HU219336B - Process for producing peptide derivatives and pharmaceutical compositions comprising such compounds and diagnostic unit containing such compounds - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív peptideket tartalmazóligandumok előállítására, amelyek legalább egy, a peptid valamelyikaminocsoportjához kötött kelátképző szerkezeti egységet tartalmaznak,amely egység kimutatható elemmel komplexképzésre képes, és ezenaminocsoport a célreceptorok iránt jelentős kötési aktivitással nemrendelkezik. A találmány szerint a fenti ligandumokat úgy állítjákelő, hogy a) egy kelátképző csoportot hordozó peptidnek legalább egyikvédőcsoportját eltávolítják; vagy b) amidkötéssel összekapcsolnak kétpeptidfragmentumot, amelyek mindegyike legalább egy aminosavat védettvagy védőcsoport nélküli alakban tartalmaz, amelyek egyike tartalmazzaa kelátképző csoportot, s ahol az amidkötést úgy létesítik, hogy akívánt aminosavszekvenciához jutnak, majd adott esetben avédőcsoporto(ka)t lehasítják; vagy c) egy kelátképző vegyületet és akívánt védett vagy védőcsoport nélküli peptidet olyan módonkapcsolják, hogy a kelátképző csoport a peptid kívántaminocsoportjához kapcsolódik, majd adott esetben a védőcsoportokatlehasítják; majd az így kapott peptidet szabad alakban vagy sóformában elkülönítik. Az így kapott peptidek kimutatható elemekkel –például 111In-mal vagy 90Y-mal – kelátokat képeznek, amelyek daganatokspecifikusan célzott kezelésére, illetve képi megjelenítésérealkalmazhatók. Hatásmechanizmusuk alapja abban áll, hogy erős kötődésiaffinitást mutatnak a daganatokban és daganatáttételekben jelentős,illetve nagy számban jelen lévő receptorokhoz. ŕ

Description

A találmány tárgya eljárás biológiailag aktív peptideket, adott esetben valamely kimutatható - előnyösen radioaktív - elemmel együtt tartalmazó ligandumok és a ligandumokat tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, melyek terápiás célokra, például daganatok kezelésére vagy in vivő diagnosztikai anyagokként alkalmazhatók. A találmány az új peptidszámazékok szintézisében alkalmazott új közbenső termékeket is ismertet.

Az elmúlt években sokféle daganatban mutatták ki különböző receptorok jelenlétét, az e célra alkalmazott diagnosztikumok szerkezete azonban gyakran nem volt pontosan meghatározott; mivel a kelátképző anyagokkal reagáltatott, radiojódot tartalmazó fehérjék vagy monoklón antitestek véletlenszerűen (random) léptek szubsztitúcióba. Az EP-A2-103,558 szabadalmi leírás egy eljárást ismertet egy biospecifikus affmitású reakciónak in vitro kvantitatív meghatározására, így például az inzulin homogén immunológiai meghatározására ír le egy módszert, melynek során az amino-fenil-EDTAEu-t inzulinnal konjugálták, és mérték a fluoreszcenciát. Nincs szó azonban arról, hogy a kapcsolódás az inzulin mely részén történik. Az EP-A2-243,929 szabadalmi leírás proteineknek vagy polipeptideknek egy riporter (jelző)-csoportjával való kapcsolódását (konjugációját) ismerteti, valamely intermedieren keresztül, mely tartalmaz legalább egy - C(R)=N- vagy -CH(R)-NH- csoportot, ahol R=hidrogénatom, egy adott esetben szubsztituált szénhidrogéncsoport.

Az EP 345 723, DD 269 785 és WO 88/05537 számú szabadalmi leírások szintén valamilyen kelátképző szerhez kötődő antitesteket, proteineket vagy polipeptideket ismertetnek. Ezek az irodalmi közlemények olyan vegyületeket írnak le, melyek kelátképző csoportokkal és/vagy radionuklidokkal „random” szubsztituáltak. Fennáll tehát az igény olyan kémiai megoldásra, amely pontosan definiált szerkezetű diagnosztikai anyagokat vagy radionuklidok daganatokba juttatására alkalmazható vivőanyagokat eredményezhet.

Vizsgálataink során olyan új, jelzett peptideket állíthatunk elő, amelyek egyrészt terápiás célokra, másrészt in vivő diagnosztikai célokra használhatók.

A találmány tárgya tehát eljárás biológiailag aktív peptideket tartalmazó ligandumok előállítására, mely peptidek olyan, biológiailag hatásos anyagok - így növekedési faktorok, peptidhormonok, valamint ezek analógjai és származékai -, amelyek legalább egy, a peptid valamelyik aminocsoportjához kötött, az alábbiakban felsorolásra kerülő kelátképző szerkezeti egységet tartalmaznak, amely kimutatható (detektálható) elemmel komplexképzésre képes, és ezen aminocsoportjuknak nincs a célreceptorok iránt jelentős kötődési affinitása. E vegyületeket az alábbiakban a találmány szerinti eljárással előállított ligandumoknak (röviden: találmány szerinti ligandumoknak) nevezzük. E ligandumok legalább egy olyan kelátképző csoportot tartalmaznak, amely egy kimutatható elemmel - például radionukliddal, radioopak elemmel vagy paramágneses ionnal - komplexet alkotni képes; továbbá e ligandumok képesek olyan receptorokhoz kötődni, amelyek kifejezetten, sőt túlnyomóan vannak jelen daganatokban vagy daganatáttételekben. A kelátképző csoport a pepiidnek olyan aminocsoportjához kapcsolódik, amely a peptid receptorhoz kötődésében nem játszik szerepet. Egy ilyen aminocsoport - a hozzá kapcsolódó kelátképző csoporttal együtt - jelentős mértékben nem zavarja és nem gátolja a peptid receptorhoz kötődését. Ez az aminocsoport előnyösen nem kapcsolódik közvetlenül aromás csoporthoz.

Az alábbiakban a receptorok fogalmi körébe beleértjük a protoonkogéneket - például a HER-2/neu protoonkogént (amely c-erb B2 néven is ismert), amelyek például emlőrák- vagy petefészekrák-daganatban nagy számban vannak jelen.

A találmány értelmében a kelátképző csoportot a peptid aminocsoportjához közvetlenül vagy közvetett úton - kétértékű hídképző (áthidaló-) csoport útján kapcsolhatjuk.

Az alábbiakban „biológiailag aktív peptideken” természetes eredetű vagy sejtek fermentációjával kapott, génsebészettel vagy szintetikus úton előállított peptideket, valamint azok származékait és analógjait értjük.

„Származékokon és analógokon” - különösen természetes eredetű peptidek esetében - olyan anyagokat értünk, amelyek molekulájában egy vagy több aminosavcsoport hiányzik és/vagy azokat egy vagy több más aminosavcsoport helyettesíti, és/vagy egy vagy több funkciós csoportot egy vagy több más funkciós csoport helyettesít, és/vagy egy vagy több csoportot egy vagy több más izoszter csoport helyettesít. Teljes általánosságban a származékokon és analógokon egy biológiailag hatásos peptid valamennyi olyan származékát értjük, amely a nem módosított szerkezetű pepiidhez minőségileg hasonló hatást fejt ki. E származékok vagy analógok például a természetes eredetű peptidnél hatékonyabbak is lehetnek. A „származékok és analógok” körébe tartozóknak tekintjük a természetes eredetű peptid antagonistáit is.

A biológiailag hatásos peptid előnyösen három vagy több aminosavcsoportból áll, amelyek egy vagy több egymáshoz kapcsolódó láncban helyezkednek el. Hangsúlyozzuk, hogy a „biológiailag aktív peptid” megjelölés antitestekre és immunglobulin-molekulákra nem vonatkozik.

A találmány szerinti eljárásban növekedési faktor típusú pepiidként alkalmazható a felhám- (epidermális) növekedési faktor (az alábbiakban röviden: EGF), továbbá a bombezin, valamint a fentiek analógjai és származékai.

A találmány szerinti eljárásban hormon jellegű pepiidként alkalmazható a luteinizálóhormont felszabadító hormon (LHRH), valamint azok analógjai és származékai.

A találmány egyik megvalósítási módja lehetővé teszi

a) felhám-növekedési faktor (különböző eredetű, például egérből, patkányból vagy emberből származó EGF),

b) LHR, LHRH-agonisták és LHRH-antagonisták,

c) gasztrint felszabadító peptid,

d) bombezin és bombezinantagonisták,

HU 219 336 Β valamint származékaik és analógjaik előállítását, ahol a fentebb a)-tól d)-ig felsorolt vegyületek legalább egy, olyan aminocsoportjukhoz kötött kelátképző csoportot hordoznak, amely aminocsoport a receptorhoz való kötődésben jelentős mértékben nem vesz részt, és a kelátképző csoport egy kimutatható elemmel komplexet alkotni képes.

A találmány szerinti ligandumok előnyösen egyetlen kelátképző csoportot tartalmaznak.

A találmány értelmében a kelátképző csoport a peptid oldallánc-ammo-csoportjához - például egy lizinmaradék N^e-amino-csoportjához - és/vagy a peptid terminális N-amino-csoportjához (ezt az alábbiakban N“amino-csoportnak nevezzük) kapcsolódhat azzal a megkötéssel, hogy ez az amidcsoport - akár oldalláncban, akár N«-helyzetben kötődik - jelentős mértékben nem befolyásolja és nem rontja a pepiidnek célreceptorok iránti kötődési affinitását.

A fentebb felsorolt peptidek közül előnyösen az alábbiak hordozhatnak kelátképző csoportot az N“amino-csoportjukon: EGF, gasztrin, LHRH, bombezin, valamint analógjaik és származékaik. Előnyösek az oldalláncban levő aminocsoportjukhoz kötődő, legalább egy kelátképző csoportot hordozó peptidek, például olyan EGF, amely aminosavszekvenciájában legalább egy lizinmaradékot tartalmaz, például a humán EGF (hEGF), LHRH, LHRH-agonisták, LHRH-antagonisták, gasztrin, gasztrint felszabadító peptid, bombezinantagonisták, valamint analógjaik és származékaik.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható peptidek egyik csoportjába tartoznak az olyan peptidek, amelyekben lizinmaradék van. E peptidek egy másik csoportjába olyan peptidek tartoznak, amelyek molekulájában egynél több lizinmaradék van jelen. Az alkalmazható peptidek egy harmadik csoportjába olyan peptidek tartoznak, amelyek lizinmaradékot nem tartalmaznak.

Könnyen belátható, hogy ha a peptid szubsztituált vagy védőcsoporttal ellátott, például acilcsoporttal szubsztituált terminális aminocsoportot tartalmaz, akkor célszerű a szubsztituens vagy védőcsoport eltávolítása a kelátképző csoporttal vagy hídképző csoporttal végzendő kapcsolás előtt.

