DE102010009571A1

DE102010009571A1 - Verfahren zum Begünstigen der Wiederherstellung einer Körperfunktion unter Verwendung von Zellen der Haarwurzelscheide, Präparat und Herstellverfahren

Info

Publication number: DE102010009571A1
Application number: DE102010009571A
Authority: DE
Inventors: Sabine Krüger; Dr. Richter Wolfgang
Original assignee: EURODERM GmbH
Current assignee: CELTISS UG (HAFTUNGSBESCHRAENKT), DE
Priority date: 2010-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2011-09-01
Also published as: EP2538952A1; AU2011220071A1; WO2011104029A1; US20110212066A1; CA2790937A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung schlägt ein Verfahren vor zum Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs oder eines anderen Bereichs oder Gewebes, mit dem Aufbringen von Zellen, welche jeweils aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich oder einen anderen Bereich oder ein anderes Gewebe eines Empfängers. Ferner werden Zellen, ein Präparat, die Verwendung von Zellen und ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats vorgeschlagen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut oder eines anderen Gewebes gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1. Sie betrifft ferner Zellen gemäß Anspruch 10, ein Präparat gemäß Anspruch 15, das Verwenden von Zellen gemäß Anspruch 16 sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 21.
Aus der Literatur ist bekannt, bestimmte Zellen des Körpers an anderer Stelle des Körpers als ihrer ursprünglichen einzusetzen. So ist aus der PCT/EP 2008/007684 der Anmelderin der vorliegenden Erfindung bekannt, die Pigmentierung eines Hautbereichs durch die Verwendung von Melanozytenvorläuferzellen eines anderen Hautbereichs zu erhöhen.
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist es, weitere Verwendungen von Körperzellen anzugeben.
Diese Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst. Daneben werden Zellen gemäß Anspruch 10, ein Präparat mit Zellen gemäß Anspruch 15, das Verwenden von Zellen gemäß Anspruch 16 sowie ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats gemäß Anspruch 21 vorgeschlagen.
Gemäß Anspruch 1 wird ein Verfahren zum Begünstigen der Wiederherstellung oder zum erstmaligen Erzielen wenigstens einer Funktion der Haut oder eines anderen Gewebes vorgeschlagen. Das Verfahren umfasst ein Aufbringen von Zellen, welche jeweils aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich eines Empfängers, einen anderen Körperbereich oder ein anderes Gewebe des Empfängers.
Gemäß Anspruch 10 werden Zellen aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders vorgeschlagen, welche zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich, Bereich oder Gewebe zum Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut des zweiten Hautbereichs, des Bereichs oder Gewebes eines Empfängers gewonnen sind bzw. wurden.
Gemäß Anspruch 15 wird ein Präparat mit den erfindungsgemäß vorgeschlagenen Zellen vorgeschlagen.
Gemäß Anspruch 16 wird das Verwenden von Zellen vorgeschlagen, welche aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen sind bzw. wurden, zum Erzeugen eines Präparats zum Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs, Bereichs oder Gewebes eines Empfängers.
Gemäß Anspruch 21 wird ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, mit Zellen der Haarwurzelscheide vorgeschlagen.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche und Ausführungsformen. Bei allen folgenden Ausführungen ist der Gebrauch des Ausdrucks „kann sein” bzw. „kann haben” usw. synonym zu „ist vorzugsweise” bzw. „hat vorzugsweise” usw. zu verstehen und soll eine erfindungsgemäße Ausführungsform erläutern.
Das erfindungsgemäße Verfahren des Anspruchs 1 dient in manchen Ausführungsformen einem nicht-therapeutischen und einem nicht-chirurgischen Zweck.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere der folgenden Merkmale aufweisen.
Wenn im Folgenden auf Nervenzellen-Vorläuferzellen bzw. -Stammzellen Bezug genommen wird, so gilt dies uneingeschränkt auch für mesenchymale Vorläuferzellen, selbst wenn dies nicht ausdrücklich erwähnt ist. Nervenzellen-Vorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen werden im Folgenden kurz als Vorläuferzellen bezeichnet; Nervenzellen-Stammzellen und/oder mesenchymale Stammzellen werden als Stammzellen bezeichnet.
Das Aufbringen von Zellen aus Haarwurzelscheiden, insbesondere aus epithelialen Haarwurzelscheiden, eines ersten Hautbereichs auf einen zweiten Hautbereich dient dem Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut des zweiten Hautbereichs, einer Funktion des zweiten Bereichs oder Gewebes bzw. hat diesen Zweck.
