HU218830B - Eljárás kollagénindukált vérlemezke-koaguláció inhibitor előállítására - Google Patents

Description

A humán vérlemezke-aggregáció ismert leghatékonyabb inducere a kollagén. Például az érfal sérülése és a kollagén felszínre kerülése következtében a vérlemezkék gyorsan megtapadnak és aktiválódnak [Baumgartner, H. R., Thromb. Haemostas., 37, 1-16 (1977); Ha- 5 wiger, J., Humán Pathol., 18,111-122 (1977)].

A humán vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációja tehát potenciális veszélyforrás azoknak a betegeknek az esetében, akik az érfalat érintő eljárásokon esnek át, például angioplasztikán vagy szepszisen, vala- 10 mint azoknak a betegeknek az esetében, akik szívizominfarktuson esnek át, illetve szívizom-infarktusból vannak gyógyulófélben többek között.

A kollagénnel indukált vérlemezke-aggregáció inhibitorai lehetnek szintetikus oligopeptidek, amelyek meg- 15 felelnek a kollagén szekvenciájának, egy kígyóméreg-fehéije és a kálin, egy, az orvosi piócából származó fehérje. A szintetikus oligopeptidek gátolják a kollagénnel indukált vérlemezke-aggregációt, oly módon, hogy a vérlemezkékhez kötődnek. Egy hátrányuk, hogy csak vi- 20 szonylag nagy dózisban vannak hatással a vérlemezke-aggregációra (körülbelül 70 pg/ml peptid eredményez 65%-os gátlást) [Bevers et al., „Collagen Derived Octapeptide Inhits Piatelet Procoagulant Activity Induced by the Combined Action of Collagen and Throm- 25 bin”, Thrombosis Research, 37, 365-370 (1985); Kamiguian et al., „Effect of a Collagen Derived Octapeptide on Different Steps of the Platelet/Collagen Interaction”, Thrombosis Research, 32, 593-604 (1983); Caen et al., „Oligopeptides with specific inhibiting properties of 30 collagen induced aggregation, process fór preparing the same and pharmaceutical compositions containing them”, EPA 0 040 149, (1981)]. A kígyóméreg gátlómechanizmusát még nem ismerik [Smith et al., Identification of 50 kdalton snake venom proteins which specifi- 35 cally inhibit piatelet adhesion to collagen”, Thrombosis and Haemostasis, 65, 678 (Abstracts of the XlIIth Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, 1991. június 30-július 6. Amszterdam)]. A kálin reagál a kollagénnel, de nem reagál a vérlemezkékkel. Ennek következtében nem specifikus a vérlemezke-kollagén kölcsönhatásra, viszont reagál a kollagénnel a vérlemezkék távollétében is [Munro et al., „Calin - a platelet adhesion inhibitor from the sálivá of the medicinái leech”, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 2,179-184(1991)].

Az EP 0 480 651 európai szabadalmi bejelentésben (Merck & Co. Inc., publikálva 1992. április 15-én) leírnak egy olyan fehérjét, amelynek molekulasúlya körülbelül 16 kdalton, és képes gátolni a humán vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját; ez a fehérje a Haemaenteria officinalis piócából származik.

Az ilyen aggregáció egyéb inhibitoraira is szükség van, amelyeknek eltérő vagy javított tulajdonságai vannak.

A találmány tárgya természetből izolált, szintetikus úton készített vagy rekombináns fehéije, amely gátolja az emlősvérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját, és amelyet emlősvért szívó rovarok nyálából izolálunk, illetve izolálhatunk.

A főemlősök vérlemezkéi a fontosak, a legfontosabbak a humán vérlemezkék. Az egyéb fajokból, például lovakból, birkákból, borjúkból, sertésekből, kutyákból és macskákból származó vérlemezkék is értékesek.

A szintetikus úton készített fehéqéket J. M. Steward és J. D. Young módszerével lehet előállítani [Solid Phase Synthesis, Pierce Chem. Company, Fockford III (1984)], illetve Houben/Weylben leírt módszer szerint (Methoden dér Organischen Chemie, 75/1 és 2, E. Wünsch (ed.), Thieme Verlag Stuttgart (1974)].

A találmány szerinti előnyös fehérjét a Triatomae (lat. Faminia) alcsalád nyálából izoláljuk, illetve még előnyösebb erre a célra a Triatoma pallidipenuis.

A találmány tárgya egy természetből izolált szintetikus úton készített, illetve rekombináns fehéije előállítása, amely gátolja a humán vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját, és amely fehérje az alábbi N-terminális aminosavszekvenciával rendelkezik:

Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu 1 5 10 15

Lys Tyr Phe Ser Ile 20

A találmány tárgya továbbá egy olyan fehérje előállítása, amely gátolja az emlősvérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját, és amely fehétjének az aminosavszekvenciája az alábbi: 50

a) a szekvencia az aa) SEQID No 1., bb) SEQ ID No 2. vagy cc) SEQ ID No 3. szekvencialistában, vagy

b) a SEQ ID No 1 -3. bármelyikének allelikus módo- 55 sításával vagy mutációjával kapott szekvenciák, amely allelikus módosítások nem érintik lényegesen a fehérje aktivitását, vagy

c) a SEQ ID No 1 - 3. bármelyike szerinti fehéije, illetve azoknak a b) pont alatt említett módosításai vagy 60 muteinjei, amelyek olyan poszttranszlációs módosításokat tartalmaznak, amelyek nem érintik lényegesen az érett fehérje aktivitását.

Még előnyösebb az a fehéije, az előzőkben említettek szerint, amely rekombináns DNS-technikával készül.

A találmány szerinti fehérje nem glikozilezett.

A találmány tárgya továbbá egy olyan cDNS vagy

DNS előállítása, amely

a) egy, az alábbi aminosavszekvenciával rendelkező fehérjét kódol:

a) a szekvencia az aa) SEQ ID No L, bb) SEQ ID No 2. vagy cc) SEQ ID No 3. szekvencialistában, vagy

HU 218 830 Β

b) egy olyan fehérjét kódol, amelynek az aminosavszekvenciája megfelel a SEQ ID No 1-3-ban található bármelyik szekvenciának, legalább egy allelikus módosítással, vagy egy mutein, amely lényegesen nem érinti a megfelelő cDNS- vagy DNS-szekvencia által kódolt érett fehérje aktivitását.

A találmány szerinti fehérje egy érett fehérjére, valamint egy prefehérjére vonatkozik, amely az érett fehérje N-terminálisát megelőző szignálszekvenciával rendelkezik. A szignálszekvenciák a 13a. és 13b. ábrákon láthatók, és a negatív előjelű sorszámuk alapján ismerhetők fel. A Met Lys Val Ile Ile szekvenciával kezdődik, és a His Alá Phe Alá szekvenciával végződik. A szignálszekvencia a felelős a membránon való áthatolásért a fehérje bioszintézise után. A szekretálódó fehérje az érett fehérje, ez a Glu Glu Cys Glu Leu szekvenciával kezdődik. A szignálszekvencia a szekréció előtt lehasad.

A találmány tárgya előnyösen egy olyan cDNSvagy DNS-szekvencia, amely az alábbi nukleotidszekvenciával rendelkezik:

a) a nukleotidszekvencia aa) SEQ ID No 4., bb) SEQ ID No 5. vagy cc) SEQ ID No 6. szekvencialistában, vagy

b) a SEQ ID No 4-6. bármelyike szerinti nukleotidszekvencia legalább egy allelikus módosításával vagy egy olyan mutációval, amely nem érinti lényegesen a megfelelő nukleotidszekvencia által kódolt érett fehérje aktivitását.

A találmány tárgya továbbá egy vektor, amely az előzőkben említett cDNS-t vagy DNS-t hordozza, emellett tartalmaz egy megfelelő szignálpeptidet, egy alkalmas promotert, és ha szükséges, akkor egy alkalmas erősítőszekvenciát. A vektorokat részletesen a Példák irodalmi hivatkozásaiban írjuk le, valamint az EP 0480 651; 0 462 632 és 0 173 177 számú európai szabadalmi bejelentésekben.

A találmány tárgya továbbá egy eukarióta- vagy prokarióta-gazdasejt előállítása, amelyet az előzőkben említett vektorral transzformálunk.

A találmány tárgya továbbá eljárás a találmány szerinti fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a fehérjét kódoló gént hordozó vektorral transzformáit gazdasejtet szaporítjuk, és izoláljuk és tisztítjuk a fehérjét.

A konkrét megvalósítási formákat a találmány példák részében írjuk le, az általános módszer kikövetkeztethető a tudományterület specifikációban ismertetett állásából, különösen a leírás példák részében.

A találmány szerinti fehérjék ipari alkalmazása az, hogy a találmány szerinti fehérjéket gyógyászati készítményekben alkalmazzuk, gyógyászatilag elfogadható hordozóval vagy hígítószerrel. A részleteket a specifikáció módszerek részében ismertetjük.

Az előzőkben említett allelikus módosítások változást jelentenek a nukleotidok vagy aminosavak szekvenciájában, illetve a genotípusban vagy a fenotípusban. Legalább egy nukleotidot vagy aminosavat helyettesítünk, illetve kivágunk vagy beszúrunk.

A legtöbb deléciótól, inszerciótól és különösen a szubsztitúciótól nem várható, hogy a találmány szerinti fehérje jellemzőiben radikális változásokat okozzon. Mivel nehéz előre megjósolni a szubsztitúció, deléció vagy inszerció pontos hatását, ezért a mutáns fehérje funkcióinak összehasonlítása a találmány szerinti fehérje jellemző funkcióival tisztázza, hogy a megváltoztatott fehérjének van-e összehasonlítható aktivitása.

A genetikai kód degenerált; azaz a legtöbb aminosavat több mint egy, három nukleotidból álló kodon kódolja. Ennek megfelelően a nukleotidszekvenciába bevitt allelikus variáció vagy megváltoztatja az aminosavszekvenciát, vagy nem. Ennélfogva az allelikus variációk elsődlegesen DNS-szinten játszódnak le, és létezhetnek a másodlagos, aminosavszekvencia-szinten is.

A találmány szerinti fehérjét kódoló DNS-szekvencia szokványos technikákkal módosítható, hogy a találmány szerinti végső fehérjében olyan módosítások jöjjenek létre, amelyek megengedik, hogy a mutáns feltétjének lényegében ugyanolyan aktivitása legyen, mint a találmány szerinti fehérjének. Az aktivitást az 1. példában leírtak szerint méljük. Tehát egy vagy több aminosavat, például 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, ... egészen 15ig, aminosav adható, helyettesíthető vagy eltávolítható anélkül, hogy lényegesen érintenénk a találmány szerinti fehéije aktivitását. A szubsztitúciókat lényegében az alábbi, 1. táblázat szerint végezhetjük, ha arra van szükség, hogy finoman szabályozzuk a találmány szerinti fehérje aminosavszekvenciáját.

A funkcióban vagy az immunológiai azonosságban lényeges változásokat úgy hozhatunk létre, hogy kevésbé konzervatív szubsztitúciókat választunk, mint ami az 1. táblázatban látható, azaz olyan csoportokat választunk, amelyek hatásukban lényegesen eltérnek (a) a szubsztitúció helyén kialakult polipeptid gerincszerkezetének fenntartásában, azaz például a lemez vagy helikális konformáció fenntartásában;

(b) a molekula töltésének vagy hidrofobicitásának fenntartásában vagy (c) az oldalláncok térkitöltésének fenntartásában.

1. táblázat

Aminosavak normál szubsztitúciója egy fehérjében

Eredeti csoport	Példa a szubsztitúcióra
Alá	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Alá, Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile,Val

HU 218 830 Β

7. táblázat (folytatás)

Eredeti csoport	Példa a szubsztitúcióra
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

A mutációkat a két összehasonlított fehérje közötti homológia alapján határozzuk meg. Az expressziós homológia hasonlóságokat jelent az aminosavakban és hiányokban mindkét összehasonlított szekvencia esetében. Az aminosavak hasonlóságát például az 1. táblázat alapján határozzuk meg.

A fehérje aminosavszekvenciája legalább 60%-os, előnyösen legalább 80%-os, előnyösebben legalább 90%-os, és legelőnyösebben legalább 95%-os homológiát mutat az 1-3-as szekvenciákkal.

Amint azt az előzőkben említettük, a találmány tárgyát képezi a DNS-variálása is. Ezek a szekvenciák szigorú körülmények között hibridizálódnak a 4-6-os szekvenciák egyikéhez. A cDNS vagy a DNS nukleotidszekvenciája legalább 60%-os, előnyösen legalább 80%-os, előnyösebben legalább 90%-os, és legelőnyösebben legalább 95%-os homológiát mutat a 4-6-os szekvenciákkal. A homológiát hibridizációval lehet mérni [Knippers, Molekulare Genetik, harmadik kiadás, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York (1982)].

A „poszttranszlációs variációk” alatt az előzőkben említettek szerinti variációkat értünk a transzláció során vagy után, ilyen például a glikozilezés, a diszulfidhidak kialakulása és az aminosavak kémiai módosítása.