A találmány szerinti eljárásban kelátképző csoportokként célszerűen alkalmazhatók a fiziológiai szempontból elfogadható, valamilyen kimutatható elemmel komplex képzésére képes csoportok. A kelátképzö csoport előnyösen alapvetően hidrofil jellegű. Ezek a kelátképző csoportok poliamino-polikarbonsav-csoportok, így a nem ciklusos ligandumokból származó csoportok [ilyen nem ciklusos ligandum például a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA), N-(hidroxi-etil)-N,N’,N’-etilén-diamin-triecetsav (HEDTA), etilénglikol-O,O’-bisz(2-amino-etil)Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraecetsav (EGTA), N,N’-bisz(hidroxi-benzil)-etilén-diamin-N,N’-diecetsav (HBED) és a trietiléntetramin-hexaecetsav (TTHA)]; a szubsztituált DTPAból származó csoportok; a makrociklusos ligandumokból származó csoportok [ilyen makrociklusos ligandumok például az 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekánΝ,Ν’,Ν’’,Ν’’’-tetraecetsav (DOTA), az 1,4,8,11-tetraaza-ciklotetradekán-Ν,Ν ’ ,N ” ,N ” ’ -tetraecetsav (TETA), a C-funkcionalizált tetraaza-ciklododekán-tetraecetsavak, tetraaza-ciklotetradekán-tetraecetsavak, triaza-ciklododekán-triecetsavak és triaza-ciklononán-triecetsavak, így például az (la), (lb) vagy (Ic) általános képletű vegyületekből származó kelátképző csoportok].

Részletesebben a találmány tárgya eljárás szabad vagy só formájú, adott esetben kimutatható elemet tartalmazó ligandum előállítására, mely magában foglal egy biológiailag aktív peptidet, azaz felhám-növekedési faktort (EGF), luteinizálóhormont felszabadító hormont (LHRH), gasztrint vagy bombezint, vagy ezek analógjait vagy származékait, melyek legalább egy kelátképző csoportot tartalmaznak, mely kelátképzö csoport egy a poliamino-polikarbonsav-csoport, és a kelátképző csoport, mely kimutatható - előnyösen radioaktív - elemmel komplexképzésre képes, közvetlenül vagy közvetetten egy kétértékű hídképző csoport útján, amidkötést formálva kötődik a peptid egy, a célreceptorok iránt jelentős affinitással nem rendelkező, a célreceptorral nem interferáló aminocsoportjához, mely aminocsoport célszerűen nem kapcsolódik közvetlenül aromás csoporthoz, mimellett a kétértékű kapcsolódó csoport egy

-Z-R-CO- (a,) általános képletű csoport, ahol R jelentése 2-4 szénatomos alkiléncsoport vagy hidroxilcsoporttal szubsztituált 2-4 szénatomos alkiléncsoport,

Z jelentése -NH- csoport, továbbá a fenti kelátképző csoport - mely adott esetben magában foglalja a kimutatható elemet - jelentése: dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA)-, N-(hidroxi-etil)Ν,Ν’,Ν’-etilén-diamin-triecetsav (HEDTA)-, etilénglikol-0,0’-bisz(2-amino-etil)-N,N,N’,N’-tetraecetsav (EGTA)-, N,N’-bisz(hidroxi-benzil)-etilén-diaminΝ,Ν’-diecetsav (HBED)-, trietilén-tetramin-hexaecetsav (TTHA)-, p-izotiocianáto-benzil-csoporttal szubsztituált DTPA sav-csoport, valamint 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-N,N’,N”,N”’-tetraecetsav (DOTA)-, 1,4,8,11tetraaza-ciklotetradekán-Ν,Ν’,Ν’’,Ν” ’-tetraecetsav (TETA)-csoport, vagy egy (la), (lb) vagy (Ic) általános képletű vegyületből származó csoport, ahol R₁₀ jelentése -CH₂CO₂H csoport;

R_n jelentése -Alk-Xj csoport, Alk jelentése 2-4 szénatomos alkiléncsoport, és

Xj jelentése -NCS vagy -NH₂ csoport, azzal jellemezve, hogy

a) egy fenti kelátképző csoportot hordozó védett pepiidnek legalább egy védőcsoportját eltávolítjuk; vagy

b) amidkötéssel összekapcsolunk két peptidfragmentumot, amelyek kívánt esetben védettek lehetnek, és amelyek mindegyike legalább egy aminosavat védett vagy védőcsoport nélküli alakban tartalmaz, és ezek egyike tartalmazza a kelátképző csoportot, s ahol az amidkötés a kívánt aminosavszekvenciának megfelelően van kialakítva, majd adott esetben eltávolítjuk a védőcsoporto(ka)t; vagy

c) egy fenti kelátképző csoportot a peptid megfelelő aminocsoportjához kapcsolunk, ahol a peptid többi

HU 219 336 Β aminocsoportja védőcsoporttal ellátott, majd eltávolítjuk a védőcsoporto(ka)t;

és a kapott szabad vagy só formában lévő ligandumokat kinyeijük, és kívánt esetben a szabad vagy só formájú ligandumokat egy, a megfelelő kimutatható - előnyösen radioaktív - elemet tartalmazó vegyülettel reagáltatjuk.

Az alkiléncsoport egyenes vagy elágazó szénláncú lehet; előnyösen egyenes szénláncú.

Az (la), (lb) és (Ic) általános képletű vegyületekben R_a előnyös jelentése Alk-NCS.

A „célreceptorok iránt jelentős affinitással nem rendelkező aminocsoport” kifejezés a jelen leírásban olyan aminocsoportokat jelent, melyek nem interferálnak a célreceptorral, így nem gátolják a találmány szerinti ligandumoknak célreceptorokhoz való kötődését. Az, hogy melyek a ligandumok kötődési affinitása szempontjából nem releváns aminocsoportok, szakember számára ismert eljárások felhasználásával könnyen meghatározható (lásd például az alábbi, 11. példát). Az említett kifejezés tehát egy kikötés (disclaimer), melynek alkalmazásával az igényelt oltalmi körből kizárjuk a célreceptorokhoz nem kötődő ligandumokat.

R₃₃-A,-B_i-C_i-D_i-E_i-F_i-G_i-H_i-I_i-K,-NH₂ (VII)

- amelyekben

R₃₃ hidrogénatomot, 1-7 szénatomos acilcsoportot vagy karbamoilcsoportot jelent;

A, jelentése adott esetben a benzolgyűrűn halogénatommal, trifluor-metil-csoporttal, 1-3 szénatomos alkilés/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phe maradék; a- vagy β-naftil-D-alanin maradék; adott esetben az 5-ös vagy 6-os helyzetben halogénatommal vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal és/vagy 1-es helyzetben formil- vagy acetilcsoporttal szubsztituált D-Trp maradék; valamint Dvagy L-Pro, D- vagy L-3,4-dehidroprolin, D- vagy LSer, D- vagy L-Thr, D- vagy L-Ala, D-piroglutamin, 3-(9-antril)-D,L-alanil, 3-(2-fluorenil)-D,L-alanil 40 vagy 3-(Het)-D,L-alanil maradék, ahol Hét jelentése (c) vagy (d) általános képletű csoport, amelyekben

A₂ és A₃ jelentése egymástól függetlenül hidrogén-, klór- vagy brómatom, vagy 1-4 szénatomos alkilcsoport; és 45

A₄ oxigén-, kén- vagy nitrogénatomot jelent;

B, jelentése adott esetben a benzolgyűrűn halogénatommal, nitro-, 1-3 szénatomos alkil- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phemaradék; adott esetben 4-es helyzetben klóratom- 50 mai szubsztituált d-a-metilPhe maradék; 2,2-difenil-glicin vagy 3-(2-naftil)-D-alanin maradék; jelentése adott esetben 5-ös vagy 6-os helyzetben halogénatommal, nitro- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal és/vagy 1-es helyzetben formil- vagy 55 acetilcsoporttal szubsztituált D-Trp maradék; 3(2-naftil)-D-alanin, 3-(l-naftil)-D-alanin, 3-(D-piridil)-alanin, D-Tyr maradék; adott esetben halogénatommal, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phe mara- 60

Az alábbi általános képleteknél alkalmazott rövidítések jelentése a következő:

AnGlu 4-(4-metoxi-fenil-karbamoil)-2-aminovajsav,

Cit 2-amino-5-ureido-pentánsav,

HCi 2-amino-6-ureido-hexánsav,

DMG N,N-dimetil-glicil,

HOB 4-hidroxi-benzoil,

MNic 6-metil-nikotinoil,

MPic 6-metil-pikolinoil,

NACAla 3-(4-nikotinoil-amino-ciklohexil)-alanin, Nic nikotinod,

Pip piperidin-2-karbonsav,

Pmc 4-pirimidinil-karbonil,

PmACAla 3-[4-(pirimidinil-karbonil)-aminociklohexilj-alanin,

PzACAla 3-(pirazinil-karbonil-amino-ciklohexil)alanin,

Pzc pirazinil-karbonil,

Tin tienil,

AA p-metoxi-fenil.

LHRH-antagonisták például a (VII) általános képletű vegyületek dék; valamint D-3-Pz-Ala, D-Tin-Glu vagy D-NicLys maradék;

Dj jelentése L-Ser maradék;

Ej jelentése Tyr; adott esetben a benzolgyűrűjén halogénatommal, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált Phe maradék; Om, Lys, Lys-Nic, MPic-Lys, Pic-Lys, DPicLys, DMG-Lys, Pmc-Lys, Pzc-Lys, PmACAla, PzACAla, His, Dpo, Arg, 3-(3-piridil)-Ala, Trp, N(3-piridil)-acetil-Lys, Glu(pMeO-fenil), Cit, HOBLys vagy PzACAla maradék;

Fj jelentése adott esetben a benzolgyűrűn halogénatommal, nitro-, amino-, 1-3 szénatomos alkil- vagy

1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phe maradék; adott esetben 5-ös vagy 6-os helyzetben halogénatommal, nitro- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal és/vagy 1-es helyzetben formil- vagy acetilcsoporttal szubsztituált D-Trp maradék; 3-(2-naftil)L-alanil, D-Tyr, D-Om, D-Lys, D-Lys-Nic, D-MNicLys, D-MPic-Lys, Pic-Lys, DPic-Lys, D-Pmc-Lys, D-Pzc-Lys, D-Bz-Lys, D-TLys, AnGlu, D-NACAla, D-PzACAla, D-PmACAla, D-3-(3-piridil)-Ala, DHis vagy benzilcsoporttal szubsztituált D-His, DArg, D-homo-Arg(Et₂), D-Cit, D-HCi, D-Lys-Pic, DCit(l-3 szénatomos alkil), D-HCi(l-3 szénatomos alkil), D-Glu(AA) vagy a-amino-o-karbamido(2-4 szénatomos alkánsav) maradék;

G_t jelentése Leu, Nle, Nval, Ν-α-metilLeu, Trp, Phe, Met, Tyr, Val, Ile, Allolle, Abu vagy Alá maradék;

Hj jelentése Arg, IOm, Lys, ILys vagy Cyp-Lys maradék;

Ii jelentése Pro, hidroxi-prolin, 3,4-dehidroprolin, PIP maradék; és

HU 219 336 Β

Kj jelentése D-Ala, D-Leu, Gly, D-Ser vagy Sár maradék szabad alakban vagy só formában.

