HU217091B - HIV-replikáció transzdomináns represszorait kódoló mutáns gének és represszorok, valamint rekombináns eljárás az előállításukra - Google Patents
HIV-replikáció transzdomináns represszorait kódoló mutáns gének és represszorok, valamint rekombináns eljárás az előállításukra Download PDFInfo
- Publication number
- HU217091B HU217091B HU904245A HU424590A HU217091B HU 217091 B HU217091 B HU 217091B HU 904245 A HU904245 A HU 904245A HU 424590 A HU424590 A HU 424590A HU 217091 B HU217091 B HU 217091B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- rex
- gene
- mutant
- priority
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 270
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 2
- 101710150336 Protein Rex Proteins 0.000 claims abstract description 270
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 98
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 98
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 claims abstract description 63
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 claims abstract description 63
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 39
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims abstract description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 122
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 110
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 109
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 104
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 91
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 79
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 66
- 108700026241 pX Genes Proteins 0.000 claims description 60
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 59
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 50
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 50
- 101150103375 rex gene Proteins 0.000 claims description 43
- 101900102211 Human T-cell leukemia virus 1 Protein Rex Proteins 0.000 claims description 38
- 108700020121 Human Immunodeficiency Virus-1 rev Proteins 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 22
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 20
- 230000004853 protein function Effects 0.000 claims description 20
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 16
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 claims description 15
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 claims description 15
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 13
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 claims description 12
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 239000012636 effector Substances 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 6
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 5
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 abstract description 94
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 abstract description 27
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 abstract description 17
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 16
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 13
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract description 4
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 86
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 53
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 47
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 45
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 38
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 38
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 22
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 21
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 21
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 20
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 20
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 20
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 20
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 15
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 15
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 15
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 12
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 11
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 11
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 10
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 10
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 9
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 9
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 9
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 108010038751 tax Gene Products Proteins 0.000 description 9
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 8
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N Cysteine Chemical compound SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 7
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 6
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 6
- 241001559589 Cullen Species 0.000 description 5
- 108700020123 Human Immunodeficiency Virus-2 rev Proteins 0.000 description 5
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N sivmac Chemical compound O=C([C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 3
- 101000756400 Human T-cell leukemia virus 2 Protein Rex Proteins 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 2
- 241000702188 Enterobacteria phage M1 Species 0.000 description 2
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 2
- 101900141355 Human T-cell leukemia virus 1 Protein Tax-1 Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- BXKDSDJJOVIHMX-UHFFFAOYSA-N edrophonium chloride Chemical compound [Cl-].CC[N+](C)(C)C1=CC=CC(O)=C1 BXKDSDJJOVIHMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 2
- YBNPKPVDURZUQN-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YBNPKPVDURZUQN-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- YCIHPQHVWDULOY-FMZCEJRJSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride Chemical group Cl.C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O YCIHPQHVWDULOY-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100323157 Arabidopsis thaliana LAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 101100098985 Caenorhabditis elegans cct-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241001101077 Crex Species 0.000 description 1
- 229920001393 Crofelemer Polymers 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 101000969630 Homo sapiens Monocarboxylate transporter 10 Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 108700018638 Human T-lymphotrophic virus 2 tax Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102100021425 Monocarboxylate transporter 10 Human genes 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- WJBLNOPPDWQMCH-MBPVOVBZSA-N Nalmefene Chemical compound N1([C@@H]2CC3=CC=C(C=4O[C@@H]5[C@](C3=4)([C@]2(CCC5=C)O)CC1)O)CC1CC1 WJBLNOPPDWQMCH-MBPVOVBZSA-N 0.000 description 1
- 101150072055 PAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 206010044696 Tropical spastic paresis Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010052104 Viral Regulatory and Accessory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N aspartyl-leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003871 intestinal function Effects 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- -1 phospho Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012205 qualitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229940116238 revex Drugs 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 101150027303 tax gene Proteins 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000035903 transrepression Effects 0.000 description 1
- 208000006961 tropical spastic paraparesis Diseases 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
- C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát a vírűs gén fenőtípűsős expressziónak a HIV–1-regén termékéből vagy a HTLV–I rex gén termékéből származótranszdőmináns represszőrai és a megfelelő műtáns gének képezik,amelyek rendelkeznek a Rev fűnkciónak a HIV–1-ben és/vagy a Rexfűnkciónak a HTLV–I-ben és HTLV–II-ben való represszálásának aképességével. Misszensz és deléciós műtánsők sőrőzatának az átmenetigén expressziós analízisét alkalmazták. A műtánsők némelyikérőlmegállapítőtták, hőgy egyaránt represszálják a Rev és a Rex fűnkciót,és így több vírűsfajjal szemben hatásősak. ŕ
Description
1. A találmány vírusok génexpressziójának a területével foglalkozik, közelebbről a HTLV-I rex (regulator of virion-protein expression=virion-protein expressziószabályzó, a továbbiakban rex) génjének és ennek más retrovírusfajban lévő megfelelő génjeinek, így a HÍV-1 revnek a fenotípusos expressziójával foglalkozik.
2. A vírusok, különösen az 1-es típusú humán immunhiányos vírushoz (HIV-1) vagy az I-es típusú humán leukémia vírushoz (HTLV-I) hasonló humán retrovírusok igen veszélyes betegségek okozói. Ez a HIV-1 esetében a szerzett immunhiányos tünet (Acquired Immuné Deficiency Syndrome, AIDS) és a HTLV-I esetében a felnőttkori T-sejt leukémia (Aduit T-cell Leukémia, továbbiakban ATL), valamint a trópusi szpasztikus parapesisként ismert nem rákos állapotok. A HTLV-II etiológiailag összefüggésben van különböző T-sejt hajas sejtes leukémia egyes eseteivel. Mindkét víruscsoport replikációs ciklusa, hasonlóan a DNS-vírusokhoz, a génexpresszió egy „korai” és egy „késői” szakaszára oszlik. A génexpresszió „korai” fázisát a szabályzó proteinek expressziója jellemzi, míg a „késői” fázisban a szerkezeti proteinek szintetizálódnak.
A HTLV-I genom a vírustranszkripció egy Taxnak nevezett aktivátorát kódolja. A Taxnak a HÍV-1-ben lévő megfelelőjét Tatnak nevezik. A Tax és a Tat valószínűleg elsődlegesen a retrovirális LTR-re (long terminál repeat=hosszú terminális ismétlődés, továbbiakban LTR) hat a virális génexpresszióban. Ezenkívül a HTLV-I kódol egy vírusszerkezeti génexpresszió-aktivátort, amelyet Rexnek neveznek. Egy funkcionális Rex protein a felelős a nem összeillesztett vírus mRNS-nek a magból a citoplazmába történő megnövekedett transzportjáért a fertőzött sejtekben. Ott ezek az mRNS-ek a vírusgenomot alkotják és kódolják a szerkezeti proteineket. Az 1-es típusú humán immunhiányos vírus (HIV-1) egy Revnek nevezett homológ proteint kódol. A rév génterméke, úgymint a tax a HTLV-I rendszerben, feltétlenül szükséges a HIV-1 szerkezeti fehérjék expressziójához.
Ennek alapvető magyarázata az, hogy a rév gén termékének (más vírusfajokban ennek megfelelőinek) dramatikus hatása van a fertőzött sejtekben a vírus mRNS transzkriptumok összeillesztési módjának a kiválasztásában. Ezt a hatást a Rév és Rex esetében a transzkripció utáni szabályzással éri el, nevezetesen a teljes hosszúságú mRNS-transzkriptum citoplazmába való transzportjának a fokozásával, ami által a vírusszerkezeti proteinek, mint főleg a Gag és Env a HIV-1 esetében, expressziója beindul, és a szabályzóproteinek expressziója ezzel járóan visszaszorul [lásd például a Rex esetében: M. Hidaka és munkatársai, EMBO J., 7, 519 (1988)] vagy módosul [lásd például a Rév esetében: Μ. H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181 (1988)]. Tehát a Rév nem szükséges egy teljesen összeillesztett HIV-1 mRNS expresszíójához, amely a vírusszabályzó proteineket, beleértve a Tatot és a Revet kódolja.
A HÍV-1-ben az indukció fent említett szelektivitása a Rév funkcióhoz szükséges RNS célszekvenciának tulajdonítható, amelyet Rév válaszelemnek neveznek (Rév Response Element, továbbiakban RRE). Az RRE megegyezik a HÍV-1 env génen belül jelen lévő egy nagy, 234 nukleotidból álló RNS másodlagos szerkezettel. A HTLV-I-ben a megfelelő szerkezetet Rex válaszelemnek nevezik (Rex Response Element, továbbiakban RexRe vagy RRX). A Rév az első proteinnek tűnik, amelyről úgy látszik, hogy az RNS magból való kijutását szekvenciaspecifikus módon szabályozza.
Szemléltetésként a Rexet véve, a Rex proteinnek a HTLV-I gag és env gének expresszióját szabályzó teljes funkciója legalább három, funkcionálisan eltérő aktivitást igényel: magban és nukleoluszban való elhelyezkedése, azaz annak képessége, hogy minden protein citoplazmatikus szintézisének a helyéről átvihető a magba és ott a nukleolusz területén koncentrálódik; a RexRE (RRX) szekvenciaspecifíkus felismerése (közvetlenül vagy közvetetten) a vírus RNS-ekben; és Rex effektoraktivitás, ennek a szabályzóproteinnek jelenleg még nem ismert aktivitása, amely ténylegesen közvetíti a részben összeillesztett vírus mRNS kijutását a magból a citoplazmába, amely mRNS tartalmazza a RexREszekvenciát.
A rex proteinjében azon szerkezeti helyeket tekintetbe véve, ahol a teljes Rex funkció ezen összetevő aktivitásai vannak (azaz a funkcionális domének), a jelen találmány bejelentése előtt mindössze az volt ismeretes, hogy a Rex aminoterminálisán lévő első 20 aminosavában egy pozitív töltésű peptiddomén szükséges a nukleoluszban való elhelyezkedéshez [H. Siomi és munkatársai, Cell, 55, 197-209 (1988)].
