中扩增的BMSC，形态较为铺展。
图1B中显示，添加bFGF培养的BMSC在培养的第九天依然可以有较好的增殖活性；未添加bFGF培养的BMSC在培养的第五天后增殖活性不断降低。
实施例3：BMSC复合组织工程支架材料的体外培养
(1)实验方法：
方法1：直接以成骨诱导液扩增BMSC，待细胞达到一定数量之后，接种于脱钙骨或其他组织工程支架材料，继续以上述成骨诱导液培养1-3周。
方法2：先以含bFGF的低糖培养基扩增BMSC，待细胞达到一定数量之后，接种于脱钙骨或其他组织工程支架材料，再以成骨诱导液培养1-3周。
方法3：先以含bFGF的低糖培养基扩增BMSC，待细胞达到一定数量之后，接种于脱钙骨或其他组织工程支架材料，再以专利(ZL 2011 1 0268830.9)实施例6中优选的体外成软骨诱导液培养0.5-8周，形成软骨样移植物(即组织工程软骨)。
其中，方法1从细胞扩增阶段就通过成骨诱导液提供成骨环境，可能更有利于后续骨再生；
方法2通过含bFGF的低糖培养基扩增细胞，与第一种方法相比可以获得更多的细胞数量；
方法3则在方法2的基础上，采用成软骨诱导液对细胞材料复合物进行为期更长的体外培养，体外再生出来的组织更加接近于软骨，植入下鼻甲缺损部位之后对周围的环境更加耐受，有望提高存活几率(下鼻甲缺损部位处于粘膜下的微环境，血供并不是非常丰富，不利于一般组织工程骨的长久存活，但组织工程软骨对缺血供的环境更加耐受)。上述被植入鼻腔黏骨膜下的组织工程软骨，由于其内部BMSC的终末骨化作用，会进一步通过“软骨内骨化”的方式继续发育成骨组织(与所缺损的组织类型相匹配)。
注：方法3优于1优于2。
(2)BMSC接种于脱钙骨材料：
选用脱钙骨作为组织工程骨的支架材料。通过脱钙处理，控制脱钙骨材料的含钙量在8-10％左右。脱钙骨材料的大小需根据不同患者的情况来定制。通 常较为适宜的脱钙骨基质载体材料的长、宽、高分别为35mm、10mm、5mm，材料的质量为4-5g。脱钙骨样品图如图2所示。
成骨诱导后BMSC以3.5×10
7细胞/g浓度接种于脱钙骨材料，培养0.5-8周，依患者下鼻甲萎缩程度决定脱钙骨大小，形成BMSC-脱钙骨复合物组织工程化骨。体外成骨诱导4周后形成的BMSC-脱钙骨复合物如图3所示。
(3)BMSC接种于其他材料：
以含bFGF的低糖培养基扩增BMSC，待细胞达到一定数量之后，接种于聚羟基乙酸/聚乳酸支架材料，成软骨诱导液培养0.5、1、2、3、4、6、8、12周之后，在体外均可形成软骨样移植物。实验结果如图4所示。
体外培养8周后，构建产物形成了瓷白色软骨样外观(图4A)，组织学结果显示典型的软骨陷窝结构(图4B、图4C)，并且表达了丰富的软骨特异基质，包括糖胺聚糖(图4D、图4E，红色)和II型胶原(图4F、图4G，褐色)。
这表明，用成软骨诱导液培养0.5-12周所得构建产物具有典型的软骨组织特征。
实施例4：动物移植实验
将实施例3制备的BMSC-聚羟基乙酸/聚乳酸支架材料的软骨样移植物(培养时间为0.5、1、2、3、4、6、8、12周)，分别植入裸鼠皮下，一个12周后发育而成的组织工程骨样本如图5所示。取出所述样本，进行检测。
结果如图5A所示。软骨样移植物在体外是组织工程软骨，植入体内之后BMSC发生终末骨化，最终形成了组织工程骨(硬骨)；图5B为5A的组织学染色，可见典型的骨样组织结构。
其中：图5A为大体观：体外再生的组织工程软骨，植入皮下非软骨再生微环境之后，可发育为骨样组织；
图5B为HE染色：组织学染色结果显示了典型的骨样结构。
将BMSC-复合脱钙骨体外成骨诱导4周后形成的组织工程骨(图3)，植入裸鼠皮下。
结果表明，4-8周发育后形成组织工程骨组织。其中，一个6周发育后所形成组织工程骨组织样品示于图6。
体外再生的组织工程软骨植入皮下环境中(非软骨再生微环境)，组织工程软骨发生异位骨化，形成组织工程骨。下鼻甲缺损部位属于非软骨再生微环 境，经成软骨诱导的BMSC-脱钙骨复合物在该环境中可发生异位骨化形成组织工程骨。
图6所示的BMSC-脱钙骨复合物样品的组织学染色如图7所示。结果表明，所述BMSC-脱钙骨复合物样品具有典型的骨样结构。图7较图5B拥有骨组织特异性的骨小梁结构，更加符合天然骨组织的组织结构。
此外，成软骨诱导液培养时间0.5-8周的构建产物的终末骨化较为充分，可形成硬度合适的硬骨。当成软骨诱导液培养时间≥12周时，所构建产物仍具有软骨组织特征，然而作为下鼻甲重建的移植物植入体内后，不易通过软骨内骨化发生终末骨化。
这提示，采用0.5周-4周(或3-30天，或7-28天)的构建产物是优选的，因为一方面移植时为软骨状，便于移植操作；另一方面，移植物在移植后易于通过软骨内骨化发生终末骨化，形成形状和硬度与天然下鼻甲更为接近。
(注：体外成软骨诱导的时间如果超过8周，则会降低移植物在体内发生异位骨化的几率)。
实施例5：下鼻甲重建
根据实施例3中的方法1，将细胞接种于脱钙骨材料，通过成骨诱导形成组织工程骨。体外培养1-3周左右，待细胞与生物材料附着良好后，鼻内镜下切开鼻腔黏膜，分离鼻粘膜和骨质，形成植入腔，将组织工程化骨体外修成合适形状后植入志愿者下鼻甲内或鼻腔外侧壁相当于下鼻甲部位。
结果：图8显示志愿者的症状改善明显，显著影像学数据及主观量表评分均有显著改善。
结果说明由于移植物为骨状，因此便于移植手术；另一方面，本发明的移植物在移植后最终发育为成熟的骨组织，最终的形成形状和硬度与天然下鼻甲更为接近。
讨论：
本发明采用的BMSC细胞复合的生物材料有诸多优点：
(1)细胞拥有多项分化潜能，在特定分化环境中可分化为不同的组织。因此其在鼻黏膜下环境靠近骨面部分可定向分化为骨组织，实现鼻甲再生；在靠近黏膜部位可定向分化为黏膜组织，以细胞替代的方式进行组织修复。