A glikozilezés az egyik fő bioszintetikus funkciója az endoplazmatikus retikulumnak és/vagy a Golgi-apparátusnak. A retikulumban képződő oligoszacharidok szekvenciája és elágazása megváltozhat a Golgi-apparátusban, a lizoszómákban vagy a plazmamembránban. Az oligoszacharidok lehetnek N-kapcsolt oligoszacharidok (aszparaginhoz kapcsolva) vagy 0-kapcsolt oligoszacharidok (szerinhez, treoninhoz vagy hidroxilizinhez kapcsolva). A glikozilezés függ a termelősejt típusától, valamint attól a fajtól, amelyből a sejttípus származik. A glikozilezés mértékét és formáját befolyásolni lehet különböző vegyületekkel, például amelyeket az EP 0 223 313 európai szabadalmi bejelentésben írtak le. A glikozilezés megváltoztatása befolyásolhatja a fehérje funkcióját.

A találmány szerinti érett fehérje normális körülmények között glikozilezve van.

A fehérjék gyakran képeznek láncok között hidakat. Ezek a diszulfídhidak cisztein-SH aminosavak között jönnek létre a térszerkezetét felvett fehérjében, illetve akkor, amikor a fehérje a transzláció során éppen felveszi a térszerkezetét. A kötések stabilizálják a fehérje háromdimenziós szerkezetét. Az ilyen diszulfidkötések ritkán képződnek a fehérjemolekulákban, amikor még a sejtcitoszolban vannak, mivel az -SH redukálóágens, a glutation magas koncentrációban van jelen, és az elbontja a legtöbb ilyen kötést.

Ha a fehérjék már kikerültek a citoplazmából, szekretálódtak vagy a sejt felszínén vannak, akkor gyakran hoznak létre további kovalens, láncok közötti kötéseket.

Emellett az aminosavak megváltoztathatók, a WO 91/10684 PCT leírás szerint. Az aminosavak oldalláncainak egyéb változtatása is lehetséges.

Az előnyös homológia legalább 90%, az előnyösebb legalább 95%, a legelőnyösebb legalább 98%, a leginkább előnyös egy vagy több aminosav megváltoztatása.

A találmány szerinti fehérje legalább 40%-os tisztaságú, előnyösen legalább 60%-os, előnyösebben legalább 80%-os, és legelőnyösebb, ha legalább 90%-os tisztaságú. A tisztaságot úgy határozzuk meg, hogy a találmány szerinti vegyület mennyisége hogyan aránylik az összfehérje mennyiségéhez. Kétlépéses tisztítást végzünk, először Sepharose gélszűrést (lásd 2. példa) másodszor HPEC-t (lásd 15. példa), ezek után a találmány szerinti fehérje mellett egyéb fehéije nem mutatható ki a 15. példában leírt módszerrel.

A találmány tárgyát képezik továbbá kötőmolekulák, egyláncú fehérjék, antitestek, illetve azok ffagmentjei, amelyek specifikusan felismerik a találmány szerinti érett fehérjén levő doméneket.

A találmány szerinti tisztított fehéije felhasználásával (lásd például az 1-3. szekvenciákat) a monoklonális antitesteket a jól ismert Koehler- és Milsteinmódszerrel állítjuk elő, amelynek során, többek között szokványosán immunizálunk egereket a találmány szerinti tisztított fehérjével mint immunogénnel.

A találmány legelőnyösebb megvalósítási módja szerint az 1-es szekvenciával jellemzett fehérjét expresszáljuk transzfektált bébihörcsög-vesesejtekben.

A találmány tárgya emellett a találmány szerinti fehérje tisztítási eljárása, amely a következő lépésekből áll:

(a) gélszűrési lépés „Superose 12” felhasználásával (lásd a 2. példát), és (b) nagy teljesítményű elektroforézis kromatográfiás rendszer alkalmazása (lásd 15. példa).

A találmány szerinti vegyületek farmakológiai aktivitással rendelkeznek, és ennélfogva gyógyszerként használhatók. Használhatók egy olyan gyógyászati készítményben, amely a találmány szerinti fehérjét gyógyászatilag elfogadható hígítószerrel vagy hordozóval kombinálva alkalmazza. A találmány tárgya emellett gyógyászati készítmény, amely a találmány szerinti farmakológiailag aktív fehérjét tartalmazza, valamint egy gyógyászatilag elfogadható sót vagy gyógyászatilag elfogadható hordozót is tartalmaz.

A találmány szerinti fehérje emellett a kollagénnel indukált vérlemezke-aggregáció gátlására, valamint a tumorsejteknek, előnyösen a metasztázisos tumorsejteknek a kollagénhez való tapadásának gátlására képes.

HU 218 830 Β

A találmány szerinti fehérjék gátolják a vérlemezke-aggregációt. A tesztrendszert az 1. példában írjuk le. A találmány szerinti fehérjék jelentős mértékben gátolják a vérlemezke-aggregációt 0,5-50 pg fehérje 0,5 ml nyálban vagy 0,5-250 pg fehérje 0,7 ml tisztított fehérjében (a 2. példában leírtak alapján tisztítva).

A legelőnyösebb fehérje, az 1. szekvencia szerinti fehérje vizsgálata azt mutatja, hogy a 2. és 15. példa szerinti nagyon alaposan tisztított fehérje IC₅₀ értéke 50 nmol/1. A találmány szerinti fehérjék a vérlemezke-aggregációt 5 nmol/1 - körülbelül 1000 nmol/1 koncentrációban gátolják.

Az in vitro tesztrendszerekből származó eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti fehérjék gyógyszerként használhatók, illetve gyógykezelésre használhatók. A teszt eredményei átvihetők az in vitro rendszerekből az in vivő rendszerbe, mivel ez egy jól bevált rendszer ezen a területen [R. J. Shebuski et al., Thrombosis and Haemostasis, 64, 576-581 (1990)].

A találmány szerinti fehérjéket intraperitonális injekciókkal adjuk be, amelyeket naponta, illetve hetente

2-3-szor adunk be. Ha az állatok naponta kapnak injekciókat, hogy a 100 nmol/1 vérkoncentrációt elérjék, akkor a vérlemezke-aggregációjuk csökken.

Súlyos mellékhatások nem figyelhetők meg ilyen körülmények között.

A találmány szerinti fehérjék mutatják a vérlemezke-aggregációt gátló hatást egerekben, napi dózisokban, hogy a körülbelül 10 nmol/1-1000 nmol/1 vérszintet elérjük.

A találmány szerinti fehérjék ennélfogva jól használhatók ateroszklerotikus vagy trombotikus betegségek által okozott laesiók kezelésében, illetve a szívizominfarktus kezelése során az újból összecsapzódás megelőzésében. Más szóval: A találmány szerinti fehérjék használhatók antiateroszklerotikus és antitrombotikus hatóanyagokként emlősökben, beleértve az embereket is, azaz az ateroszklerotikus/trombotikus laesiók kezelésében, például az ateroszklerctikus plakkok feltörése, illetve az endotelium megzavarása vagy eltávolítása miatt, például szepszisben vagy transzplantátumokban, illetve instabil angina kezelésében. Használható továbbá az újból összecsapzódás megelőzésére a szívizominfarktus fibrinolízissel vagy angioplasztikával (PTCA) való kezelése során. Ha a fibrinolitikus terápiát (sztreptokinázzal, tPA-val vagy más plazminogén aktivátorokkal) használjuk a szívizominfarktus kezelésére, akkor a találmány szerinti fehérjék használhatók adjuváns anyagként arra, hogy megelőzzük az újbóli összecsapzódást a vérerekben. A szívizominfarktus kezelése egy ballonkatéterrel (PTCA) az érfalat is megsérti, és ez újabb vérrög kialakulásához vezethet. Ez megelőzhető, ha a találmány szerinti fehérjéket adagoljuk a beavatkozás alatt és után. A fehérjék nemcsak a koronáriaangioplasztikában használhatók, hanem más angioplasztikás beavatkozásokban is használhatók.

A találmány tárgya tehát

a) egy, a találmány szerinti fehérje használata gyógyszer készítésére, amely gyógyszert ateroszklerotikus vagy trombotikus megbetegedések kezelésében lehet használni, illetve meg lehet akadályozni az újbóli összecsapzódást a szívizominfarktus kezelése után; (A fehérjék jól használhatók mint profilaktikusan működő gyógyszerek.)

b) eljárás ateroszklerotikus vagy trombotikus betegség kezelésére, illetve az újra összecsapzódás megelőzése szívizominfarktus utáni kezelés során, ami abban áll, hogy a találmány szerinti fehérjéből a betegség elnyomásához elegendő mennyiséget adunk be a kezelést igénylő betegnek;

c) gyógyászati készítmény ateroszklerózisos vagy trombotikus betegség kezelésére, illetve az újra összecsapzódás megelőzésére szívizominfarktus kezelése után, azzal jellemezve, hogy a találmány szerinti fehérjét tartalmazza, valamint egy gyógyászatilag elfogadható hordozót vagy hígítószert.

Ezekre az indikációkra a megfelelő dózis természetesen változik, attól függően például, hogy a találmány szerinti fehérjék közül melyiket használjuk, a gazdaszervezettől, a beadás módjától, valamint a kezelendő állapot súlyosságától és természetétől függően. Általában azonban állatokban akkor kapunk kielégítő eredményeket, ha napi dózisokat alkalmazunk, és az elért vérszint 10-1000 nmol/1, az előnyös napi dózis 30-300 nmol/1.

A találmány szerinti fehérjéket bármely szokványos módon bejuttathatjuk a szervezetbe, különösen enterálisan, orálisan, például tabletták vagy kapszulák formájában, illetve parenterálisan, például injektálható oldatok vagy szuszpenziók formájában.

Az 1-es szekvencia szerinti fehérje az előnyös vegyület.

A jelen találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely a találmány szerinti vegyületeket tartalmazza, legalább egy gyógyászati hordozóval vagy hígítószerrel együtt. Az ilyen vegyületeket szokványos módon lehet előállítani [Remington’s Pharmaceutical Science, 15^th ed., Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980)].

A találmány szerinti fehérjék gátolják a metasztázisos tumorsejtek kollagénhez való tapadását. A tesztrendszert a 14. példában írjuk le. A találmány szerinti fehérjék a metasztázisos tumorsejtek kollagénhez való adhézióját jelentősen gátolják 1-100 pg fehérje 0, 5 ml-ben nyálban, vagy 1-500 pg fehérje 0,5 ml tisztított fehérjében (csak a 2. példa szerint tisztítva).

A legelőnyösebb fehérje az 1-es szekvencia szerinti fehérje, IC₅₀-értéke 100 nmol/1 nagyon alaposan - a 2. és 15. példa szerint - megtisztított fehérje. A találmány szerinti fehérjék a metasztázisos tumorsejtek kollagénhez való adhézióját 10-2000 nmol/1 koncentrációban gátolják.

Az in vitro tesztrendszerekből származó eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti fehérjék gyógyszerként használhatók, illetve gyógyászati kezelésre használhatók. A teszteredmények átvihetők az in vitro rendszerből az in vivő rendszerbe, mivel az egy jól beállított rendszer ezen a területen (Chan et al., Science, 2, 1600-1602 (1990)].

A találmány szerinti fehérjéket adagolhatjuk a primer tumor sebészeti eltávolítása során vagy után, hogy

HU 218 830 Β ezzel megakadályozzuk a metasztázis kialakulását a levált tumorsejtek révén, amelyek bejuthatnak a véráramba az operáció során. Ezeket az antimetasztázisos hatásokat vizsgálhatjuk „kísérletes” vagy „spontán” állati modellekben (Chan et al., Science 2, 1600-1602 (1990)]. A találmány szerinti fehérjéket intraperitonális injekciókkal juttathatjuk be, amelyeket naponta, illetve hetente 2-3-szor adunk be. Ha az állatok naponta kapnak injekciókat a 200 nmol/1 vérszint elérése céljából, akkor a metasztázisos tumorsejtek adhéziója csökken, a kiülepedett metasztázisos sejtek által okozott centrumok száma alapján.

Ilyen körülmények között nem figyelhető meg súlyos mellékhatás.

A találmány szerinti fehérjék gátolják a metasztázisos tumorsejtek adhézióját kollagénhez egérben, napi dózisok alkalmazásával, hogy a 20-2000 nmol/1 vérszintet elérjük, az előnyös vérszint 60-600 nmol/1.

A találmány szerinti fehérjék tehát használhatók rák kezelésére. Előnyösen kezelhetők a metasztázisos tumorsejteket eredményező rákok, és a kezelés a legelőnyösebb a nagyon erős metasztázisos tumorsejteket eredményező rákok esetében.

A találmány tárgya tehát

a) egy, a találmány szerinti fehérje alkalmazása metasztázisos tumorsejteket eredményező rák kezelésére alkalmazható gyógyszer előállításában; (A fehéijék jól használhatók profilaktikus hatású gyógyszerekként, amelyeket például a tumorok sebészeti úton való eltávolítása előtt adnak be.)

b) eljárás matasztázisos tumorsejteket termelő rák kezelésére, ami abban áll, hogy az ilyen kezelésre szoruló beteget a találmány szerinti fehéije betegséget elnyomó hatású mennyiségével kezeljük;

c) metasztázisos tumorsejtek kezelésére alkalmas gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy egy, a találmány szerinti fehérjét tartalmaz, valamint egy gyógyászatilag elfogadható hordozót, illetve hígítószert.

Ezekre az indikációkra a megfelelő dózis természetesen változik, attól függően például, hogy a találmány szerinti fehérjék közül melyiket használjuk, a gazdaszervezettől, a beadás módjától, valamint a kezelendő állapot súlyosságától és természetétől függően. Általában azonban állatokban akkor kapunk kielégítő eredményeket, ha napi dózisokat alkalmazunk, és az elért vérszint 20-2000 nmol/1, az előnyös napi dózis 60-600 nmol/1.