A kelátképző csoportok) kapcsolódhatnak) a (VII) általános képletű vegyület terminális N^a-amino-csoportjához az 1-es helyzetben, ha R33 jelentése hidrogénatom; és/vagy az E_rben és/vagy F_rben, és/vagy H,ben jelen lévő szabad aminocsoportokhoz. Az LHRHantagonisták csoportjába tartozó, találmány szerinti ligandumok előnyösen olyan (VII) általános képletű vegyületek, amelyek az 1-es vagy 6-os, vagy 8-as helyzetű aminocsoporthoz, különösen a 6-os vagy 8-as helyzetű aminocsoporthoz kapcsolódó kelátképző csoprotot tartalmaznak.

LHRH-agonisták például a (VIII) általános képletű pGlu-His-A ₅-Ser-B₂-C₂-C₂-Arg-Pro-E₂ (YIH) vegyületek - ahol

A_s jelentése Trp, Phe vagy 3-(l-naffil)-Ala maradék; B₂ jelentése Tyr, Phe, D-Trp vagy 3-(pentafluor-fenil)Ala maradék;

C₂ jelentése (e) általános képletű aminosav-egység, amelyben

R₃₄ jelentése -(CH₂)_p.-, -(CH₂)_p.-CO-,

-(CH₂)_p..-R₃₅-, -(CH₂)_p.„-Y₆-(CH₂)_p„- általános képletű csoport, amelyben p’ értéke 1,2, 3, 4 vagy 5; p” értéke 0,1, 2 vagy 3, bármelyik p”’ jelentése egymástól függetlenül 1, 2 vagy 3, R₃₅ jelentése fenil- vagy ciklohexilcsoport, és Y₆ jelentése oxigén- vagy kénatom, -SO- vagy - S0₂- képletű csoport;

D₂ jelentése Leu, Ile, Nle, MeLeu maradék; és E₂ jelentése Gly-NH₂-, -NH-R₃₁ vagy

-NH-NH-CO-NH-R₃₂ általános képletű csoport, ahol R₃i jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkilcsoport, cikloalkilcsoport vagy fluor-(rövid szénláncú alkil)-csoport, és R₃₂ hidrogénatomot vagy rövid szénláncú alkil-csoportot jelent szabad alakban vagy só formában.

A C₂ maradék előnyösen D-konfígurációjú.

A kelátképző csoport előnyösen a C₂-ben lévő szabad aminocsoporthoz kötődik.

Bombezinantagonista hatású vegyületeket közölnek például a 0 339 193 és 0 315 367 számú európai közrebocsátási iratban, amelyek tartalmát e leírásunkban hivatkozási alapként építjük be. Bombezinantagonisták különösen a (IXa) általános képletű ^36~^6~^3~^3~^3~^3~^3~^3~^3~^3~ΰ (^^a)

1234567 89 10 vegyületek - ahol

R_}6jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil-,

2-6 szénatomos alkanoil-, 4-6 szénatomos cikloalkoxi-karbonil- vagy 1-4 szénatomos alkoxikarbonilcsoport;

A₆ közvetlen kémiai kötést vagy Gly, Arg, Lys, Phe,

Asp, Nal, Pro, β-Ala vagy Glp maradékot jelent; B₃ közvetlen kémiai kötést vagy Gly, Pro vagy Asn maradékot jelent;

C₃ közvetlen kötést vagy Lys vagy D-Nal maradékot jelent;

D₃ jelentése közvetlen kémiai kötés vagy His, MeHis,

EtHis, PrHis, Gin, Glu, (DMe)-Glp, Leu, MeLeu,

Lys, Pál, Phe, Pro, Arg, Trp vagy Thr maradék;

E_} jelentése Trp, Val, Nal, Leu, Lys vagy Pál maradék; F₃ jelentése Ala, MeAla, Aib, Gly, Pro, Leu, Phe, Ser,

Val, Nal, Thr, Arg vagy Glu maradék;

G₃ jelentése Val, Alb, Leu, Ile, Thr, Phe vagy Ser maradék;

H₃ jelentése Gly, Sár, Ala, Ser, Aib, Pro, Lys, Asp,

Arg, Val, Ac³c, Ac⁵c, vagy Ac⁶c maradék;

I₃ jelentése His, MeHis, Aib, Val, Leu, MeLeu, Ala,

Ile, Met, Pro, Phe, Gin, Lys, Pál, Ser, Thr, Glu, Asp,

Tip vagy Nal maradék; és

Q jelentése K₃-R₃₇ általános képletű csoport, amelyben K₃ Leu, MeLeu, Ile, Melle, Aib, Pro, Val, MeVal, Phe, Ape, MeApe, Met, Ser, Gin, Glu vagy Trp maradékot jelent, és R₃₇ jelentése 1-3 szénatomos alkil-amino-, di(l—4 szénatomos alkil)-aminovagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport; vagy 1-4 szénatomos alkoxi-, 1-10 szénatomos alkil-aminovagy di(l —10 szénatomos alkil)-amino-csoport;

valamint a (IXb) általános képletű

A₇-B₄-Gln—Trp-Ala- Val- W-X₆- Y₆- T, (IXb) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 vegyületek - ahol

A₇ hidrogénatomot, Boc, Lys vagy Arg maradékot jelent;

B₄ jelentése közvetlen kémiai kötés vagy Asn, Thr vagy Glp maradék;

W Gly vagy Ala maradékot jelent;

X₆ közvetlen kémiai kötést, His(R_3g), Phe, Ser vagy Ala maradékot jelent;

Y₆ jelentése közvetlen kémiai kötés, Leu vagy Phe maradék;

T, jelentése aminocsoport, NH(CH₂)₄CH₃ képletű csoport, benzil-amino-csoport vagy Met-R₃₉, Leu-R₃₉, Ile-R₃₉ vagy Nle-R₃₉ általános képletű csoport;

R_3s hidrogénatomot vagy benzilcsoportot jelent; és R₃₉ jelentése amino-, hidroxil-, metoxi- vagy -NHNH₂ csoport szabad alakban vagy só formában.

A bombezinantagonisták körébe tartozó, találmány szerinti ligandumok előnyösen olyan (IXa) vagy (IXb) általános képletű vegyületek, amelyekben a kelátképző csoport az 1-es és/vagy 2-es, és/vagy 4-es, és/vagy 5-ös, és/vagy 6-os, és/vagy 7-es, és/vagy 8-as helyzetű szabad aminocsoporthoz kapcsolódik, és még előnyösebben csak egyetlen kelátképző csoportot tartalmaznak, amely a fentebb meghatározott módon kapcsolódik.

A találmány szerinti ligandumok szabad formában vagy só alakban lehetnek. E sók például szerves savakkal, polimer savakkal vagy szervetlen savakkal képzett savaddíciós sók, így hidrokloridok és acetátok; vagy a kelátképző csoportban jelen lévő karboxilcsoporttal vagy szulfonsavcsoporttal (csoportokkal) alkotott sók, például alkálifémsók, így nátrium- vagy káliumsók, vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan ammóniumsók.

A találmány szerinti ligandumokat a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy

HU 219 336 Β

a) egy kelátképző csoportot hordozó pepiidnek legalább az egyik védőcsoportját eltávolítjuk; vagy

b) amidkötéssel összekapcsolunk két peptidffagmentumot, amelyek mindegyike legalább egy aminosavat védett vagy védőcsoport nélküli alakban tartalmaz, amelyek egyike tartalmazza a kelátképző csoportot, s ahol az amidkötést úgy létesítjük, hogy a kívánt aminosavszekvenciához jutunk, majd adott esetben a védőcsoporto(ka)t lehasítjuk; vagy

c) egy kelátképző vegyületet és a kívánt védett vagy védőcsoport nélküli peptidet olyan módon kapcsoljuk, hogy a kelátképző csoport a peptid kívánt aminocsoportjához kapcsolódik, majd adott esetben a védőcsoporto(ka)t lehasítjuk, majd az így kapott ligandumot szabad alakban vagy só formában elkülönítjük.

A fenti reakciókat ismert módszerekkel analóg módon hajthatjuk végre, például úgy, ahogyan ezt az alábbi példákban leírjuk, különösen az a) eljárás alkalmazásával. A kelátképző csoport amidkötés útján kapcsolódik, így e kötés az amidcsoport kialakítására általánosan alkalmazott módszerekhez hasonlóan alakítható ki. Kívánt esetben e reakciókban olyan funkciós csoportokat, amelyek a reakcióban nem vesznek részt, a peptidek körében alkalmazott védőcsoportokkal vagy a kívánt kelátképző csoport szempontjából célszerű védőcsoporttal (védőcsoportokkal) láthatjuk el. A „védőcsoport” megnevezés funkciós csoportokkal rendelkező polimer gyantákra is vonatkozik.

Ha a fenti b) és c) eljárásban olyan peptid előállítása kívánatos, amelyben a kelátképző csoport valamilyen kétértékű hídképző vagy távolságtartó (spacer) csoport útján kapcsolódik a peptid aminocsoportjához, akkor a fenti b) és c) eljárásokban a hídképző csoport jelen lehet a kiindulóanyagokként alkalmazott, megfelelő aminosavakban, peptidffagmentumokban vagy peptidekben, vagy a kelátképző csoporthoz is kapcsolódhat. Az említett aminosavak, peptidffagmentumok vagy peptidek ismert módszerekhez hasonló módon állíthatók elő úgy, hogy egy megfelelő aminosavat vagy hídképző vagy távolságtartó csoportot nem tartalmazó peptidet a hídképző vagy távolságtartó csoport kiépítésére alkalmas vegyülettel, például HO₂C-R-CO₂H, H₂N-R-CO₂H általános képletű savval vagy annak valamilyen reakcióképes származékával, például aktív észterével reagáltatunk. Aktív észtercsoportok vagy karboxilaktiváló csoportok például a 4-nitro-fenil-, pentaklór-fenil-, pentafluor-fenil-, szukcinimidil- és 1-hidroxi-benzotriazolil-csoport.

Úgy is eljárhatunk, hogy a kelátképző vegyületet előbb a hídképző vagy távolságtartó csoportot eredményező vegyülettel reagáltatjuk, majd az így kapott terméket ismert módszerekkel analóg módon peptiddel, peptidfragmentummal vagy aminosawal reagáltatjuk.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint ha a kelátképző csoport valamilyen poliamino-polikarbonsavból származik, akkor a kelátképző vegyületet - például DTPA-dianhidridet - a hídképző vagy távolságtartó csoport kiépítésére alkalmas vegyülettel, például H₂N-R-CO₂H általános képletű savval vagy annak valamilyen reakcióképes származékával, például alkil-észterével reagáltatjuk, s így a hídképző vagy távolságtartó csoporttal módosított kelátképző vegyülethez jutunk. Ez utóbbi vegyületet azután aktiválhatjuk, például átalakíthatjuk a megfelelő hidraziddá úgy, hogy a módosított kelátképző vegyületet például hidrazin-hidráttal reagáltatjuk. A hidrazidcsoportos kelátképző vegyületet ezt követően ismert módszerekhez hasonló módon, például a megfelelő aziddá történő átalakítás után aminosawal, peptidfragmentummal vagy peptiddel kapcsolhatjuk.