Amint a fentiekben említettük, a HTLV-I esetében a Rex géntermék és a HIV-1 esetében a Rév géntermék szükséges a vírus szaporodásához [lásd például a HTV esetében: E. Terwilliger és munkatársai, J. Virol., 62, 655 (1988)]. A Rex és Rév döntő fontosságát kihangsúlyozza az a tény, hogy a különböző elsődleges szerkezetük ellenére funkcionálisan rokonok, és a HTLV-I Rex képes kifejteni hatását más vírusfajokban is, így HÍV-1ben is [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, (1988)], annak ellenére, hogy:
- Rév és Rex nem rendelkeznek szignifikáns homológiával sem nukleotid, sem aminosav szinten,
- a nukleotidszekvenciák és az RRE törzs- és hurokszerkezetei eltérőek a RexRE-étől (RRX) a HTLV-I-ben,
- a Rex és Rév proteinek másodlagos szerkezetének számítógépes előjelzése nem mutat szignifikáns hasonlóságokat, és
- úgy tűnik, hogy a Rex protein az RRE-nek nem azon helyéhez kötődik, mint a Rév protein, azonban mégis lehetséges a Rév proteint helyettesíteni a Rex proteinnel a HIV-1 rendszerben, valamint a legutóbbi időben azt tapasztalták, hogy a HTLV-I Rex és a HIV-1 Rév képesek helyettesíteni a HIV-2 Rev-et (Rev2), és hogy a HTLV-I Rex helyettesíteni képes az analóg HTLV-II szabályzóproteint is. Ez a kiegészítés elegendő például egy transzfunkcionális Rex proteinnel rendelkező revhiányos HIV-1 provírust megvédeni. Másrészről egy rexhiányos HTLV-I provírus megmentése fordított helyettesítéssel nem látszik megvalósíthatónak. így ebből a szempontból nem teljes a szimmetria. Ezen megfordíthatóság hiányának az alapját még nem
HU 217 091 Β értjük, de valószínűleg kapcsolatban van ezen proteinek funkcionális jellegével, amelyek szükségesek a célRNS-szekvencia felismeréséhez.
A szabályzóproteinekben történő mutációk a vad típusú funkcióval szemben egy domináns negatív fenotípusú génterméket adhatnak [I. Herskowitz, Natúré, 329, 317 (1987)]. Domináns negatív mutáns proteinek, amelyek transzdomináns represszorként ismertek, amelyeknek kis csoportját az utóbbi időben fedezték fel különböző nem rokon vírusokban, a vírusellenes hatású szerek új csoportját képezik. A genetikai analízisekben a negatív mutációk azok, amelyek a génfunkciócsökkenését vagy -elvesztését okozzák. Domináns negatív mutációk azok, amelyek megakadályozzák, hogy ugyanazon gén másolatai, amelyek nem mutáltak (azaz, amelyek szekvenciája vad típusú), helyesen működjenek. Másrészről a recesszív negatív mutációk nem gátolják a vad típusú megfelelőjüket. Továbbá, néhány domináns mutáció a vad típusú géneket csak akkor gátolja, ha a mutáns és a vad típusú gének azonos kromoszómán helyezkednek el (DNS- vagy RNS-molekula). Ebben az esetben a gátló mutációról azt mondják, hogy az „ciszaktivitású” („cis-acting”). Másrészről, egy domináns mutáció gátolhatja a megfelelő vad típusú gént akkor is, ha az egy különálló kromoszómán helyezkedik el. Ezt a típust „transz-módon ható” („trans-acting”) mutációnak vagy egyszerűen transzdomináns mutációnak tekintjük.
Ezen úgynevezett transzdomináns gének közül néhányat leírtak, ezek az eukarióta vagy Herpes vírus transzkripciós faktorok génjeire vonatkoznak [I. A. Hope és K. Struhl, Cell, 46, 885 (1986); R. Gentz és munkatársai, Science, 243, 1695 (1989); S. J. Triezenberg és munkatársai, Gén. & Devel., 2, 718 (1988); A. D. Friedman és munkatársai, Natúré, 335, 452 (1988)]. így, ha a Herpes simplex vírus néhány deléciós mutánsa túlságos mértékben kifejezett (overexpressed), a VP16 transzaktivátor gátolja a VP16 funkciót, ezáltal kizárva a HSV-1 vírusok replikációját a normálisan ezt lehetővé tevő sejtekben. A retrovírusok tekintetében szintén leírtak transzdomináns mutánsokat, például a HTLV-II Tax protein esetében [W. Wachsman és munkatársai, Science, 235, 674 (1987)] és a jelen találmány prioritási időpontja után a HIV-1 tat [M. Green és munkatársai, Cell, 58, 215 (1989)] és gag génjei [D. Trono és munkatársai, Cell, 59, 113 (1989)] esetében.
Ezen a két szabályzóprotein összetétele és funkciói közötti különbségek jelzik, hogy a Rex szerkezet összehasonlítása a Rév proteinével vagy annak ismert mutánsaival, nem ad útmutatást a mutációk kiválasztására, amelyek a vírusproteinek transzdomináns represszorait képezhetik.
A fenti fogalmak terápiás alkalmazása magában foglalhatja az ártalmas géntermékek termelésének vagy túltermelésének a gátlását a gén oly módon történő megváltoztatásával, hogy az domináns negatív mutációkat hozzon létre, amely által a létrejövő gén olyan szabályzóproteineket kódol, amelyek ha kifejeződnek, megszüntetik a vad típusú funkció aktivitását [I. Herskowitz, Natúré, 329, 219 (1987)]. Vírus-, például retrovírus-fertőzések esetében igen kívánatosnak látszik a vírusfunkció megfelelő transzdomináns, például a rév vagy rex gén, inhibitorainak a biztosítása az esszenciális szabályzó gének hasonló inhibitorainak a szerkesztésével. Ez a törekvés az „intracelluláris immunizáció” kívánt eszközeit biztosíthatja a vírusfertőzések kezelésének 1988-ban először javasolt megvalósítására [D. Baltimore, Natúré, 335, 395 (1988)].
3. A találmány összefoglalása
A HTLV-I rex, illetve a HIV-1 rév gén transzdomináns változatait állítottuk elő, amelynek a terméke blokkolja a HTLV-I, HTLV-II, illetve a HIV-1 replikációt. Továbbá, a rex vagy rév gén ezen szerkesztett transzdomináns változatainak a terméke blokkolja a HTLV-I (és egyes esetekben a HTLV-II) és a HIV-1 (és egyes esetekben a HÍV-2 és SIV) replikációját.
Ez az első közölt eset olyan vírusrepresszorok előállítására, amelyek egynél több vírusfajra hatnak, azaz transzdomináns géntermékek, amelyek egynél több vírusfaj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját represszálják.
A találmány olyan proteineket kódoló génekre vonatkozik, amelyek transzdomináns módon represszálják egynél több vírusfaj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját és így egynél több vírusfaj replikációját blokkolják, főleg az alábbiakban ismertetett pcRexM2-ben, pcRexM7-ben és pcRexM8-ban; az M6, M7 és Ml3-ban és a pM 10-ben lévő mutáns génekre vonatkozik.
Olyan proteineket kódoló génekre is vonatkozik, amelyek transzdomináns módon represszálják a HTLV-I és/vagy HTLV-II rex gén fenotípusos expresszióját és olyan proteineket kódoló génekre, amelyek transzdomináns módon HIV-1 és/vagy HIV-2 és/vagy SIV rév gén fenotípusos expresszióját, főleg az alábbiakban ismertetett pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM17 és pcRexl3A15 plazmidokban; a pMlO, p9/14, pM21, pM22, pM27, pM29 és pM32-ben, és az M6, M7 és Ml3-ban lévő mutáns génekre.
Vonatkozik ezen gének előállításának egy eljárására, amely magában foglalja a megfelelő vad típusú géneknek egy megfelelő expressziós rendszerből való izolálását, ennek a génnek megfelelő klónozó rendszerbe történő elhelyezését, a kívánt mutáció génbe való bevitelét és a kapott mutáns génnek a kívánt mutációt tartalmazó klónból való kinyerését. Vonatkozik még egy eljárásra a fentiekben meghatározott proteinek előállítására, amely a fent meghatározott mutáns gén egy megfelelő expressziós és szaporító rendszerben történő expresszióját és szaporítását és a kifejezett termék abból való kinyerését foglalja magában.
Vonatkozik olyan proteinkre is, amelyek transzdomináns módon represszálják több, mint egy vírusfaj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját, és így blokkolják több, mint egy vírusfaj replikációját, különösen az alábbiakban leírt pcRexM2, pcRexM7 és pcRexM8; az M6, M7 és Ml3 és pMlO mutáns proteinjeire.
Vonatkozik egy vektorra is, például egy retrovirális vagy plazmidvektorra, amely a fentiekben meghatározott gént olyan formában tartalmazza, amely alkalmas
HU 217 091 Β arra, hogy funkcionális állapotban szabaduljon fel az emlős célsejtben in vivő vagy in vitro.
Vonatkozik még egy gyógyszerkészítményre, amely a fentiekben meghatározott gént vagy proteint olyan megfelelő formában tartalmazza, amely alkalmas a kívánt profilaktikus vagy terápiás hatás elérésére és gyógyászatilag megfelelő vivőanyagot vagy hígítóanyagot tartalmaz, például egy beteg testéből kivett sejt formájában, amelyet in vitro kezelünk a visszavitel előtt.
Vonatkozik még vírusfertőzések kezelésének egy módszerére, amely a fentiekben meghatározott gén vagy protein olyan megfelelő formában való beadásából áll, amellyel elérhető az ilyen kezelést igénylő betegeknek a kívánt megelőző vagy terápiás hatású kezelése, például a beteg testéből kivett és visszavitel előtt in vitro kezelt sejtek formájában.
„Kezelés” alatt a vírusfertőzések profilaktikus, valamint gyógyító kezelését értjük, a „gyógyító” hatás alatt a vírusfertőzés latens állapotban való stabilizálását értjük.
Vonatkozik még az itt meghatározott génekre, proteinekre és DNS-szegmentumokra, amelyeket gyógyászati célra alkalmazunk.