Das Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs eines Empfängers im Sinne der vorliegenden Erfindung umfasst in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Begünstigen einer Re-Innervierung des zweiten Hautbereichs, des Bereichs des Körpers oder des Gewebes. Das Aufbringen der Zellen kann dabei in manchen Ausführungsformen vorteilhaft dazu beitragen, eine Re-Innervierung der Haut oder von (Haut-)Zellen anzuregen. In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens trägt dieses im Rahmen des Begünstigens der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs oder eines anderen Bereichs oder Gewebes zu einer erhöhten Innervierung bei oder umfasst dieses.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Zellen Nervenzellen-Vorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (kurz: Vorläuferzellen) oder umfassen solche. In manchen Ausführungsformen liegen derartige Zellen auch in einer Zellmischung vor, die man erhält, wenn man die von der Haarwurzelscheide gewonnenen Zellen nicht nach ihrer Herkunft, Funktion oder Beschaffenheit trennt. Trennt man die gewonnenen Zellen jedoch nach Erhalt, so kann man durch Verwenden von vornehmlich Nervenzellen-Vorläuferzellen und/oder mesenchymalen Vorläuferzellen, vor allem durch Verwenden von Nervenzellen-Vorläuferzellen eine höhere Wirkung nach ihrem Auftragen im Sinne der vorliegenden Erfindung erzielen.
Das Aufbringen von Zellen, die aus Haarwurzelscheiden gewonnen wurden, bringt den Vorteil einer im Wesentlichen unbegrenzten Verfügbarkeit mit sich, so dass vorteilhaft eine Gewinnung der Zellen ohne Entnahme von Haut, d. h. ohne chirurgischen Eingriff in die Integrität der Haut an der Entnahmestelle, möglich ist. Aufgrund der einfachen und in hoher Stückzahl möglichen Gewinnung der Zellen aus Haarwurzelscheiden kann es vorteilhaft möglich sein, im Wesentlichen unbegrenzte Hautareale zu behandeln. Das Aufbringen aus Haarwurzelscheiden gewonnener Zellen impliziert somit deren vorteilhaft hohe Verfügbarkeit.
Die Zellen, welche gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, liegen in bestimmten Ausführungsformen dieser Verfahren in einer Suspension oder in einem Sediment vor.
Das Aufbringen der Zellen erfolgt in bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung durch einfaches Aufpinseln, Aufsprühen, Auftupfen oder dergleichen. Das Aufbringen erfolgt in manchen Ausführungsformen nicht-invasiv. Es erfolgt in bestimmten Ausführungsformen nicht-chirurgisch. Es kann in manchen oder in allen Ausführungsformen ohne ärztliches oder medizinisches Fachwissen erfolgen.
Das Aufbringen der Zellen kann bspw. mittels einer Suspension mit 10²–10⁹ Zellen/ml, insbesondere mit 10⁵–10⁷ Zellen/ml, bspw. mittels Spritze oder Spray oder in einem biokompatiblen Vlies erfolgen.
Das Auftragen kann in einer biokompatiblen Lösung (z. B. PBS) oder mittels eines biokompatiblen Trägers (z. B. Hyaluronan, Kollagen) erfolgen. Die Zellen können dabei als vitale oder z. B. mittels Mitomycin C oder durch Bestrahlung wachstumsarretierte Zellen oder auch als Zellextrakte (wie z. B. Lyophilisate, Sonicate) eingesetzt werden. Auch von diesen Zellen konditionierte Medien können zu diesem Zweck eingesetzt werden.
Das Aufbringen der Zellen kann durch einfaches Auftragen auf die Haut erfolgen. Die Zellen können mittels z. B. Fibrinkleber auf dem zweiten Hautbereich fixiert und mit einem Okklusiv- oder Okklusionsverband geschützt werden. Aber auch jede andere geeignete Form des Aufbringens z. B. durch Integration der Zellen in biologische oder synthetische Matrices ist erfindungsgemäß möglich.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die Zellen aus Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen. Das Zupfen der Haare ist in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen die einzige Art der Trennung und/oder der Gewinnung der Zellen aus dem ersten Hautbereich. Es wird in diesen Ausführungsformen somit ausschließlich gezupft. Insbesondere wird nicht geschnitten, gestanzt oder dergleichen.
Die Zellen können vorteilhaft auf einfache und somit wiederholt durchführbare Weise gewonnen werden. Der Vorgang des Gewinnens dieser Zellen vor ihrer Aufbringung kann vergleichsweise einfach und schmerzfrei durchgeführt werden. Dieser Vorgang birgt ferner kein Komplikationsrisiko, insbesondere kein oder kein nennenswertes Infektionsrisiko. Insbesondere werden bei alleinigem Auszupfen der Haare bzw. ihrer Haarwurzelscheiden keine Erreger übertragen, die typischerweise bei Blutkontakt übertragen werden.
Bei der Verwendung von Zellen aus Haarwurzelscheiden können die Zellen bspw. durch ein Auszupfen von Kopfhaaren, insbesondere von Anagenhaaren, insbesondere vom Capillitium, gewonnen sein, was, wie oben angesprochen, einen weiteren Vorteil gegenüber der Verwendung von Zellen anderer Herkunft insbesondere von interfollikulären Stammzellen bedeutet.
Ein „Gewinnen” im Sinne der Anmeldung bedeutet in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Trennen oder Lösen der Zellen vom ersten Hautbereich. Es kann erfindungsgemäß auch ein Lösen der Zellen vom ersten Hautbereich umfassen. Dieses Lösen kann bspw. ein einfaches Auszupfen von Haaren, insbesondere Anagenhaaren aus der Kopfhaut, umfassen. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen umfasst das Gewinnen das Trennen der Zellen vom ersten Hautbereich ausdrücklich nicht.
Das Gewinnen im Sinne der Anmeldung bedeutet in manchen Ausführungsformen das Trennen der Zellen, ggf. auch die Aufbereitung, z. B. mittels Trypsin, oder umfasst ein solches Trennen und/oder Aufbereiten.
Zum „Gewinnen” von Zellen aus Haarwurzelscheiden kann erfindungsgemäß neben dem Trennen der Zellen vom ersten Bereich – oder alternativ hierzu – auch das Isolieren der Zellen aus den Haar- wurzelscheiden, insbesondere aus epithelialen Haarwurzelscheiden, zählen.
Zum Schritt des „Gewinnens” kann auch ein Schritt oder eine Mehrzahl von Schritten zählen, mittels welcher die gewonnenen Zellen zu ihrem Aufbringen vorbereitet werden. Dies kann mittels Herstellen einer Zellsuspension (Zellsuspension allgemein, oder Nervenzellen-Vorläufer-Suspension und/oder Suspension mesenchymaler Vorläuferzellen) geschehen.
Die Zellsuspension kann in bestimmten Ausführungsformen nach einer in vitro-Vermehrung der Zellen hergestellt werden. In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen erfolgt eine Anzüchtung.
Die Zellsuspension kann jedoch auch direkt hergestellt werden, d. h. ohne vorherige Anzucht der Zellen und/oder ohne deren Verbringen in eine Kultur mit dem Ziel des Anzüchtens, Ausdifferenzierens oder Ausreifens dort.
In manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen, ohne diese zuvor zur Aufzucht der Zellen in Kultur verbracht zu haben, aufgebracht.
Das Gewinnen umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Lösen der Zellen von der Haut oder Kopfhaut, gleich ob es vitale Haut oder biopsierte Haut ist, nicht.
Die Zellsuspension bzw. Zellen-Suspension kann neben den Zellen- und/oder Vorläuferzellen biokompatible Substanzen wie PBS und/oder einen biokompatiblen Träger wie bspw. Hyaluronan oder Kollagen umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der zweite Hautbereich, der zweite Bereich oder das zweite Gewebe zur Aufnahme der Zellen vorbereitet. Diese Vorbereitung erlaubt besonders wirksam ein Anwachsen der aufgebrachten Zellen auf dem zweiten Hautbereich, Bereich oder Gewebe.
Das Vorbereiten des zweiten Hautbereichs kann bspw. ein Entfernen der Epidermis, oder von Teilen hiervon, des zweiten Hautbereichs umfassen. Letzteres ist bspw. mittels Dermabrasio oder oberflächlicher Laserapplikation mit den hiermit verbundenen, dem Fachmann bekannten Vorteilen möglich.
Das Vorbereiten umfasst in bestimmten erfindungsgemäßen Ausführungsformen das Aufbringen einer geeigneten Lösung. Als Beispiel sei hier eine Fibrinogen-Lösung genannt, welche den zweiten Hautbereich zur späteren Aufnahme der Zellen und zu deren besserem Anhaften und vor allem Anwachsen am zweiten Hautbereich vorbereitet.
In bestimmten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der zweite Hautbereich, Bereich oder Gewebe zur Aufnahme der Zellen nicht und/oder nicht im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens vorbereitet. Letzteres ist z. B. dann der Fall, wenn die Zellen auf eine bestehende Wunde aufgebracht werden.
In manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen des Verfahrens werden die auf den zweiten Hautbereich, Bereich oder Gewebe aufgebrachten Zellen stimuliert. Dies dient in manchen Ausführungsformen z. B. einem beschleunigten Reifen oder Ausdifferenzieren der Zellen.
Eine solche Stimulierung kann mittels UV-Belichtung erfolgen. Diese aktiviert die transferierten Zellen und kann z. B. mittels Breitband-UV, Schmalband-UVB, PUVA oder Excimer-Laser-Bestrahlung erfolgen.
Eine Stimulierung bspw. mittels Ultraviolett-Belichtung kann einmalig oder wiederholt erfolgen. Die Bestrahlung sollte dabei vorteilhaft jeweils unterhalb der Erythem-Schwelle liegen. Zum Beispiel kann eine zweimalige Bestrahlung pro Woche zur Erzielung einer gewünschten Reifung des zweiten Hautbereichs führen. Eine häufigere oder weniger häufige Bestrahlung ist ebenfalls möglich.
Untersuchungen der Anmelderin haben gezeigt, dass ein Stimulieren mittels Bestrahlung auch die Wundheilung weiter begünstigen kann. Dies konnte bereits mit einer UV-Stimulierung gezeigt werden.
Die Zellen können von einem Spender stammen und bei diesem auch wieder aufgebracht werden.
In manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind Spender und Empfänger identisch. Der erste Hautbereich und der zweite Hautbereich sind somit Hautbereiche ein und desselben Lebewesens. In einem solchen Fall können vorteilhaft Bemühungen, welche ein Typisieren oder Matchen aufgrund von genetischen Unterschieden zwischen Spender und Empfänger betreffen, entfallen oder sich verringern. Zudem entfallen Risiken der Übertragung – bspw. von Infektionen – vom Spender auf den Empfänger.
Die Zellen können jedoch auch von einem Spender stammen und bei einem von diesem verschiedenen Empfänger aufgebracht werden. Dabei ist es unerheblich, ob Spender und Empfänger Mensch oder Tier sind. Auch eine Übertragung von Tier auf Mensch und umgekehrt ist von der Erfindung umfasst.
Unter „Zellen” bzw. „Vorläuferzellen” werden erfindungsgemäß sowohl autologe als auch allogene und xenogene Zellen bzw. Vorläuferzellen/Stammzellen verstanden.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch Zellen gemäß den Merkmalen des Anspruchs 10. Vorteilhafte Weiterbildungen sind auch hierbei wiederum Gegenstand jeweils der Unteransprüche.
Da mit den erfindungsgemäßen Zellen dieselben Vorteile wie mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erzielbar sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen an dieser Stelle explizit auf deren obenstehende Diskussion verwiesen.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs gewonnen. Die erfindungsgemäßen Zellen liegen somit außerhalb des Körpers vor.
Die erfindungsgemäßen Zellen sind in manchen erfindungsgemäßen Ausführungsformen zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich, Bereich oder Gewebe zur Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut des zweiten Hautbereichs geeignet und vorgesehen.
In bestimmten Ausführungsformen wurden die erfindungsgemäßen Zellen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen.
In manchen Ausführungsformen sind die Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
In bestimmten Ausführungsformen sind oder werden die Zellen nicht verändert, insbesondere nicht genetisch verändert.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ferner gelöst durch ein Präparat mit den Merkmalen des Anspruchs 15.
Da mit dem erfindungsgemäßen Präparat dieselben Vorteile wie mit dem oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren erzielbar sind, wird zur Vermeidung von Wiederholungen an dieser Stelle explizit auf deren obenstehende Diskussion verwiesen.
Das erfindungsgemäße Präparat weist erfindungsgemäße Zellen auf.
Ferner wird die erfindungsgemäße Aufgabe auch gelöst durch Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 16 oder des Anspruchs 21. Die mit diesen Verfahren erzielbaren Vorteile sind dieselben, die mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren erzielbar sind, weshalb zur Vermeidung von Wiederholungen auf deren diesbezügliche Diskussion verwiesen wird.
Die Zellen können dabei mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut des Spenders oder mittels Zupfen oder anderweitigem Gewinnen von Haaren aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen sein.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Zellen zur Verwendung gewonnen und vorgesehen, ohne zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
Gemäß Anspruch 21 wird ein Verfahren zum Herstellen eines Präparats vorgeschlagen. In manchen Ausführungsformen hiervon ist das Präparat eine Suspension. In bestimmten Ausführungsformen ist das Präparat zur Verwendung in irgendeinem der vorstehend beschriebenen Verfahren vorgesehen und geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, umfasst in manchen Ausführungsformen wenigstens das enzymatische Ablösen der Zellen von der Haarwurzelscheide eines entnommenen Haars. Die enzymatische Ablösung kann bspw. mittels einer Trypsin/EDTA-Lösung erfolgen.
Das EDTA kann als Flüssigkeit in Form einer klaren, farblosen, geruchlosen Lösung, hergestellt nach Ph. Eur. (europäisches Arzneibuch in der aktuellen Version), mit einem pH von 5,42 bis 6,04 und einer Osmolarität von 331–368 mOsm/kg vorliegen, wie es beispielsweise von der Firma Biochrom AG, Deutschland unter der Artikelnummer L2113 in einer 100 ml Glasflasche erhältlich ist.
Die Trypsin/EDTA-Lösung kann 0,8%-ig vorliegen. Die Lösung bewirkt insbesondere eine Ablösung der epithelialen Zellen vom Haarschaft. Die Ablösung erfolgt vorzugsweise bei 37°C. Jedoch sind auch höhere Temperaturen möglich, bei denen die Viabilität der Zellen noch gewährleistet ist, oder niedrigere, bei denen noch eine Aktivität von Trypsin gewährleistet ist.
Zur enzymatischen Ablösung kann eine Inkubation in Trypsin, 0,1% bis 10%, besonders zwischen 0,5% bis 4%, in PBS über 1–50, insbesondere über 15–30 min, erfolgen.
PBS kann von der Firma BioConcept, Schweiz in einer 500 ml-Flasche in flüssiger Form mit einem pH von 7,3 ± 0,2 und einer Osmolarität von 285 ± 10 als PBS ohne Ca/Mg mit der Artikelnummer 3-05F29 (PBS1) oder als PBS mit Ca/Mg unter der Artikelnummer 8-05F00 (PBS2) als sterile, farblose und klare Flüssigkeit, die bei Raumtemperatur gelagert werden kann, bezogen werden. Dieses PBS kann zur Herstellung von M-Lösung geeignet sein.
Vorteilhaft an dem Vorgehen des enzymatischen Ablösens ist insbesondere, dass durch die mögliche Verwendung von Enzymen eine nachteilige Auswirkung auf die behandelten Zellen und/oder deren Veränderung, u. a. genetische Veränderung, vermieden werden kann. Die enzymatische Ablösung ist daher besonders schonend für die zu gewinnenden Zellen.
Daneben umfasst das Verfahren zum Herstellen der Suspension in einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen alternativ oder ergänzend – jeweils unabhängig voneinander – die folgenden Schritte: a) Stoppen des enzymatischen Ablösens, z. B. durch die Zugabe von Humanserum, b) Zentrifugieren der Suspension zum Erhalten eines Sediments, c) erneutes Suspendieren des zellhaltigen Sediments in einer Thrombin-Lösung, welche eine sofortige Fixierung der aufgebrachten Zellen in dünner Schicht bei der Applikation auf vorangehend aufgebrachtes Fibrinogen erlaubt und somit eine homogene, nicht zu okklusive Applikation in jeder Körperregion ermöglicht.
Als Kleberproteinlösung kann TissuCol-DuoS 2 ml Immuno, welches zum Beispiel mit der Artikelnummer B 1332020110614 von der Firma Baxter AG, Österreich hergestellt und von der Firma Baxter Deutschland GmbH, Hyland Immun Division, Deutschland lieferbar ist, eingesetzt werden. Ein solcher biologischer Zweikomponentenkleber besteht aus 2 Fertigspritzen zu 2 ml Kleberproteinlösung mit Fibrinogen und 2 ml Thrombin-Lösung, nach Vermischen der Komponenten kann eine Verfestigung des Klebers in Sekunden bis Minuten erfolgen.
Das Verfahren umfasst in manchen Ausführungsformen – jeweils unabhängig voneinander – die folgenden Schritte: Überführen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments in eine biokompatible Lösung, Einbringen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments in einen biokompatiblen Träger und/oder Herstellen eines Zellextraktes.
Im Folgenden werden exemplarische Ausführungsbeispiele detailliert beschrieben.
So wurde in einem ersten exemplarischen Ausführungsbeispiel ein Präparat vorbereitet. Hierzu wurden verschiedene Lösungen hergestellt, welche theoretisch für vier Patienten reichen und im Einzellfall variabel anpassbar sind.
Eine Dispase-Lösung wurde aus 20 ml Dispase und 40 ml PBS1 zubereitet und in 250 ml-Nährmedienflaschen resuspendiert. Anschließend wurden 4 × je 15 ml zum Haarezupfen in 50 ml Röhrchen aliquotiert.
PBS1 wurde 4 × zu je 8 ml zum Überführen der Haarfollikel in 50 ml-Röhrchen aliquotiert.
Für die Trypsin-Lösung wurden 4 ml Trypsin-Lösung (z. B. TS-Lösung von Sigma), 2 ml EDTA (1,0% von Biochrom) und 4 ml PBS1 gemischt und zu je 2 ml in 15 ml-Röhrchen aliquotiert.
Die Lösung zum Abstoppen wurde durch Mischen von 135 ml PBS2 mit 15 ml Humanserum und Resuspendieren der Mischung in 250 ml-Nährmedienflaschen hergestellt. Anschließend wurde die Lösung zu je 30 ml in 50 ml-Röhrchen aliquotiert.
Für die Thrombin-Lösung wurden 2 ml Thrombin (TissueCol-DuoS) mit 11,3 ml PBS2 (mit Ca/Mg) gemischt und in 15 ml-Röhrchen resuspendiert. Zum Versand wurden je 2 ml in 2 ml-Spritzen mit steriler Kanüle (Gr. 1) aufgezogen, die Luftblasen entfernt, die Kanüle wieder mit einer Schutzhülle versehen, die Spritzen in Klebebeutel verpackt und in nicht-gefrorenem Zustand mit Kühlakku verschickt.
Die Fibrinogen-Lösung wurde durch Mischen von 2 ml Fibrinogen (TissueCol-DuoS) mit 6 ml PBS 1 hergestellt. Zum Versand wurden je 2 ml in 2 ml-Spritzen mit steriler Kanüle (Gr. 1) aufgezogen, die Luftblasen entfernt, die Kanüle wieder mit einer Schutzhülle versehen, die Spritzen in Klebebeutel verpackt und in gefrorenem Zustand mit Trockeneis verschickt.
Je Patient und/oder je nach Behandlung können folgende Geräte und/oder Verbrauchsmaterialien eingesetzt und ggf. in einem Behandlungsset mitverschickt werden bzw. zur Behandlung bereitliegen: Pipettierhilfe und Ladekabel, eine sterile Metall-Pinzette, eine 90 ml-Petrischale, Pipetten (10 Stuck 10 ml/5 Stück 2 ml), ein Zellsieb, 1–2 Kryoröhrchen; ein 50 ml-Röhrchen mit 15 ml Dispase-Lösung, ein 50 ml-Röhrchen mit 8 ml PBS1, ein 15 ml-Röhrchen mit 2 ml Trypsin-Lösung, ein 50 ml-Röhrchen mit 30 ml PBS2/Humanserum. ein 50 ml-Röhrchen (für Zellsieb), vier 15 ml-Röhrchen (für Zentrifugation); eine Spritze (mit Kanüle) mit 2 ml Fibrinogen-Lösung, eine Spritze (mit Kanüle) mit 2 ml Thrombin-Lösung.
Zunächst wurde eine Zellsuspension hergestellt. Dazu ließ man eine Fibrinogen-Lösung (Spritze) bei Raumtemperatur auftauen. Eine Dispase-Lösung zum Haarezupfen (15 ml) wurde in eine 90 ml-Petrischale überführt. Danach wurden an etwa 250 bereits ausgezupft vorliegenden Haarfollikeln (kann ausreichend sein zur Behandlung einer Fläche von ca. 20 bis 30 cm²) der Großteil des Haares (totes Haarmaterial) abgeschnitten. Die Haarfollikel wurden in die 90 ml-Petrischale überführt.
Die geschnittenen Haarfollikel wurden mittels einer sterilen Pinzette in ein 50 ml-Röhrchen, welches 8 ml PBS1 enthielt, überführt. Anschließend wurden 2 ml Trypsin-Lösung zugegeben. Es sollte darauf geachtet werden, dass alle Haarfollikel in die Lösung eintauchen.
Das Röhrchen wurde (z. B. mit Hilfe eines Wärmeblocks/Wasserbades) auf ca. 37°C aufgewärmt. Die Trypsin-Behandlung erfolgte für ca. 25–30 min unter gelegentlichem Schütteln/Resuspendieren. Durch Zugabe von 30 ml PBS2/Serum wurde das Trypsin inaktiviert.
Ein mechanisches Ablösen der Nervenzellen-Vorläuferzellen wurde durch gründliches Auf- und Abpipettieren (mind. 30-mal) z. B. mittels einer 10 ml-Pipette erreicht.
Anschließend wurde die Suspension über ein Zellsieb (Porengröße 70 μm) in ein 50 ml-Röhrchen transferiert, um totes Zellmaterial/Zellklumpen zu entfernen.
Die Suspension (40 ml) wurde auf vier 15 ml-Röhrchen verteilt. Die Zellen wurden abzentrifugiert und der Überstand abgegossen oder abpipettiert. Zum Zellpellet wurde die Thrombin-Lösung (2 ml) aus der Spritze zugegeben und die Zellen mit einer 2 ml-Pipette resuspendiert. Dabei wurden Zellen aus den vier Röhrchen gesammelt.
Es wird darauf hingewiesen, dass in manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Zentrifugieren nicht vorgesehen ist. Das Verfahren kann in solchen Ausführungsformen somit ohne Zentrifugieren ablaufen. Dies kann den apparativen Aufwand, welcher zur Durchführung des Verfahrens erforderlich ist, vorteilhaft gering halten.
Anschließend wurde die Zellsuspension in ein Kryoröhrchen überführt und daraus wieder in die Thrombin-Spritze mit Kanüle aufgezogen.
Zur Behandlung von zuvor durch Abrasion erzeugten oberflächlichen Hautwunden wurden den Patienten 2 ml Fibrinogen-Lösung auf die Wundfläche aufgebracht. Anschließend wurde die Thrombin-Zell-Lösung aufgebracht. Die Wunde wurde auf übliche Weise verbunden. Der erste Verbandswechsel fand jeweils nach 5 Tagen statt.
Ebenso konnte zur Behandlung von Narbengewebe u. a. wegen mangelnder Sensibilität über der Narbe (gleiches ist möglich bei Keloidbildung) eine Vorbehandlung der Patienten wie folgt erfolgt sein: Nach örtlicher Betäubung des Wundbereichs wurde das Narbengewebe mittels Dermabrasio oder unter Verwendung eines Erbium-YAG-Lasers abgetragen. Anschließend begann das erfindungsgemäße Verfahren mit dem Aufbringen der Zellsuspension und des Fibrinklebers (optional) mittels einer Spritze oder einer Spray-Vorrichtung. Die behandelten Areale wurden mit Folienverband abgedeckt. Ein erster Verbandswechsel erfolgte nach 5 bis 7 Tagen.
Im Folgenden wird das Beispiel der Behandlung eines Patenten, bei dem eine Rückkehr von Empfinden des Patienten im Bereich des behandelten zweiten Hautbereichs beobachtet werden konnte, beschrieben:
Der Patient, männlich, 29 Jahre, hatte aus einer zeitlich weit zurückliegenden Operation eine Narbe am Oberkörper. Dieses wurde nach einer Hautabrasio wie folgt mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt. Dabei wurden bei dem Patienten zumindest auch Nervenzell-Vorläuferzellen aufgetragen.
Nach einer nur einmaligen Behandlung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren im Jahr 2009 schloss sich die vor Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mittels Dermabrasio geschaffene, akute Wunde. Dabei beobachtete der Patient ein Wiederkehren von Gefühl bzw. sensibler Empfindung in der sich neu gebildeten Narbe. Darin unterschied sich die Narbe, die sich nach Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildet hatte, von jener, die sich nach der zurückliegenden Operation am Oberkörper gebildet hatte. Letztere war unter Ausbleiben der Sensibilität über dem Narbenareal verwachsen. Die fehlende Sensibilität hatte sich auch mehrere Jahre nach der Operation nicht eingestellt. Durch Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Sensibilität und die Fähigkeit des Patienten zur Diskriminierung von Reizen auf dem neu gebildeten Narbengewebe hingegen wieder zurückgekehrt.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 2008/007684 [0002]

Claims

Verfahren zum Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs oder eines anderen Bereichs oder Gewebes, gekennzeichnet durch den Schritt: Aufbringen von Zellen, welche jeweils aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders gewonnen wurden, auf einen zweiten Hautbereich oder einen anderen Bereich oder ein anderes Gewebe eines Empfängers.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Nervenzellen-Vorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (kurz: Vorläuferzellen) sind oder umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs oder eines anderen Bereichs oder Gewebes eine erhöhte Innervierung ist oder umfasst.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen oder Vorläuferzellen jeweils aus Haarwurzelscheiden des ersten Hautbereichs mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen wurden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt Vorbereiten der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen vor dem Aufbringen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den zusätzlichen Schritt Aufbringen der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen ohne jeweils diese zuvor zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu haben.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt Vorbereiten des zweiten Hautbereichs, Bereichs oder Gewebes zur Aufnahme der gewonnenen Zellen oder Vorläuferzellen.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, gekennzeichnet durch den Schritt Stimulieren der Zellen oder Vorläuferzellen nach ihrem Aufbringen auf den zweiten Hautbereich, Bereich oder Gewebe.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei Spender und Empfänger identisch sind.