A találmány szerinti eljárás egy másik előnyös megvalósítási módja szerint ha kívánatos egy karboxilcsoportot vagy annak anhidridjét hordozó kelátképző vegyület közvetlen kapcsolása a peptid aminocsoportjával (kétértékű hídképző vagy távolságtartó csoport nélkül), akkor a kelátképző szert aktiválhatjuk, például a megfelelő hidraziddá alakíthatjuk úgy, hogy hidrazinhidráttal reagáltatjuk. A hidrazid típusú kelátképző vegyületet azután ismert módszerekkel analóg módon, például aziddá való átalakítása után azidkapcsolás útján aminosawal, peptidfragmentummal vagy peptiddel reagáltatjuk.

Ha a kívánt cél a kelátképző csoportnak a kiindulóanyagként alkalmazott peptid vagy peptidfragmentum terminális N^a-amino-csoportjához való kapcsolása, és a peptid vagy peptidfragmentum egy vagy több, oldalláncban elhelyezkedő aminocsoportot tartalmaz, akkor az utóbbi aminocsoportokat célszerűen védőcsoporttal, például a peptidkémiában alkalmazott védőcsoporttal látjuk el.

Ha a cél a kelátképző csoport kapcsolása a kiindulóanyagként alkalmazott peptid vagy peptidfragmentum oldalláncában elhelyezkedő valamilyen aminocsoportjához, és a peptid szabad terminális aminocsoportot tartalmaz, akkor ez utóbbi csoport védőcsoporttal látható el.

Ha a cél a kelátképző csoportnak az összekapcsolása a kiindulóanyagként alkalmazott peptid vagy peptidfragmentum terminális aminocsoportjával, és ez a terminális aminocsoport szubsztituált vagy védett formában van, például acilcsoporttal szubsztituált, akkor célszerű a kelátképző csoporttal történő kapcsolás előtt a szubsztituáló- vagy védőcsoportot eltávolítani.

A b) és c) eljárásban alkalmazott kelátképző vegyület lehet ismert; ha nem ismert, akkor ismert módszerekhez hasonló eljárással állítható elő.

A találmány szerinti ligandumok a szokásos módon - például kromatográfíával - tisztíthatok. Előnyös, ha a találmány szerinti ligandumok 5 tömeg%-nál kevesebb, kelátcsoportot nem hordozó szabad peptidet tartalmaznak.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint olyan, fentiekben meghatározott találmány szerinti ligandumok állíthatók elő szabad vagy só formában, amelyek egy kimutatható elemmel komplexkötésben vannak (ezeket a komplexeket az alábbiakban találmány szerinti eljárással előállított kelátoknak, röviden találmány szerinti kelátoknak nevezzük) szabad alakban vagy só formában. E kelátok in vivő diagnosztikai célra, valamint terápiás kezelésre alkalmazhatók.

HU 219 336 Β

A találmány szerinti kelátok mindegyike egy találmány szerinti ligandumot - különösen a fentebb a)-tól

d)-ig felsorolt ligandumokat - valamely kimutatható elemmel alkotott komplex alakjában tartalmaz.

„Kimutatható (detektálható) elemen” értünk bármely olyan elemet, különösen olyan fémiont, amely terápiás szempontból vagy in vivő diagnosztikai eljárások szempontjából hasznos sajátsággal rendelkezik, például kimutatható (detektálható) sugárzást bocsát ki, vagy az NMR-szinképek relaxációs sajátságait befolyásolja.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazható kimutatható fémionok például a nehézfémek és a ritkaföldfémek ionjai, például a számítógépes axiális tomográfia (rövidítve: CAT) érzékelésére alkalmazható nehézfémés ritkaföldfémionok; valamint paramágneses ionok, így a Gd³⁺-, Fe³⁺-, Mn²⁺- és Cr²⁺-ionok; fluoreszkáló ionok, így az Eu³⁺-ion; radionuklidok, így a γ-sugarakat kibocsátó radionuklidok, a β-sugárzó radionuklidok, az α-sugárzó radionuklidok, a pozitronkibocsátó radionuklidok, például a ⁶⁸Ga, ⁶²Cu, ⁵²Fe és ⁶²Zn; valamint az Auger-elektron-kibocsátó radionuklidok.

A találmány szerinti eljárásban célszerűen olyan γkibocsátó radionuklidokat alkalmazunk, amelyeket például a diagnosztikai módszerekben felhasználhatunk. A γ-kibocsátó radionuklidok felezési ideje célszerűen 1 órától 40 napig, előnyösen 5 órától 4 napig, még előnyösebben 12 órától 3 napig terjed. Ilyenek például a galliumból, indiumból, technéciumból, itterbiumból, réniumból és talliumból származó radionuklidok, így a ⁶⁷Ga, ⁱⁿIn, ^mTc, ¹⁶⁹Yb és a ¹⁸⁶Re. A γ-sugárzó radionuklidot előnyösen az alkalmazott, találmány szerinti ligandumtól vagy pepiidtől függően választjuk meg. Még előnyösebb, ha a találmány szerinti ligandum olyan γ-sugárzó radionukliddal alkot kelátot, amelynek felezési ideje megfelel a peptid daganatban mutatott felezési idejének vagy annál hosszabb.

A találmány szerinti eljárásban célszerűen alkalmazhatók továbbá olyan radionuklidok, amelyek képalkotásra (képi megjelenítésre) használhatók, így a pozitronkibocsátó radionuklidok, például azok, amelyeket fentebb említettünk.

Célszerűen alkalmazható β-sugárzó radionuklidok például a terápiásán alkalmazható radionuklidok, így a 9PY, ®⁷Cu, ^l86Re, ¹⁸⁸Re, >®Er, ^l21Sn, i²⁷Te, i⁴³Pr, i⁹⁸Au, ¹⁰⁹Pd, ¹⁶⁵Dy, ³²P, ¹⁴²Pr vagy Ag elemekből származó radionuklidok. A β-sugárzó radionuklidok felezési ideje előnyösen 1 órától 14,3 napig, még előnyösebben 2,3 órától 100 óráig terjed. A β-sugárzó radionuklidot előnyösen úgy választjuk meg, hogy felezési ideje megfeleljen a peptid daganatban mutatott felezési idejének vagy annál hosszabb legyen.

Célszerűen használhatók a terápiásán alkalmazható α-sugárzó radionuklidok, például a ²¹¹At és a ²¹²Bi.

Terápiás kezelésre használhatók továbbá az Augerelektron-kibocsátó radionuklidok, például a ¹²⁵J, ¹²³J és a ⁷⁷Br.

A találmány szerinti kelátokat úgy állíthatjuk elő, hogy egy találmány szerinti ligandumot megfelelő, kimutatható elemet szolgáltató vegyülettel, például valamilyen fémsóval, előnyösen vízben oldható sóval reagáltatunk. E reakció ismert módszerekkel analóg módon hajtható végre, például az alábbi irodalmi helyek szerint: Perrin: Organic Ligand, Chemical Data Series 22, NY Pergamon Press (1982); valamint Krejcarit és Tucker: Biophys. Biochem. Rés. Com. 77, 581 (1977); továbbá Wagner és Welch: J. Nucl. Med. 20, 428 (1979).

A találmány szerinti kelátokat célszerűen úgy képezzük, hogy egy találmány szerinti ligandumot a kimutatható elemet szolgáltató vegyülettel olyan pH-érték mellett reagáltatunk, amelyen a találmány szerinti ligandum kémiailag stabil.

A kimutatható fémiont úgy is bevihetjük az oldatba, mint egy közbenső kelátképző vegyülettel alkotott, például olyan komplexet, amely a fémiont oldhatóvá teszi, azonban termodinamikai szempontból a találmány szerinti kelátnál kevésbé stabilis. Ilyen közbenső kelátképző vegyület például a 4,5-dihidroxi-l,3-benzol-diszulfonsav (Tiron). Egy ilyen folyamat során a kimutatható fémion liganduma kicserélődik.

A találmány szerinti kelátok úgy is előállíthatok, hogy kovalens kötéssel összekapcsoljuk egy kimutatható elem kelátképző vegyülettel alkotott komplexét a védett vagy nem védett alakban lévő peptiddel, majd kívánt esetben legalább egy jelen lévő védőcsoportot eltávolítunk. Ugyanez a reakció úgy is megvalósítható, hogy valamilyen nem detektálható fémionnal komplexet alkotó kelátképző vegyületet alkalmazunk, majd az így kapott, komplex pepiidben a fémiont a kívánt kimutatható elemmel kicseréljük.

A találmány szerinti kelátok továbbá úgy is létrehozhatók, hogy a kimutatható elemmel komplexet alkotó kelátképző vegyületet olyan peptidfragmentummal kapcsoljuk, amely legalább egy aminosavat védett vagy nem védett alakban tartalmaz, majd lépésenként folytatjuk a peptidszintézist mindaddig, amíg a végső peptidszekvenciát el nem érjük, és kívánt esetben legalább egy jelen lévő védőcsoportot eltávolítunk. A kimutatható elem helyett a kelátképző vegyület valamilyen nem kimutatható fémet is tartalmazhat komplexkötésben, amely fém azután a kapott komplex pepiidben a kívánt kimutatható elemre cserélhető.

A találmány értelmében a kelátképző csoport hídképző vagy távolságtartó csoport útján, például a fentebb meghatározott (a,) általános képletű csoport útján is kapcsolódhat; nyilvánvaló, hogy ilyen esetben a találmány szerinti kelátok fentebb ismertetett előállítása során a peptid vagy peptidfragmentum, vagy a kelátképző vegyület tartalmazhatja a hídképző vagy távolságtartó csoportot.

A fentebb említett reakciók ismert módszerekhez hasonló úton megvalósíthatók. Az adott kelátképző csoporttól függően a jelzés hatásfoka megközelíti a 100%ot, s ekkor tisztítás nem szükséges. A radionuklidokat oxidált alakban - például ^99mTc esetében pertechnetát alakban - is alkalmazhatjuk, amely redukálókörülmények között vihető komplexkötésbe.

A fentebb említett reakciókat célszerűen olyan körülmények között valósítjuk meg, hogy a fémnyomok7

HU 219 336 Β kai történő szennyeződést elkerüljük. Előnyösen desztillált ionmentesített vizet, ultratiszta reagenseket és komplexképzésre alkalmas tisztaságú radioaktív vegyületeket alkalmazunk, hogy a nyomnyi mennyiségű fémszennyezések hatásait csökkentsük.