A találmány vonatkozik még a fent leírt gének és proteinek funkcionális fragmentum vagy származék formáira, azaz olyan fragmentumokra vagy származékokra, amelyek funkcionálisan egyenértékűek. „Funkcionális fragmentum vagy származék” alatt olyan fragmentumot vagy származékot értünk, amelynek olyan farmakológiai aktivitása van, amely minőségileg azonos az ép mutáns gén vagy fehéije farmakológiai aktivitásával és mennyiségileg azonos vagy eltérő, azaz nagyobb vagy kisebb, mint az ép mutáns gén vagy protein farmakológiai aktivitása, például körülbelül 1%-tól körülbelül 10000%-ig, főleg körülbelül 10%-tól körülbelül 1000%-ig.
A találmány vonatkozik még az itt meghatározott génekből, proteinekből és DNS-szegmentumokból származó inhibitorokra is, amelyek képesek utánozni a transzdomináns, azaz elsősorban az RNS-t kötő domént a fent leírt mutáns Rex vagy Rév proteinben, így kis molekulatömegű inhibitorokra vagy semlegesítő monoklonális antitestekre. A kis molekulatömeg itt egy körülbelül 10 kd alatti, elsősorban körülbelül 1 kd alatti molekulatömeget jelent.
A további szempontokat, amelyekre a találmány vonatkozik, az alábbiak tartalmazzák:
- a HIV-1 Rév funkcióinak egy transzdomináns represszora, amely egy első és egy második doménből áll, az első dómén lényegében a vad típusú HÍV -1 Rév specifikus kötő funkcióival rendelkezik és a második dómén nem rendelkezik a vad típusú HIV-1 Rév aktivációs funkcióval, a második dómén a vad típusú HÍV-1 Révből módosított egy vagy több mutációval; előnyösen az első dómén tartalmazza a vad típusú Rév körülbelül 10-es aminosavhelyétől körülbelül a 68-as aminosavhelyig terjedő részt, és a módosított második dómén a vad típusú Rév körülbelül 68-as aminosavhelyétől a körülbelül 90es aminosavhelyig teijedő részből származik; különösen a fenti egy vagy több mutáció téves vagy deléciós mutáció, amelyek a vad típusú Revnek körülbelül a 68-as aminosavhelye és körülbelül a 90-es aminosavhelye között mennek végbe, előnyösen körülbelül a 78-astól körülbelül a 86-osig, különösen körülbelül a 78-astól körülbelül a 83-as vagy 84-esig mennek végbe, a vad típusú HÍV-1 Rév első doménjének a specifikus kötő fúnkciói lényegében funkcionálisan épek maradnak; főleg az alább leírt pMlO, pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32 represszorok vagy ezeknek egy funkcionális fragmentuma vagy származéka;
- a HÍV Rév fúnkciónak egy transzdomináns represszora, amely tartalmaz egy első domént, amely lényegében rendelkezik a vad típusú HIV-1 Rév specifikus kötő funkcióival, ez a transzdomináns represszor nem rendelkezik a vad típusú HIV-1 Rév aktivációs funkcióival; előnyösen az első dómén tartalmazza a vad típusú Rev-nek körülbelül a 10-es aminosavhelyétől körülbelül a 68-as aminosavhelyig teijedő részét, és a transzdomináns represszor nem tartalmazza a vad típusú Revnek körülbelül a 68-as aminosavhelyétől legalább a 90-es aminosavhelyig teijedő részét; főleg az alábbiakban leírt ρΔ9/14 és ρΔ10/14 represszorok vagy ezeknek egy funkcionális fragmentuma vagy származéka;
- egy DNS-szegmentum, amely a HTLV-I Rex protein fúnkciójának a transzdomináns represszorát kódolja, a represszor a Rex protein vad típusú formájából módosított, legalább egy transzdomináns negatív mutációval a vad típusú Rex protein peptiddoménjében, amely a Rex protein effektoraktivitását fejti ki, ez a represszor lényegében rendelkezik a Rex protein vad típusú formájának a magban elhelyezkedő aktivitásával; előnyösen egy ilyen DNS-szegmentum, amelyben a vad típusú Rex protein peptiddoménje tartalmazza körülbelül az 59-es aminosavhelytől a körülbelül 121-es aminosavhelyig, különösen a következő aminosavhelyek bármelyikében: 59,60, 64, 65, 119, 120 és 121; főleg egy DNS-szegmentum, amely a következő mutáns rex gének bármelyikét tartalmazza: M6, M7, M13 és ezek variánsai és származékai, amelyek a HTLV—I Rex proteinfunkció transzdomináns represszióját mutatják;
- a HTLV-I Rex proteinfúnkciójának megfelelő transzdomínáns represszora a vad típusú formából úgy módosítva, hogy az előnyösen rendelkezik azon képességgel, hogy represszálja akár a HIV-1 Rév proteinfunkcióját, akár a HTLV-II Rex proteinfunkcióját;
- egy eljárás a Rex protein génaktiváló funkciójának a specifikus gátlásának az azonosítására, amely a következő lépésekből áll:
i) rendelkezésre bocsát egy genetikus rendszert, amely tartalmaz:
- egy olyan DNS-szegmentumot, amely kódol egy mRNS-t, amely tartalmaz egy szabályzó válaszelemet, amelyet felismer a Rex protein, és legalább egy nem használt összeillesztési helyet (azaz egy régiót vagy intront, amely az összeillesztés felismerési szekvenciához kapcsolt, de amely nem összeillesztett az mRNS-en kívül);
- egy DNS-szegmentum, amely kódol egy rex gént, amely képes kifejeződni egy proteintermék termelése céljából, amely indukálja az mRNS kijutását a magból;
- egy rex gént kódoló DNS-szegmentummal és az mRNS-t kódoló DNS-szegmentummal transzformált
HU 217 091 Β gazdasejt, amely rendelkezik a rex gén proteintermékének és az mRNS-nek a kifejező képességével;
ii) ezt a genetikus rendszert tartalmazó sejtek érintkeztetésbe hozása a Rex protein feltételezett specifikus inhibitoraként ható szerrel olyan körülmények között, amikor a szer belép a sejtekbe;
iii) ezen szemek az mRNS-nek a magból történő kijutására kifejtett hatásának a meghatározása, amely felhasználja a nem használt összeillesztési helyet; és iv) ezen szemek az mRNS-nek az összeillesztett formájának a magból történő kijutására kifejtett hatásának a meghatározása, amely az összeillesztési helyet használja; és
- az mRNS összeillesztett formája, amelyben az összeillesztési hely használt, ami által a nem használt összeillesztési helyet tartalmazó mRNS kijutásának a csökkenése az mRNS összeillesztett formája kijutásának a változatlan mértékével együtt azt jelzi, hogy ez a szer a HTLV-I rex gén vagy a rex gén egy terméke aktivitásának egy specifikus inhibitora; az mRNS szabályzó elem, amelyet felismer a Rex protein, amely előnyösen a HTLV-I-ből, HTLV-II-ből és HÍV-1-ből választott vírus mRNS-éből származik;
- a fentiekben meghatározott azonosítási módszer, amelyben a nem használt összeillesztési helyet tartalmazó mRNS kijutásának a csökkenése előnyösen kimutatható az első protein termelési szintjének a meghatározásával, amelyet a nem használt összeillesztési helyet tartalmazó mRNS kódol, és az mRNS összeillesztett formájának a megnövekedett kijutása előnyösen kimutatható a második protein termelési szintjének a meghatározásával, amelyet az mRNS összeillesztett formája kódol;
- a fentiekben ismertetett azonosítási módszer, amelyben a szabályzó válaszelemet és az összeillesztési helyet tartalmazó mRNS-t egy olyan plazmid kódolja, amely tartalmazza a HTLV-I provírus 3’-végét, beleértve a Rex és Tax proteinek kódoló régióját, a teljes env gént, a Rex válaszelemet és a teljes r’LTR-t; előnyös az alábbiakban leírt pgTAX-LTR plazmid és a rex gén, amely előnyösen a pRex plazmidon van;
- plazmid pgTAX-LTR;
- a Rex protein génaktivációs funkciója specifikus inhibitorának a fenti azonosítási módszernek megfelelő azonosítására szolgáló szűrővizsgálati szerekből álló reagenskészlet, amely a következőket tartalmazza:
- egy olyan mRNS-t kódoló DNS-szegmentum, amely tartalmaz egy szabályzó válaszelemet, amelyet felismer a Rex protein és legalább egy nem használt összeillesztési helyet;
- egy olyan rex gént kódoló DNS-szegmentum, amely képes oly módon kifejeződni, hogy egy proteinterméket hozzon létre, amely indukálja az mRNS kijutását a magból; és
- egy tartály, amely tartalmazza a rex gént kódoló DNSszegmentummal és az mRNS-t kódoló DNS-szegmentummal transzformált gazdasejtet, amely sejt képes kifejezni a rex gén proteinterméket és az mRNS-t;
- a HIV-1, HTLV-I vagy HTLV-II replikáció gátlásának egy módszere, amely a fent meghatározott DNSszegmentum egy olyan sejtbe való beviteléből áll, amely rendelkezik ezen vírusok egyike replikációjának a képességével és azzal a képességgel, hogy kifejezze a DNS-szegmentumot a HTLV-I Rex funkció transzdomináns repressziójának a termelése céljából; és - egy módszer a HIV-1, HIV-2 és SIV, különösen a HIV-1 replikációjának a gátlására, amely a HIV-1 Rex funkció egy transzdomináns represszorának a HÍV- 1-gyel fertőzött sejtbe való beviteléből áll.
4. Az ábrák magyarázata
4.1
Az 5.1 és 6.1 fejezetekre vonatkozó ábrák
1. ábra: A HTLV-I rex nukleotid- és aminosavszekvenciája. [Az oligonukleotidokkal változtatott aminosavhelyeket (1) (87-es, 88-as, 89-es aminosavhelyeket) és (2) (94-es hely) megjelöltük, a 82-es, 90-es, 91-es és 97-es helyekhez hasonlóan. A teljes szekvencia 567 nukleotidot tartalmaz és 189 aminosavat kódol.]
A. ábra: A HTLV-I rex génbe bevitt 29 mutáció helye.
A HTLV-I rex gén egy 189 aminosavból álló proteint kódol. Egy helyre irányuló mutagenezist alkalmazva misszensz (helytelen értelmű) helyettesítéseket végeztünk meghatározott aminosavmaradékok esetében (bekeretezéssel jelöltük), és ezeket a rex génen belüli elhelyezkedésüknek megfelelően neveztük el. (Az ábrán az egybetűs aminosavkódokat használjuk.)
2A. ábra: A rex immunprecipitációja. A rex immunprecipitáció utáni 30 rex mutánsból 7-nek az SDS/poliakrilamid gélelektroforézise (SDS=sodium-dodecyl-sulfate, nátrium-dodecil-szulfát, továbbiakban SDS) (azt mutatja, hogy a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRexM14, pcRexM17 és pcRexl3A15 még termelnek Rex proteint):
A: pgtat (a Rex antitest negatív kontrollja)
B: pcRex
C: pcRexM2 D: pcRexM7 E: pcRexM8 F: pcRexM13 G: pcRexM14
H: pcRexM17 (az ebben a sorban lévő kisebb molekulatömeg valószínűleg ennek a proteinnek a módosításakor végbement változásnak tulajdonítható, például foszforilációnak)
I: pcRexl3A15
2B. ábra: Mutánsok biológiai fenotípusai. A 2A. ábrához hasonlóan Tat immunprecipitáció után: A: pgtat+pXF3
B: pgtat+pcRev C: pgtat+pcRex D: pgtat+pcRexM=
E: pgtat+pcRexM7 F: pgtat+pcRexM8 G: pgtat+pcRexM13 H: pgtat+pcRexM14 I: pgtat+pcRexM17 K: pgtat+pcRex!3A15
HU 217 091 Β
2C. ábra: A 2B. ábrához hasonló. (Azt mutatja, hogy néhány Rex mutáns a vad típusú Rexszel szemben transzdomináns, nevezetesen: a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 és pcRexl3A 15 mutánsok)
A: pgtat+pXF3+pXF3 B: pgtat+pcRex+pXF3 C: pgtat+pcRex+pcRexM2 D: pgtat+pcRex+pcRexM7 E: pgtat+pcRex+pcRexM8 F: pgtat+pcRex+pcRexM13 G: pgtat+pcRex+pcRexM14 H: pgtat+pcRex+pcRexM17 I: gtat+pcRex+pcRexl3A15
2D. ábra: A 2B. ábrához hasonló. (Azt mutatja, hogy néhány Rex mutáns a vad típusú Revvel szemben transzdomináns, nevezetesen a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8 és részben a pcRexM13 mutánsok)
A: pgtat+pXF3+pXF3 B: pgtat+pcRev+pXF3 C: pgtat+pcRev+pcRexM2 D: pgtat+pcRev+pcRexM7 E: pgtat+pcRev+pcRexM8 F: pgtat+pcRev+pcRexM13 G: pgtat+pcRev+pcRexM14 H: pgtat+pcRev+pcRexM17 I: pgtat+pcRev+pcRexl3A15
3. ábra: Szerkesztett Rex mutánsok
4. ábra: A rex kódolószekvencia mutagenezise céljából szintetizált 29 oligonukleotid szekvenciája
4.2
Az 5.2 és 6.2 fejezetekre vonatkozó ábrák
5. ábra: A HIV-1 rév génbe bevitt mutációk helye.
A HIV-1 rév gén egy 116 aminosavból álló, a bemutatott jósolt szerkezetű proteint kódol. A rév két kódoló exonja közötti határt megjelöltük (SP). Csoportos pontmutációkat (pM) végeztünk oligonukleotid irányítású mutagenezissel, amint azt a bekeretezett maradékok mutatják. Ezeket a mutációkat a Révén belüli elhelyezkedésüknek megfelelően neveztük el, az N-terminálist pMl-gyel és a C-terminálison lévőt pM14-gyel. Minden bevitt mutációra két-négy szomszédos aminosav van hatással, és mindegyik, kivéve a pM7-et, a rév génszekvenciába egy egyedül álló BglII helyet vitt be. Ezek a bevitt helyek megkönnyítik az ezt követő N- és C-terminális deléciós (ρΔ) mutánsok szerkesztését. A pA mutánsokat a deléció kiterjedése szerint neveztük el, például ρΔΙ 1/14 a bevitt pMl 1 és pM14 mutációk között deletált. (Az ábrán egybetűs aminosavkódokat használunk.)
5A. ábra: A HIV-1 rév génbe bevitt további misszensz és deléciós mutációk helye (-=deletált aminosav.
6. ábra: A pcREV DNS és megfelelő aminosavszekvenciája
7. ábra: Az Ml-Ml4 mutációs helyeknek megfelelő
DNS-szekvencia
8. ábra: A HIV-1 rév és tat transzaktivátorok immunprecipitációja
9. ábra: HÍV -1 provirális védővizsgálat
10. ábra: A rév és kiválasztott Rév mutánsok sejten belüli elhelyezkedésének a megállapítása közvetett immunfluoreszcenciával
A. és 11B. ábrák: A Rév mutánsok analízise domináns negatív fenotípus keresése céljából
12. ábra: A Rév funkció kompetitív gátlása
12A. ábra: A HIV-1 rév transzaktivátor dómén szerkezete. A 116 aminosavból álló teljes hosszúságú proteint egy intronnal elválasztott két exon kódolja, amely nagymértékben megfelel a vírus env génnek. A „kötő” és az „aktiváló” domének a vonalkázott keretekben vannak, amelyek magukban foglalják a 23-56-os, illetve a 78-83-as maradékokat. S = összekapcsolási hely; N=a magban való elhelyezkedéshez fontos, erősen bázikus régió, amely jelentős azonosságot mutat az „Arg-gazdag” RNS-kötő résszel.
4.3 Az 5.3 és 6.3 fejezetekhez tartozó ábrák
13. ábra: (A) A HIV-1 Rex protein aminosavszekvenciája és a bevitt 25 pontmutáció mindegyikének a helye. A bekeretezett aminosavak mindegyikét kódoló nukleotidot eltávolítottuk és a keretben lévő oligonukleotiddal helyettesítettük, amely aszparatil-leucin dipeptidet kódol. (Az ábrán egybetűs aminosavkódokat használunk.) (B) A Rexre érzékeny pgTAX-LTR expreszszíós vektor szerkezete. A CR-1 HTLV-I provírus 3’-végét a géntérkép 5013-as helyén lévő [M. Seiki és munkatársai, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 3618-3622 (1983)] HindlII helyéről a 3’LTR-en keresztül inszertáltuk a pBC12/CMV expressziós vektorba. Ez a fragmentum tartalmazza a Tax kódoló két exont (üres keretek), a teljes env gént és a HTLV-I teljes 3’-LTR-ét, beleértve a RexRE-t (RRX) is [S. M. Hanley és munkatársai, Genes Develop., 3, 1534-1544(1989)].
14. ábra: (A) A Rex, ellentétben a Revvel és IL-2vel, aktiválja a HTLV-I Env protein pgTAX-LTR vektor általi expresszióját. A COS sejtek még nem összefolyó (subconfluent) tenyészeteit pgTAX-LTR-rel és pREX-szel [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738 (1988)], pREV-vel [M. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181-183 (1988)] vagy pCMV-IL-2-vel [B. R. Cullen, Cell, 46, 973-982 (1986)] kotranszfektáltuk. Az utolsó sávban a sejteket pgTAX-LTR távollétében pREXszel transzfektáltuk. Az Env proteintermelést immunprecipitációval és gélelektroforézissel analizáltuk. Az ismert
HU 217 091 Β molekulatömegű standardokat baloldalt jelöltük.
(B) A rex mutánsok Rex funkciójának az analízise. A pBC13/CMV expressziós vektorba történt inszerció után a 25 rex mutáns mindegyikét (Ml-Ml 8 és M21-M27 jelűek, lásd a 13A ábrát; az M19 és M20szal jelölteket nem szerkesztettük meg) kotranszfektáltuk a pgTAX-LTR-rel, és a tenyészetek Rex-függő HTLV-I Env protein expresszióját analizáltuk a 12. példában leírt módon.
15. ábra: A HTLV-I Env, Tax és Rex proteinek szimultán immunprecipitációs analízise COS sejtekben, amelyeket pgTAX-LTR-rel és az inaktív (Ml, M2, M6, M7, M13) vagy gyengített (Ml5) Rex mutánsokkal vagy a vad típusú pRexszel, pRevvel és pCMV-IL-2 vektorokkal kotranszfektáltuk. (A) Env-termelés; (B) Tax-termelés; (C) vad típusú és mutáns Rex proteintermelés.
16. ábra: A HTLV-I Rex mutánsok sejten belüli elhelyezkedése immunfluoreszcencia alapján. A vad típusú M6, M7 és M13 Rex proteinek a nukleoluszokban és a magban helyezkednek el a kifejező sejtekben. Ezzel ellentétben az Ml Rex proteint csak a citoplazmában mutattuk ki, míg az M2 protein az egész sejtben eloszlik. Az Ml 5 mutáns a kifejezősejtek magjában helyezkedik el, de ellentétben a vad típusú Rex proteinnel, a nukleoluszból kizártnak tűnik.
17. ábra: (A) A rex mutánsok vad típusú Rex proteinfunkcióját gátló képességének az analízise. Minden tenyészetet pgTAX-LTR-rel, pREX-szel és valamelyik Rex mutánssal (1-6-os sávok), pREX-szel (7-es sáv), pREV-vel (8-as sáv) vagy pCMV-Il-2vel (9-es sáv) kotranszfektáltuk. A HTLV-I Env-termelést a 14. ábrában leírtak szerint analizáltuk.
(B) A HTLV-I rex transzdomináns mutánsok gátolják a HIV-1 Rév proteinfunkcióját. Sejteket pgTAT-tal, pREV-vel és pBC/CMV-IL-2-vel vagy az M6, M7 és Ml3 transzdomináns Rex mutánsokkal kotranszfektáltuk, és vizsgáltuk a Tat protein 72 aminosavas, megrövidített formájának a Rév által indukált termelését (2-es sáv). Az M6, M7 és M13 (3-5-ös sávok) teljesen gátolják a HIV-1 Rév proteint, minthogy a Tat proteinnek csak a teljes hosszúságú 86 aminosavat tartalmazó formája volt kimutatható.
(C) A HTLV-I transzdomináns Rex mutánsok blokkolják a Rev-hiányos HÍV-1 provírus replikációjának a Rex általi kivédését. Sejteket revhiányos HIV-1 provírus plazmiddal és pREX-szel kotranszfektáltunk Ml, M7 és M13 mutánsok jelzett mértékű feleslegének a jelenlétében. Mértük a
HIV-1 p24 Gag protein szintjét a felülúszóban.
5. A találmány részletes leírása
A jelen találmányban alkalmazott eljárások és technikák a szakterületen ismertek.
Vírusfajták alatt azt értjük, hogy azok rendszertanilag eltérő fajok, így a HTLV-I, HTLV-II, SIV, HÍV-1 és HÍV-2. A találmány főleg a retrovírusok területére, különösebben a humán retrovírusokra vonatkozik.
A gének, amelyek expressziójának a represszálása a jelen találmány célja, előnyösen olyan gének, amelyek egy nemkívánatos tulajdonságot kódolnak, mint például egy funkciót, amely a provírus aktiválódását és fertőző részecskékké való érését eredményezi, például a HIV-1 és HIV-2 revje.
A rév és a Rév alkalmazása itt HIV-1 revet, illetve HIV-1 Rev-et jelent, ha másként nem jelöljük. így más vírusfajok, mint a HIV-2 egyenértékű revjét és Revjét „HIV-2 rév (rev-2)”-nek, illetve „HIV-2 Rév (Rev2)”nek jelöltük stb.
Amennyiben ezek előállítása itt nincs részletesen leírva, a kiindulási anyagként alkalmazott vegyületek, vektorok, sejtvonalak stb. vagy reagensek ismertek és nyilvánosan hozzáférhetők vagy szokásos módon előállíthatok ismert és közönségesen hozzáférhető anyagokból vagy egyenértékű anyagok állíthatók elő szokásos módon ismert és közönségesen beszerezhető anyagokból. Ily módon a Rex gén kinyerhető a HTLV-I-ből és a rév gén a HTV- 1-ből előállított bármely izolált anyagból és a pgTAX-LTR előállítható például HUT102-ből vagy MTI-bői. Más módon géneket kémiai szintézissel is lehet alkotni olyan genetikai kódnak megfelelően, amely a kívánt aminosavszekvenciával rendelkező proteint termeli. A Rex és Rév transzdomináns represszorát standard rekombináns DNS-módszerrel vagy standard kémiai peptidszintézis módszerekkel vagy ezen módszerek kombinációjával állítjuk elő, amelyek mindegyike ismert.
5.1.
A találmány egyik szempontból a HTLV-I-ben a Rex funkció transzdomináns represszorával foglalkozik, különösen a HTLV-I-ben a Rex funkció olyan transzdomináns represszoraival, amelyek szintén hatásosak a funkcionálisan egyenértékű, de szerkezetileg nem rokon Rév funkcióval a HÍV-1-ben.
Különösen módosított kódolószekvenciákat szerkesztettünk és fejeztünk ki, és azt találtuk, hogy rendelkeznek a fenti tulajdonsággal.
A vad típusú rex kódolószekvenciát (lásd 1. ábra) megváltoztattuk egy beszerezhető mutagenezis rendszer segítségével, amely megfelel az „oligonukleotidra irányuló in vitro mutagenezis rendszer, 2. változatának [“Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system Version 2”, Amersham, England (1988), Code RPN. 1523, itt a továbbiakban ezt „Amersham protocol”-ként rövidítjük]. A végső expressziós vektorok szerkesztését egymást követő lépésekben hajtottuk végre:
(1) a rex kódolószekvenciát tartalmazó bakteriofág M13 vektor előállítása, (2) a rex kódolószekvencia mutagenezise és
HU 217 091 Β (3) a mutált gén újraklónozása emlős expressziós plazmidokba.
mutánst szerkesztettünk, beleértve egy deléciós mutánst is. A 29 egy helyre irányuló mutáció helyét és természetét a 3. ábrában adtuk meg. A mutagenezishez felhasznált megfelelő oligonukleotidokat a 4. ábrában soroltuk fel. Ezek mind hordoznak egy BglII restrikciós helyet.
A rex kódolószekvenciát pcRex (=pRex) plazmidból izoláltuk [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738 (1988)]. A vad típusú rex gén más forrásai hozzáférhetők. így a rex gén klónozható például hasonló módon, mint azt a HTLV-I gag, pol, env és tax gének esetében Β. K. De és A. Srinivasen [Nucl. Ac. Rés., 77, No 5. 2142 (1989)] leírják, a szokásos HTLV-I sejtvonalak teljes genomján kívül, mint például a HŰT 102 (TIB 162) és azMZ2 [J. G. Sodroski és munkatársai, Science, 225,381 (1984); I. Miyoshi és munkatársai, Natúré, 294, 770 (1981); V. Manzari és munkatársai, PNAS, 80, 1574 (1983)] például polimeráz láncreakciót használva.
A tat és rév kódolószekvenciákat pgTat és pcRev plazmidokból izoláltuk [Μ. H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181 (1988)]. Más módon is izolálhatok, például HÍV provírus klónból, mint a λΗΧΒΖ (Aids Research and Reference Reagent Program, 1989. június, NIH, katalógusszám 70).
Az előállított különböző rex gének biológiai aktivitását a HÍV-1 rév és a HTLV-I rex géntermékek hatásának érzékeny mérésével vizsgáltuk a különböző gének COS sejtekben való expressziójával [Gluzman és munkatársai, Cell, 23, 175 (1981)]. A vírusszerkezeti proteinek szintézisének a megindításához hasonlóan a Rév és a Rex proteinek indukálják a HIV-1 Tat szabályzó protein megrövidített formájának a termelését [H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181-183 (1988); L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738-740 (1988)]. Egy genomenális HIV-1 tat génnek egy funkcionális HIV-1 rév vagy egy HTLV-I rex génnel együtt történő koexpressziója egy nem összeillesztett tat mRNS citoplazmatikus expresszi ójához vezet, amely a Tatnak egy megrövidített egyexonos formáját kódolja, amely 72 aminosav hosszúságú. A funkcionális Rév vagy Rex protein hiánya lehetővé teszi a 86 aminosavból álló teljes hosszúságú Tat protein expresszióját, amely a Tat kétexonos formájának felel meg. így a rév vagy rex funkció egy aktív transzrepresszorának a jelenléte a 72 aminosavból álló Tat protein csökkent vagy megszűnő termeléséhez vezet. Ez a különbség jól látható az immunprecipitációs analízis során.
Amint a 2C. ábrából látható, a 30 mutánsból 6-ot találtunk, nevezetesen a pcRexM2-t, pcRexM7-et, pcRexM8-at, pcRexM17-et és pcRexl3A15-öt, amelynek transzdomináns Rex represszora volt. Ugyanezt tapasztaltuk a pcRev esetében (lásd 2D. ábra), nevezetesen a pcRexM2-nél, pcRexM7-nél, pcRexM8-nál és részben a pcRexM13-nál, amely jelzi, hogy a transzdominancia nem korlátozódik a HTLV-I génre, és a mutánsok némelyike, nevezetesen ebben a sajátos esetben a pcRexM2, pcRexM7 és a pcRexM8 mindkét gén esetében transzdominánsok.
Minthogy az először kapott eredmények közül néhány azt jelezte, hogy a legeredményesebb mutációk a 87-es és 94-es aminosavhelyek között vannak, és így úgy tűnt, hogy a rex/rev gén egy része körülbelül a 82-es és körülbelül a 97-es aminosavhelyek között fekszik, különleges jelentősége volt a transzdomináns Rex/Rev represszorok szerkesztésének, a további vizsgálatok azt mutatták, hogy a mutációk előnyös helyeinek a kiterjedése szélesebb a Rex proteinben, vagyis ezek legalább olyan közel fekhetnek az N-terminálishoz, mint a 22-es aminosavhely, és legalább olyan távol a C-terminálistól, mint a 101-es aminosavhely.
5.2
A HÍV-1-ben lévő Rév funkcióra irányuló további vizsgálatok során szintén találtunk transzdomináns rév represszorokat. Lehetséges, hogy ezek legalább némelyike szintén gátolja a Rex funkciót a HTLV-I-ben vagy a HTLV-II-ben, de ezt itt nem vizsgáltuk.
Másrészről azt találtuk, hogy ezeknek legalább egy része gátolja a HTV-2-ben és SIVmac-ban a Rév funkciót.
Továbbiakban kiterjedt mutációs analízis a révén belül legalább két elkülönülő funkcionális dómén vázlatos leírásához vezetett, amelyek nélkülözhetetleneknek látszanak a transzaktiválásban. Ezeket a doméneket úgy képzeltük el, mint amelyek tartalmazzák a „kötő domént”, amely a Rév proteint a megfelelő célszubsztráthoz irányítja, és egy „aktivációs domént”, amely lehetővé teszi a kötődés funkcionális következményeit, a transzkripcionális aktiválás szerepének a betöltését.
Következésképpen a révén belül két funkcionális domént határoztunk meg: egy kötődomént, amely valószínűleg a Rév proteint a célsejtjéhez irányítja és egy aktiválási domént, amely lehetővé teszi a nem teljesen összeillesztett azon RNS-ek kijutását a magból, amelyek a Gag és Env proteineket kódolják. A Rév aktiválási doménjének a mutációja hiányos Rév protein expreszszióját eredményezi, amely a Rév funkció transzdomináns inhibitoraként hat. Az ilyen mutánsok jelentősen gátolják a HIV-1 replikációt, ha tenyészetben transzfektált sejtekben fejeződnek ki, és így szintén transzdominánsok, mint az 5.1 fejezetben leírt mutánsok.
Ezen második törekvésre vonatkozó részletes felvilágosítást az alábbi 6.2 fejezetben adjuk meg. Az itt talált transzdomináns mutánsokat a következőképpen jelöltük: ρΜΙΟ, ρΔ9/14 és ρΔ10/14 (lásd a 4-11. példákat) és pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32 (lásd a 1 la. és 1 lb. példákat), a pM 10-ről megállapítottuk, hogy hatásosan gátolja nemcsak a HIV-1 rév génfunkciót, hanem a HIV-2 és SIVmac rév génfunkciót is.
A fenti 9 transzdomináns mutánsok közül a ρΜΙΟ, pM21 és a pM32 előnyösek, különösen a ρΜΙΟ.
5.3
Egy további, a HTLV-I-ben a Rex funkciójára irányuló, az 5.1-hez hasonló vizsgálataink eredményeképpen szintén találtunk transzdomináns represszorokat, és kifejlesztettünk egy módszert, amely lehetővé teszi a Rex aktivitások kimutatását és alkalmazható a Rex funkció olyan specifikus gátlóinak az azonosítására, amelyek általában nem akadályoznak más vírus- vagy gazdasejtfunkciókat. Ez a Rex inhibitorkimutatás egy
HU 217 091 Β olyan genetikus rendszert alkalmaz, amely egy Rex-érzékeny „riporter” gént tartalmaz, amely egy szabályzóelemet magában foglaló mRNS nem összeillesztett formáját, például egy RexRE-t (RRX) kódol. Ebben a rendszerben egy Rex funkcióval rendelkező protein indukálja ennek az össze nem illesztett mRNS-nek a kijutását a sejtmagból a citoplazmába. A Rex funkció hiányában ez az mRNS a citoplazmába való kijutás előtt összekapcsolódik, amint azt a fentiekben jeleztük. Ezen genetikus rendszert tartalmazó sejtek érintkezése a Rex funkció egy várható inhibitorával, a HTLV-I Rex funkció specifikus gátlása megy végbe ennek a szemek a hatására, amelyet ennek a sajátos mRNS össze nem illesztett formájának a magból történő kijutásának a csökkenése jelez, miközben nem csökken ugyanannak az mRNS-nek az összeillesztett formájának a magból való kijutása. Ez a módszer alkalmas például a HTLV-I Rex protein kémiai inhibitorainak a kimutatására, például olyan inhibitorok kimutatására, amelyek képesek a mutáns Rex vagy Rév proteinben a transzdomináns domént utánozni, mint például kis molekulatömegű inhibitorok, valamint a Rex transzdomináns mutáns formák kimutatására, amelyek a Rex represszoraiként hatnak.
A rex gén transzdomináns negatív mutációnak az azonosítására egy sorozat pontmutációt hajtottunk végre, amelyekben különböző helyeken két-három aminosavból álló szegmentumokat változtattunk meg a Rex protein lineáris szekvenciájában, és ezen mutánsok között a HTLV-I Rex proteinnek több transzdomináns represszorát azonosítottuk, amelyek közül több még transzdominánsan represszálja a HTLV-II Rex és/vagy a HIV-1 Rév proteinfunkcióit és így, hasonlóan az 5.1 fejezetben leírt mutánsok néhányához, szintén represszálják egy vírusfaj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját.
Tehát a találmány vonatkozik a Rex protein génaktiválási funkciója specifikus inhibitorának az azonosítási eljárására is, amely a fenti 3. pontban meghatározott lépésekből áll. Amint fent említettük, a HTLV-I Rex protein képes a HIV-1 Rév proteinfunkcióját helyettesíteni. Ezenkívül most azt tapasztaltuk, hogy a Rex képes helyettesíteni az analóg HTLV-II szabályzó proteint, így ezen három vírus bármelyikéből származó mRNSek, amelyek tartalmazzák a Rex által felismert válaszelemet és legalább egy megfelelő, nem használt összeillesztési helyet, felhasználhatók ebben az eljárásban.
Előnyösen a válaszelemet és az összeillesztési helyet tartalmazó mRNS-t egy olyan plazmid kódolja, amely tartalmazza a HTLV-I provírus 3’-végét, beleértve a Rex és Tax proteineket kódoló régiókat, a teljes env gént, a RexRE (RRE) Rex válasz alkotóelemet és a teljes 3’LTR-t. Egy ilyenplazmidra példa a pgTAX-LTR. Az egyszerűség kedvéért a mutáns analízisekben, amelyekben szükséges a mutáns rex génmásolatok és a vad típusú rex génmásolatok arányának az ellenőrzése, a pgTAX-LTR-en lévő rex gént egy recesszív negatív mutáció inaktiválja, és ebben a rendszerben az aktív rex gén a pREX-ként jelölt különálló plazmidon van. Azonban vegyületek vizsgálata esetén például az aktív rex gén ugyanabban a plazmidban vagy más DNS-vektorban lehet, mint amelyet ennek a rendszernek az mRNS-e igényel. Továbbá, ez az aktív rex gén tartalmazhat természetes szekvenciavariánst, amelyet ebben a találmányban alkalmazunk, vagy a rex génnek bármely más mutáns formáját, amely képes úgy kifejeződni, hogy egy olyan proteinterméket hozzon létre, amely rendelkezik a Rex protein génaktiváló funkciójával, beleértve a fenti mRNS magból való kijutásátnak az indukcióját.
A fent felsorolt genetikai rendszer elemei egy retrovírus teljes funkcionális genomját kódoló DNSszegmentum alkalmazásával is előállíthatok; ez alkalmazható fertőzött sejtek esetében is. Biztonsági meggondolásokból azonban, valamint az egyszerűség kedvéért, ez a genetikai rendszer előnyösen nem alkalmazható fertőző vírus termelésére. Ezt úgy tettük lehetővé, hogy a rendszerbe egy genetikai hibát vittünk, amely legalább egy vírus aktivitásexpresszióját megakadályozza, amely nélkülözhetetlen bármely fertőző vírus szaporodásához, amelyekből valamelyik genetikai elemet felhasználtuk. Ezt meg lehet tenni például úgy, hogy a rendszerből kihagyjuk legalább egy részét egy vírusgénnek vagy más mutációval.
Előnyös példáját adják a rex génnel és az mRNS-t kódoló DNS-szegmentummal transzformált gazdasejtnek a COS sejtek, amelyeket a fent leírt plazmidvektorokkal transzfektáltunk. Itt a „transzformáció” kifejezés magában foglalja a „transzfekció” kifejezést, és egy vektor DNS-t magában foglaló genetikus transzformációt jelez, amely vektor DNS a fertőző szert kódolja, főleg egy vírust. Egy ilyen vektor transzfekciója után a tenyészetben lévő transzformált sejtek kisebb részéből szét lehet szómi más sejtek nagy részébe fertőző vírusrészecskék segítségével, ezáltal egy, a gazdasejtek egy nagyobb részéhez lehet juttatni, amelyek az érdekességgel bíró géneket kifejezik. Ezenkívül ebben a genetikai rendszerben a gazdasejteknek a transzformációja nem kell, hogy stabil szerkezetet eredményezzen; akár stabil, akár időleges génexpressziós rendszereket fel lehet használni a szükséges mRNS és rex gén előállítására, így az ismert expressziós rendszerek széles változata alkalmazható az inhibitorok jelen eljárás szerinti azonosítására.
Ebben az eljárásban az mRNS kijuttatásának a csökkenése, amely magában foglalja a nem használt összeillesztési helyet anélkül, hogy ennek az mRNS-nek az összeillesztett formájának kivitele csökkenne, azt jelzi, hogy ez a szer a HTLV-I rex gén aktivitásának vagy a rex gén egy terméke aktivitásának egy specifikus inhibitora. A kémiai szerek esetében, amelyekről megállapítottuk, hogy a jelen eljárás alkalmazásakor specifikus inhibitorok, a hatás módja általában magában foglalhatja az mRNS transzkripciójának vagy transzlációjának a specifikus gátlását. Még valószínűbb módja a hatásnak a Rex protein egy vagy több aktivitásának a specifikus gátlásából áll, beleértve a magban való elhelyezkedést, a Rex válaszelem-felismerést vagy a Rex effektorfunkciót.
Előnyösen az olyan mRNS-nek - amely tartalmazza a nem használt összeillesztési helyet - a magból való
HU 217 091 Β kijutásának a csökkenése az első termelési szintjének a meghatározásával mutatható ki, ezt az első proteint az az mRNS kódolja, amely tartalmazza a nem használt összeillesztési helyet (azaz az mRNS-nek csak a nem összeillesztett formája kódolja ezt az első fehéijét); az mRNS összeillesztett formájának a megnövekedett kijutása a magból kimutatható a második protein termelési szintjének a meghatározásával, ezt a második proteint ezen mRNS-nek az összeillesztett formája kódolja.
Előnyösen az össze nem illesztett formában lévő mRNS kódolja a HTLV-I Env proteineket. Ennek az mRNS-nek az összeillesztése egy rövidebb mRNS-t eredményez, amely egy másik HTLV -I proteint, a Taxot kódolja. Az alábbi 12. és 13. példákban például egy RexRE (RRE) elemet tartalmazó össze nem illesztett mRNS magból történő kijutását az Env protein expressziójával mutatjuk ki. Továbbá az össze nem illesztett mRNS ilyen kijutásának a gátlása, amely a Rex funkció gátlásának az eredménye, kimutatható az Env protein termelésének a csökkenésével. Azonban, minthogy ez a csökkenés a hatóanyagnak a vírusra vagy a gazdasejtre kifejtett általános toxicitásának lehet az eredménye, a rex génfunkció specifikus gátlását az Env expresszió csökkenése és ezzel együtt az mRNS összeillesztett formája kijutásának szinten maradása jelzi, amely a HTLV-I Tax protein termelésének a szinten maradásában nyilvánul meg. így előnyös a HTLV-I Env, Tax és Rex proteinexpresszió egymás melletti analízisének az elvégzése.
Az alábbi 12. és 13. példákban például az Env és Tax proteinek expresszióját megfelelő antitestekkel való immunprecipitációval és a kapott csapadék elektroforetikus analízisével határoztuk meg. A Rex funkció specifikus gátlásának a nagyobb méretű szűrővizsgálata enzimhez kötött immunvizsgálatból (enzyme linked immunoassay, ELISA) állhat az Env és Tax esetében, vagy az mRNS-nek genetikai manipulációval való megváltoztatása más, alkalmasabb termékek előállítása céljából az összeillesztett és össze nem illesztett formák kimutatására. Például az mRNS-t meg lehet változtatni úgy, hogy egy olyan enzimet kódoljon, amely azután színes hidrolízisterméket eredményez, ilyen például az E. coli β-galaktozidáz. Ha ennek az enzimnek a génjét az env gén helyére inszertáljuk, az össze nem illesztett mRNS ezt az enzimet fogja kódolni, míg az összeillesztett forma ezt nem kódolja. Egy másik, hasonlóan megfelelő indikátorgén kódolható az mRNS-be úgy, hogy az az összeillesztett mRNS formában fejeződjön ki, például a Tax-szekvenciákhoz való fúzióval. A gyors és hatásos nagy tömegű szűrővizsgálatra irányuló további törekvések könnyen nyilvánvalóvá válnak a szakemberek számára.
A találmány egy másik szempontja egy reagenskészlet előállítása a fenti módszernek megfelelően a Rex protein génaktiválási funkciója specifikus inhibitorainak az azonosítására, amely magában foglalja a fenti 3. fejezetben leírt komponenseket. Ez a készlet esetleg még tartalmaz a következőkből valamit: sejttenyészeteknél alkalmazott tápközeg; a „riporter” mRNS összeillesztett vagy össze nem illesztett formája magból való kijutási szintjének a meghatározására alkalmazott reagensek, akár közvetlenül, például nukleinsavhibridizációval vagy közvetetten, például ennek az mRNS-nek az összeillesztett vagy össze nem illesztett formájának a proteintermékének az immunológiai kimutatásával; és a fenti reagenskészlet komponensei bármelyikének az alkalmazására vonatkozó útmutatások a találmány módszereivel dolgozók számára.
A fenti módszert felhasználtuk különböző rex gén mutánsoknak domináns negatív mutációra irányuló szűrővizsgálatokban. Ha ezeket a rex gén mutánsokat együtt fejezzük ki a plazmid pgTAX-LTR-rel a találmány szerinti Rex inhibitor kimutatási rendszerben, a mutációk olyan csoportját találjuk, hasonlóan az 5.1 fejezetben leírttal, amelyben a Rex proteinben aminosavhelyettesítések vannak az 59-60, 64-65 és a 119-121 helyeken, amely azt eredményezi a proteinekben, hogy nemcsak a Rex funkció hiányzik, hanem azok a vad típusú Rex proteinfunkciójának a transzdomináns represszoraiként is hatnak és amelyek még a vad típusú Rév proteinfunkciójának a transzdomináns represszoraiként is hatnak.
Ez a mutációs analízis a negatív mutánsok egy második csoportját is létrehozta, amelyek a Rex 5-7 és 14-15 aminosavhelyein szubsztitúciókat tartalmaznak, és amelyek nem rendelkeznek Rex funkcióval. Ezek a mutáns proteinek nem irányulnak megfelelően a sejtmag felé és nem transzdominánsok. Továbbá a negatív mutánsoknak egy harmadik csoportját találtuk, amelyet egyetlen mutáns példáz, amelyben a Rex 141-143-as aminosavhelyein szubsztituált, ez megtartja részben a Rex funkciót és a mag felé irányul, de nem lokalizálódik a mag nukleolusz régiójában. Ez a mutáns protein nem transzdomináns represszora a HTLV-I Rex funkciónak. Ezen eredmények felvetik a lehetőséget, hogy a nukleoluszban való lokalizáció más szekvenciákkal jár, mint az amino-terminálison azonosított pozitív töltésű maradékok [H. Siomi és munkatársai, Cell, 55,197-209 (1988)]. Ezenkívül a tapasztaltak feltételezhetővé teszik, hogy egy Rex protein mutáns a Rex funkció transzdomináns represszoraként szolgál, és hogy a mutánsok a Rex protein számára nemcsak a maghoz irányuló aktivitása szükséges, hanem egy különálló nukleolusz lokalizációs aktivitás is.
Ezek az észlelések a Rex mutánsokkal kapcsolatban a Rex proteinen belül legalább két funkcionálisan különböző peptiddomén közeli kötődését mutatják, az első részt vesz a maghoz és nukleoluszhoz való irányításban, és egy második az effektoraktivitásában vesz részt. A maghoz való irányítottsággal nem rendelkező Rex mutánsok a Rex aminoterminálisán a pozitív töltésű peptiddoménben vannak, amelyről az előzőekben láttuk, hogy nukleolusz lokalizációs szignálként hatnak; ha az aminoterminális 20 aminosavat tartalmazó peptid egy másik proteinhez kapcsolódik DNS-rekombinációval, ez a dómén indukálja ennek a proteinnek a maghoz való irányulását és a nukleoluszban való lokalizációját, hasonló módon, mint azt a Rex esetében megfigyeltük [H. Siomi és munkatársai (1988), lásd fent], így nem
HU 217 091 Β valószínű, hogy a mutáns a Rex 141-143-as aminosavrégiójában van, abban a régióban, amely szükséges a nukleoluszban való lokalizációhoz, még akkor sem, ha ez a mutáns a maghoz irányult, de nem lokalizálódott a mag nukleoluszrégiójában. Valószínűbb, hogy ebben a mutánsban a változás inkább a rex nukleolusz lokalizációs funkcióra van hatással közvetve az aminoterminális doménben, például a megfelelő feltekeredésre hatva.
A Rex másik fő, funkcionálisan különálló doménje az 59-60 (tirozin-izoleucin), 64-65 (tirozin-triptofán) és 119-121 (treonin-fenil-alanin-hisztidin) aminosavakat tartalmazza. Ezen különálló helyek mindegyikének a megváltozása (M6, M7 és Ml3 mutánsok) egy olyan Rex protein képződéséhez vezet, amelynek nincs biológiai aktivitása és nem rendelkezik transzdomináns gátló tulajdonságokkal. Öt különböző mutáció, amelynek nincs hatása a Rex funkcióra, a Rex protein lineáris szekvenciájában elválasztja az M6 és M7 régiókat az Ml3-tól, jelezvén, hogy ezen két különálló régió a funkcionális doménen belül megfelelő fehéijefeltekeredést igényel. így a Rex protein teljes lineáris része tartalmazza az aminosavaknak ezen két régióját, amelyek a legfontosabbak a Rex effektorfunkciójában, és ezért azt a domént jelenti, amelyet mutálni kell a rex transzdomináns represszorának az előállítása céljából.
A jelen észlelések nem irányulnak a rex doménre, amelyben a RexRE (RRX) felismeréséhez szükséges aktivitás van egy mRNS-ben. Tehát nem ismert, hogy vajon a Rex funkció transzdomináns represszoraként szolgáló mutánsnak szükséges-e megtartani a RexREhez vagy más vírus olyan felismerési eleméhez való (közvetlen vagy közvetett) kötődési képességét, amelyet a Rex felismer.
A találmány másik szempontja azzal a DNS-szegmentummal foglalkozik, amely a HTLV-I Rex proteinfunkciójának egy transzdomináns represszorát kódolja, valamint magával ezzel a transzdomináns represszorral. Ez a represszor egy protein, amely a Rex protein vad típusú formájából módosított legalább egy mutációval, amely negatívan befolyásolja a Rex protein effektoraktivitását. Ez a represszor lényegében a Rex protein vad típusú formájának a nukleoluszban lévő aktivitásával rendelkezik. Főleg ennek a represszomak a negatív mutációja egyike azoknak, amelyek a vad típusú Rex protein peptiddoménjében egy aminosavat érintenek, amely peptiddomén körülbelül az 59-es aminosavhelytől körülbelül a 121-es aminosavhelyig teljed, még pontosabban a következő helyek bármelyikében: 69, 60, 64, 65, 119, 120 és 121. A Rex represszort kódoló DNS-szegmentum lehet a következő rex gének bármelyike: M6, M7, M13 és ezek variánsai és származékai, amelyek a HTLV-I Rév proteinfunkció transzdomináns repressziós hatásával rendelkeznek.
Ennek a DNS-szegmentumnak a szekvenciája a HTLV-I bármelyik izolált Rex génjéből származhat [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738-740 (1988); M. Seiki és munkatársai, Science, 227, 1227-1229 (1985)] vagy kémiai szintézissel előállítható. A Rex funkció transzdomináns represszorát standard rekombináns DNS-módszerekkel vagy a peptidszintézis standard kémiai módszereivel vagy ezen módszerek kombinációjával állítottuk elő, amelyek mindegyike jól ismert a géntechnológia területén.
Azokat a mutánsokat, amelyek negatívan hatnak a Rex protein effektoraktivitására, az alábbiakban írjuk le. Azonban a mutációk más típusai is, amelyek célja a proteinszerkezetnek ugyanazon vagy közel ugyanazon aminosavhelyeihez lokalizált hatás elérése, szintén nagyon valószínűen termelnek Rex variánsokat és származékokat, amelyek a jelen találmánynak megfelelően a HTLV-I Rex proteinfunkciónak transzdomináns represszorai. Ezek a lokalizált hibák lehetnek például egyetlen aminosav deléciói vagy inszerciói vagy kémiailag vagy szerkezetileg hasonló aminosavak helyettesítése. Másrészről, kiteijedtebb deléciók vagy inszerciók vagy helyettesítések, amelyek széttörik a másodlagos szerkezetet (például a β-lap régióban egy prolin) valószínűleg hatással vannak a protein távol lévő részeire a protein feltekeredésén keresztül; ezért ezek a mutációk a Rex effektorfunkcióhoz szükséges doménen belül a megjelölt helyeken nem valószínű, hogy olyan mutáns Rex proteint hoznának létre, amelyek lényegében megtartják a Rex protein vad típusú formájának a nukleoluszban lévő aktivitását.
A fenti 5.3 fejezet transzdomináns Rex mutánsainak a Rév funkciót gátló hatását vizsgáltuk, és azt találtuk, hogy a HIV-1 Revnek is a represszorai. A transzdomináns Rex mutánsok ezen osztályának a lehetséges vírusellenes hatását a HIV-1 replikáció gátlására irányuló vizsgálattal bizonyítottuk.
Ezenkívül és amint fent már említettük, most fedeztük fel, hogy a HTLV-I Rex funkcionálisan helyettesíteni képes az analóg HTLV-II szabályzó proteint akkor is, ha a HTLV-II-ben a megfelelő válaszelem nukleotidszekvenciája valamennyire eltér a HTLV-I-ben lévő RexRE (RRX) törzs és hurok szerkezetétől.