(2)干细胞具有一定的旁分泌(Paracrine)作用，可以分泌VEGF促进血管新生，分泌IL-6调节免疫平衡抑制炎症，分泌SDF抑制周围组织中的细胞凋亡等，这些均有利于修复鼻黏膜功能。
(3)干细胞具有一定的免疫调节作用。可以防止T淋巴细胞的不适当激活，抑制T细胞增殖，抑制T细胞向Th1、Th17分化。此外，可以通过产生IDO分解代谢物来对T细胞进行免疫抑制。同时，干细胞可以将树突状细胞转化为耐受性表型，干细胞产生的HLA-G5和B7-H4可使效应T细胞向Treg(调节性T细胞)分化，维持T细胞静止状态和调节T细胞亚型平衡。干细胞也可抑制B细胞的活化和功能，通过旁分泌的方式将这些细胞阻滞在细胞周期的G0/G1期，从而抑制B细胞的增殖；也可通过下调B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(Blimp-1)的mRNA表达来抑制B细胞向浆细胞的分化。因此，干细胞在组织修复过程中可产生免疫耐受微环境，从而中断免疫反应，减少局部微环境的免疫炎症反应，有利于黏膜组织的修复。
(4)相对于无生物活性的假体植入，或羟基磷灰石这类的无细胞负载植入，干细胞在黏膜再生方面具有其显著优势。单纯假体植入或无细胞负载植入都无法实现干细胞微环境所产生的免疫调节作用，进而降低植入后鼻中隔黏膜再生效率，影响患者预后。
与其他材料对比，如使用自体骨、或使用无细胞移植物羟基磷灰石修复：自体骨为自体来源无免疫原性，但其来源有限，对于患者会造成二次伤害，部分患者难以接受；此外，矿化后的成熟天然骨组织中活细胞含量极少，因此，将其移植到鼻甲所处的黏膜环境中很难存活(缺乏成骨细胞和血供)，而组织工程骨的活细胞含量远高于天然骨，且刚植入体内时孔隙率较高，血管化完成前可通过体液渗透获得营养，血管化建立后即可稳定存活。因此，自体组织工程骨植入体内后(尤其在非成骨环境下)的存活率远高于自体骨移植。以羟基磷灰石等生物陶瓷为代表的无细胞植入物虽可改善鼻甲状态，改善通气量及生理结构，但其对于鼻黏膜修复并无明显效果。此外，由于鼻腔环境易感染，人工材料又缺乏生物活性，因此存在材料外露、脱出、感染和排异等诸多风险。BMSC-聚羟基乙酸/聚乳酸的骨移植物，移植后降解会产生酸性降解产物，会干扰下鼻甲的再生。
与现有技术相比，本发明的BMSC-脱钙骨的骨移植物具有一定柔韧度，便于修剪为适宜大小和形状的移植物。此外，本发明的移植物具有优异的力学强 度特性，并且移植后不会产生酸性降解产物，并且通过提供利于骨再生的微环境使得本发明的移植物更易于在鼻黏膜下环境实现骨再生与黏膜再生，因此有助于形成性能(如硬度等)符合要求的下鼻甲。
因此，本发明用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物具有显著的修复效果，具有安全性高、相容性好、可塑性强、修复效果优异等特点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (14)
- 一种组织工程化骨移植物，其特征在于，它包括：(a)脱钙骨基质载体；(b)人骨髓基质干细胞(BMSC)细胞；其中，所述脱钙骨基质载体的脱钙程度为95-85％；和/或所述脱钙骨基质载体的厚度为3-8mm。
- 如权利要求1所述的骨移植物，其特征在于，所述脱钙骨基质载体的脱钙程度为92％-86％。
- 如权利要求1所述的骨移植物，其特征在于，所述脱钙骨基质载体的厚度为4.5-5.5mm。
- 如权利要求1所述的骨移植物，其特征在于，所述的BMSC为自体细胞。
- 如权利要求1所述的骨移植物，其特征在于，所述的BMSC来源于松质骨。
- 如权利要求5所述的骨移植物，其特征在于，所述的松质骨包括：髂骨、胸骨、肋骨。
- 如权利要求1所述的骨移植物，其特征在于，所述移植物为固态细胞材料复合物，且BMSC在复合材料中的浓度为1×10 7个细胞/cm 3-1×10 8个细胞/cm 3，优选2×10 7细胞/cm 3-7×10 7细胞/cm 3。
- 如权利要求1所述的骨移植物，其特征在于，所述组织工程化骨移植物形状与人体需要移植的下鼻甲缺损部位形状相符。
- 一种制备如权利要求1所述骨移植物的方法，其特征在于，包括步骤：(1)提供一自体BMSC细胞，所述BMSC细胞来自自体骨髓；(2)通过含有碱性成纤维生长因子(bFGF)的培养液体外扩增培养BMSC细胞；和(3)接种BMSC细胞于脱钙骨基质载体，体外成软骨诱导培养，形成组织工程化骨(BMSC-脱钙骨复合物)。
- 如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述体外培养液中bFGF的浓度为0-10ng/mL；优选2-5ng/mL。
- 如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述BMSC的接种浓度为1×10 7细胞/g-1×10 8细胞/g；优选为2×10 7细胞/g-7×10 7细胞/g；更优选地，为3.5×10 7细胞/g-5×10 7细胞/g。
- 如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述体外成软骨诱导培养0.5-8周；优选0.5-4周。13.一种如权利要求1所述骨移植物的用途，其特征在于，用于制备一种修复下鼻甲缺损部位的药物。
- 如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述下鼻甲缺损部位选自下鼻甲基底、下鼻甲周边组织、鼻腔外侧壁。