A találmány szerinti fehérjéket bármely szokványos módon bejuttathatjuk a szervezetbe, különösen enterálisan, orálisan, például tabletták vagy kapszulák formájában, illetve parenterálisan, például injektálható oldatok vagy szuszpenziók formájában.

Az 1-es szekvencia szerinti fehérje az előnyös vegyület.

A jelen találmány tárgya gyógyászati készítmény, amely a találmány szerinti vegyületeket tartalmazza, legalább egy gyógyászati hordozóval vagy hígítószerrel együtt. Az ilyen vegyületeket szokványos módon lehet előállítani [Remington’s Pharmaceutical Science, 15^,h ed., Mack Publishing Company, Easton Pennsylvania (1980)].

A jelen találmány tárgya egy, a humán vérlemezkék kollagén által indukált aggregációjának gátlására képes hatóanyag. Az új specifikus inhibitor előfordul a természetben, egy fehérje (azaz nem oligopeptid), és gátolja a tumorsejtek és a kollagén kölcsönhatását. Ez az inhibitor a vérszívó Triatoma pallidipennis nyálában található. (Lásd az 1. példát.)

A jelen találmány tárgya tehát egy tisztított és izolált fehérje, amely gátolja a humán vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját. A fehérje Triatoma pallidipennisből izolálható. A találmány tárgyát képezik továbbá azok a gyógyászati készítménye, amelyek egy fehérjét tartalmaznak, valamint azok a módszerek, amelyek az utóbbiakat trombotikus laesiók kezelésére, illetve a szívizominfarktus elleni kezelés utáni újbóli összecsapzódás megakadályozására, illetve metasztázis előrehaladásának kezelésére.

Tehát a jelen találmány tárgya értékes, farmakológiailag aktív hatóanyag, például egy új fehéije, amely specifikusan gátolja a kollagénnel indukált vérlemezke-aggregációt magas specifikus aktivitás mellett; egy új fehérje, amely specifikusan zavaija a vérlemezkekollagén kölcsönhatást anélkül, hogy előidézné a vérlemezkeközi alkotóelemek, például az ATP felszabadulását, aminek nemkívánatos mellékhatása van önmagában; egy új, gyógyászatban használható fehérje, amelyet ateroszklerotikus és trombotikus megbetegedések kezelésére lehet használni, illetve meg lehet előzni vele a szívinfarktus elleni kezelés utáni újbóli összecsapzódást; egy új fehérje, amely zavaija a tumorsejt-kollagén kölcsönhatást, és amely például tumorsejt-metasztázis megelőzésére használható.

Az inhibitor tulajdonságainak és jellemzőinek vizsgálatával az alábbi eredményeket kaptuk:

1. Az inhibitor nem fibrinogén receptorantagonista, mivel a növekvő fibrinkoncentrációval végzett kísérletek azt mutatták, hogy nincs hatásuk a gátló hatásra. Lásd 3. példa.

2. Nem tromboxánantagonista, mivel megelőzi az aszpirinnel kezelt vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját, de nem előzi meg az U46619 (egy tromboxán mimetikum) által okozott aggregációt. Lásd 4. példa.

3. Valószínűleg nem gátolja a protein-kináz C által befolyásolt szignáltranszdukciós (jelátvezetési) bioszintézis utat, mivel a forbol-észterek (fórból-12-mirisztát-13-acetát) által okozott aggregációt nem gátolja. Lásd 4. példa.

4. Gátolja a kollagénnel kezelt vérlemezkék release-reakcióját. Lásd 5. példa.

5. Nem gátolja a trombin vagy ADP által indukált vérlemezke-aggregációt. Lásd 6. példa.

6. Az inhibitor nem lép reakcióba a kollagénnel. Jóllehet az inhibitor kollagénnel való előinkubálása nem eredményez megnövekedett gátló hatást, a vérlemezkéknek a gátlószerrel való megismételt, meghosszabbított inkubációja magasabb gátlópotenciát eredményez. Lásd 7. példa.

7. A vérlemezke-aggregáció reverzibilissé válik nagy mennyiségű kollagén hozzáadására. Lásd 7. példa.

HU 218 830 Β

8. A proteázinhibitoroknak nincs mérhető hatásuk az aktivitásra. Lásd 8. példa.

9. A gátló hatás erősebb Mg²⁺ ionok jelenlétében.

Lásd 9. példa.

10. Az inhibitor megakadályozza, hogy a vérlemezkék a kollagénmátrixhoz dózisfüggő módon hozzákötődjenek. Lásd 10. példa.

Ezek az eredmények erősen arra utalnak, hogy az inhibitor egy nagy specifikus aktivitással rendelkező kollagénreceptor, azaz 1C_5o=2,5 pg per ml, az alábbiakban ismertetendő „Superose”-frakcióból (a részlegesen tisztított inhibitor alapján), illetve IC_so=5O nmol/1 a nagyon megtisztított fehéqe alapján (a 2. és 15. lépésekben leírt egymást követő lépések szerint megtisztítva).

11. Az inhibitort Sepharose-hordozóhoz kötött tripszinnel inkubáltuk. A proteolitikus emésztés hatására a gátló hatás teljesen elveszett. Lásd 11. példa, amely azt mutatja, hogy az inhibitor egy fehérje.

12. Az inhibitor nem hasítható kollagenázzal. Lásd

12. példa.

13. A 150 mmol/1 NaCl jelenlétében végzett gélszűréses kromatográfia alapján az inhibitor molekulasúlya 20 kda±5 dalton, azaz körülbelül 20 kdalton. Lásd 13. példa. A nem glikozilezett fehérjének a cDNS-szekvencia alapján (lásd a SEQ ID No 1-et) számított molekulasúlya 18,923 dalton.

14) Az inhibitor gátolja az erősen metasztázisos tumorsejtek (MTLn3) kollagénhez dózisfuggő módon való adhézióját. Lásd 14. példa.

A jelen találmány szerinti inhibitor nem kötődik a kollagénhez (vagy nem reagál vele), kötődik a vérlemezkékhez, és nem okozza a kollagén összecsapzódását.

A jelen találmány szerinti kollagéninhibitor rutinszerűen izolálható a vérszívó Triatoma pallidipennis nyálából, amint azt az alábbi példákban leírjuk. A szokványos nyálgyűjtési módszerek teljesen használhatók a kiindulási anyagként szolgáló nyál összegyűjtésére. A. Triatoma pallidipennis Közép- és Kelet-Afrikában sűrűn előfordul, tehát könnyen hozzáférhető. Ismert róla, hogy a Trypanosoma cruzi hordozója.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá DNSszekvenciák, az ezeket a szekvenciákat tartalmazó vektorok, az említett vektorokat hordozó sejtek, módszerek a fehéijék rekombináns DNS-módszerrel való előállítására, valamint a jelen találmány szerinti fehérjék elleni antitestek. A találmány tárgyát képezik továbbá azok az izolált és/vagy rekombináns DNS-szekvenciák (azaz például genomiális vagy cDNS), amelyek egy olyan fehérjét (például természetes fehérjét) kódolnak, amely gátolja a humán vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját. A találmány tárgyát képezik továbbá a jelen találmány szerinti, rekombináns technikákkal előállított fehérjék, amelyek például az ismertetett szekvenciákkal rendelkeznek.

Az „izolált” szakkifejezés alatt azt értjük, hogy a jelen találmány szerinti inhibitor vagy más egység a vele természetesen kombinálódó, illetve a vele együtt rekombináns úton vagy szintetikusan keletkező komponensektől elválasztott (tisztított) formában van jelen. Az ilyen izolálásnak vagy tisztításnak minden mértékét generikusan értjük. Előnyös az izolálásnak vagy tisztításnak az a mértéke, amikor az inhibitort gyógyászati célokra lehet használni. Az izolálásnak ezt a mértékét (például aktivitást vagy tisztaságot) rutinszerűen el lehet érni kromatográfiás technikákkal, például azokkal, amelyeket a példákban használunk. A további tisztítást, például a homogenitásig, rutinszerűen el lehet érni szokványos módszerek alkalmazásával, mondjuk az alábbi kézikönyvekben leírt módszerek alkalmazásával:

Methods of Enzymology, 182, Guide to Protein

Purification, ed. Murray P. Deutscher, Academic

Press 1990;

Protein Purification Applications - A Practical

Approach, ed. E. L. V. Harris and S. Angel, IRLPress, 1990;

Protein Purification, Principles and Practice, Róbert

Scopes, Springer-Verlag 1982;

Protein Purification, Principles, High Resolution

Methods and Applications, ed. J.-C. Janson and L.

Ryden, VCH publishers 1989.

A tisztaságot a számos rutinmódszer egyikével lehet meghatározni, például SDS poliakrilamidgél-elektroforézissel, analitikai HPLC-vel stb. A tisztított inhibitor használható arra, hogy meghatározzuk a fehérje aminosavsorrendjét, ami a szakterületen jártas szakember számára pusztán rutineljárás [Hewick R. M. et al.,

J. Bioi. Chem., 256, 7990-7997 (1981)].

A jelen találmány szerinti fehéqe alatt nem csak a megnevezett rovarfajból izolált fehéijét értjük, hanem minden más szervezetből izolálható fehéijét. Emellett a jelen találmány szerinti inhibitorok közé tartoznak a rokon szerkezetű inhibitorok is, például a más szervezetből izolált, lényegében hasonló aminosavszekvenciával rendelkező kollagénnel indukált vérlemezke-inhibitor is.

Mivel ezt a fehéijét egy harapó rovarból izoláljuk, és természetes haszna az, hogy megakadályozza, hogy a harapott sebet hosszabb ideig nehogy elzáqák a vérrögök, és ezzel befolyásolják a vértáplálék felvételét, ezért nagyon valószínű, hogy az ilyen kollagénindukált vérlemezkeaggregáció-gátlók megtalálhatók más vérszívó szervezetek nyálában is, különösen a rovarokéban, például a Triatominae alcsalád kúpos orrú Reduviid rovaraiban, úgymint a Triatoma infestans, a Triatoma dimidiata, a Triatoma maculata, a Rhodnius prolixus, a Panstrongylus megistus és a Panstrongylus infestans nyálában.

A jelen találmány szerinti fehérjék monomerek, egyláncú molekuláris formával rendelkeznek, azaz nem kötődnek kovalensen vagy nem kovalensen más polipeptidláncokhoz. A találmány vonatkozik a fehérje más molekuláris formáira is, azaz például a dimerekre vagy más oligomerekre, a más polipeptidekkel képzett tercier struktúrákra, a fehérje fragmentjeire stb. Mind a glikozilezett mind a nem glikozilezett formák idetartoznak, mindkét forma rutinszerűen előállítható például emlős- (glikozilezett) vagy bakteriális sejtekben (nem glikozilezett) expresszálva.

A jelen találmány szerinti inhibitor aminosav szekvenciája használható arra, hogy a megfelelő DNS-próbák szekvenciáját meghatározzuk, ami azután arra használható, hogy más inhibitorokat találjunk, például más

HU 218 830 Β fajokban. Az ilyen próbák rutinszerűen szintetizálhatok, például automatizált DNS-szintetizátorok alkalmazásával, és a genomiális vagy cDNS-könyvtárak átvizsgálása hasonlóképpen rutinmunka a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára. (Lásd a WO 90/07861 számú nemzetközi bejelentés publikációját, 1990. július 26.)

A találmány például a 12a.-c., 13a. és b., valamint a 22-24. ábrákon bemutatott DNS-szekvenciákra vonatkozik. A találmány emellett a fentiekben meghatározott muteineket kódoló DNS-szekvenciákra is vonatkozik. A 18., 21. és 24. ábrák -18-+5 régiójának szekvenciáját az 1-es és 2-es inhibitorok megfelelő teljes hosszúságú cDNS-szekvenciáiból következtetjük ki.

Ennek következtében a jelen találmány tárgyát képezi az a DNS-szekvencia, amely megfelel (kódolja) az inhibitornak mind a természetes DNS-szekvenciáját (gén), ha a természetes környezetből izoláljuk, például oldatban vagy egy vektoron, valamint ennek muteinjei, akár azok, amelyek a természetben fordulnak elő például más fajokban, izolált formában vagy szintetikusan, azaz helyspecifikus mutagenezissel előállítva. A különböző fajok genetikai könyvtárainak átvizsgálása egy alkalmas próbával a szakterületen ismert módszerekkel történik. A muteinek előállítását szolgáló módszerek szintén rutinmódszerek, és szokványosak a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakemberek számára csakúgy, mint azok a szűrővizsgálati módszerek, amelyekkel az ilyen új fehérjék hatékonyságát vizsgálják, például amelyeket az alábbiakban ismertetünk.

Az alkalmas muteinek, akár szintetikusak, akár a természetben előfordulók (izolált formában) azok, amelyek legalább egy részével, azaz legalább 5%-ával, előnyösen legalább 50%-ával, legelőnyösebben legalább 90%-ával rendelkeznek az alábbiakban ismertetett, izolált T. pallidipennis inhibitor biológiai aktivitásának.