Zellen aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders, gewonnen zu ihrem Einsatz in oder auf einem zweiten Hautbereich, anderen Bereich oder anderem Gewebe eines Empfängers zum Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut des zweiten Hautbereichs des anderen Bereichs oder anderen Gewebes eines Empfängers.
Zellen nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Nervenzellen-Vorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (kurz: Vorläuferzellen) sind oder umfassen.
Zellen nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet dass das Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs oder eines anderen Bereichs oder Gewebes eine erhöhte Innervierung ist oder umfasst.
Zellen nach einem der Ansprüche 10 bis 12, gewonnen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders.
Zellen nach einem der Ansprüche 10 bis 13, gewonnen und vorgesehen zu ihrem Aufbringen auf einen zweiten Hautbereich, Bereich oder Gewebe eines Empfängers oder zum Herstellen eines Präparats, ohne vor ihrem Aufbringen oder vor dem Herstellen zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
Präparat mit Zellen gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14.
Verwenden von Zellen gewonnen aus Haarwurzelscheiden eines ersten Hautbereichs eines Spenders zum Erzeugen eines Präparats zum Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs, Bereichs oder Gewebes eines Empfängers.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Nervenzellen-Vorläuferzellen und/oder mesenchymale Vorläuferzellen (kurz: Vorläuferzellen) sind oder umfassen.
Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Begünstigen der Wiederherstellung wenigstens einer Funktion der Haut eines zweiten Hautbereichs oder eines anderen Bereichs oder Gewebes eine erhöhte Innervierung ist oder umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Zellen mittels Zupfen von Haaren aus der vitalen Haut oder einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders oder anderweitig aus einer vorliegenden Hautbiopsie des Spenders gewonnen sind.
Verfahren nach Anspruch 16 bis 19, wobei die Zellen gewonnen und vorgesehen sind zu ihrem Aufbringen auf einen zweiten Hautbereich, anderen Bereich oder auf ein anderes Gewebe eines Empfängers oder zum Herstellen eines Präparats, ohne vor ihrem Aufbringen oder vor dem Herstellen zur Anzucht von Zellen in eine Kultur verbracht zu werden oder verbracht worden zu sein.
Verfahren zum Herstellen eines Präparats, insbesondere einer Suspension, welche Zellen aufweist, insbesondere zur Verwendung in einem der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 sowie 16 bis 20, mit wenigstens einem oder mehreren der folgenden Schritte: – Enzymatisches Ablösen Zellen von der Haarwurzelscheide; – Stoppen des enzymatischen Ablösens, insbesondere durch die Zugabe von Humanserum; – Zentrifugieren oder Filtrieren der Suspension zum Erhalten eines Sediments oder Zellkonzentrates; – Suspendieren des zellhaltigen Sediments oder Konzentrates, insbesondere in einer Thrombin-Lösung; – Überführen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments oder des Konzentrates in eine biokompatible Lösung; – Einbringen der Zellen oder der Suspension oder des Sediments oder des Konzentrates in einen biokompatiblen Träger; und/oder – Herstellen eines Zellextraktes.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei das Verfahren ein Kultivieren der Zellen der Haarwurzelscheide nicht umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 22, wobei das Verfahren den Schritt eines Zentrifugierens und/oder eines Filtrierens, insbesondere des Zentrifugierens oder Filtrierens der Suspension zum Erhalten eines Sediments, nicht umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 23, wobei das Verfahren den Schritt eines Stoppens des enzymatischen Ablösens nicht umfasst.