- 一种修复下鼻甲缺损部位的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的骨移植物施用给有需要的受试者。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2020115256340 | 2020-12-22 | ||
| CN202011525634.0A CN114712560A (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 |
| PCT/CN2021/140551 WO2022135487A1 (zh) | 2020-12-22 | 2021-12-22 | 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117858733A true CN117858733A (zh) | 2024-04-09 |
Family
ID=82158831
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011525634.0A Pending CN114712560A (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 |
| CN202180087453.0A Pending CN117858733A (zh) | 2020-12-22 | 2021-12-22 | 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011525634.0A Pending CN114712560A (zh) | 2020-12-22 | 2020-12-22 | 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20240108786A1 (zh) |
| CN (2) | CN114712560A (zh) |
| WO (1) | WO2022135487A1 (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115227868B (zh) * | 2022-07-20 | 2023-07-07 | 中南大学湘雅医院 | 骨缺损修复材料及镁预处理脱细胞组织工程骨支架 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU746773B2 (en) * | 1996-07-03 | 2002-05-02 | Cleveland Clinic Foundation, The | A composite bone marrow graft |
| CN1146368C (zh) * | 2000-12-15 | 2004-04-21 | 四川大学华西医院 | 生物衍生组织工程骨及其制备方法 |
| US20100055078A1 (en) * | 2008-08-15 | 2010-03-04 | The Government of the U.S.A, as represented by the Department of Veterans Affairs | Methods of making a transplantable bone repair system using multipotent stem cells |
| CN102085390B (zh) * | 2009-12-07 | 2014-08-27 | 上海国睿生命科技有限公司 | 软骨脱细胞基质及其制备方法和用途 |
| US20120251609A1 (en) * | 2011-03-29 | 2012-10-04 | Yen-Chen Huang | Demineralized cancellous bone matrix |
| CN111214707A (zh) * | 2020-02-10 | 2020-06-02 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨及其构建方法 |
-
2020
- 2020-12-22 CN CN202011525634.0A patent/CN114712560A/zh active Pending
-
2021
- 2021-12-22 US US18/258,630 patent/US20240108786A1/en active Pending
- 2021-12-22 CN CN202180087453.0A patent/CN117858733A/zh active Pending
- 2021-12-22 WO PCT/CN2021/140551 patent/WO2022135487A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20240108786A1 (en) | 2024-04-04 |
| WO2022135487A1 (zh) | 2022-06-30 |
| CN114712560A (zh) | 2022-07-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cancedda et al. | Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone | |
| Yamada et al. | Bone regeneration following injection of mesenchymal stem cells and fibrin glue with a biodegradable scaffold | |
| EP1793874B1 (en) | Soft tissue constructs comprising adult mesenchymal stem cells | |
| DeBruijn et al. | Bone induction by implants coated with cultured osteogenic bone marrow cells | |
| Schliephake et al. | Use of cultivated osteoprogenitor cells to increase bone formation in segmental mandibular defects: an experimental pilot study in sheep | |
| US6911202B2 (en) | Cosmetic repair using cartilage producing cells and medical implants coated therewith | |
| US20060182725A1 (en) | Treatment of tissue with undifferentiated mesenchymal cells | |
| US20070178074A1 (en) | Chondrocyte Culture Formulations | |
| US20100197020A1 (en) | Tissue engineering tendon and construction methods in vitro thereof | |
| Bücheler et al. | Tissue engineering in otorhinolaryngology | |
| Rapp et al. | Repairing critical-sized rat calvarial defects with progenitor cell-seeded acellular periosteum: a novel biomimetic scaffold | |
| AU2004230980B2 (en) | Process for producing cartilage cells for transplantation | |
| Zhao et al. | Repair of long bone defects of large size using a tissue-engineered periosteum in a rabbit model | |
| Costales et al. | Ectopic bone formation during tissue-engineered cartilage repair using autologous chondrocytes and novel plasma-derived albumin scaffolds | |
| CN117858733A (zh) | 一种用于下鼻甲重建的组织工程骨移植物 | |
| Chen et al. | Anchoring dental implant in tissue-engineered bone using composite scaffold: a preliminary study in nude mouse model | |
| Zhou et al. | Orbital wall repair in canines with beta‐tricalcium phosphate and induced bone marrow stromal cells | |
| Rotter et al. | Reconstruction of auricular cartilage using tissue-engineering techniques | |
| CN111214707A (zh) | 一种破骨细胞前体和间充质干细胞作为种子细胞的基质依赖型组织工程骨及其构建方法 | |
| Crawford et al. | Regeneration concerns in craniofacial cartilage and bone defects | |
| Marolt | Tissue Engineering Craniofacial Bone Products | |
| Jiang et al. | Use of autologous chondrocytes and bioinert perforated chambers to tissue engineer cartilage in vivo | |
| CN115581811A (zh) | 一种自体组织工程活细胞睑板替代物及其制备方法和应用 | |
| Lucaciu et al. | Regenerative Medicine versus Conventional Auto/Allografts in Bone Reconstruction as an Option for Enhanced Quality of Life | |
| Rakhorst et al. | The emerging field of tissue engineering |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |