HU227304B1 - Process for producing 9alpha-hydroxy-steroids - Google Patents

Process for producing 9alpha-hydroxy-steroids Download PDF

Info

Publication number
HU227304B1
HU227304B1 HU0700461A HUP0700461A HU227304B1 HU 227304 B1 HU227304 B1 HU 227304B1 HU 0700461 A HU0700461 A HU 0700461A HU P0700461 A HUP0700461 A HU P0700461A HU 227304 B1 HU227304 B1 HU 227304B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
hydroxy
strain
nocardia
hours
formula
Prior art date
Application number
HU0700461A
Other languages
English (en)
Inventor
Katalin Dr Olasz
Aniko Tegdes
Valeria Gancsos
Gabor Dr Hantos
Kalman Dr Koenczoel
Gabor Balogh
Sandor Erdelyi
Original Assignee
Richter Gedeon Nyrt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Gedeon Nyrt filed Critical Richter Gedeon Nyrt
Priority to HU0700461A priority Critical patent/HU227304B1/hu
Publication of HU0700461D0 publication Critical patent/HU0700461D0/hu
Priority to CA002689422A priority patent/CA2689422A1/en
Priority to PCT/HU2008/000078 priority patent/WO2009004394A2/en
Priority to UAA201001164A priority patent/UA98151C2/ru
Priority to US12/665,351 priority patent/US8367394B2/en
Priority to CN200880023394A priority patent/CN101687903A/zh
Priority to JP2010514150A priority patent/JP2010531660A/ja
Priority to KR1020097025817A priority patent/KR20100038297A/ko
Priority to EP08776244.9A priority patent/EP2173761B1/en
Priority to EA201070087A priority patent/EA015734B1/ru
Publication of HUP0700461A2 publication Critical patent/HUP0700461A2/hu
Publication of HU227304B1 publication Critical patent/HU227304B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J21/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having an oxygen-containing hetero ring spiro-condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J21/001—Lactones
    • C07J21/003—Lactones at position 17
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C12P33/12—Acting on D ring
    • C12P33/16—Acting at 17 position
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J21/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen having an oxygen-containing hetero ring spiro-condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya új eljárás az (I) általános képletű 9a-hidroxi-szteroid-származékok
- ahol -A-A’- jelentése -CH2-CH2- vagy -CH=CHcsoport - szelektív előállítására a (II) általános képletű vegyületek
ahol -A-A’- jelentése -CH2-CH2- vagy -CH=CHcsoport - biokonverziója útján.
Ismert, hogy a 9a-hidroxi-szteroidokat önmagukban is széleskörűen hasznosítják a gyógyászatban, mivel például a pregnán-szteroidok 9a-hidroxi-származékai glükokortikoidaktivitással rendelkeznek; valamint az androsztánsorozat 9a-hidroxi-vegyületei antiandrogén és antiösztrogén hatóanyagként alkalmasak gyógyításra.
A 11-es szénatomon helyettesítetlen 9a-hidroxiszteroidok könnyen dehidrálhatóak önmagukban ismert kémiai módszerekkel, és a keletkező 9(11 )-dehidroszteroidok fontos intermedierek nagy aktivitással rendelkező vegyületek előállítása során. Ilyen vegyület például a gyulladásgátló hatású hidrokortizon (kémiai néven: 11 β,17,21-trihidroxi-pregn-4-én-3,20-dion) és prednizolon (kémiai néven: 11 β, 17,21-trihidroxi-pregn1,4-dién-3,20-dion), vagy az eplerenon (kémiai néven: 9a, 11«-epoxi-17fj-hidroxi-3-oxo-pregna-4-én-7,21-dikarbonsav-gamma-lakton), mely utóbbi széles körű indikációs területtel rendelkezik; így béta-blokkolóként csökkenti a szív- és érrendszeri halálozás kockázatát, valamint magas vérnyomás kezelésére és vizelethajtóként alkalmazzák.
Először 1958-ban Hanze és munkatársai hidroxilezték 9a-helyzetben a A4-3-ketopregnán-sorozat tagjait Cunninghamella és Helicostylum fonalas gombatörzsekkel (lásd 3 038 913 számú USA-beli szabadalmi leírást). 1960-ban Sih és munkatársai leírták a szteroidok 9a-hidroxilezését A1-dehidrogenáz enzimaktivitással rendelkező mikroorganizmusokkal A1-dehidrogenáz-inhibitor jelenlétében (lásd 3 065 146 számú USAbeli szabadalmi leírást). Két évvel később Sebek Ascochyta linecola törzzsel valósított meg szteroid 9a-hidroxilezést (lásd 3 116 220 számú USA-beli szabadalmi leírást).
Az előzőekben említett munkában Sih és munkatársai (lásd 3 065 146 számú USA-beli szabadalmi leírást) már többek között mikobaktérium törzseket is felsoroltak, mint szteroid 9a-hidroxiláz enzimkészlettel rendelkező mikroorganizmusokat.
Ismert az is, hogy 1977-ben Frederick és munkatársai mutagén kezeléssel olyan új mikobaktériumtörzset hoztak létre, amely csak részlegesen bontotta le a vizsgált szterolszubsztrátokat és ennek következtében 9ahidroxi-származékok halmozódtak fel (lásd 4 029 549 számú USA-beli szabadalmi leírást). Wovcha ugyanezt a törzset, a Mycobacterium fortuitum NRRL B—8119 törzset újabb 9a-hidroxi-származékok előállítására alkalmazta (lásd 4 035 236 számú USA-beli szabadalmi leírást).
Wovcha és munkatársai tanulmányozták a Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 törzs szteroidváz-lebontó képességét. Megállapították, hogy a szén-dioxiddá és vízzé való lebontás kulcslépése a A1-dehidrogenáz és 9a-hidroxiláz enzimek egymást követő működése. A két konverziós lépés felcserélhető, vagyis mindkét reakciót két-két enzim(csoport) képes végrehajtani; például az egyik A1-dehidrogenáz-enzim az, amelyik a kiindulási vegyületet konvertálja, a másik pedig a 9ahidroxi-származékot A1-dehidrogénezi. Kísérleteikben abból indultak ki, hogy a felsorolt enzimek indukálhatóak; különböző induktorokat alkalmazva jelentős eltérést tapasztalhattak a képződő termékek mennyiségében és összetételében [Biochimica et Biophysica Acta 574,471—479 (1979)].
Szteroid vegyületek 9a-hidroxilezését valósították meg Marsheck és munkatársai 1981-ben új mutáns Nocardia canicruria törzzsel úgy, hogy A1-dehidrogenáz-enzim inhibitor használatára nem volt szükség. A felsorolt példáik között szerepel a 9a-hidroxi-ketolakton (kémiai néven: 9a,17-dihidroxi-3-oxo-17a-pregna4-én-21-karbonsav-gamma-lakton) előállítása ketolaktonból (kémiai néven: 17-hidroxi-3-oxo-17a-pregna-4én-21-karbonsav-gamma-lakton) kiindulva; 0,5 g/dm3 koncentrációjú ketolakton szubsztrátbevitel mellett 30% konverzióval keletkezett a kívánt hidroxilezett termék (lásd 4 397 947 számú USA-beli szabadalmi leírást).
A szteroid 9a-hidroxiláz enzim indukálhatóságát többek között Mutafov és munkatársai is vizsgálták Rhodococcus sp. törzzsel, és megállapították, hogy maga a termékként keletkező 9a-hidroxi-4-androsztén3,17-dion nagyon rossz induktor, mivel induktorként alkalmazása esetén a reakciósebesség fele; a keletkező 9a-hidroxi-termék mennyisége negyede a 4-androsztén-3,17-dion-vegyület induktorként alkalmazásához képest [Process Biochemistry 32 (7), 585-589 (1997)].
A szteroidváz lebontásának génszintű aspektusait vizsgálva Brzostek és munkatársai arra a következtetésre jutottak, hogy szteroid 9a-hidroxi-származékok előállításához szükséges A1-dehidrogenáz-enzim-aktivitás blokkolása sokszor azért ütközik nehézségbe, mert nemcsak többféle A1-dehidrogenáz-enzim létezik, hanem a genom esetenként öt A1-dehidrogenáz-gént tartalmaz [Microbiology 151,2393-2402 (2005)].
HU 227 304 Β1
Ismert, hogy az eplerenon előállítására a szintetikus kémiai reakciólépések mellett mikrobiológiai lépést is alkalmaztak, többek közt egy értékes intermedier; a kanrenon (kémiai néven: 17-hidroxi-3-oxo-17a-pregna4,6-dién-21-karbonsav-gamma-lakton) 7β- és/vagy 11a-hidroxilezését mikroorganizmusokkal (Diplodia, Aspergillus, Absidia sp.) valósították meg (lásd 2004/087 562 és a 2004/097 475 számú USA-beli és 2005/000 865 számú PCT szabadalmi bejelentést).
Az eplerenon más úton való előállítása a kanrenon 9a-hidroxilezésén keresztül lehetséges. A 9a-hidroxikanrenon- (kémiai nevén: 9a,17-dihidroxi-3-oxo-17apregna-4,6-dién-21-karbonsav-gamma-lakton) vegyületet először mikrobiológiai hidroxilezéssel Ng és munkatársai hozták létre (lásd 97/21720 számú PCT és 222 453 számú magyar szabadalmi leírást), amint az az említett leírások 17. példájában szerepel.
A 9a-hidroxi-kanrenon szabadalmi igénypontban, mint termék először 1998-ban fordul elő ugyancsak Ng és munkatársai bejelentésében (lásd 98/25948 számú PCT szabadalmi leírást; nemzeti fázisba nem került), akik csak 2005-ben jelentették be termékigényüket (lásd 7 129 345 számú USA-beli szabadalmi leírást).
A 97/21720 és a 98/25948 számú bejelentésekben a nemzetközi vizsgáló hatóság összesen 18 önálló találmányt látott, és így a bejelentőnek kiválasztási találmányok benyújtását javasolták. Ennek eredményeképpen több mint 100 tagú szabadalomcsalád jött létre, amelyek közül számos tartalmazza változatlan formában a WO-97/21720 bejelentés már említett 17. példáját (lásd 2005/239 761 számú PCT szabadalmi leírást).
Az említett 17. példa 83 potenciálisan szteroid 9ahidroxilező képességű enzimmel rendelkező mikroorganizmus szkrínelésének adatait tartalmazza, a kanrenon biokonverziója során keletkező konverziós termékek VRK, HPLC/UV és LC/MS analízisének eredményét megadva. A táblázatból az olvasható ki, hogy a fenti analitikai módszerekkel észlelhető-e vagy sem 9a-hidroxi-kanrenon az esetleges termékben. E táblázatban szerepel egy mikobaktérium, a Mycobacterium fortuitum ATCC 6842 törzs, de az analitikai eredményeket tartalmazó oszlopokban nem rendeltek hozzá adatot. A törzs biokonverziós képességére vonatkozó bőséges irodalmi dokumentáció ismeretében [a publikációk sora az Acta Med. Rio de Janeiro 1,1 (1936)cikkel kezdődik] feltételezhető, hogy a kanrenon teljes lebomlása következett be (lásd 4 029 549 és 4 035 236 számú USA-beli szabadalmi leírást).
Ezt a feltételezést támasztja alá, hogy a fenti szabadalom család mikrobiológus szerzőtársainak közreműködésével 2003-ban megjelent egy publikáció, amely szinte ugyanezt a táblázatot tartalmazza, de a benne szereplő Mycobacterium fortuitum törzs az előbbinek szteroid 9a-hidroxilezésre mutációval továbbfejlesztett változata: NRRL B—8119 nyilvántartási számú (lásd előbb) [J. Nat. Prod. 66, 350-356 (2003)]. Ebben az esetben a szerzők szerint a Mycobacterium fortuitum NRRL B—8119 kanrenonszubsztrátból sem hidroxi-, sem dehidrogénezett terméket nem hozott létre; metabolizmus nem történt.
A korábban hivatkozott 17. példában szerepel 3 Nocardia törzs, név szerint a Nocardia aurentis, a Nocardia cancicruria és a Nocardia corallina törzsek. A VRK és HPLC vizsgálat jelez némi 9a-hidroxi-kanrenon-vegyülethez hasonló termék keletkezését e törzsek körében két törzs konverziós termékeinél, de végső soron 9a-hidroxi-kanrenon keletkezését az LC/MS analízis kizárja.
Az előbbi publikációban szerepel az egyetlen leírás, amelyben a 9a-hidroxi-kanrenon mikrobiológiai előállítását számszerű adatokkal is alátámasztották: Corynespora cassiicola ATCC 16718 törzzsel lombikban végzett fermentációval, aerób körülmények között 0,1 g/dm3 koncentrációjú kanrenonszubsztrát-bevitel mellett 30% konverzióval keletkezett a kívánt hidroxilezett termék [J. Nat. Prod. 66, 350-356 (2003)].
Az áttekintett leírások alapján kanrenon vagy ketolakton 9a-hidroxi-származékának mikrobiológiai előállítására nem találtunk olyan eljárást, amely megfelel az ipari alkalmazhatóság kritériumainak.
A találmány célja, tehát, egy olyan ipari léptékben is alkalmazható mikrobiológiai eljárás kidolgozása, amelyben az (II) általános képletű szteroidot, ahol -A-A’-jelentése:
-CH2-CH2- vagy -CH=CH-, mint szubsztrátot számottevő mértékű lebomlás és melléktermék-képződés nélkül tudjuk a 9-es helyzetű szénatomon hidroxilezni.
Kezdeti, a 9a-hidroxi-kanrenon mikrobiológiai előállítását célzó kísérleteinkben legalkalmasabbnak a mikobaktériumtörzsek bizonyultak. 38 mikobaktérium és Nocardia törzset vetettünk alá konverziós képességvizsgálatnak ketolakton- és kanrenonszubsztráton. E törzsek között szerepeltek vad típusú szterin bontótörzsek, mint például a Mycobacterium fortuitum ATCC 6842, vagy a részlegesen vázbontó Mycobacterium fortuitum NRRL B-8129; illetve számos, kifejezetten 9a-hidroxilezésre kifejlesztett törzs: Mycobacterium fortuitum NRRL B—8119, Mycobacterium sp. NCAIM 1072, Mycobacterium sp. NCAIM 324.
A szkrínelés során három olyan törzset találtunk, amely vékonyréteg-kromatográfiai analízissel észlelhető mennyiségű 9a-hidroxi-származékot állított elő: Mycobacterium fortuitum NCAIM 00327, Mycobacterium fortuitum NCAIM 00323 és a Nocardia sp. RG 1369.
Mindhárom törzs képes a (II) általános képletű vegyületet, ahol -A-A’- jelentése - -CH2-CH2-, konvertálni 9a-hidroxi-származékká. Felismertük - azonban azt, hogy csak a Nocardia sp. RG 1369 törzs képes a (II) általános képletű vegyületet, ahol -A-A’- jelentése -CH=CH-, is konvertálni 9-hidroxi-származékká.
A továbbfejlesztés érdekében végzett kísérleteket rázatott, levegőztetett lombikban végeztük, a tápfolyadékban biztosítva a szénforrást glükóz, szacharóz, glicerin közül választva, előnyösen glicerint 5-25 g/dm3, előnyösen 15 g/dm3 koncentrációban, valamint a nitrogénforrást élesztőkivonat, növényi peptonkivonat vagy maláta formájában, előnyösen az élesztökivonatot, a növényi peptont és a malátát együttesen alkalmazva 1-10 g/dm3, előnyösen 5-5 g/dm3 koncentrációban
HU 227 304 Β1 esetenként ammónium, foszfát, kálium, magnézium és vas kiegészítését vegyületeik alkalmazásával. Tenyésztési körülményként 28-35 °C-ot, előnyösen 32 °C-ot választottunk. A leírt módon tenyésztve a Nocardia sp. RG 1369 törzset, és 4 g/dm3 koncentrációban adagolva a kanrenonszubsztrátot, azt tapasztaltuk, hogy a szteroid jelentős része elbomlik néhány óra alatt, bár ekkor még a 9a-hidroxi-kanrenon-termék izolálható, de 24 órával a szubsztrát beadása után a szteroidváz teljes lebomlása következik be.
A későbbi kísérleteinkben a 9a-hidroxi-kanrenontermék keletkezése felé szelektív induktor alkalmazásával próbáltuk eltolni a folyamatot. Többféle, önmagában ismert induktor közül az AD (kémiai néven: 4-androsztén-3,17-dion), valamint a 10,11-dihidroxi-levodion (kémiai néven: 13-etil-10,11 </-dihidroxi-4-gonén-3,17dion) bizonyult hatásosnak. A 10,11 -dihidroxi-levodiont induktorként alkalmazva 6-10 órával később következett be a teljes lebomlás, mint AD alkalmazása esetén. A 10,11-dihidroxi-levodion induktort metanol-víz keverékben, előnyösen 3:1 arányú keverékben melegen, előnyösen 50 °C-on oldottuk és sterilre szűrtük, a tenyésztési folyamat lag periódusának a végén, 10-24 órás korban, előnyösen 18 órás korban adagoltuk a tenyészethez 0,01-0,5 g/dm3, előnyösen 0,05 g/dm3 koncentrációban.
A lebomlási folyamat lassítható A1-dehidrogenázenzim-inhibitor alkalmazásával, kísérleteink alapján klorocid-, oxi-tetraciklin- és sztreptomicinantibiotikumok, valamint kinonok, például hidrokinon, naftokinon és ninhidrin közül a sztreptomicint választottuk. Utóbbi alkalmazása esetén értük el a legjobb eredményt; 3-7 órával megnövekedett a teljes lebomlási idő. A kísérletek során az antibiotikumot az indukció után 2-8 órával, előnyösen 6 órával adagoltuk, 2-10 mg/dm3, előnyösen 6 mg/dm3 végkoncentrációban.
A hosszú kísérletsorozat eredményei alapján arra a felismerésre jutottunk, hogy meg kell próbálnunk mutagén kezeléssel és szelekcióval olyan törzs létrehozását a Nocardia sp. RG 1369 törzsből kiindulva, amellyel iparilag alkalmazható eljárásban előállítható az (I) általános képletű vegyület, ahol -A-A’- jelentése -CH2-CH2- vagy -CH=CH-.
A lehetséges mutagén kezelési módok közül 254 nm hullámhosszúságú fénnyel való besugárzást választottuk. A mutagén kezelés során önmagában ismert módon, Mineralight UVGL-58 típusú lámpával 15 cm távolságból kezeltük a fiziológiás sóoldatban szuszpendált Nocardia sp. RG 1369 tenyészetet aszeptikus körülmények között, az előzetesen felvett letalitás görbe alapján választott 23 perc besugárzási ideig.
Az önmagában ismert módon nyert tiszta tenyészeteket szkríneltük, és meglepő módon találtunk közöttük olyat, amelyik a (II) általános képletű vegyületből, ahol -A-A’- jelentése -CH2-CH2- vagy -CH=CH-, számottevő lebomlás nélkül képes (I) általános képletű vegyületet, ahol -A-A’- jelentése -CH2-CH2- vagy -CH=CH-, konvertálni. Az ilyen módon nyert új, Nocardia sp. F1a (RG 4451) jelű baktérium törzzsel magasabb, mint 80%-os konverziót értünk el. E törzset RNSszekvenálás útján azonosítottuk és Nocardia farcinica NCAIM (P) - B 001342 azonosító számon iparjogvédelmi célú letétbe helyeztük.
A fentiek alapján a találmány eljárás az (I) általános képletű vegyület
ahol -A-A’- jelentése---CH2-CH2- vagy -CH=CH-csoport - szelektív előállítására a (II) általános képletű vegyület
ahol -A-A’- jelentése -CH2-CH2- vagy -CH=CHcsoport - biokonverziója útján, amely abban áll, hogy a biokonverzióhoz szükséges hidroxilező mikroorganizmusként Nocardia farcinica nevű, NCAIM (P) - B 001342 deponálási számú baktériumtörzset alkalmazunk.
Az új, mutáns Nocardia farcinica NCAIM (P) - B 001342 törzs csekély eltérést mutat a kiindulási, Nocardia sp. RG 1369 törzs morfológiai jellemzőihez viszonyítva. Ez az eltérés legjobban YTA agar felületén (összetétele: 10 g/dm3 tripkazein; 1 g/dm3 élesztőkivonat; 5 g/dm3 nátrium-klorid; 0,25 g/dm3 magnéziumszulfát-6-hidrát; 0,07 g/dm3 kalcium-klorid-2-hidrát; 20 g/dm3 agar-agar) mutatkozik meg: a kiindulási Nocardia sp. RG 1369 törzs sárga-narancssárga pigmentet termel és a sima fényes felületű, kifejlődött telep nagyobb része található az agarfelszín alatt, mint felette. Ezzel szemben az új, mutáns Nocardia farcinica NCAIM (P) - B 001342 törzs telepei nem sima, hanem barázdált felszínűek és jelentéktelen részük növekedik az agar felszíne alá.
A baktériumtörzs identifikálását a 16S rRNS gén részleges szekvenciaanalízise alapján végeztük el.
>RG2 (Nocardia sp.) F1a (RG 4451) fullseqed2:
GTCGAGCGGTAAGGCCCTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGAT
CTGCCCTGTACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTTACATC
GCATGGTGTTTGGTGGAAAGATTTATCGGTACAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTG
HU 227 304 Β1
GTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACAC
TGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG
CGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTC
GACAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGTAGAAGAAGCACCGGCCAACTACGTGCCAGC
AGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCTTGTAG
GCGGTTTGTCGCGTCGTCCGTGAAAACTTGGGGCTCAACCCCAAGCTTGCGGGCGATACGGG
CAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATC
AGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGAAGCGAAAGC
GTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTG
TGGGTTTCCTTCCACGGGATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTA
CGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGG
ATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCGGAAACCTGCAGAG
ATGTAGGCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA
GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCGCGTTATGGC
GGGGACTCGCAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATC
ATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGATACC
GTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCC
CGTGAAGTTGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGC
CTTGTACACACGGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCC
CTTGT
A kapott szekvencia (1396 bp) a teljes gén (1527 bp) 91%-át lefedi.
A vizsgált törzs faji identifikációját a NCBI BLAST találatok alapján, az alkalmazott genotaxonómiai módszerrel így állapíthatjuk meg: RG 4451 törzs helyes faji 30 megjelölése Nocardia farcinica.
Besorolása az élővilág rendszerébe: Nocardia farcinica Trevisan 1889 [3]
Sejtes szervezetek; Bacteria; Actinobacteria; Actinobacteria; Actinobacteridae; Actinomycetales; Coryne- 35 bacterineae; Nocardiaceae; Nocardia; Nocardia farcinica
A felhasznált NCBI BLAST [2] azonosítás pontosabb adatai:
Elérhetősége: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/, Verzió: BLASTN 2.2.16 (Mar-25-2007) Adatbázis: Data- 40 base: All GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences bút no EST, STS, GSS, environmental samples or phase 0, or 2 HTGS sequences); 5,284,371 sequences; 20,692,750,832 totál letters, Algoritmus: megablast.
A Nocardia farcinica fajba tartozó törzsek 16S 45 rRNS génjének szekvenciája identikusnak vagy naA:
gyón hasonlónak mondható. A hasonlóság a genuszon belül is nagyfokú, viszont a Corynebacterineae nemzetség családjai, (vő: Nocardiaceae, Mycobacteriaceae) határozottan elválnak.
Lényeges és tisztán felismerhető különbség jelentkezik a két törzs (I) általános képletű vegyület, ahol -A-A’-jelentése -CH2-CH2-vagy-CH=CH-, konverziója tekintetében; az új, mutáns Nocardia farcinica NCAIM (P) - B 001342 törzs 9a-hidroxilező képességét megőrizte, de a szteroidváz lebontása jelentősen visszaszorult. Ennek a - korábban pontosított kísérleti körülményeink közötti - csökkent intenzitású lebomlásnak köszönhetően a 9a-hidroxi-termék feldúsul, izolálható: iparilag hasznosítható.
Az 1. ábra A diagramja a kiindulási Nocardia sp. RG 1369 törzsre jellemző szteroid átalakítási görbéket tartalmazza kanrenonszubsztrát és a korábban megadott fermentációs körülmények alkalmazása esetén. A B diagram a Nocardia farcinica NCAIM (P) - B 001342 törzs konverziós képességét mutatja azonos körülményeket alkalmazva.
HU 227 304 Β1
Β:
A találmányunkat a következő példákkal illusztrál- 20 juk.
1. példa
Nocardia farcinica NCAIM (P) - B 001342 tenyészetet a következő összetételű ferde agaron tartjuk fenn: 25
Anyag g/dm3
Potato dextrose agar 39
Agar-agar 5
Sterilezés 121 °C 20 perc
A leoltott tenyészetet 32 °C-on 4 napig inkubáljuk, majd +4-10 °C-on további 30 napig tároljuk tenyészet indítása céljából. Vegetatív tenyészet készítéséhez 35 egy ferde agárról leoltunk 500 cm3-es lombikba sterilezett 100 cm3, következő összetételű táptalajt:
Komponens g/dm3
Glicerin 10
Élesztőkivonat 1,5
Szójaliszt 5
Karbamid 0,5
Ammónium-klorid 3
Kálium-dihidrogén-foszfát 0,5
Magnézium-szulfát 7-hidrát 0,5
Vas(lll)-klorid 6-hidrát 0,05
Tween-80 0,5
Kalcium-karbonát 3
pH-állítás 6,7-6,8-re 20% NaOH-oldattal
Sterilezés 121 °C 30 perc
A tenyészetet 48 órán át rázatjuk 32 °C-on,
200 l/perc löketszámú rázóasztalon, majd 10%-kal átoltunk 500 cm3-s lombikba sterilezett 100 cm3, következő összetételű táptalajt: 60
Komponens g/dm3
Glicerin 10
Élesztőkivonat 1,5
Maláta 5
Ammónium-klorid 3
Kálium-dihidrogén-foszfát 0,5
Magnézium-szulfát 7-hidrát 0,5
Vas(lll)-klorid 6-hidrát 0,05
Kalcium-karbonát 3
pH-állítás 6,7-6,8-re 20% NaOH-oldattal
Sterilezés 121 °C 30 perc
A tenyészetet 72 órán át rázatjuk 32 °C-on, 200 l/perc löketszámú rázóasztalon, majd 10%-kal átoltunk 500 cm3-s lombikba sterilezett 100 cm3, következő összetételű táptalajt:
Komponens g/dm3
Glicerin 15
Élesztőkivonat 5
Maláta 5
Szójaliszt 5
pH-állítás min. 6,9-re 20% NaOH-oldattal
Sterilezés 121 °C 30 perc
A tenyészetet 72 órán át rázatjuk 32 °C-on, 200 l/perc löketszámú rázóasztalon, majd 18 órás korában indukáljuk a 9a-hidroxiláz-enzim képződését, mg, metanol-víz 3:1 arányú elegyében oldott 10,11dihidroxi-levodion hozzáadásával. A tenyészethez órás indukció után hozzáadunk 0,4 g, dimetilformamidban oldott ketolaktonszubsztrátot (kémiai nevén: 17-hidroxi-3-oxo-17a-pregna-4-én-21-karbonsavgamma-lakton). További 16 óra múlva a tenyészetet kloroformmal extraháljuk, a szerves fázist szárazra pá6
HU 227 304 Β1 roljuk, etil-acetátból kristályosítjuk, szűrjük, szárítjuk. A kapott kristályos anyag 456 mg, amely HPLC-mérés szerint 74,3%, azaz 339 mg (amely 84,7%-os hozamot jelent) 9a-hidroxi-ketolakton (kémiai nevén: 9a,17-dihidroxi-3-oxo-17a-pregna-4-én-21-karbonsav-gammalakton) terméket tartalmaz.
Az így kapott termék meghatározását NMR-szerkezetazonosítással végeztük. A jellemző kémiai eltolódások:
1H-NMR {500 MHz, DMSO-d6 (TMS), δ (ppm)}: 0,87 (3H, s, 18-Me); 1,20 & 1,67 (2H, m & m, H-12);
1,25 (3H, s, 19-Me); 1,32 & 1,54 (2H, m & m,
H-15); 1,43 & 1,48 (2H, m & m, H-7); 1,47 & 1,67 (2H, m & m, H-11); 1,58 & 2,33 (2H, m & m, H-1);
1,65 (1H, m, H-9); 1,86 & 2,05 (2H, m & m, H-16);
l, 90 (1H, m, H-8); 1,92 & 2,37 (2H, m & m, H-20);
2,17 & 2,38 (2H, m & m, H-2); 2,20 & 2,43 (2H, m &
m, H-6); 2,40 & 2,54 (2H, m & m, H-21); 4,18 (1H, s, OH); 5,65 (1H, m, H-4).
13C-NMR {125 MHz, DMSO-d6 (TMS), δ (ppm)}: 13,6 (C-18); 19,4 (C-19); 22,3 (C-15); 24,3 (C-7); 25,8 (C-11); 26,5 (C-12); 27,9 (C-1); 28,8 (C-21); 30,5 (C-20); 31,3 (C-6); 33,8 (C-2); 34,8 (C-16); 37,4 (C-8); 42,0 (C-14); 44,0 (C-10); 44,9 (C-13); 75,1 (C-9); 95,3 (C-17); 124,9 (C-4); 170,6 (C-5);
176,3 (C-22); 197,9 (C-3).
2. példa
Mindenben az 1. példában leírtak szerint járunk el, de a főfázistenyészet laboratóriumi fermentorban készül.
Az inokulumtenyészetet 72 órán át rázatjuk 32 °C-on, 200 l/perc löketszámú rázóasztalon, majd 10%-kal átoltunk 9 dm3 térfogatú laboratóriumi üvegfermentorba sterilezett 5 dm3 főfázistáptalajt, melynek összetétele:
Komponens g/dm3
Glicerin 15
Élesztőkivonat 5
Maláta 5
Szójaliszt 5
SB 2020 0,5
pH-állítás min. 6,9-re 20% NaOH-oldattal
Sterilezés 121 °C 30 perc
A tenyésztést 32 °C-on, 300 l/perc keverőfordulattal, 200 dm3/óra áramlási sebességű levegőztetéssel végezzük. A tenyészetben 18 órás korában indukáljuk a 9a-hidroxiláz-enzim képződését, 250 mg, metanol-víz 3:1 arányú elegyében oldott 10,11-dihidroxi-levodion hozzáadásával. A tenyészethez 6 órás indukció után hozzáadunk 5 g, etanolban oldott kanrenonszubsztrátot (kémiai nevén: 17-hidroxi-3-oxo-17apregna-4,6-dién-21-karbonsav-gamma-lakton). A biokonverziót a fent leírt laboratóriumi fermentorban folytatjuk, 30 °C-on, 300 l/perc fordulatszámmal kevertetve, 200 dm3/óra áramlási sebességű levegőztetéssel.
További 16 óra múlva a tenyészetet kloroformmal extraháljuk, a szerves fázist szárazra pároljuk, etil-acetátból kristályosítjuk, szűrjük, szárítjuk. A kapott kristályos anyag 5,66 g, amely HPLC-mérés szerint 72,4%, azaz 4,1 g (amely 82%-os hozamot jelent) 9a-hidroxikanrenon (kémiai nevén: 9a,17-dihidroxi-3-oxo-17apregna-4,6-dién-21-karbonsav-gamma-lakton) terméket tartalmaz.
Az így kapott termék meghatározását NMR-szerkezetazonosítással végeztük. A jellemző kémiai eltolódások:
1H-NMR {500 MHz, DMSO-d6 (TMS), δ (ppm)}: 0,92 (3H, s, 18-Me); 1,15 (3H, s, 19-Me); 1,22 & 1,75 (2H, m & m, H-12); 1,48 & 1,67 (2H, m & m, H-11);
l, 48 & 1,77 (2H, m & m, H-15); 1,64 & 2,25 (2H, m &
m, H-1); 1,92 & 2,10 (2H, m & m, H-16); 1,94 & 2,36 (2H, m & m, H-20); 1,97 (1H, m, H-8); 2,26 & 2,54 (2H, m & m, H-2); 2,42 & 2,57 (2H, m & m, H-21);
2,50 (1H, m, H-9); 4,13 (1H, s, OH); 5,65 (1H, br,
H^l); 5,89 (1H, dd, H-7); 6,18 (1H, dd, H-6).
13C-NMR {125 MHz, DMSO-d6 (TMS), δ (ppm)}: 13,3 (C-18); 18,8 (C-19); 21,5 (C-15); 25,2 (C-11);
26.2 (C-12); 26,7 (C-1); 28,6 (C-21); 30,4 (C-20);
33.3 (C-2); 34,7 (C-16); 39,2 (C-8); 40,6 (C-14);
42,0 (C-10); 45,5 (C-13); 74,1 (C-9); 94,9 (C-17);
124,6 (C-4); 127,9 (C-6); 136,2 (C-7); 162,5 (C-5); 176,2 (C-22); 198,1 (C-3).

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű vegyületek
    - ahol -A-A’- jelentése -ΟΗ2-ΟΗ2- vagy -CH=CHcsoport - szelektív előállítására a (II) általános képletű
    - ahol -A-A’- jelentése -CH2-CH2- vagy -CH=CHcsoport - biokonverziója útján, azzal jellemezve, hogy a biokonverzióhoz szükséges hidroxilező mikroorganizmusként Nocardia farcinica nevű, NCAIM (P) - B 001342 deponálási számú baktériumtörzset alkalmazunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a biokonverzió mértéke 80% feletti.
    Kiadja a Szellemi Tulajdon Nemzeti Hivatala, Budapest Felelős vezető: Szabó Richárd osztályvezető
HU0700461A 2007-07-04 2007-07-04 Process for producing 9alpha-hydroxy-steroids HU227304B1 (en)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU0700461A HU227304B1 (en) 2007-07-04 2007-07-04 Process for producing 9alpha-hydroxy-steroids
EA201070087A EA015734B1 (ru) 2007-07-04 2008-06-30 СПОСОБ СИНТЕЗА 9α-ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ
US12/665,351 US8367394B2 (en) 2007-07-04 2008-06-30 Process for the synthesis of 9α-hydroxy-steroids
PCT/HU2008/000078 WO2009004394A2 (en) 2007-07-04 2008-06-30 PROCESS FOR THE SYNTHESIS OF 9α-HYDROXY-STEROIDS
UAA201001164A UA98151C2 (ru) 2007-07-04 2008-06-30 СПОСОБ СИНТЕЗА 9α-ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ
CA002689422A CA2689422A1 (en) 2007-07-04 2008-06-30 Process for the synthesis of 9.alpha.-hydroxy-steroids
CN200880023394A CN101687903A (zh) 2007-07-04 2008-06-30 用于合成9α-羟基甾体化合物的工艺方法
JP2010514150A JP2010531660A (ja) 2007-07-04 2008-06-30 ９α−ヒドロキシ−ステロイドの合成方法
KR1020097025817A KR20100038297A (ko) 2007-07-04 2008-06-30 9α-히드록시-스테로이드의 합성 방법
EP08776244.9A EP2173761B1 (en) 2007-07-04 2008-06-30 Process for the synthesis of 9-alpha-hydroxy-steroids

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU0700461A HU227304B1 (en) 2007-07-04 2007-07-04 Process for producing 9alpha-hydroxy-steroids

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU0700461D0 HU0700461D0 (en) 2007-08-28
HUP0700461A2 HUP0700461A2 (en) 2010-01-28
HU227304B1 true HU227304B1 (en) 2011-02-28

Family

ID=89987625

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0700461A HU227304B1 (en) 2007-07-04 2007-07-04 Process for producing 9alpha-hydroxy-steroids

Country Status (10)

Country Link
US (1) US8367394B2 (hu)
EP (1) EP2173761B1 (hu)
JP (1) JP2010531660A (hu)
KR (1) KR20100038297A (hu)
CN (1) CN101687903A (hu)
CA (1) CA2689422A1 (hu)
EA (1) EA015734B1 (hu)
HU (1) HU227304B1 (hu)
UA (1) UA98151C2 (hu)
WO (1) WO2009004394A2 (hu)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103343155B (zh) * 2013-06-26 2015-04-01 山西祖源工贸有限公司 一种制备9a-羟基雄烯二酮的方法
CN103361394B (zh) * 2013-08-07 2016-08-17 中国科学院上海高等研究院 利用微生物转化制备9α-羟基-雄烯二酮的方法
CN108277170B (zh) * 2017-09-29 2020-06-05 沈阳博泰生物制药有限公司 一种新金分枝杆菌及其在制备9-羟基黄体酮中的应用
CN110564652B (zh) * 2019-10-01 2022-06-14 江苏佳尔科药业集团股份有限公司 分枝杆菌及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4035236A (en) 1975-10-24 1977-07-12 The Upjohn Company Process for preparing 9α-hydroxyandrostenedione
US4029549A (en) 1976-03-26 1977-06-14 The Upjohn Company Process of producing 9α-hydroxy-3-ketobisnorchol-4-en-22-oic with mycobacterium fortuitum
US4397947A (en) * 1981-06-12 1983-08-09 G. D. Searle & Co. Microbial process for 9α-hydroxylation of steroids
DE69637140T2 (de) * 1995-12-11 2008-04-10 G.D. Searle Llc, Chicago Verfahren zur herstellung einer epoxy-verbindung

Also Published As

Publication number Publication date
CA2689422A1 (en) 2009-01-08
WO2009004394A8 (en) 2010-01-14
WO2009004394A2 (en) 2009-01-08
HUP0700461A2 (en) 2010-01-28
EP2173761A2 (en) 2010-04-14
EA201070087A1 (ru) 2010-08-30
JP2010531660A (ja) 2010-09-30
UA98151C2 (ru) 2012-04-25
HU0700461D0 (en) 2007-08-28
KR20100038297A (ko) 2010-04-14
EP2173761B1 (en) 2013-04-10
CN101687903A (zh) 2010-03-31
EA015734B1 (ru) 2011-10-31
WO2009004394A3 (en) 2009-05-07
US8367394B2 (en) 2013-02-05
US20100209967A1 (en) 2010-08-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marsheck et al. Microbial degradation of sterols
JP2719377B2 (ja) ９α―ヒドロキシ―１７―ケトステロイドの微生物学的製法
HU227304B1 (en) Process for producing 9alpha-hydroxy-steroids
HU183022B (en) Process for preparing 4-androstene-3,17-dione derivatives
Huszcza et al. Transformations of testosterone and related steroids in Absidia glauca culture
EP1534732B1 (en) 5 androsten-3-ol steroid intermediates and processes for their preparation
US4039381A (en) Composition of matter and process
GB1571143A (en) Degradation of steroids by microorganims
GB1576129A (en) Process for the manufacture of -androsten-17-one derivatives and their use
US4175006A (en) Composition of matter and process
US4214051A (en) Process for preparing 9α-OH BN acid methyl ester
US20070066579A1 (en) 5-androsten-3beta-ol steroid intermediates and processs for their preparation
US20040265948A1 (en) Microbial method for hydrolysis and oxidation of androst-5-ene and pregn-5-ene steroid esters
US4226936A (en) Process for preparing 9α-OH BN alcohol
US4214052A (en) Process for preparing 9α-OH BN alcohol
Azizuddin et al. Stereoselective Microbial Hydroxylation of Progestin, Norethisterone by Using Aspergillus niger and Penicillium citrinum
IE47691B1 (en) Process for the manufacture of 21-hydroxy-20-methylpregnane derivatives
DE2652376A1 (de) Neue 7alpha beta-methylhexahydro-1, (5)-indan(di)on-verbindungen und verfahren zu ihrer herstellung
US4223092A (en) Process for preparing 9α-OH BN acid methyl ester
US20060100185A1 (en) 5-Androsten-3beta-ol steroid intermediates and processes for their preparation
US4221868A (en) Process for preparing 9α-OH testosterone
EP0087787A1 (en) Pregnane derivatives and method of producing the same
US20020035260A1 (en) 4-aza-steroids
US4423146A (en) Composition of matter and process
IE44516B1 (en) Process for the manufacture of 4-androstene-3-,17-dione derivatives