A találmány szerinti kelátok például szabad vagy só formában lehetnek. Ilyen sók például a szerves savakkal, polimer savakkal vagy szervetlen savakkal alkotott savaddíciós sók, így a hidrokloridok és acetátok; másrészt az olyan karboxilcsoportokkal képezhető só formák, amelyek a molekulában jelen vannak, azonban a kelátképzésben nem vesznek részt, például az alkálifémsók, így a nátrium- vagy káliumsók, valamint a szubsztituált vagy szubsztituálatlan ammóniumsók.

Különösen előnyös találmány szerinti kelátok az (la), (lb) vagy (Ic) általános képletű vegyületek - ahol R_n jelentése -(CH₂)₂_4-NCS-csoport -, és amelyek radioaktív ittriummal, például ^Y-mal komplexet alkotnak.

A találmány szerinti kelátok és gyógyászati szempontból elfogadható sóik terápiás hatást mutatnak, s ennek alapján - a kimutatható fémiontól függően - vegyületekként, például receptorpozitiv daganatok és áttételek láthatóvá tételére alkalmazhatók, ha komplexkötésben valamilyen paramágneses iont, γ-sugárzó fémiont vagy pozitront kibocsátó radionuklidot tartalmaznak komplexkötésben; vagy radioaktív gyógyszerhatóanyagként alkalmazhatók receptorpozitiv daganatok és áttételek in vivő kezelésére, ha valamilyen a- vagy βsugárzó radionuklidot vagy Auger-elektron-kibocsátó radionuklidot tartalmaznak komplexkötésben. Ez standard vizsgálati módszerekkel, így a biológiai eloszlás kimutatása útján - amint ezt a 12. példában leírjuk például 1-5 pg/kg, 0,5-2 mCi ^U1ln-mal jelzett, találmány szerinti ligandum intravénás adagolása után igazolható. A találmány szerinti kelátok továbbá affinitással rendelkeznek daganatokban és áttételekben kifejezetten vagy túlnyomórészt jelen lévő receptorok iránt, s ez standard in vitro kötési vizsgálatokkal igazolható például úgy, amint all. példában ismertetjük; ennek során a találmány szerinti kelátokat 10~^1θ-10^-8 M koncentrációban adagoljuk.

A találmány további konkrét megvalósítási változatai révén az alábbi lehetőségek adódnak.

1. Módszer kialakítása in vivő képalkotásra (képi megjelenítésre), daganatok vagy áttételek in vivő kimutatása egy egyénen, ami abban áll, hogy a) az egyénnek egy találmány szerinti kelátot adagolunk, és b) a szövetek, például a daganatok vagy áttételek elhelyezkedését - amelyek a találmány szerinti keláttal megcélozhatok - regisztráljuk. E módszer különösen alkalmas olyan tumorok in vivő kimutatására, amelyek igen kifejezetten vagy igen nagy számban tartalmaznak receptorokat, közelebbről olyan esetekben, ha daganatképző sejtek gyakran fordulnak elő. Az in vivő kimutatásra a találmány értelmében olyan találmány szerinti kelátok alkalmasak, amelyek γ-sugárzó radionuklidot, pozitronkibocsátó radionuklidot vagy paramágneses fémiont tartalmaznak komplexkötésben, például a fentebb kifejtett formában.

A képalkotó vegyületként a fenti 1. módszert alkalmazott, találmány szerinti kelátokat parenterálisan, előnyösen intravénásán, például befecskendezhető oldatok vagy szuszpenziók alakjában, előnyösen egyszeri befecskendezéssel adagoljuk. A megfelelő adag természetesen függ például az adott ligandumtól és az alkalmazott kimutatható elem, például radionuklid típusától. E célra előnyösen olyan mennyiséget fecskendezünk be, amely lehetővé teszi a fotográfiai letapogatóeljárásokkal végzett képalkotást, amely e területen ismeretes. Ha radioaktívan jelzett, találmány szerinti kelátot alkalmazunk, akkor ezt előnyösen olyan adagban használjuk, amelyben a radioaktivitás 0,1-50 mCi, előnyösen 0,1-30 mCi, még előnyösebben 0,1 és 20 mCi között van.

Állatok esetében a javasolt dózistartomány 0,1-2 mCi γ-kibocsátó radionukliddal jelzett 0,1-10 pg/kg ligandum lehet. Nagyobb emlős állatok, például emberek esetében a javasolt dózistartomány 0,1-15 mCi, előnyösen 0,1-30 mCi, például

3-15 mCi γ-sugárzó radionukliddal jelölt, 1-200 pg találmány szerinti ligandum, és ez az alkalmazott γsugárzó radionuklidtól függ. így például indium esetében előnyös a kisebb mennyiségű radioaktivitás adagolása, míg technécium esetében a felső határhoz közel eső mennyiséget adagolunk.

A találmány szerinti kelátoknak a daganatképző (tumorigén) helyeken történő feldúsulását a megfelelő képalkotó módszerekkel követhetjük; alkalmazhatunk például nukleáris orvosi leképező műszert, például letapogatóeszközt, γ-kamrát, forgó γ-kamrát, és előnyös mindezeket számítógéppel összekötni. Használhatunk továbbá pozitronkibocsátó tomográfiás (rövidítve PÉT) letapogatóeszközt, valamint MRI berendezést vagy CAT-letapogató eszközt is.

2. Módszer kialakítása daganatok és áttételek in vivő kezelésére egy ilyen kezelésre szoruló egyénen; e módszer abban áll, hogy ennek az egyénnek egy találmány szerinti kelát terápiás szempontból hatásos mennyiségét adagoljuk.

Az in vivő kezelési módszer végrehajtására olyan, találmány szerinti kelátok alkalmazhatók, amelyek a fentiekben meghatározott α-, β- vagy Augerelektron-sugárzó radionuklidot tartalmaznak komplexkötésben.

E módszer különösen alkalmas olyan daganatok in vivő kezelésére, amelyek igen kifejezetten vagy igen nagy számban tartalmaznak receptorokat, különösen akkor, ha a daganatképző sejtek előfordulása igen gyakori.

A terápiás módszerben alkalmazott adagok természetesen függenek például a kezelésre szoruló betegségi állapottól, a daganat térfogatától, az alkalmazott keláttól, például a kelátnak a daganatban mutatott felezési idejétől, valamint az elérni kívánt terápiás céltól. A dózist általában a radioaktivitásnak az egyes szervekben végbemenő eloszlása és a célszervben való felvétele alapján számítjuk ki. A találmány szerinti kelátot például olyan napi mennyiségben adagoljuk, amelynek útján 0,1-3 mCi/testsúly8

HU 219 336 Β kg, például 1-3 mCi, előnyösen 1-1,5 mCi/testsúly-kg radioaktivitást viszünk a szervezetbe. Állatokon a javasolt dózis 0,1-3 mCi a- vagy βsugárzó radionukliddal, például ⁹⁰Y-mal jelzett 0,1-5 pg/kg ligandum lehet. Nagyobb emlősök, például emberek esetében a javasolt dózistartomány 0,1-3 mCi/testsúly-kg, például 0,1-1,5 mCi/testsúly-kg a- vagy β-sugárzó radionukliddal jelzett 1 -200 pg ligandum, amelyet célszerűen osztott adagokban, naponta 1 -4 alkalommal adagolunk.

A találmány szerinti a- vagy β-sugárzó kelátokat bármilyen szokásos úton, különösen parenterálisan, például befecskendezhető oldatok vagy szuszpenziók alakjában alkalmazhatjuk; előnyösen adagolhatok továbbá infúzióban, például 30-60 percig tartó infúzióban is. A daganat helyétől függően a kelátokat a daganathoz lehető legközelebbi helyen - például katéter segítségével - adagolhatjuk. Az adagolás módja függhet az alkalmazott kelát disszociációs és kiválasztási sebességétől.

A találmány szerinti kelátokat szabad formában vagy gyógyászati szempontból elfogadható sók alakjában adagolhatjuk. E sók a szokásos módon állíthatók elő, és hatásuk a szabad vegyületek hatásával azonos nagyságrendű.

A találmány szerinti kelátokat a fentebb meghatározott alkalmazási célokra előnyösen rövid idővel az adagolásuk előtt állítjuk elő, azaz a kívánt, kimutatható fémionnal történő jelzést (jelölést) - különösen a kívánt α-, β- vagy γ-sugárzó radionukliddal való jelzést - előnyösen rövid idővel az adagolás előtt végezhetjük.

A találmány szerinti kelátok különböző típusú szilárd vagy nem szilárd daganatok és áttételeik képi megjelenítésére vagy kezelésére alkalmazhatók. Ilyen módon leképezhető vagy kezelhető daganatok például az agyalapi mirigy, gyomor, hasnyálmirigy, központi idegrendszer, agyvelő, petefészek, emlő, vastagbél, prosztata, vese és tüdő rákos daganatai, különböző paragangliómák, neuroblasztómák, gliómák, a nyúltagy, pajzsmirigy karcinómái, különböző mielómák, csontdaganatok, karcinoidok, valamint mindezek áttételei.

A fenti alkalmazási célokra peptidegységként előnyösen olyan vegyületet választunk, amely a diagnosztikai vagy terápiás szempontból célzott szervben vagy szövetben specifikusan felhalmozódik. A találmány segítségével receptorspecifikus ligandumokat és kelátokat állíthatunk elő egy meghatározott sejtpopuláció megcélzására.

A találmány alkalmazásával megvalósítható:

i) egy találmány szerinti ligandumot szabad formában vagy gyógyászati szempontból elfogadható valamilyen sója alakjában, egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel összekeverve tartalmazó gyógyászati készítmény előállítása;

ii) egy találmány szerinti kelátot szabad formában vagy gyógyászati szempontból elfogadható valamilyen sója alakjában, egy vagy több gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal vagy hígítószerrel összekeverve tartalmazó gyógyászati készítmény előállítása; és iii) egy találmány szerinti ligandum felhasználása szabad formában vagy gyógyászati szempontból elfogadható valamilyen sója alakjában diagnosztikai szer előállítására, meghatározott szövetek képi megjelenítése (leképezése) céljából.

A fenti készítményeket a szokásos módon állíthatjuk elő; e készítmények előnyösen folyékonyak.

A találmány szerinti készítményeket külön-külön csomagok alakjában is elkészíthetjük, amelyek a ligandumnak a fémionnal való összekeverésére, valamint az így kapott kelát adagolására vonatkozó tájékoztatást is tartalmazzák. A készítmény előállítható továbbá kettős csomag (ikercsomag) alakjában is, tehát úgy, hogy az egyik csomag a ligandum adagolási egységeit, a másik csomag a kimutatható fémion adagolási egységeit, valamint az ezek összekeverésére és az így kapott kelát adagolására vonatkozó tájékoztatást tartalmazza.

A találmány szerinti eljárást az alábbi, nem korlátozó jellegű kiviteli példákban részletesen ismertetjük. E példákban valamennyi hőmérsékletértéket Celsius-fokokban adjuk meg. Az [α] θ értékek nem korrigáltak. A példákban az alábbi rövidítéseket alkalmazzuk:

Boc:	terc-butoxi-karbonil,
TFA:	trifluor-ecetsav,
DTPA:	dietilén-triamin-pentaecetsav,
DMF:	dimetil-formamid.
Az „F”	tényező a kapott termék peptidtartalmát

mutatja (F=l érték 100%-os peptidtartalmat jelent). A 100%-tól való eltérés [(l-l/F)xl00] az ecetsav- és víztartalom következménye.

1. példa

DTP A -NH- CH₂-CH₂-CO₂CH₃ előállítása g nátrium-hidrogén-karbonát és 2,1 g 3-aminopropionsav-metil-észter-hidroklorid 30 liter vízzel készült oldatához 5,3 g DTPA-dianhidridet adunk, 1 percig reagálni hagyjuk, majd a reakcióelegy pH-értékét előbb sósavoldattal 3-ra, majd 1 n nátronlúgoldattal 5,5-re állítjuk be. Az így kapott elegyet liofilizáljuk, majd kromatográfiásan tisztítjuk. Eluálószerként először kloroform/metanol/50%-os ecetsav 7:4:2 arányú elegyét, majd 7:5:4 arányú elegyét alkalmazva kapjuk a cím szerinti vegyületet.

Tömegszínkép (MS) gyors elektronbombázásos módszerrel (az alábbiakban röviden: FAB-MS): MH+ 479.

• 2. példa

DTP A-NH- CH₂-CH₂-CO-NHNH₂ előállítása

330 mg DTPA-NH-CH₂-CH₂-CO₂CH₃ metanolos oldatához 200 mg hidrazin-hidrátot adunk, 24 órán át szobahőmérsékleten tartjuk, majd a metanolt lepároljuk, és a maradékot szilikagélen kromatografáljuk. Eluálószerként kloroform/jégecet/víz 5:8:3 arányú elegyét alkalmazzuk. Az így kapott terméket ioncserélő gyantán (AG 4-X4, OH alakban; a Biorad cég készítménye) további tisztításnak vetjük alá. így fehér, liofilizált termék alakjában kapjuk a cím szerinti vegyületet. FAB-MS: MH+ 479.

HU 219 336 Β

3. példa

DTPA-$-Ala-EGF előállítása

a) Azidszármazék előállítása

14,3 mg DTPA-P-Ala-hidrazid 1 ml DMF-fel készült oldatát -15 °C-ra hűtjük, és 0,02 ml 3 n dietiléteres hidrogén-klorid-oldatot és 5,4 μΐ terc-butil-nitritet adunk hozzá. A reakcióelegyet 30 percig állni hagyjuk, és az így kapott oldatot használjuk fel a következő lépésben (az anyalúg 1 ml térfogata 0,03 mmol azidot tartalmaz).

b) Kapcsolás mg EGF(l-53) terméket 1 ml DMF-ben oldva 0 °C-ra hűtünk, és ehhez az oldathoz előbb 0,88 μΐ Netil-diizopropil-amint, majd 25 μΐ a) lépésben kapott oldatot adunk. A reakcióelegyet 16 órán át hűtőszekrényben állni hagyjuk, közben a reakció előrehaladását vékonyréteg-kromatográfiásan (VRK) ellenőrizzük (kifejlesztőszerként kloroform/metanol/50%-os ecetsav 7:5:4 arányú elegyét alkalmazzuk), majd további 0,88 μΐ N-etil-diizopropil-amint és 25 μΐ fenti a) lépésben kapott azidoldatot adunk a reakcióelegyhez. Ezután az elegyet hűtőszekrényben tartjuk 12 órán át, majd vákuumban bepároljuk, és a maradékot fordított fázisú túlnyomásos folyadékkromatográfiával (HPLC)

tisztítjuk (az oszlop töltete:	ET 250/8/4 Nucleosil
300-7 C18; a Macherey és Nagel cég terméke). A ka-
pott termék jellemzői:
F (a peptidtartalom a termékben)=0,91
Aminosavelemzés Számított	Talált
Asx	7	7,1
Glx	3	3,2
Ser	6	5,3
His	1	0,9
Thr	2	1,6
β-Ala	1	1,1
Arg	4	4,0 (standard)
Tyr	5	5,1
Cys-Cys	6	3,2
Val	2	1,8
Met	1	1,3
lle	2	2,2
Leu	4	4,4
Pro	2	1,9
4. példa

ⁿⁱIn-mal jelzett DTPA-$-Ala-EGF előállítása 1 mg DTPA-p-Ala-EGF 0,01 mólos ecetsavval készült oldatát 0,22 μ pórusméretű Millex-GV szűrőn vezetjük át. ⁿⁱInCl₃-ot (Amersham, 370 MBq/ml) előzetesen azonos térfogatú, 0,5 mólos nátrium-acetát-oldattal hígítunk. A jelzést úgy végezzük, hogy a DTPA-p-AlaEGF-oldatot az InCl₃-oldattal elegyítjük, majd szobahőmérsékleten lassan keverjük.

5. példa ⁹⁰Y-mal jelzett ϋΤΡΑ-β-ΑΙα-EGF előállítása A ‘K’Y-ot soSr-’OY radionuklidgenerátorból vesszük.

A generátor felépítését, eluálását és a [^YjEDTA acetát-komplexszé alakítását M. Chinol és D. J. Hnatowich közlik a következő helyen: J. Nucl. Med. 28, 1465 (1987). 1 mg DTPA-P-Ala-EGF-terméket 5 ml 0,01 mólos ecetsavoldatban oldunk, az oldatot szobahőmérsékletre hagyjuk felmelegedni, és 50 μΐ steril, 0,5 mólos acetátoldatban oldott 1,0 mCi ’θΥ-οΙ adunk hozzá. Az elegyet 30-60 percig állni hagyjuk a kelátképzés teljes lejátszódása céljából.

6. példa [DTPA-β-Α/α-Trp]-tetragasztrin előállítása

A 3. példa szerint eljárva, azonban EGF helyett HTrp-Met-Asp-Phe-NH₂ alkalmazásával a cím szerinti vegyületet kapjuk, F=0,77, [a]^ -6,7° (c=0,5,95%-os ecetsavban).

A cím szerinti vegyületet a 4., illetve 5. példában leírt eljárást követve ^H1In-mal vagy ^Y-mal jelezzük.

7. példa

Acetil-DPhe(pCl)-DPhe(pCl)-DTrp-Ser-TyrDLys(R)-Leu-Arg-Pro-DAla-NH₂ előállítása, ahol

R jelentése (f) képletű csoport

150 mg DTPA-hidrazid 25 ml DMF-fel készült, -20 °C-ra hűtött oldatához 0,37 ml 3 n éteres hidrogénklorid-oldatot, majd 72 μΐ terc-butil-nitritet adunk, a reakcióelegyet körülbelül 30 percig keveijük, s ezalatt a reakcióelegy hőmérsékletét -15 °C és -20 °C között tartjuk. Ezt követően a reakcióelegyhez 200 mg acetilDPhe(pCl)-DPhe(pCl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys-Leu-ArgPro-DAla-NH₂ 100 ml DMF-fel készült, -20 °C-ra hűtött oldatát adjuk, és utána a reakcióelegyhez addig adagolunk N-etil-diizopropil-amint, amíg 9-es pH-t el nem érünk. Az így kapott elegyet körülbelül 70 órán át 0 °C-on keveijük, s közben a pH értékét 9-en tartjuk.

A DMF-et vákuumban ledesztilláljuk, amíg a visszamaradó termék térfogata az 5 ml-t el nem éri, majd éter hozzáadásával kicsapjuk a cím szerinti vegyületet. A csapadékot szüljük, mossuk és megszárítjuk.

A termék tisztítását úgy végezzük, hogy 150 ml vízben oldjuk, az oldat pH-értékét ammónium-hidroxidoldat hozzáadagolásával 7-re állítjuk, majd az oldatot duolite ES 881 töltetű oszlopon vezetjük át, s utána gradienseluálást végzünk víz-dioxán-ecetsav elegyekkel. A cím szerinti vegyületet tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és liofilizáljuk. Az így kapott, cím szerinti termék [a]_b értéke -14,5° (c=0,2, 95%-os ecetsavban).

A kiindulóanyagok a következőképpen állíthatók elő.

a) DTPA-hidrazid előállítása g nátrium-hidrogén-karbonát 7 liter vízzel készült oldatához 0,74 g Boc-NH-NH₂-t, majd utána 2 g DTPA-dianhidridet adunk. Néhány másodperc alatt tiszta oldatot kapunk, amelyet 40 °C hőmérsékleten 0,5 liter térfogatra töményítünk, és a maradék pH-értékét 1 n sósavoldattal 5-re állítjuk. Az elegy pH-értékét 15 perc keverés után 1 n nátronlúgoldattal 7-re állítjuk, majd az elegyet liofilizáljuk. Az így kapott terméket szilikagélen kromatografáljuk, eluálószerként kloroform, metanol, víz és ecetsav elegyét használjuk. A monoszubsztituált terméket összegyűjtjük, és ioncserélő gyantán (AG 4-X4, OH alakban; a Biorad cég készítménye) tisztítjuk. Az így kapott terméket 10 ml TFA-ban old10

HU 219 336 Β juk, és a reakcióelegyet 30 percig keverjük, majd a DTPA-hidrazidot diizopropil-éter hozzáadásával kicsapjuk, szűrjük, és igen jó vákuumban szárítjuk.

b) Acetil-DPhe(pCl)-DPhe(pCl)-DTrp-Ser-TyrDLys-Leu-Arg-Pro-DAla-NH₂ előállítása

Ezt a peptidet enyhe savval hasítható gyantán szintetizáljuk [ilyen például az 1%-ban térhálósított 4-(2’,4’dimetoxi-fenil-amino-metil)-(fenoxi-metil)-polisztirolamely például a Novabiochem cégtől szerezhető be], ennek során Ν-α-Fmoc-védőcsoportos aminosavakat alkalmazunk az alábbi sorrendben:

Fmoc-DAla-OH—>Fmoc-Pro-OH—»Fmoc-Arg(Pmc)OH-»Fmoc-Leu-OH->Fmoc-DLys(Boc)-OH-»FmocTyr(tBu)-OH—»Fmoc-Ser(tBu)-OH—>Fmoc-DTrpOH—>Fmoc-DPhe(pCl)-OH—>Fmoc-DPhe(pCl)-OH

Az aminosavakat minden egyes ciklusban diizopropil-karbodiimid/hidroxi-benzotriazol segítségével, DMF-ben aktiváljuk, majd a kapcsolás teljes lejátszódása után az Fmoc-csoportokat 20% piperidint tartalmazó DMF-es oldattal lehasítjuk. Az N-acilezést az utolsó lépésben ecetsavanhidriddel hajtjuk végre.

A védett peptidet tartalmazó gyantát 95:5 arányú IFA/víz eleggyel kezeljük, s így egyidejűleg eltávolítjuk az oldalláncban elhelyezkedő védőcsoportokat, és felszabadítjuk a peptidet. A tisztítást fordított fázisú HPLCeljárással végezzük, majd acetát alakban lévő AG-4X4 ioncserélőn folytatjuk. így a cím szerinti vegyülethez jutunk, amelyet a 4. példában, illetve az 5. példában leírt eljárás útján ^1HIn-mal vagy ’W-mal jelzünk.

8. példa

Az (1) képletű peptid előállítása (LHRH-antagonista ligandum és komplexe)

E vegyületet a 3. példában leírt eljárással (azid előállításával és kapcsolásával), azonban kiindulóanyagként H-DNal(2)i-DPhe(pCl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys(CH₂CHOH-CH₂OH)-Leu-Lys(CH₂-CHOH-CH₂OH)Pro-DAla-NH₂ alkalmazásával állítjuk elő; F=0,83.

A kiindulóanyagként alkalmazott peptidet szilárd fázisú szintézissel - például a 8. b) példában leírt módszerrel - állíthatjuk elő, azonban a 3. és 5. ciklusban Fmoc-DLys(CH₂-CHOH-CH₂OH)-ot, és az utolsó ciklusban Fmoc-DNal-OH-ot alkalmazunk. A kapcsolási reakció teljes lejátszódása után a védett peptidet tartalmazó gyantát 95:5 arányú TFA/víz eleggyel kezelve egyidejűleg távolítjuk el az oldalláncban elhelyezkedő védőcsoportokat, és felszabadítjuk a peptidet. Az így nyert peptidet fordított fázisú HPLC-eljárással, majd ezt követően acetát formában lévő AG-4X4 gyantán ioncserélővel tisztítjuk. Az így kapott, cím szerinti termék [α]20Δ értéke -16° (c=0,5, 95%-os ecetsavban).

A cím szerinti vegyületet a 4. példában, illetve az 5. példában leírt eljárás útján ^H1In-mal vagy ^Y-mal jelöljük.

9. példa

Acetil-His-Trp-Ala-Val-DAla-Lys($-Ala-DTPA)Leu-OEt előállítása (bombezinantagonista ligandum és komplexe)

A 3. példában leírt eljárást követjük (azid előállítása és kapcsolása), azonban kiindulóanyagként acetil-HisTrp-Ala-Val-DAla-Lys-Leu-OEt-vegyületet alkalmazunk, s így a cím szerinti vegyületet kapjuk.

A kiindulóanyagként alkalmazott peptid a 0 315 367 számú európai közrebocsátási iratban közölt eljárással állítható elő.

A cím szerinti vegyületet a 4., illetve 5. példában leírt eljárást követve ^H1In-mal vagy ⁹⁰Y-mal jelezzük.

A találmány szerinti kelátok daganatreceptorok iránti kötődési affinitását az alábbi módon vizsgáltuk.

10. példa

A kötődési sajátságok vizsgálata

EGF-receptor-pozitív emberi daganatot az eltávolítása után azonnal -70 °C hőmérsékleten tároltunk; az alábbi izolálást eljárás során ezt a szövetanyagot 0-4 °C hőmérsékleten tartottuk. A daganatszövetet kis kockákra vágtuk, majd 5 rész „A” pufferoldatban (amely 20 mM HEPES-t, 0,1 mM EDTA-t és 250 mM szacharózt tartalmazott, és 7,4 pH-értékű) homogenizáltuk. A membránokat differenciális centrifugálással különítettük el, majd az anyagot 30 mM HEPES-t (pH 7,4), 1 mg/ml szarvasmarha-szérumalbumint (BSA) és 1 mM benzamidint tartalmazó inkubáló pufferoldattal hígítottuk. A vizsgálandó elegy (végtérfogata 200 μΐ) 100 000 cpm [¹²⁵J]-EGF-et, a szövetet (vizsgálatonként 5-25 pg fehérjét) és 10~⁹ M koncentrációban a 3. példában előállított vegyületet tartalmazta. A jéghideg vizsgálandó oldatot örvénylőkeveréssel összekevertük, majd a polipropiléncsöveket vízfürdőbe helyeztük, és 30 percig 37 °C-on inkubáltuk. A reakciót 4 ml jéghideg Hank- vagy Trisz-puffer hozzáadásával leállítottuk. A Trisz-pufferoldat 10 mM Triszt tartalmazott 0,9%-os nátrium-klorid-oldatban, 7,4 pH-érték mellett. A szűrésre alkalmazott pufferoldatok 1% BSA-t (V. frakció) tartalmaztak az üvegrost szűrőn (A/E típus) végbemenő nem specifikus kötődés gátlására. A rostszűrőt használat előtt néhány perccel a szűrőpufferoldatba merítettük. A csöveket 4 ml szűrőpufferoldattal öblítettük, és az öblítőfolyadékot a megfelelő szűrőre folyattuk. A szűrőt harmadik mosása után szárítottuk, és a szűrőhöz kötött radioaktivitást γ-számlálóban mértük. A szűrők mosása megközelítőleg 10 másodpercig tartott. Megfigyeltük, hogy a 3. példában előállított vegyület a [¹²⁵J]-EGF specifikus kötődését gátolta (IC₅₀-értéke 1,3 nM).

A kötődési vizsgálatot hasonló módon megismételtük, azonban vizsgálandó anyagként 1 pg 3. példában előállított, 0,2 mCi ⁿⁱInCl3-dal jelölt vegyületet alkalmaztunk. A vizsgálatokat szilikonozott boroszilikát üvegcsövekben végeztük, és kontrollként a nem specifikus kötődés meghatározása céljából ΙΟ⁷ M EGF-et is alkalmaztuk. E vizsgálatok során megfigyeltük, hogy a

4. példában előállított vegyület erős affinitással kötődött az EGF-receptorokhoz (IC₅₀-értéke 3 nM).

Egy következő, hasonlóan végrehajtott kötődési vizsgálat során hím Sprague-Dawley-patkányokból származó, a hipofízis elülső lebenyéből vett LHRH-receptor-pozitív membránokat és 1 pg 8. példa szerint elő11

HU 219 336 Β állított, 0,4 mCi ^ulInCl3-dal jelzett vegyületet alkalmaztunk (a jelzést szobahőmérsékleten 15 percig végeztük), és 10~⁶ M (DAla⁶)LHRH-t adtunk az elegyhez a nem specifikus kötődés meghatározására. Megfigyeltük, hogy a 8. példában előállított, ¹ In-mal jelzett vegyület erős affinitással kötődött az LHRH-receptorokhoz (IC50-értéke 1,1 nM).

11. példa

A biológiai eloszlás vizsgálata

A radioaktivitás biológiai eloszlása meghatározható standard képalkotó eljárással 20±5 g testsúlyú, EGFreceptor-pozitív (MDA 231, MDA 468 vagy A 431) daganatot hordozó, szőrtelenített egereken, vagy egy csoport ilyen állat egymás utáni leölésével és szerveik radioaktvitásának a meghatározásával. A 4. példa szerinti vegyületet intravénásán, 90-100 pCi-nek megfelelő mennyiségben adagoltuk, majd a radioaktivitást 5, 10,15, 30, 60 perc múlva, valamint 20 és 48 óra elmúltával mértük. A befecskendezés után 5 perccel radioaktivitást mutattunk ki a májban, vesékben, húgyhólyagban és a daganat helyén. A befecskendezés után 60 perccel a radioaktivitás erőssége növekedett, és a daganat helyén lokalizálódott.

12. példa

DTPA-EGF előállítása

A cím szerinti vegyületet a 8. példában leírt eljárást követve, kiindulóanyagként mEGF felhasználásával állítjuk elő.

Az így kapott, cím szerinti vegyületet a 4., illetve 5. példában leírt eljárást követve ^IHIn-mal vagy ⁹⁰Y-mai jelezzük.

13. példa l-(4-Izotiocianáto-benzil)-DTPA-EGF előállítása mg mEGF-vegyületet 5 ml, 1:1 térfogatarányú acetonitril-víz elegyben oldunk, és az oldat pH-értékét szódával 9,8-re állítjuk, majd 1,5 mg N-{2-[bisz(karboxi-metil)-amino]-etil}-N’-{2-[bisz(karboxi-metil)amino]-2-(4-izotiocianáto-benzil)-etil}-glicint [vagy 1(4-izotiocianáto-benzil)-DTPA-t] adunk hozzá. A reakcióelegyet 9 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 20 ml vízzel hígítjuk, és fordított fázisú HPLCoszlopra visszük. A cím szerinti vegyületet gradienseluálással különítjük el („A” pufferoldat: 0,1%-os TFA, ,3” pufferoldat: 0,1% TFA acetonitriles oldatban), és liofilizálás után fehér por alakjában nyerjük.

Az így kapott, cím szerinti vegyületet a 4., illetve 5. példában leírt eljárást követve ^H1In-mal vagy ⁹⁰Y-mal jelöljük.

14. példa (4-Izotiocianáto-benzil)-DOTA-EGF előállítása

A cím szerinti vegyületet a 13. példában leírt eljárást követve, azonban l-(4-izotiocianáto-benzil)-DTPA helyett 4-(izotiocianáto-benzil)-DOTA kiindulóanyagként való alkalmazásával állítjuk elő.

A cím szerinti vegyületet a 4., illetve 5. példában leírt eljárással¹¹'In-mal vagy ⁹⁰Y-mal jelezzük.

Claims (7)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás szabad vagy só formájú, adott esetben kimutatható elemet tartalmazó ligandum előállítására, mely magában foglal egy biológiailag aktív peptidet, azaz felhám-növekedési faktort (EGF), luteinizálóhormont felszabadító hormont (LHRH), gasztrint vagy bombezint, vagy ezek analógjait, vagy származékait, melyek legalább egy kelátképző poliamino-polikarbonsav-csoportot tartalmaznak, a kelátképző csoport - mely kimutatható, előnyösen radioaktív elemmel komplexképzésre képes, és amely adott esetben a kimutatható elemet tartalmazza - közvetlenül vagy közvetetten egy kétértékű hídképző csoport útján, amidkötést formálva kötődik a peptid egy aminocsoportjához, mely aminocsoport célszerűen nem kapcsolódik közvetlenül aromás csoporthoz és nem interferál a célreceptorral, így nem gátolja a ligandumnak a célreceptorhoz való kötődését, mimellett a kétértékű kapcsolódó csoport egy -Z-R-CO- (a,) általános képletű csoport, ahol

   R jelentése
2. 2-4 szénatomos alkiléncsoport vagy hidroxilcsoporttal szubsztituált 2-4 szénatomos alkiléncsoport,

   Z jelentése -NH- csoport, és a kelátképző csoport az alábbi poliamino-polikarbonsavakból származó csoport: dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA), N-(hidroxi-etil)-N,N’,N’-etilén-diamin-triecetsav (HEDTA), etilénglikol-0,0’-bisz(2-amino-etil)Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetraecetsav (EGTA), N,N’-bisz(hidroxi-benzil)-etilén-diamin-N,N’-diecetsav (HBED), trietilén-tetramin-hexaecetsav (TTHA), p-izocianáto-benzil-csoporttal szubsztituált DTP A, 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekán-N,N’,N”,N”’-tetraecetsav (DOTA), 1,4,8,11-tetraaza-ciklotetradekán-Ν,Ν’ ,N” ,N ” ’ -tetraecetsav (TÉTA) vagy egy (la), (Ib) vagy (Ic) általános képletű vegyület, ahol