Az alkalmas muteinek különböznek a természetes fehérjéktől bármely lehetséges módosításban, beleértve egy vagy több aminosav delécióját, addícióját és/vagy szubsztitúcióját, mindaddig, ameddig jelentős biológiai aktivitásuk marad; a biológiai aktivitás előnyösen nem változik. Az ilyen muteinek ekvivalensek a természetes fehérjékkel. Hasonlóképpen az alábbiakban ismertetett DNS-szekvenciák ekvivalensei közé tartoznak az allélikus variánsok, az ismertetett ekvivalens muteineket kódoló szekvenciák, és azok a DNS-szekvenciák, amelyek homológok velük.

A találmány tárgyát képezik továbbá a trombolitikus polipeptid fragmentjei, például amelyek hasonló funkciókkal vagy izolált alfunkciókkal rendelkeznek, ilyenek például az izolált epitopok, aktív helyek, fibrin és/vagy fibrinogén kötőhelyek stb. Az inhibitor egyláncú formái az előnyösek.

A találmány tárgyát képezik az antitestek és antitesttermelő sejtvonalak, különösen a monoklonális antitestek és sejtvonalak, amelyeket rutinszerűen készíthetünk a találmány szerinti tisztított fehérjék alkalmazásával, a konvencionális Köhler- és Milstein-módszer alkalmazásával, immunogénként a találmány szerinti erősen tisztított fehérjével szokványosán immunizált egereket alkalmazva. A találmány vonatkozik az említett antitestek ffagmentjeire, például azokra az antitestfragmentekre, amelyek az inhibitorfehérjén levő epitóphoz kötődő domént tartalmaznak, illetve szintetikus kötődoménekre, például minotópokra, amelyek specifikusan felismernek a jelen találmány szerinti fehéqéken található doméneket.

A kollagénnel indukált vérlemezke-aggregációja a humán (és más emlős-) vérlemezkéknek a jelen találmány szerinti inhibitora használható antiateroszklerotikus és antitrombotikus ágensként emlősökben, beleértve az embereket is, például ateroszklerotikus/trombotikus laesiók kezelésére, például az ateroszkleratikus plakkok felbomlása következtében, amelyek angioplasztikából származnak (PTA/PTCA), illetve amelyek az endotélium megzavarásából vagy eltávolításából származnak, például szepszisben vagy transzplantátumokban. Használható instabil angia kezelésére és/vagy újra összecsapzódás megelőzésére szívizominfarktus kezelése után. Az ilyen alkalmazások részletei, például a dózishatárok, az adagolás módjai (előnyösen orálisan vagy parenterálisan) stb. rutinszerűen meghatározhatók, például más antitrombotikus hatóanyagokkal, úgymint tPA-val, sztreptokinázzal vagy vérlemezkeaggregáció-inhibitorokkal, úgymint alloprost stb. való analógia és/vagy rutinszerű összehasonlítás alapján.

A jelen találmány szerinti inhibitor használható tumorsejtek metasztázisának megakadályozására azáltal, hogy blokkolja a kötőszöveten való áthaladásukat. Használható az összes invazív tumor, például a melanóma metasztázisának megelőzésére. Az elképzelésünk az alábbi, anélkül hogy ragaszkodnánk bármilyen elmélethez. A metasztázis során a tumorsejteknek át kell hatolniuk az alapmembránon és az intersticiális mátrixon. Mindkét mátrix gazdag a különböző kollagéntípusokban. A tumorsejtek szaporodásához ezekkel a sejtekkel való kölcsönhatásra van szükség. A kollagénreceptor (VLA2) szerepére ebben a kölcsönhatásban a bizonyítékot Chan és munkatársai közölték [Science, 2, 1600-1602 (1990)], akik klónozták a VLA2 pozitív tumorsejteket, amelyek lényegesen több metasztázisos tumortelepet hoztak létre. Kramer és Marks [J. Bio. Chem., 264, 4684-4688 (1989)] képesek voltak blokkolni a humán melanómasejtek kollagénhez való kapcsolódását egy VLA2-ellenes antitesttel. Lásd még PA US 73234708-A „Monoklonális antitest-vérlemezkék ellen - amely gátolja a vérlemezke reakcióját kollagénnel, és amelyet rák kimutatására, valamint kezelésére lehet használni”, US Dept. Health and Humán Services. A jelen találmány szerinti inhibitor kollagénreceptorantagonista lévén megelőzi a tumorsejtek kölcsönhatását a környező mátrixszal, és ezzel gátolja a metasztázist.

Használható emellett standardként az új inhibitorok hatékonyságának megállapítására, amelyek kifejleszthetők például a jelen inhibitor szerkezetének módosításával, standard mutagenezis, irányított mutagenezismódszerrel, például szekvenciák deléciójával és/vagy inszerciójával, fehéijemódosítással stb. A jelen találmány szerinti inhibitor használható standard antitrombotikum8

HU 218 830 Β ként olyan szűrővizsgálati eljárásokban, amelyek vizsgálják a különböző vegyületek antitrombotikus hatékonyságát, illetve standardként azoknak a vegyületeknek a hatékonyságának a meghatározásiban, amelyek blokkolják az ilyen kollagénnel indukált vérlemezkeaggregációt, például véralvadási deficienciában szenvedő betegekben.

További részletezés nélkül az a véleményünk, hogy a szakterületen jártas szakember az előző leírás alapján képes a jelen találmányt teljes mértékben alkalmazni. Az alábbi előnyös megvalósítási módokat ennek következtében csak kizárólag illusztrációként adjuk meg, és nem szánjuk a leírás semmilyen formájú korlátozására.

A találmány különböző tárgyai, tulajdonságai, előnyei sokkal világosabbak, jobban érthetők lesznek, ha a mellékelt ábrákkal együtt szemléljük őket, amelyekben referenciaként karakterek ugyanazt vagy a hasonló részt jelölik számos részben. Az ábrákat az alábbiakban ismertetjük:

Az 1. ábrán a humán vérlemezke-aggregáció dózisfüggő gátlását láthatjuk a Triatoma nyálával;

A 2. ábrán a humán vérlemezke-aggregáció dózisfüggő gátlását láthatjuk a Triatoma-nyál „Superose” pooljával;

A 3. ábrán a „Superose 12” gélszűrési mintázatát láthatjuk;

A 4. ábrán az aggregáció gátlásának a fibrinogén koncentrációtól való függését láthatjuk;

Az 5. ábrán az aszpirinnel előkezelt vérlemezkék kollagénindukált aggregációjának megelőzését látjuk;

A 6. ábrán azt látjuk, hogy nincs reakció kollagénnel;

A 7. ábrán az inhibitor proteolitikus emésztését láthatjuk;

A 8. ábrán az inhibitor kollagénnel szembeni stabilitását látjuk;

A 9. ábrán az inhibitor molekulasúlyának meghatározása látható;

A 10. ábrán az inhibitor homogenitásig való tisztítása látható;

All. ábrán a PCR-termékek mérete látható;

A 12a. ábrán a szubklónozott 1-es típusú PCR-termék DNS-szekvenciája látható, valamint az abból kikövetkeztetett aminosavszekvencia;

A 12b. ábrán a szubklónozott 2-es típusú PCR-termék DNS-szekvenciája látható, valamint az abból kikövetkeztetett aminosavszekvencia;

A 12c. ábrán a szubklónozott 3-as típusú PCR-termék DNS-szekvenciája látható, valamint az abból kikövetkeztetett aminosavszekvencia;

A 13a. ábrán a klónozott 1-es inhibitor cDNS-ének DNS-szekvenciája látható, valamint a megfelelő aminosavszekvencia;

A 13b. ábrán a klónozott 2-es inhibitor cDNS-ének DNS-szekvenciája látható, valamint a megfelelő aminosavszekvencia;

A 14. ábrán az inhibitort kódoló DNS-t tartalmazó expressziős plazmid látható;

A 15. ábrán az érett rekombináns fehérje molekulasúlya látható, olyan antitestekkel kimutatva, amelyek specifikusan felismerik az érett fehérjét;

A 16. ábrán az 1-es inhibitor érett fehérjeszekvenciája látható;

A 17. ábrán a 2-es inhibitor érett fehérjeszekvenciája látható;

A 18. ábrán a 3-as inhibitor érett fehérjeszekvenciája látható;

A 19. ábrán az 1-es inhibitor érett fehérjét kódoló DNS-kódoló szekvencia látható;

A 20. ábrán a 2-es inhibitor érett fehérjét kódoló DNS-kódoló szekvencia látható;

A 21. ábrán a 3-as inhibitor érett fehérjét kódoló DNS-kódoló szekvencia látható;

A 22. ábrán az 1-es inhibitor preproteint kódoló DNS-szekvencia látható;

A 23. ábrán a 2-es inhibitor preproteint kódoló DNS-szekvencia látható;

A 24. ábrán a 3-as inhibitor preproteint kódoló DNS-szekvencia látható;

A 25. ábrán a találmány szerinti cDNS megtalálásának folyamatábrája látható, és

A 26. ábrán a találmány szerinti fehérje SEQ ID No. 1-ben bemutatott szekvenciájának N-terminális aminosavai láthatók.

Az alábbiakban közöljük a szekvenciák listáját.

Az 1-es szekvencia az 1-es inhibitor érett fehéijeszekvenciáját tartalmazza;

A 2-es szekvencia a 2-es inhibitor érett fehéqeszekvenciáját tartalmazza;

A 3-as szekvencia a 3-as inhibitor érett fehérjeszekvenciáját tartalmazza;

A 4-es szekvencia az 1-es inhibitor érett fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza;

Az 5-ös szekvencia a 2-es inhibitor érett fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza;

A 6-os szekvencia a 3-as inhibitor érett fehérjét kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza;

A 7-es szekvencia az 1-es inhibitor preproteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza;

A 8-as szekvencia a 2-es inhibitor preproteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza;

A 9-es szekvencia az 3-as inhibitor preproteint kódoló DNS-szekvenciát tartalmazza;

A 10-es szekvencia az érett fehérje N-terminális aminosavait tartalmazza.

Az alábbi példákban minden hőmérsékletet Celsiusfokban adunk meg, korrekció nélkül, és ha külön nem jelezzük, akkor minden részt és százalékot súlyra adunk meg. Minden eddig és ezután idézett találmányt és publikációt referenciának tekintünk.

1. példa: A találmány szerinti fehérje aktivitása

A humán vérlemezkék kollagén jelenlétében képződő aggregátumainak képződése gátlódik, ha a Triatoma pallidipennis nyálát vagy a tisztított fehérjét adjuk a rendszerhez. A gátlás korrelációban van a nyál vagy a fehérje koncentrációjával.

A rovarokat arra serkentjük, hogy nyálukat egy szilikonozott üveglemezre lövelljék ki, a proboszcisz mechanikai ingerlésével. A kilövellt anyagot kihúzott szilikonozott Pasteur-pipettával gyűjtjük össze. 500 pl vérlemez9

HU 218 830 Β kében gazdag plazmát (300 000 vérlemezke/μΐ) inkubálunk különböző mennyiségű nyállal (1,25-20 pg fehérje 20 μΐ-ben), vagy különböző mennyiségű „Superose” poollal (0,5-10 pg fehérje 200 pl-ben) a 2. példából 37 °C-on egy aggregométerben. 1 perc elteltével 1 pg kollagént adunk hozzá, majd a fényáteresztés növekedését (aggregáció) figyeljük. Lásd az 1. és 2. ábrát.

2. példa: A fehérje tisztítása

A fehérje tisztításának fontos lépése a gélszűrés alkalmazása, „Superose 12” felhasználásával. 2 ml (5 mg fehérje) nyálat kromatografálunk egy „Superose 12” HR 16/50 kromatográfiás oszlopon (Pharmacia) 10 mmol/1 Tris-HCl pH 7,4; 0,0001% „Pluronic F68” összetételű pufferrel. Ezután az inhibitort 10 mmol/1 Tris-HCl pH 7,4, 0,0001% „Pluronic F68”, 200 mmol/1 NaCl összetételű pufferrel eluáljuk. Lásd 3. ábra. Az inhibitor pool 25 pg fehérjét tartalmaz. 5 pg fehéije az aggregációt 70%-ban gátolja. A vérlemezkék inhibitor nélküli aggregációját tekintjük 100%-os aggregációnak és 0%-os gátlásnak. A többi adatot ennek megfelelően számítjuk.

3. példa: A gátlás független a fibrinogéntöl

A találmány szerinti fehéije által mutatott gátlóaktivitás független a hozzáadott frbrinogén koncentrációjától. 500 pl gélszűrt vérlemezkét kombinálunk fibrinogénnel és 50 pg nyállal. 1 percig inkubáljuk 37 °C-on, majd 1 pg kollagént adunk hozzá, és figyeljük az aggregációt. A 2-es és 4-es oszlopok által képviselt értékek (nyállal) nem mutatnak lényeges eltérést, míg az 1-es és 3-as oszlopok által képviselt értékek (nyál nélkül) korrelációt mutatnak a hozzáadott fibrinogén koncentrációjától. Lásd 4. ábra.

4. példa: A találmány szerinti fehérjék által indukált vérlemezke-aggregáció mechanizmusának kimutatása

A találmány szerinti fehérje mechanizmusának tanulmányozására néhány standard vegyületet adunk a tesztrendszerhez, amelyben váltakozva a találmány szerinti fehéije vagy puffer van. A találmány szerinti fehéije aktivitása lényegesen nem változik, ha aszpirint adunk hozzá (4-es oszlop). Emellett az U46619 és a PM A-vegyületek hatása nem befolyásolható a találmány szerinti fehérjével. Ennek következtében a találmány szerinti fehérje nem tromboxánantagonista, és valószínűleg nem inhibitora a protein-kináz C-nek.

1-es és 2-es oszlopok: 500 pl vérlemezkében gazdag plazmát (300 000 vérlemezke/pl) inkubálunk a találmány szerinti fehérjével (2-es oszlop) (200 pl „Superose”-pool) vagy pufferrel (1-es oszlop), 1 percig 37 °C-on. Ezután 1 pg kollagént adunk hozzá, majd az aggregációt egy aggregométerrel mérjük.

3-as és 4-es oszlopok: 500 pl vérlemezkében gazdag plazmát inkubálunk 1 mmol aszpirinnel 20 percig szobahőmérsékleten. Ezután a találmány szerinti fehérjét (4-es oszlop) vagy puffért (3-as oszlop) adunk hozzá. 1 percig inkubáljuk 37 °C-on, majd 1 pg kollagént adunk hozzá, és követjük az aggregációt.

5-ös és 6-os oszlop: 500 pl vérlemezkében gazdag plazmát inkubálunk a találmány szerinti fehérjével (6-os oszlop) vagy pufferrel (5-ös oszlop), 1 percig 37 °C-on. Ezután 1 pmol U46619-et adunk hozzá, és követjük az aggregációt.

7-es és 8-as oszlopok: 500 pl vérlemezkében gazdag plazmát inkubálunk a találmány szerinti fehérjével (8-as oszlop) vagy pufferrel (7-es oszlop), 37 °C-on egy aggregométerben. 1 perc elteltével 10 ng PMA-t (forbol-12-mirisztát-13-acetát) adunk hozzá, és követjük az aggregációt.

Az eredményeket az 5. ábrán mutatjuk be.

5. példa: Vérlemezke-release reakció (ATP-mérés)

Ha vérlemezke és kollagén van jelen, akkor a találmány szerinti fehérje képes gátolni a vérlemezkék aktiválását. Az ATP-t használjuk az aktiválás indikátoraként. 500 pl vérlemezkében gazdag plazmát inkubálunk 200 pl, a találmány szerinti fehérjével (Superose pool), illetve vízzel 1 percig 37 °C-on. Ezután 1 pg kollagént adunk hozzá. Az aggregációt 10 percig követjük. Ezután 200 pl szuszpenziót kombinálunk 250 pl HEPES pufferrel (pH 7,4), 100 mmol/1 luciferinnel és 5 pg/ml luciferázzal. Ezután mérjük a lumineszcenciát.

A vérlemezkék össz-ATP tartalmát a vérlemezkék „Nonidet P40”-nel való lízise után határozzuk meg.

A hozzáadott találmány szerinti fehérje mennyisége	Maximális aggregáció	Felszabadult ATP az össz-ATP-tartalom százaléka
-	68%	49%
15 pl (=5 pg fehérje)	49%	15%
30 pl (= 10 pg fehérje)	18%	2%

6. példa: A vérlemezke-aggregáció gátlása különböző anyagokkal

A találmány szerinti fehérje a kollagénnel indukált vérlemezke-aggregációra specifikus. 500 pl szűrt vérlemezkét (300 000 vérlemezke/pl) inkubálunk a találmány szerinti fehérjével 1 percig 37 °C-on. Ezután indukáljuk az aggregációt kollagénnel (2 pg/ml), trombinnal (0,06 U/ml) vagy ADP-vel (1χ10~^{4 5} mol/1), majd követjük az aggregációt.

	Maximális aggregáció
kollagén	trombin	ADP
Kontroll	64%	75%	57%
Részlegesen tisztított fehéije (200 pl) „Superose”-pool	23%	75%	44%

7. példa: A kollagénnel indukált aggregáció gátlása

A találmány szerinti fehérje nem reagál kollagénnel. A kollagénindukált vérlemezke-aggregáció gátlása a fehérje jelenlétében semlegesíthető fölöslegben hozzáadott kollagénnel. 500 pl vérlemezkében gazdag plaz10

HU 218 830 Β makollagénnel (2 pg/ml) indukált aggregációját az alábbi módosításokkal mérjük:

1: kontroll, inhibitor nélkül;

2: a találmány szerinti fehérjét (100 pg nyál) 10 percig előinkubáljuk humán vérlemezkékkel a kollagén hozzáadása előtt;

3: az inhibitort (100 pg nyál) előinkubáljuk kollagénnel, mielőtt vérlemezkében gazdag plazmát adunk hozzá;

4, 5, 6: az aggregáció mérése után 2,5 és 10 pg kollagént adunk a 2. számú próbához, és ismét mérjük az aggregációt. Lásd 6. ábra.

8. példa: Aproteázinhibitorok hatása a gátlóaktivitásra

A találmány szerinti fehérje nem proteáz. Proteázinhibitorokat (2 mmol/1 PMSF, 2 mmol/1 leupeptin, 2 mmol/1 aprotinin) vagy puffért inkubálunk 15 percig a „Superose”-poollal (200 pl). A vérlemezkében gazdag plazmát hozzáadjuk, majd az aggregációt kollagénnel kezdjük (2 pg/ml).

	Maximális aggregáció
Kontroll (a találmány szerinti fehérje nélkül)	86%
+„Superose”-pool	52%
+„Superose”-pool+proteáz inhibitorok	48%

9. példa: A gátlás a Mg²⁺jelenlététől függ A Mg²+-kation fokozza a vérlemezke-aggregációnak a találmány szerinti vegyület által okozott gátlását. De a Ca²⁺-kationnak nincs jelentős hatása a vérlemezke-aggregáció gátlására. 500 pl vérlemezkében gazdag plazmát kombinálunk 2 mmol/1 Mg²⁺- vagy Ca²⁺-ionokkal, valamint 40 pg nyállal vagy pufferrel. 1 percig inkubáljuk 37 °C-on, majd 1 pg kollagént adunk hozzá, és figyeljük az aggregációt.

Adalékok	Maximális aggregáció
-	77%
Nyál	33%
2 mmol/1 Mg2+	75%
Nyál+2 mmol/1 Mg2+	19%
2 mmol/1 Ca2+	63%
Nyál+2 mmol/1 Ca2+	39%

10. példa: A találmány szerinti fehérjével inkubált vérlemezkék kevésbé tapadnak a kollagénhez

Amikor a vérlemezkéket inkubáljuk a találmány szerinti fehérjével, akkor azok részlegesen elvesztik azt a képességüket, hogy a kollagénhez kötődnek. Egy 96 lukas lemezt kollagénnel borítunk (1-es típus, 4 °C, éjszakán át). Lukanként 1 χ 10⁷ vérlemezkét inkubálunk különböző mennyiségű inhibitotorral és 2 mmol/1 Mg²⁺ -ionnal 20 percig 37 °C-on, kevertetés közben. Ezeket PBS-sel mossuk, majd a megtapadt vérlemezkéket rögzítjük 2,5% glutárdialdehiddel 2 óra hosszat 37 °C-on.

A vérlemezkéket ezután eltávolítjuk a lukakból, és mikroszkóp alatt megszámláljuk őket.

Fehérje*	Tapadó vérlemezkék per mm2
-	13 500
10 pl	12 000
50 pl	6 500

*fehérje: „Superose”-pool 0,5 mg fehcrjc/ml-re töményítve

11. példa: Az inhibitor inkubálása tripszin-Sepharose-zal

A találmány szerinti fehérjét Sepharose-hoz kötött tripszinnel emésztjük. A találmány szerinti fehérje emésztésének eredménye az, hogy a találmány szerinti fehérje aktivitása teljesen elvész. 200 pg nyálat kombinálunk Sepharose-hoz kötött tripszinnel vagy pufferrel, vagy Sepharose-zal, és a tripszin-Sepharose-t pufferrel kombináljuk. Mindegyik sarzs 150 mmol/1 NaCl-t tartalmaz, hogy ezzel megelőzzük a mátrixhoz való aspecifrkus adszorpciót. Éjszakán át inkubáljuk kevertetés közben szobahőmérsékleten, majd a sarasokat centrifugáljuk, és a felülúszókat egy aggregációs esszéhez adjuk hozzá (500 pl vérlemezkében gazdag plazma, 1 pg kollagén). A proteolitikus emésztést egy SDS-poliakrilamid-gélen követjük. Lásd 7. ábra.

12. példa: Az inhibitor gátlása kollagenáz-Sepharose-za!

A találmány szerinti fehérje nem hasítható kollagenázzal. Kollagenázt (Clostridium histolyticum) kötünk Sepharose-hoz, és az alábbi sarasokban használjuk:

1. 100 pl kollagenáz-Sepharose+60 pl találmány szerinti fehérje+140 pl víz+10 pl puffer.

2.100 pl 150 mmol/1 NaCl, 50 mmol/1 Tris-HCl pH 7,4+60 pl találmány szerinti fehérje+140 pl víz+10 pl puffer.

3. 100 pl kollagenáz-Sepharose+200 pl víz+10 pl puffer. Kontrollként szarvasmarha-szérumalbumint kötünk Sepharose-hoz, és az alábbi sarasokban használjuk:

4. 100 pl BSA-Sepharose+60 pl találmány szerinti fehérje+140 pl víz+10 pl puffer.

5.100 pl BSA-Sepharose+200 pl víz+10 pl puffer. Fehérje: „Superose”-pool

Puffer: 140 mmol/1 Tris-HCl pH 7,4, 100 mmol/1 CaCl₂

A szárasokat centrifugáljuk, majd az egyes felülúszókból 200 pl-t inkubálunk 500 pl vérlemezkében gazdag plazmával 1 percig 37 °C-on. Ezután 1 pg kollagént adunk hozzá, és az aggregációt követjük. A kollagenáz-Sepharose aktivitását úgy követjük, hogy kollagénnel inkubáljuk, majd SDS-poliakrilamid-gélen futtatjuk. Lásd 8. ábra.

13. példa: Az inhibitor molekulasúlyának meghatározása gélszűréssel

A találmány szerinti fehérje molekulasúlya 20 000+5000 dalton, Superose 12 oszlopszűréssel mérve. 2 ml nyálból származó „Superose”-poolt (lásd 2. pél11

HU 218 830 Β da) „Superose 12” HR16/50 oszlopon kromatografáljuk Tris-HCl pH 7,4, 150 mmol/1 NaCl, 0,0001 „Pluronic”

F68 összetételű pufferrel. Szarvasmarha-szérumalbumint (molekulasúly 67 kDa), kimotripszinogént (molekulasúly 25 kDa), ribonukleázt (molekulasúly 14 kDa) használunk molekulasúly-markerekként. Lásd 9. példa.

14. példa: A tumorsejtek kollagénhez való tapadását csökkenti a találmány szerinti fehérje jelenléte

A találmány szerinti fehérje gátolja a tumorsejtek ta- 10 padását egy kollagénmátrixhoz. Ennélfogva a tumorsejtek migrációja részlegesen vagy teljesen megelőzhető. Megelőzhető az, hogy a szervekben vagy a vérerekben megtelepedjenek, ha a találmány szerinti fehérje a beteg vérében vagy plazmájában van. MTLn3 sejteket (pat- 15 kányemlőtumor-sejteket) ⁵¹Cr-rel jelzünk. Egy lukas lemezt kollagénnel borítunk (III-as típusú) 4 °C-on, éjszakán át. 2 x1ο⁴ jelzett sejtet 500 μΐ DMEM F12 táptalaj, mmol/1 HEPES, 1 mmol/1 bikarbónát, 1% BSA összetételű oldatban inkubálunk először 0,2,5 vagy 10 μΐ talál- 20 mány szerinti fehérjével („Superose-pool”, 0,5 mg fehérje/ml), 10 percig, 37 °C-on. Azután ezt a szuszpenziót egy kollagénnel borított lukba visszük át, és 2 óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Ezután a lukakat mossuk, és a megtapadt sejteket 1 mol/1 NaOH-dal eltávolítjuk. A megta- 25 padt sejtek radioaktivitását megszámláljuk.

A hozzáadott inhibitor mennyisége μΐ	Sejttapadás (cPm)
0	2215
2	2071
5	1608
10	1081

15. példa: Az inhibitor homogenitásig való tisztítása

A 2. példa alapján izolált találmány szerinti fehérjét homogenitásig tisztítjuk nagy teljesítményű elektroforézis kromatográfiás rendszerrel

A részlegesen tisztított inhibitort egy nagy teljesítményű elektroforézis kromatográfiás rendszerre (HPEC, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) visszük fel. Az elektroforézist egy 7,5%-os poliakrilamidgélen vé5 gezzük Triszglicinpuffer-rendszerben, a gyártó előírásai szerint. A mintafelvivő puffer tartalmaz SDS-t, de nem tartalmaz redukálószert, például DTT-t, és az aliquot részt nem forraljuk fel, mielőtt felvisszük a gélre. A fehérjét ezt követően eluáljuk a gélből, a 230 nm-en mért abszorpció alapján detektáljuk, majd frakcionáljuk. A gátló hatással rendelkező frakciókat SDS-poliakrilamidgél-elektroforézissel elemezzük (12,5-os SDS-poliakrilamid-gél, Coomassie Brilliant Blue-val festve). Lásd 10. ábra.

16. példa: Aminosavelemzés

A fehérjemintákat szárazra pároljuk, majd 6 mol/1 sósavban hidrolizáljuk, amely 2% fenolt tartalmaz, 24, 48 és 72 óra hosszat. A ciszteintartalmat perhangyasavas oxidáció után ciszteinsavként mérjük [Moore, J. Bioi. Chem., 238, 235-27 (1963)]. A triptofánt 4 mol/1 N-metánszulfonsavas hidrolízis után mérjük [Simpson et al., J. Bioi. Chem., 251, 1936-1940 (1970)]. A mintákat azután egy aminosavanalizátorral elemezzük. Az elemzés az alábbi eredményeket mutatja (az összes aminosav %-ban kifejezve) Gly = 8,3%; Ala=l,6%; Ser = 8,9%; Thr=10,7%, Val = 8,7%; Leu = 6,6%; Ile=2,5%; Pro=4,5%; Cys = 3,0%; Met=l,0%; His = 2,3%; Tyr=4,3%; Asp = 6,2%; Glu=7,2%; Lys = ll,0%; Arg=l,8%; Asn=5,7%; Gln=2,3%; Phe=2,5% és Trp=l,l%.

17. példa: Az aminosavszekvencia meghatározása

A fehérje aminosavszekvenciáját egy Applied Bio35 systems, Inc., (ABI) (Foster City, CA) automatikus aminosavszekvenátorral határozzuk meg, a gyártó előírásai szerint. Az 1-20 aminosav szekvenciája (az N-terminálisról) az alábbi:

Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu 1 5 10 15

Lys Tyr Phe Ser Ile 20

18. példa: A Triatomapallidipennis nyálmirigy cDNS-ből származó inhibitor cDNS három formája fő fragmentjeinek PCR-amplifikálása, szubklónozása és a DNS-szekvencia meghatározása

1. rész: A Triatoma pallidipennis nyálmirigy RNS- 50 izolálása és a cDNS első szálának szintézise

A nyálmirigyekből származó tisztított össz-RNSből kiindulva, az RNS szekvenciáját reverz transzkriptázzal átírjuk, így kapjuk az első cDNS-láncot. Egy speciális oligonukleotidot használunk az első cDNS-szál 55 szintézisének indítására. A Triatoma pallidipennis nyálmirigyéből össz-RNS-t izolálunk egy olyan eljárással, amely magában foglalja a szövet feloldását guanidiumtiocianátban, majd ezt követően a lizátumot céziumklorid-pámán ultracentrifugáljuk [Maniatis et al., Mole- 60 cular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. Az így kapott 10 pg nyálmirigyössz-RNS-t használjuk arra, hogy a kiegészítő DNS (cDNS) első szálát megszintetizáljuk. Erre a célra Moloney rágcsáló leukémiavírus reverz transzkriptázt, a megfelelő reakciópuffert, dezoxinukleotidokat és RN-áz blokk ΙΙ-t használunk egy kereskedelmi forgalomban levő „lst Strand Synthesis Kit”-ből (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA, USA), a gyártó által megadott leírás alapján. Az illesztési lépésben használt oligonukleotid, amelyet az első cDNS-szál szintézisének indítómolekulájaként használunk, nem azonos azzal, amelyet a „lst Strand Synthesis Kit”-ben találunk, hanem egy linkerindító molekula (bevitel: 1,4 pg), amelyet a kereskedelmi forgalomban levő „ZAP12

HU 218 830 Β cDNS™ Synthesis Kit”-ből veszünk (Stratagene Cloning Systems). Szekvenciája az alábbi (egy Xhol restrikciós endonukleázfelismerési hely alá van hozva, lásd a 25. ábra összefoglalóját is).

’ -GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGittTiI ! ΓΡ-3 ’ Xhol

2. rész: Az inhibitor cDNS-fragmentek PCR-amplifikálása a nyálmirigy első cDNS-száláról

Az aminosavszekvencia alapján, amit a találmány szerinti tisztított fehéije Edman-degradációjával határozunk meg, három oligodezoxinukleotidot és egy linkeroligodezoxinukleotidot tervezünk és szintetizálunk. A tisztított inhibitor N-terminálisának kiválasztott szakaszai aminosavszekvenciája alapján (17. példa), három degenerált oligodezoxinukleotidot tervezünk és szintetizálunk az inhibitor cDNS egy nagyobb részének amplifikálásához. A szekvenciák szerkezete az alábbi („I” jelentése dezoxiinozin, ha két betűt látunk zárójel10 ben per jellel elválasztva, akkor az egy olyan pozíciót jelent, ahova két különböző dezoxinukleotidot építettünk be, a megfelelő aminosavszekvenciát hárombetűs kóddal jelezzük a dezoxinukleotidszekvencia alatt, egy Sphl restrikciós endonukleázfelismerési szekvenciát aláhúztunk):

#1 oligodezoxinukleotid:

5’-GCGCGC ATG CCI CCI GGI GA(C/T) AA(C/T) TT(C/T) GA-3’

Sphl

Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp #2 oligodezoxinukleotid:

5’-AAC TTT GA(C/T) (C/T)TI GA(G/A) AA(G/A) TA(C/T) TT-3’

Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe #3 oligodezoxinukleotid:

5’-ATG CCI CCI GGI GA(C/T) AA(C/T) TTT GA(C/T) (C/T)TI GAG AAG Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys

TA)C/T) TT-3’

Tyr Phe

Az oligodezoxinukleotidok az Edman-degradáció- 30 val meghatározott aminosavszekvencia különböző átlapolórészeinek felelnek meg. A #3 oligodezoxinukleotid tartalmazza a #1 oligodezoxinukleotidot az elején és az #2 oligodezoxinukleotidot a végén.

Egy további oligodezoxinukleotidot is előállítót- 35 tünk, amelynek szekvenciája az első cDNS-szál szintéziséhez használt linkerindító molekulából származik (lásd 1. rész):

#4 oligodezoxinukleotid:

5’-GAGAGAGAGAAACTAGTCTCGAG-3’ 40 Xhol

Egy Applied Biosystems PCR-Mate™ 391 DNSszintetizátorral végzett szintézis után a négy oligodezoxinukleotidot gélszűréssel tisztítjuk egy kereskedelmi forgalomban levő NAP-5 oszlopon (Pharmacia Biosys- 45 tems), és indítómolekulaként használjuk őket három különböző polimeráz láncreakcióban (PCR; 4 800 159 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés), az alábbiak szerint. A kereskedelmi forgalomban levő „GeneAmp™ DNA Amplification Kit”-et AmpliTaq™ rekombináns Taq DNS-polimerázzal használjuk (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA), a gyártó előírásai szerint. A Triatoma nyálmirigy össz-RNS alapján szintetizált első cDNS (lásd 1. rész) 5%-át (2,5 μΐ) használjuk templátként mind a három PCR-reak- 55 cióban. Az oligodezoxinukleotid indítómolekulákat az alábbiak szerint kombináljuk: a #1 és #4 oligodezoxinukleotidot a #1 PCR-reakcióban, a #2 és #4 oligodezoxinukleotidot a #2 PCR-reakcióban, a #3 és #4 oligodezoxinukleotidot a #3 PCR-reakcióban. A három PCR-reak- 60 ciót egy Perkin-Elmer Cetus Thermal DNA Cyclerben inkubáljuk, az alábbi hőmérsékletprogram szerint, 38 ciklusban, a #l-től a #3 lépéseket ciklusosán ismételve: *kiindulási lépés: 3 perc 94 °C *ciklusprogram:

*#1 cikluslépés: 1 perc 30 másodperc 94 °C-on *#2 cikluslépés: 2 perc 40 °C-on *#3 cikluslépés: 3 perc 72 °C-on (Az #l-#3 cikluslépéseket 38-szor megismételjük.) *végső lépés: 10 perc 72 °C-on.

A reakcióelegy 5%-át (5 μΐ) elektroforézissel elválasztjuk egy 1,5%-os agarózgélen egy 123 bázispáros létra DNS-méretstandardot használva (Gibco-BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA). Miután a gélt etídium-bromiddal megfestettük, mindegyik PCR-reakcióban egyetlen DNS-csíkot láthatunk, és látszólagos méretük a DNS-méretstandard alapján 530-560 bázispár között van (11. ábra, balról jobbra: 123 bázispáros létra, #1, #2 és #3 PCR-reakciók).

3. rész: Az inhibitor cDNS-fragmentek szubklóno50 zása és szekvenálása

A #1 PCR-reakció megmaradt reakcióelegyében levő DNS-ffagmentet (lásd 2.) 1,5%-os agarózgélen végzett elektroforézis után izoláljuk egy olyan eljárás szerint, hogy a DNS-t hozzákötjük, majd leoldjuk NA45DEAE membránról (Schleicher & Schüll, D-3354, Dassel, Németország), majd N-butanollal extraháljuk és etanollal kicsapjuk [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]. A kinyert DNS-ffagment végeit alkalmassá tesszük egy vektorba való ligáláshoz,

HU 218 830 Β oly módon hogy az Sphl és Xhol restrikciós enzimekkel (Boehringer Mannheim GmbH, D-6800 Mannheim, Németország) emésztjük, majd kétszer extraháljuk fenol-kloroform 1:1 arányú elegyével, ezután kétszer extraháljuk kloroformmal. A pGEM^R-5Zf(-) plazmidvektorból (Promega, Madison, WI, USA) 3 pg-ot linearizálunk kettős emésztéssel, az Sphl és a Sáli restrikciós enzimek felhasználásával (Boehringer Mannheim GmbH), majd elválasztjuk és izoláljuk egy 1,5%os agarózgélen az előzőkben leírtak szerint. Az emésztett és extrahált amplifikált DNS 50%-át, valamint az emésztett és gélen tisztított vektor-DNS 20%-át elegyítjük, etanollal kicsapjuk, majd Egáljuk a kereskedelmi forgalomban levő „DNA Ligation Kit” (Stratagene Cloning Systems) reagensei és leírása alapján. A teljes ligálási reakcióelegyet használjuk a kereskedelmi forgalomban levő „Epicurian Coli ^RXL1-Blue Supercompetent Cells” (Stratagene Cloning Systems) transzformálásával, a gyártó előírásai szerint. A teljes transzformálási reakcióelegyet 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB agarlemezre szélesztjük. Az inkubálás után talált ampicillinrezisztens Escherichia coli kiónok közül húszat 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB táptalajban szaporítunk, majd a plazmidjaikat az alkalikus lízis „miniprep” módszerével izoláljuk [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)]. A 20 klónból származó plazmid-DNS-ek Sphl és SacI restrikciós enzimmekkel (Boehringer Mannheim GmbH) végzett kettős emésztése és 1,5%-os agarózgélen végzett elektroforézise után 13-ról kiderült, hogy egy körülbelül 580 bp méretű DNS-szakaszt hordoz („pozitív kiónok”). A DNS-szekvenálást a pozitív kiónok közül öt fenol/kloroformmal extrahált plazmidjának szekvenciáját meghatározzuk, a kereskedelmi forgalomban levő „Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit” (United States Biochemical Corporation, Cleveland, OH USA) felhasználásával, mind T7, mind SP6 indítómolekulák (Promega) felhasználásával. A különböző plazmidokban levő inszertek komplett szekvenciáját meghatározzuk ily módon. Mind az öt inszertszekvenciában egy nyitott leolvasási keret azonosítható. Háromfajta inszertszekvencia található a nyitott leolvasási keretből következő aminosavszekvencia alapján, a szekvenált plazmidklónok közül három tartozik az egyik fajtába, és egy-egy tartozik a

2-es, illetve 3-as fajtába.

Az 1-3-as típusú plazmidok egy-egy képviselőjében levő komplett DNS-inszertszekvenciát a 12. ábrán mutatjuk be, a nyitott leolvasási keret szekvenciájából következő aminosavszekvenciával együtt. Az egyes különböző típusú plazmidinszertekből származó aminosavszekvenciákban az első 15 aminosav szekvenciája azonos azzal, amit a Triatoma-nyálból izolált inhibitor N-terminálisának 6-20. aminosavpozíciója között találtunk (17. példa).

19. példa: Egy vérlemezkeaggregáció-inhibitort kódoló gén lokalizálása, izolálása és klónozása

A T. pallidipennis DNS-retrikciós endonukleázos emésztésével kapott, klónozott restrikciós fragmenteket tartalmazó genomiális könyvtárat vizsgálunk át a próbákkal, replikafiltereken, a szokásos módszerek alkalmazásával. Azokat a kiónokat választjuk ki, amelyek hibridizálnak a próbával. Az ezekből a kiónokból származó DNS-inszertet azután szubklónozzuk, standard módszerek alkalmazásával, egészen addig, amíg azt a minimális méretű DNS-t megkapjuk, amely kötődik a próbához.

Ezeknek a fragmenteknek meghatározzuk a szekvenciáját, majd megfelelő eukarióta expressziós vektorba visszük át oly módon, hogy a kódoló régiót az expresszióhoz szükséges összes elemet, azaz egy promoterszekvenciát, egy terminátorszekvenciát és egy replikációs origót tartalmazó expressziós vektorba visszük, amely elemek működés szempontjából mind hozzá vannak kötve a PAI génhez (PAI=vérlemezkeaggregációinhibitor). Az expressziós vektor tartalmaz még egy szelekciós markert is az így keletkező vektor szelektálásához. Az expressziós vektort azután abba az eukariótagazdaszervezetbe transzformáljuk, amelyre terveztük, majd a PAI expressziós terméket izoláljuk.

20. példa: A vérlemezkeaggregáció-inhibitort (PAI) kódoló gén szekvenciájának meghatározása

Egyszálú és kétszálú DNS-szekvenálást végzünk a Sanger és munkatársai által leirt didezoxinukleotid láncterminációs módszer alkalmazásával [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 - 5467 (1977)].

21. példa: Genomiális könyvtárak és mutáns klánok átvizsgálása a T. pallidipennis szekvenciával rokon új szekvenciák keresése céljából

Csakúgy mint az előzőkben, a T. pallidipennisből izolált inhibitor aminosavszekvenciájából származó próbákkal vizsgálunk át más genomiális könyvtárakat, a jelen inhibitorral rokon szekvenciák keresése céljából. Hasonlóképpen a mutáns inhibitorokat tartalmazó könyvtárakat, amelyeket a T. pallidipennis gént hordozó vektor rutinszerű mutagenezisével állítunk elő (MNNG kezelés, illetve helyspecifikus mutagenezis), átvizsgáljuk az aktivitás szempontjából.

22. példa: A találmány szerinti fehérje két izoformját kódoló komplett cDNS-klónok izolálása, jellemzése és szekvenálása

a) Általános megközelítés

A T. pallidipennisből extrahált poliA(+) RNS-ből származó cDNS-könyvtárat vizsgálunk át a 18. példában szereplő próbával replikafiltereken, standard módszerek alkalmazásával. A pozitív kiónokat külön kiszélesztéssel, valamint a tarfolt-hibridizálás megismétlésével tisztítjuk. A leghosszabb cDNS-klón cDNS-ének szekvenciáját határozzuk meg a Sanger-féle didezoxinukleotidszekvenálási módszerrel.

b) A vizsgálatok konkrét leírása

1. rész: cDNS-könyvtár készítése Triatoma pallidipennis nyálmirigy RNS-ből

A Triatoma pallidipennis-nyálmirigyekből a 18. példa 1. része alapján izolált körülbelül 500 pg össz-RNS-t használjuk poliA⁺ mRNS-izolálására oligo(dT)-celluló14

HU 218 830 Β zon végzett kettősaffinitás-kromatográfiával. Erre a célra egy kereskedelmi forgalomban levő „mRNA purification Kit”-et (Pharmacia Biosystems GmbH, W-7800 Freiburg, Németország) használunk két egymást követő dúsítási lépésben, a gyártó előírásait követve. A második tisztítási lépés után a kitermelés 13 pg poliA+ mRNS. Ebből a készítményből 5 pg-ot használunk egy cDNSkönyvtár készítésére a „Lambda ΖΑΡ II” bakteriofág vektorban, a kereskedelmi forgalomban levő „ZAPcDNA™ Gigapack II Gold Cloning Kit” (Stratagene Cloning Systems) reagenseit és leírását alkalmazva. A méretftakcionálás után kapott első cDNS-frakció végső mennyiségének 33%-át ligáljuk 2 pg bakteriofág vektor DNS-hez. A teljes ligáló elegy pakolása után (7 különböző pakolási reakcióban), egy amplifikálatlan cDNS-könyvtárat kapunk összesen 20 χ 10⁶ független-rekombináns fággal.

2. rész: Inhibitor cDNS-klónok izolálása Triatoma pallidipennis nyálmirigy cDNS-könyvtárból

Összesen 5xl0⁵, az előzőkben leírt cDNS-könyvtárból származó rekombináns fágot vizsgálunk át DNSDNS hibridizálással, dupla tarfolt-lifttel Biodyne A nejlonmembránt alkalmazva (Pali BioSupport, East Hills, NY, USA). A hibridizációt 5 χ SSC, 5 χ Denhardt-oldat, 0,2% SDS és 100 pg/ml denaturált, fenollal extrahált, ultrahanggal tördelt heringsperma DNS (Sigma Chemical Company, St. Louis, M0, USA) összetételű oldatban végezzük, az alábbiak szerint készített, radioaktívan jelzett DNS-próbát alkalmazva. A 18. példából származó #1 típusú plazmidklón inszert DNS-ét a fentiekben leírt módon, Sphl és SacI restrikciós enzimekkel végzett kettős emésztés után izoláljuk. A kinyert inszert DNS-ből körülbelül 25 ng-ot radioaktív izotóppal jelezzük, „Prime-IT™ Random Primer Labeling Kit” alkalmazásával (Stratagene Cloning Systems) [a-³²P]dCTP (3000 Ci/mmol; Amersham Buchler, W-3300, Braunschweig, Germany) alkalmazásával. A jelzett DNS-fragmentet a beépületlen radioaktivitástól kromatográfiával választjuk el, „NAP™-5” oszlopon (Pharmacia Biosystems). A szűrő hibridizálásának és a mosásnak a hőmérséklete 50 °C, a végső mosási lépést 2 χ SSC plusz 0,2% SDS öszetételű oldatban végezzük. Az autoradiográfiát -70 °C-on végezzük 48 óra hosszat, és így több mint 300 tar foltot kapunk, amely mindkét replikaszűrőn jelet ad. Az ilyen pozitív szignálok közül 80 körül levő bakteriofágokat eluáljuk az eredeti felülrétegző lemezből, majd külön újraszélesztjük, olyan sűrűségben, amely lehetővé teszi az egyedi fágklónok izolálását. Az előzőkben leírt tarfolt-hibridizálási eljárást használjuk ugyanazzal a DNS-próbával, és összesen 76 olyan független fágklónt izolálunk a lemezekről, amelyek pozitív jelet adnak.

3. rész: Az inhibitor cDNS-klónok jellemzése és szekvenálása

A fágklónokat külön-külön az „in vivő kihasítás” eljárásának vetjük alá, amely az előzőkben említett Stratagene cDNS-könyvtár-készítő kit leírásában található. Az „in vivő kihasítás” után izolált 76 különböző pBluescript SK plazmid „miniprep” módszerrel izolált DNSét kettős emésztéssel hasítjuk, EcoRI és Xhol restrikciós endonukleázok alkalmazásával (Boehringer Mannheim), majd 1,5%-os agarózgélen elválasztjuk, és etidiumbromiddal festjük. Számos különböző méretű inszertet kapunk, ezek mérete 620 bázispárig terjed. AT3 és T7 indítómolekulákkal végzett DNS-szekvenálást (Stratagene Cloning System) a fentiekben leírtak szerint hajtjuk végre 8 olyan klónplazmid DNS-én, amelyekről azt találtuk, hogy a 76 vizsgált független klón közül ezek hordozzák a legnagyobb DNS-inszerteket. Az így azonosított cDNS-klónok a nyitott leolvasási keretről transzlálódó aminosavszekvencia alapján 2 különböző osztályba tartoznak, az egyik osztály pontosan megfelel a #1 típusú plazmidinszertnek (6 klón, ezek jele „1-es inhibitor”), amelyet a 18(3) példában írtunk le, a másik osztály pontosan megfelel a #2 típusú plazmidinszertnek (klón, ezek jele „2-es inhibitor”). További DNS-szekvenálási kísérleteket végzünk, amelyek igazolják az addig meghatározott szekvenciákat, további, az ismert szekvenciákon alapuló oligodezoxinukleotid felhasználásával:

#5 oligodezoxinukleotid:

’-TATCACTCTGAACTCAAGTG-3 ’ #6 oligodezoxinukleotid:

'-TTACCGCCGTTTCCATTTGG-3 ’ #7 oligodezoxinukleotid:

’-TTACTTCAAAGTTGCACC-3 ’ #8 oligodezoxinukleotid:

’ -GCA ACATG A AGGTG ATC ATTGC AGC AAC-3 ’

A leghosszabb független kiónok 5’ végei azonosaknak bizonyultak, 5 bázispár 5’ nem transzlálódó régióval, ezzel azt sugallva, hogy a komplett mRNS-transzkriptumok cDNS-eit klónoztuk, beleértve a transzkripciós iniciációs pontot is. Az 1-es inhibitor, valamint a

2-es inhibitor cDNS-klónokból származó aminosavszekvenciákat, valamint a komplett DNS-t a 13. ábrán mutatjuk be.

23. példa: A rekombináns inhibitor expressziója és szekréciója stabilan transzfektált bébihörcsög-vesesejtekben (BHK)

a) Általános megközelítés

A cDNS-klónokból származó kódoló szekvenciákat ezután egy alkalmas eukarióta expressziós vektorba visszük át oly módon, hogy a kódoló régiót egy olyan expressziós vektorba építjük be. amely az expresszióhoz szükséges összes elemet tartalmazza, azaz például egy promoterszekvenciát, egy terminátorszekvenciát és egy replikációs origót, amelyek mindegyike működés szempontjából a PAI génhez van kapcsolva, ezenkívül tartalmaz egy szelekciós markért, az így kialakult expressziós vektor izolálására. Az expressziós vektort azután abba a gazdaszervezetbe transzformáljuk, amelyhez terveztük, majd a PAI expressziós terméket izoláljuk.

b) A vizsgálatok konkrét leírása

1. rész: Expressziós plazmidok készítése az inhibitorhoz, a pMPSV/CMV vektor felhasználásával

Két oligodezoxinukleotidot szintetizálunk az inhibitort kódoló szekvenciák PCR-amplifikálásához, mind az 1-es, mind a 2-es inhibitor plazmid cDNS-klón szekvenciája alapján. Az egyiket (#9) az ATG iniciációs

HU 218 830 Β kodon körüli régió kódoló láncából vezetjük le, meghosszabbítva egy 5’ farokkal, amely tartalmaz egy HindlII felismerési szekvenciát, és egy optimalizált „Kozák-helyet” [Kozák, M: Point mutations define a sequence flanking the AUG initiation codon that modu- 5 lates translation by eukaryotic ribosomes. Cell, 44, 283-292 (1986)), míg a másikat (#10) nyitott leolvasási keretek TAA terminációs kodon körülötti régiója nem kódoló szálából vezetjük le, amely egy 5’ farokkal van megtoldva, benne egy HindlII felismerési szekvenciával (a HindlII restrikciós endonukleázfelismerési szekvenciáit aláhúztuk, a hatékony transzlációs iniciációhoz szükséges optimalizált „Kozák-helyet” csillagokkal jelöljük, a szekvenciáknak azokat a részeit, amelyek az eredeti cDNS-klón-szekvencia egyik vagy másik szálával egyeznek, vastagított betűkkel jelezzük):

#9 oligodezoxinukleotid:

-GCGATAAAGCTTCCACCATGAAGGTGATCATTGCAGC-3 ’ HindlII**** #10 oligodezoxinukleotid:

-GCGATAAAGCTTATTACTTCATGTTATCAC-3 ’ HindlII

Akármelyik cDNS-klón-plazmidból körülbelül 3 pg-ot használva templátként két különböző PCRamplifikálást végzünk a két oligodezoxinukleotid indítómolekula a #9 és #10 jelenlétében, a fentiekben ismertetettek szerint (18. példa, 2. rész), azonban 38 helyett csak 18 ciklust végezve a #l-#3 lépésekből. Az 1-es inhibitor és a 2-es inhibitor amplifikált kódoló szekvenciái, amelyek az optimalizált Kozák-helyet tartalmazzák, de nem tartalmazzák a komplett poliadenilezési szignált (5’-AATAAA-3’) az eredeti cDNS-klónok terminációs kodonjától közvetlenül 3’ irányban találhatók, izoláljuk, majd ligálásra alkalmassá tesszük HindlII restrikciós endonukleázzal (Boehringer Mannheim) való emésztéssel, majd ezt követő extrakciós lépésekkel, az előzőkben leírtak alapján (18. példa, 3. rész). A pMPSV/CMV-HE vektort [Wirth, M., Schumacher, L., Hauser, H.: Construction of new expression vectors fór mammalian cells using the immediate early enhancer of the humán cytomegalovirus to increase expression írom heterologous enhancer/promoters. In: Conradt, H. S. [Ed.], Protein Glycosylation: Cellular, Biotechnical and Analytical Aspects, 15, 49-52, VCH publishers, Weinheim (1991); Kratschmar, J., Haendler,B., Bringmann P., Dinther, H. Hess, H., Donner, P. Schleuning, W.-D.: Highlevel secretion of the four salivary plasminogen activators írom the vámpíré bat Desmodus rotundud by stablytransfected babt-hamster kidney cells. Gene, 116, 281-284 (1992)] HindlII restrikciós enzimmel emésztve linearizáljuk, majd a leírás szerint izoláljuk.

A kinyert plazmid DNS-t defoszforilezzük, 1 egység borjúbél alkalikus foszfatázt (Boehringer Mannheim) használva, amelyet extrakciós eljárásnak vetünk alá, majd az inhibitort kódoló PCR-fragmentek szubklónozására használjuk a 18. példa 3. részében leírtak szerint.

Az így kapott, a HindlII inszerteket hordozó pMPSV/CMV-inhibitor-1 vagy -2 konstrukciókat EcoRI restrikciós endonukleázzal emésztjük (Boehringer Mannheim), majd az esetek felében egy körülbelül 580 bázispár méretű EcoRI restrikciós ffagment látható, jelezve azokat a konstrukciókat, amelyekben az inhibitort kódoló inszert a helyes orientációban van a pMPSV/CMV vektor Myeloproliferative Sarcoma

Vírus promoteréhez képest. Az ilyen pMPSV/CMVinhibitor-1 és -2 konstrukciók komplett inhibitorkódoló inszertjeinek azután meghatározzuk a szekvenciáját, a #5 #8 oligodezoxinukleotidok, valamint két további indító molekula (#11 és #12 oligodezoxinukleotidok) felhasználásával, amelyek az expressziős vektornak az inszerciót határoló részéből származnak, hogy ellenőrizzük azokat a mutációkat, amelyeket a PCR-amplifikáció során vihettünk be:

#11 oligodezoxinukleotid:

’-ACCAGAAAGTTAACTGG-3 ’ #12 oligodezoxinukleotid:

'-CCTAGTTTGTGGTTGTCC-3 ’ így kapunk két olyan konstrukciót az 1-es inhibitor és a 2-es inhibitor emlőssejtekben való expressziójára, amelyeknek az aminosavszekvenciája azonos a 13. ábrán bemutatott szekvenciával. A konstrukciók sematikus térképét a 14. ábrán mutatjuk be („Amp”: ampicillinrezisztencia marker, „MPSV promoter”: Myeloproliferative Sarcoma Vírus promoter, „SJ”: SV40 intron, beleértve az illesztési pontjait is, „polyA régió”: SV40 poliadenilezési régió, „CMV enhancer”: citomegalovírusfokozó szekvencia, „őri”: pBR322 replikációs origó).

2. rész: A BHK-sejtek transzfekciója és szelekciója Két újraszekvenált pMPSV/CMV-inhibitor-1 és

-2 konstrukció plazmid DNS-ét izoláljuk, „Qiagen-tip 100” oszlopok felhasználásával (Qiagen Inc. Chatsworth, CA, USA). Hasonlóképpen előállítunk két plazmidot, amelyek rezisztencia-markergéneket hordoznak, az egyik a hygromicin B kinázt (pSK/HMR272, úgy állítjuk elő, hogy egy BamHI-HindlII fragmentet, amely a HSVtk promotert a higromicin B kináz génhez kapcsolva tartalmazza, BluescriptSK plazmidba szubklónozzuk, amely fragmentet a pHMR272 vektorból nyerünk ki; ezt a vektort Bemhard és munkatársai írták le [Bemhard, H. U., Krammer, G., Rövekamp, W. G: Construction of a fusion gene that confers resistance agaist hygromicin B to mammalian cells in culture; Experimental Cell Research, 158, 237-243 (1985)], a másik a puromicin-N-acetil-transzferázt [pSV2pacdeltap; De La Luna, S., Soria, I., Pulido, D., Ortin, J., Jimenez, A.: Efficient transformation of mammalian cells with constructs containing a puromicin-resistance

HU 218 830 Β marker, Gene, 62, 121-126 (1988)]. Körülbelül 20 pg 1-es vagy 2-es inhibitor konstrukciót, 6 pg puromicinrezisztenciát hordozó plazmidot és 2 pg higromicin rezisztenciát hordozó plazmidot használunk a bébihörcsög-vesesejtek (BHK) transzfekciójához, a leírás sze- 5 rint [Kratzschmar, J., Haendler, B., Bringmann, P., Dinter, H., Hess, H., Donner, P., Schleunung, W.-D.: High-level secretion of the four salivary plasminogen activators írom the vámpíré Desmodus rotundus by stably-transfected baby hamster kidney cells. Gene, 10 116, 281-284 (1992)], „Lipofectin™ Reagens” felhasználásával (Gibco-BRL Life technologies) egy kettős szelekciós eljárást használunk, DMEM/10% FCS (Gibco-BRL Life Technologies) oldatot használva amely 0,7 mg/ml higromicin B-t (Calbiochem Corpo- 15 ration, La Jolla, CA, USA) és 5 pg/ml puromicint (Sigma Chemical Company) tartalmaz. A kéthetes szelekció után kapott kettős rezisztens, pMPVS/CMV-inhibitor-1 vagy -2 BHK-sejtek keverékét szérummentes OPTI-MEM táptalajban szaporítjuk (Gibco-BRL Life 20 Technologies), a leírás szerint [Kratzschmar, J., Haendler, B., Bringmann, P., Dinter, H., Hess, H., Donner,

P., Schleunung, W. D.: High-level secretion of the four salivary plasminogen activators from the vámpíré Desmodus rotundus by stably-transfected baby hamster 25 kidney cells. Gene, 116, 281-284 (1992)]. A kondicionált táptalajt 24 óra elteltével kinyerjük, 2000xg-vel centrifugálva megszabadítjuk a sejttörmeléktől, majd fagyasztva szárítjuk.

3. rész: A rekombináns inhibitor kimutatása BHK- 30 sejttenyészet felülúszójában

A kondicionált táptalaj aliquot részeiben megvizsgáljuk az inhibitorkoncentrációt, Westem-blot alkalmazásával (lásd 24. példa). Az antiinhibitor antiszérum specifikusan reagál egy 19 kDa fehérjével, amely a 35 pMPSV/CMV-inhibitor-l-gyel transzfektált BHK-sejtek, illetve a pMPSV/CMV-inhibitor-2-vel transzfektált BHK-sejtek kondicionált táptalajában található meg. Nem figyelhető meg reakció azokban a kontrolitáptalajokban, amelyek az inhibitor inszertet nem tártál- 40 mazó pMPSV/CMV konstrukcióval transzfektált sejtek után keletkeznek (lásd 15. ábra). A transzfektált sejtek kivonata csak nagyon gyenge jelet ad, mutatva hogy a rekombináns fehérjék szekretálódtak a közegbe. A két rekombináns forma immunológiai kimutatása mellett a 45 transzfektált BHK-sejtek felülúszóit funkcionális esszében is vizsgálhatjuk. A kollagénnel indukált vérlemezke-aggregációt mérhetjük az 1. példában leírt aggregációs vizsgálatban.

24. példa: Antitesttermelés

Körülbelül 100 pg, a 2. és 15. példa alapján tisztított inhibitort hozzáadunk 0,5 ml komplett Freund-féle adjuvánshoz, majd az emulziót bőr alá injekciózzuk egy nyúlnak. Két hét elteltével egy második injekciót is 55 beadunk a nyúlnak, amely körülbelül 80 pg tisztított inhibitort és 0,5 ml inkomplett Freund-féle adjuvánst tartalmaz. Az injekciózás után számos szérummintát veszünk, hogy a specifikus antitestek termelődését ellenőrizzük. Western blottal vizsgáljuk ezeket a mintákat. 60 ng tisztított inhibitort viszünk egy 12,5-os SDS-poliakrilamid-gélre, majd az elektroforézist, a blottolást és a kimutatást standard módszerekkel végezzük [E. Harlowe, D. Lane: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory (1988)] a tesztszérum hígítása 1:500 arányban, peroxidázzal konjugált kecske antinyúl IgG-t használunk szekunder antitestként, a kimutatást ECL kittel végezzük (Amersham International, Amersham, UK). A biottok azt mutatják, hogy az antiszérum specifikusan reagál a tisztított inhibitorral.

Az alábbiakban összefoglaljuk az inhibitor cDNSfragmenteknek Triatoma pallidipennis-nyálmirigyekből izolált mRNS-ről szintetizált össz-cDNS-ről való amplifikálására és szubklónozására alkalmazott stratégiáját:

Az inhibitor N-terminális aminosavszekvenciája (a 17. példából) Három degenerált oligodezoxinukleotid (#1, #2, #3) tervezése, #1 tartalmaz egy felismerési helyet az Sphl restrikciós enzim számára

Az #1, #2 és #3 oligonukleotidok szintézise és tisztítása gél szűréssel (18.2. példa)

Triatoma pallidipennisnyálmirigyek

Össz-RNS-izolálás (18.1. példa)

A poliA⁺ mRNS-dűsítása kettősaffmitás-kromatográfiával oligo(dT) cellulózon (18.1. példa)

Az első cDNS-szál szintézise reverz transzkriptázzal, indítómolekulaként olyan dezoxioligonukleotidot alkalmazva, amely egy oligo(dT) hosszabbítást és egy 5’ hosszabbítást tartalmaz, amelyben az Xhol restrikciós endonukleáz egy felismerési helye található (18.1, példa)

A #4 oligodezoxinukleotid szintézise és tisztítása, amely a cDNSszintézishez használt indítómolekula 5’ meghosszabbításából származik, benne az Xhol-felismerési szekvenciával (18.2. példa)

Polimeráz láncreakciós (PCR) amplifikálás három külön reakcióban, a Triatoma pallidipennis nyálmirigy össz-cDNS-t használva templátként:

* #1 reakció a #1 oligodezoxinukleotiddal (inhibitorspecifikus) és a #4 (aspecifikus) oligodezoxinukleotiddal mint indítómolekulával * #2 reakció a #2 oligodezoxinukleotiddal (inhibitorspecifikus) és a #4 (aspecifikus) oligodezoxinukleotiddal mint indítómolekulával * #3 reakció a #3 oligodezoxinukleotiddal (inhibitorspecifikus) és a #4 (aspecifikus) oligodezoxinukleotiddal mint indítómolekulával (18.2. példa)

A három reakcióban (#1, #2 és #3) keletkező DNStermék azonosítása (18.2. példa; 11. ábra)

A #1 PCR-reakcióból származó DNS-termék izolálása, kettős emésztése Sphl és Xhol restrikciós enzimekkel, szubklónozása SphI-Sal-I enzimekkel emésztett pGEM-5Zf vektorba, a szubklónozott DNS inszert szekvenciájának meghatározása számos független plazmidklónból (18.3. példa; 12. ábra)

Claims (16)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját gátló fehérje előállítására, amely gátolja az emlős vérlemezkék kollagénnel indukált aggregációját, 5 ahol a fehérje szekvenciája az alábbi:

   a) aa) SEQ IDNo 1., bb) SEQ ID No 2. vagy cc) SEQ ID No 3. szekvencia, vagy

   b) a SEQ ID No 1-3. bármelyikének allelikus módosí- 10 tásával vagy mutációjával kapott szekvenciák, amely allelikus módosítások nem érintik lényegesen a fehérje aktivitását, vagy

   c) a SEQ ID No 1-3. bármelyike szerinti fehérje, illetve azoknak a b) pont alatt említett módosításai vagy 15 muteinjei, amelyek olyan poszttranszlációs módosításokat tartalmaznak, amelyek nem érintik lényegesen az érett fehérje aktivitását, azzal jellemezve, hogy azt a természetből izoláljuk szintetikusan vagy rekombináns módszerrel állítjuk elő, és kívánt esetben izoláljuk és tisztítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét emlősvért szívó rovarok nyálából izoláljuk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét a Triatoma pallidipennis nyálából izoláljuk.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan fehérjét állítunk elő, melynek N-terminális aminosavszekvenciája az alábbi:

   Glu Glu Cys Glu Leu Met Pro Pro Gly Asp Asn Phe Asp Leu Glu Lys Tyr Phe Ser He 1 5 10 15 20
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, 20 hogy a fehérjét rekombináns módszerrel állítjuk elő.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy glikozilezés nélküli fehérjét állítunk elő.
7. 7. Eljárás DNS vagy cDNS előállítására, mely az alábbi aminosavszekvenciának megfelelő fehérjét kó- 25 dolja:

   a) aa) SEQ IDNo 1., bb) SEQ ID No 2. vagy cc) SEQ ID No 3. szekvencia, vagy

   b) egy olyan fehérjét kódol, amelynek az aminosav- 30 szekvenciája megfelel a SEQ ID No 1-3-ban található bármelyik szekvenciának, legalább egy allelikus módosítással, vagy egy mutein, amely lényegesen nem érinti a megfelelő cDNS- vagy DNS-szekvencia által kódolt érett fehérje aktivitását, azzal jellemezve, hogy az emlí- 35 tett molekulákat izoláljuk vagy szintetikus, vagy rekombináns módszerekkel előállítjuk.
8. 8. Eljárás cDNS vagy DNS előállítására, melynek szekvenciája az alábbi:

   a) aa) SEQ IDNo 4., bb) SEQ ID No 5. vagy cc) SEQ ID No 6. szekvencia, vagy

   b) a SEQ ID No 4-6. bármelyike szerinti nukleotidszekvencia, legalább egy allelikus módosításával vagy egy mutációval, amely nem érinti lényegesen a megfele- 45 lő nukleotidszekvencia által kódolt érett fehérje aktivitását, azzal jellemezve, hogy az említett molekulákat izoláljuk vagy szintetikus, vagy rekombináns módszerekkel előállítjuk.
9. 9. Eljárás nukleinsav előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7. vagy 8. igénypont szerinti szekvenciát, egy alkalmas szignálpeptidet, egy alkalmas promotert és kívánt esetben egy alkalmas erősítőszekvenciát kapcsolunk.
10. 10. Eljárás eukarióta- vagy prokariótasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely gazdasejtet a 8. igénypont szerinti cDNS-t vagy DNS-t tartalmazó vektorral transzformálunk.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy bébihörcsög-vesesejtet használunk gazdasejtként.
12. 12. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehérjét kódoló gént tartalmazó vektorral transzformált gazdasejtet szaporítjuk, majd izoláljuk és tisztítjuk a fehéijét.
13. 13. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tisztítás során (a) egy gélszűrési lépést alkalmazunk „Superose 12”-vel, majd (b) egy nagy teljesítményű elektroforéziskromatográfiás lépést.
14. 14. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, az40 zal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított fehérjét legalább egy, gyógyászatilag elfogadható hígítószerrel vagy hordozóval szokásos adagolási formává alakítjuk.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kollagénnel indukált humán vérlemezke-aggregáció profilaktikus vagy akut helyzetben való gátlására alkalmas gyógyszert állítunk elő.
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy metasztázisos tumorsejtes rák kezelésére alkal50 más gyógyszert állítunk elő.