   R₁₀ jelentése -CH₂CO₂H csoport;

   R_n jelentése -Alk-X, csoport, Alk jelentése 2-4 szénatomos alkiléncsoport, és

   X] jelentése -NCS vagy -NH₂ csoport, azzal jellemezve, hogy

   a) egy fenti kelátképző csoportot hordozó védett pepiidnek legalább egy védőcsoportját eltávolítjuk; vagy

   b) amidkötéssel összekapcsolunk két peptidfragmentumot, amelyek kívánt esetben védettek lehetnek, és amelyek mindegyike legalább egy aminosavat védett vagy védőcsoport nélküli alakban tartalmaz, és ezek egyike tartalmazza a kelátképző csoportot, s ahol az amidkötés a kívánt aminosavszekvenciának megfelelően van kialakítva, majd adott esetben eltávolítjuk a védőcsoporto(ka)t; vagy

   c) egy fenti kelátképző csoportot a peptid megfelelő aminocsoportjához kapcsolunk, ahol a peptid többi aminocsoportja védőcsoporttal ellátott, majd eltávolítjuk a védőcsoporto(ka)t; majd a kapott ligandumot kinyerjük, és kívánt esetben a szabad formában lévő ligandumot ismert módon sóvá ala12

   HU 219 336 Β kítjuk, és kívánt esetben a szabad vagy só formájú ligandumot egy, a megfelelő kimutatható - előnyösen radioaktív - elemet tartalmazó vegyülettel reagáltatjuk.

   R^-Ai-Bi-Cj-D^Ej-F^G ahol az általános képletben

   R₃₃ jelentése hidrogénatom, 2-7 szénatomos alkanoilcsoport vagy karbamoilcsoport,

   Aj jelentése adott esetben a benzolgyűrűn halogénatommal, trifluor-metil-csoporttal, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phe maradék; a- vagy β-naftil-Dalanin maradék; adott esetben az 5-ös vagy 6-os helyzetben halogénatommal vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal és/vagy 1-es helyzetben formilvagy acetilcsoporttal szubsztituált D-Trp maradék; valamint D- vagy L-Pro, D- vagy L-3,4-dehidroprolin, D- vagy L-Ser, D- vagy L-Thr, D- vagy LAla, D-piroglutamin, 3-(9-antril)-D,L-alanil, 3-(2fluorenil)-D,L-alanil vagy 3-(Het)-D,L-alanil maradék, ahol Hét jelentése (c) vagy (d) általános képletű csoport, amelyekben

   A₂ és A₃ jelentése egymástól függetlenül hidrogén-, klór- vagy brómatom, vagy 1 -4 szénatomos alkilcsoport; és

   A₄ oxigén-, kén- vagy nitrogénatomot jelent;

   Bj jelentése adott esetben a benzolgyűrűn halogénatommal, nitro-, 1-3 szénatomos alkil- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phe maradék; adott esetben 4-es helyzetben klóratommal szubsztituált D-a-metilPhe maradék; 2,2-difenil-glicin vagy 3-(2-naftil)-D-alanin maradék;

   Cj jelentése adott esetben 5-ös vagy 6-os helyzetben halogénatommal, nitro- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal és/vagy 1-es helyzetben formil- vagy acetilcsoporttal szubsztituált D-Trp maradék; 3(2-naftil)-D-alanin, 3-(l-naftil)-D-alanin, 3-(D-piridil)-alanin, D-Tyr maradék; adott esetben halogénatommal, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phe maradék; valamint D-3-Pz-Ala, D-Tin-Glu vagy D-NicLys maradék;

   Dj jelentése L-Ser maradék;

   Ej jelentése Tyr; adott esetben a benzolgyűrűjén halogénatommal, 1-3 szénatomos alkil- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal szubsztituált Phe maradék; Om, Lys, Lys-Nic, MPic-Lys, Lys-Pic, MPic-Lys, DMG-Lys, Pmc-Lys, Pzc-Lys, His, Dpo, Arg, 3-(3piridil)-Ala, Trp, N-(3-piridil)-acetil-Lys, Glu(pMeOfenil), Cit, HOBLys vagy Pz-ACAla maradék;

   Fj jelentése adott esetben a benzolgyűrűn halogénatommal, nitro-, 1-3 szénatomos alkil- vagy alkoxicsoporttal szubsztituált D-Phe maradék; adott esetben 5-ös vagy 6-os helyzetben halogénatommal, nitro- és/vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoporttal és/vagy 1-es helyzetben formil- vagy acetilcsoporttal szubsztituált D-Trp maradék; 3-(2-naftil)-Lalanil, D-Tyr, D-Om, D-Lys, D-Lys-Nic, D-MNicLys, D-MPic-Lys, D-Pmc-Lys, D-Pzc-Lys, D-Bz2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan ligandum előállítására, melynél a peptid egy (VII) általános képletű LHRH-antagonista szabad alakban vagy só formában ,-Η,-Ιί-Κί-ΝΗ, (VII)

   Lys, D-ILys, AnGlu, D-NACAla, D-PzACAla, DPmACAla, D-3-(3-piridil)-Ala, D-His vagy benzilcsoporttal szubsztituált D-His, D-Arg, D-homo10 Arg(Et₂), D-Cit, D-HCi, D-Lys-Pic, D-Cit(l-3 szénatomos alkil), D-HCi(l-3 szénatomos alkil), D-Glu(AA) vagy a-amino-a>-karbamido-(2-4 szénatomos alkánsav) maradék;

   Gj jelentése Leu, Nle, Nval, Ν-α-metilLeu, Trp, Phe,

   15 Met, Tyr, Val, Ile, Allolle, Abu vagy Ala maradék; H, jelentése Arg, IOm, Lys, ILys vagy Cyp-Lys maradék;

   Ii jelentése Pro, hidroxi-prolin, 3,4-dehidroprolin, PIP maradék; és

   20 Kj jelentése D-Ala, D-Leu, Gly, D-Ser vagy Sár maradék, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás szabad vagy só

   25 formájú ligandum előállítására, melynél a peptid egy (IXa) általános képletű bombezinantagonista,

   R₃₆-A₆-B₃-C₃-D₃-E₃-F₃-G₃-H₃-I₃-Q (IXa)

   1 23456789 10 ahol az általános képletben

   30 R₃₆ jelentése hidrogénatom, 1-6 szénatomos alkil-, 2-6 szénatomos alkanoil-, 4-6 szénatomos cikloalkoxikarbonil- vagy 1-4 szénatomos alkoxi-karbonil-csoport;

   A₆ közvetlen kémiai kötést vagy Gly, Arg, Lys, Phe,

   35 Asp, Nal, Pro, β-Ala vagy Glp maradékot jelent; B₃ közvetlen kémiai kötést vagy Gly, Pro vagy Asn maradékot jelent;

   C₃ közvetlen kötést vagy Lys vagy D-Nal maradékot jelent;

   40 D₃ jelentése közvetlen kémiai kötés vagy His, MeHis, EtHis, PrHis, Gin, Glu, (OMe)-Glp, Leu, MeLeu, Lys, Pál, Phe, Pro, Arg, Trp vagy Thr maradék;

   E₃ jelentése Trp, Val, Nal, Leu, Lys vagy Pál maradék; F₃ jelentése Ala, MeAla, Aib, Gly, Pro, Leu, Phe, Ser,

   45 Val, Nal, Thr, Arg vagy Glu maradék;

   G₃ jelentése Val, Aib, Leu, Ile, Thr, Phe vagy Ser maradék;

   H₃ jelentése Gly, Sár, Ala, Ser, Aib, Pro, Lys, Asp, Arg, Val, Ac³c, Ac⁵c vagy Ac⁶c maradék;

   50 I₃ jelentése His, MeHis, Aib, Val, Leu, MeLeu, Ala, Ile, Met, Pro, Phe, Gin, Lys, Pál, Ser, Thr, Glu, Asp, Trp vagy Nal maradék; és

   Q jelentése K₃-R₃₇ általános képletű csoport, amelyben K₃ Leu, MeLeu, Ile, Melle, Aib, Pro, Val, MeVal,

   55 Phe, Ape, MeApe, Met, Ser, Gin, Glu vagy Trp maradékot jelent, és R₃₇ jelentése 1-3 szénatomos alkilamino-, di(l—4 szénatomos alkil)-amino- vagy 1-3 szénatomos alkoxicsoport; vagy Q 1-4 szénatomos alkoxi-, 1-10 szénatomos alkil-amino- vagy

   60 di( 1 -10 szénatomos alkil)-amino-csoport;

   HU 219 336 Β vagy egy (IXb) általános képletű vegyület

   A₇-B₄-Gln-Trp-Ala-Val-W-X₆-Y₆-T₁ (IXb) 12 34 5 6789 10 ahol az általános képletben

   A₇ hidrogénatomot, Boc, Lys vagy Arg maradékot jelent;

   B₄ jelentése közvetlen kémiai kötés vagy Asn, Thr vagy Glp maradék;

   Gly vagy Alá maradékot jelent; közvetlen kémiai kötést, His(R₃₈), Phe, Ser vagy Alá maradékot jelent;

   Y₆ jelentése közvetlen kémiai kötés, Leu vagy Phe maradék;

   Tj jelentése aminocsoport, NH(CH₂)₄CH₃ képletű csoport, benzil-amino-csoport vagy Met-R₃₉, Leu-R₃₉, Ile-R₃₉ vagy Nle-R₃₉ általános képletű csoport;

   R₃₈ hidrogénatomot vagy benzilcsoportot jelent; és R₃₉ jelentése amino-, hidroxil-, metoxi- vagy -NHNH₂ csoport, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás DTPA-p-AlaEGF, acetil-DPhe(pCl)-DPhe(pCl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys (DTPA)-Leu-Arg-Pro-DAla-NH₂, DTPA-DNal-(2)‘DPhe-(p-Cl)-DTrp-Ser-Tyr-DLys(CH₂-CHOHCH₂OH)-Leu-Lys-CH₂-CHOH-CH₂OH)-Pro-DAla-NH₂ és acetil-His-Trp-Ala-Val-DAla-Lys(p-Ala-DTPA)Leu-OEt ligandum előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás kimutatható elemet magában foglaló ligandum előállítására, melynél a kimutatható elem egy fluoreszcens vagy egy α-, β- vagy γ-sugárzó elem, azzal jellemezve, hogy megfelelő kiindulási vegyületeket alkalmazunk.
6. 6. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1. igénypont szerinti eljárással előállított ligandumot a gyógyászatban alkalmazható hordozó- vagy hígítóanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
7. 7. Diagnosztikai egységcsomag, mely az 1. igénypont szerinti eljárással előállított ligandumot és egy kimutatható elem dózisegységét tartalmazza.