A találmány foglalkozik még a HÍV -1, HTLV-I és HTLV-II replikáció gátlásának a módszerével, amely, amint fent meghatároztuk, egy DNS-szegmentumnak egy sejtbe való beviteléből áll, amely a Rex funkció egy transzdomináns represszorát kódolja, és amely sejt rendelkezik ezen vírusok egyikét replikáló képességgel. Ennek a sejtnek megvan azon képessége, hogy kifejezze a DNS-szegmentumot a transzdomináns represszor termelésére. Ez a sejt lehet egy olyan, amelyet előzőleg megfertőzött egy vagy több ezen vírusok közül, vagy ezek a sejtek lehetnek egy vagy több vírus számára nem fertőzött célsejtek.
A fent említett genetikai rendszer előnyös megvalósítása céljából egy Rexre érzékeny „riporter” plazmidot, a pgTAX-LTR-t állítottuk elő (13B. ábra). Részletezve, a pgTAX-LTR vektor tartalmazza a tax génnek a HTLV-I env génnel elválasztott két proteint kódoló exonját és a RexRE (RRE) tartalmú teljes HTLV-I 3’LTR-t. Ezen HTLV-I-szekvenciák expresszióját elősegíti a humán citomegalovírus azonnali korai régiója, és a patkány preproinzulin gén 3’-régiója még poliadenilációs szekvenciákat biztosít [B. R. Cullen, Cell, 46, 973-982 (1986)]. Ez a vektor az Envet csak Rex
HU 217 091 Β jelenlétében termeli, azonban a Tax szintetizálódik a Rex jelenlétében és anélkül is. Ez a vektor maga nem termel Rexet, amely az Sphl helyen lévő mutációnak tulajdonítható, amely egybeesik a Rex transzláció iniciációs kodonjával. A Rex távollétében a pgTAX-LTR Tax proteint termel az ebből a vektorból való összeillesztett mRNS transzlációjának válaszaként, amelyből gyakorlatilag minden env-szekvencia hiányzik. Azonban, ha a pgTAX-LTR a pREX expressziós plazmíddal kotranszfektált, a HTLV-I Env proteinszintézise aktivált. Ez a 62-68 kd méretű protein könnyen azonosítható anti-HTLV-I burkoló (envelope) monoklonális antitest 0,5 α-val való immunprecipitációval [S. Matsushita és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,2672-2676 (1986)] (14A. ábra, 1. sáv). Ezzel ellentétben nem mutatható ki HTLV-I Env protein, ha a pREX-es akár pREV-vel (2. sáv), akár pCMV-Il-2vel (3. sáv) helyettesítjük, amelyek a HÍV-1 Rév proteint, illetve a humán IL-2 polipeptidet kódolják. Hasonló módon nem lehet Env proteint azonosítani, ha a sejteket pREX-szel transzfektáljuk pgTAX-LTR távollétében (4. sáv).
így a fent meghatározott genetikai rendszerben a pgTAX-LTR általi HTLV-I Env expresszió specifikusan indukálódik egy protein jelenlétében, amely a vad típusú Rex protein génaktiváló funkciójával rendelkezik. A rendszerben, amely magában foglal egy Rex funkcióval bíró proteint biztosító gént, ha az érintkezik egy Rex funkciót gátló szerrel, a Tat protein tovább termelődik anélkül, hogy a szer hatással lenne valamilyen vírus vagy sejt aktivitására, amely nincs kapcsolatban a génexpresszióval vagy a gén termékével, amely Rex funkciót fejt ki. így, amint a 12. példában és a 15. ábrában jeleztük, a Rex funkció specifikus inhibitorainak az azonosítására szolgáló, a példában megadott módszer előnyösen magában foglalja a HTLV-I Env, Tax és Rex proteinexpresszió egyidejű analízisét.
Megjegyzendő, hogy a Rex funkciónak az alábbiakban és a 15. ábrában leírt módon transzdomináns represszorokkal való specifikus gátlása esetében a HTLV-I Tax proteintermelése nyilvánvalóan megnövekszik. Ez feltehetően az Env mRNS összeillesztett forma magból való megnövekedett kijutásának az eredménye, amely kivitel a Rex funkció hiányának tulajdoníthatóan az összeillesztés előtt nem történik meg. Azonban általában a Rex funkció specifikus inhibitora kivédheti az mRNS összeillesztését, de a nem összeillesztett RNS kijutását nem indukálja. Ennek megfelelően a Rex funkció specifikus inhibitorainak az azonosítását szolgáló jelen eljárás csak azt igényli, hogy az összeillesztett mRNS magból való kijutása ne csökkenjen, amely a jelen helyzetben a Tax proteint termeli.
Ennek a rendszernek a használatát az alábbi 12. példában magyarázzuk meg. Ebben a mutációs analízisben az Ml 3 bakteriofágban ismét oligonukleotidra irányított mutagenezist alkalmaztunk a rex gén elsődleges szerkezetének a megváltoztatására 25 különböző helyen (13A. ábra). A bekeretezett aminosavakat aszparaginsav-leucin dipeptiddel helyettesítettük oligonukleotid duplex kereten belüli inszerciójával, amely tartalmazza a diagnosztikus Bglll restrikciós helyet. Ezen rex mutánsok mindegyikét ezután inszertáltuk a pBC12/CMV eukarióta expressziós vektorba [B. R. Cullen, Cell, 46,
973-982 (1986)], és a mutációkat DNS-szekvenálással igazoltuk.
A rex mutációk mindegyikének meghatároztuk a biológiai aktivitását a pgTAX-LTR vektorral való kotranszfekcióval. Minthogy ezen rex mutánsok közül tizenkilenc vad típusú fenotípusnak mutatkozott, öt mutáns (Ml, M2, M6, M7 és Ml3) nem rendelkezett env génaktivációs aktivitással, és egy mutáns (Ml5) csak részleges funkcióval rendelkezett (14B. ábra). Ezután COS sejteket kotranszfektáltunk ezzel a hat rex defektív mutánssal és a pgTAX-LTR vektorral, majd elvégeztük egymás mellett a HTLV-I Env, Tax és Rex proteinexpressziójának az analízisét, amint azt a 12. példában leírjuk (lásd a 15A-C. ábrákat is). Míg a HTLV-I Env csak a vad típusú Rex protein jelenlétében (15A. ábra, 7. sáv) vagy a részben aktív Ml 5 mutánsjelenlétében (15A. ábra, 6. sáv) volt kimutatható, a 40 kd Tax protein minden tenyészetben kimutatható volt (15B. ábra). Tehát az Ml, M2, M6, M7 és Ml3 mutánsok esetében megfigyelt env génexpresszió hiánya inkább a Rex biológiai aktivitás specifikus hiányának tulajdonítható, mint ezen proteinek nem specifikus, toxikus hatásainak a transzfektált COS tenyészetekben. Ezekben a tenyészetekben a mutáns Rex proteinek mindegyikét azonosítottuk, amely jelzi, hogy minden mutáns stabil módon kifejeződött. Az M2, M6 és Ml3 mutánsok vándorlása nem különböztethető meg a vad típusú Rex proteintől (15C. ábra, 2., 3., 5. és 7. sávok), míg az M7 és Ml5 proteinek egy kisebb molekulatömeget mutatnak (4. és 6. sávok), és az Ml mutáns protein elektroforetikusan kettős proteinsávot mutat (1. sáv). Az Ml, M7 és Ml5 mutánsokban a proteint kódoló régió szekvenciameghatározása szerint nincs más változás, mint amelyet a specifikus mutációkkal bevittünk. Tehát a méretben megmutatkozó ezen különbségek biokémiai alapja valószínűleg a mutáns Rex proteinek megváltozott poszttranszlációs folyamatát mutatja.
A vad típusú Rex proteinhez hasonlóan a biológiailag inaktív M6, M7 vagy M13 Rex mutánsokkal transzfektált sejtek in situ immunfluoreszcens festése, amint azt a 12. példában részletesen leíijuk, azt mutatja, hogy normál módon célozzák meg a kifejező sejtek nukleoluszát és magját (16. ábra). Éles ellentétben az Ml mutáns protein csak a citoplazmatikus részben volt kimutatható, míg az M2 Rex mutáns közelítőleg homogén módon az egész sejtben. Ezekkel az észlelésekkel megegyező az a tény, hogy az Ml és M2 mutációk megváltozott bázikus aminosavmaradékai a pozitív töltésű peptiddoménen belül helyezkednek el, amely nukleoláris lokalizációs szignálként funkcionál. A részben aktív Ml5 mutáció a mutáns Rex proteinmagban való elhelyezkedéséhez vezet, de eltérően a vad típusú Rex proteintől, az M15 protein nem lokalizálódik egyébként a mag nukleolusz régiójában, tulajdonképpen az Ml5-ről úgy tűnik, hogy kizáródott a nukleoluszból (16. ábra). Ezek az eredmények feltételezhetővé teszik, hogy az N-terminá12
HU 217 091 Β lison a bázikus aminosavaktól távoli maradékok magukban foglalják vagy részt vesznek a Rex nukleoluszban való elhelyezkedésben.
Meghatároztuk a rex mutánsoknak a vad típusú HTLV-I Rex protein és a HIV-1 Rév protein biológiai aktivitását blokkoló képességét (17. ábra). Ha a COS sejteket a pgTAX-LTR-rel és pREX-szel kotranszfektáljuk (A tábla), az M6, M7 és Ml3 mutánsoknak tízszeres molekuláris feleslege egy domináns negatív fenotípusban jelenik meg, amelyben a vad típusú Rex protein aktivitása jelentősen gátolt (3-5. sávok). Ezzel ellentétben az Ml, M2 és Ml5 proteinek recesszív negatív mutánsként hatnak, minthogy a vad típusú protein hatása nem változott (1., 2., 6. sávok). Hasonlóan a HIV-1 Rév proteinje nincs kölcsönhatásban a Rex proteinnel (8. sáv), sem az IL-2-vel (9. sáv).
Ezután a transzdomináns Rex mutánsok Rév funkciót blokkoló képességét határoztuk meg a HIV-1 rendszerben (17B. ábra). Ha a COS sejteket pgTattal és pRewel kotranszfektáltuk, az M6, M7 és Ml3 rex mutánsok tízszeres molekuláris feleslege gátolta a Rév protein hatását (3., 4., 5. sávok), amelyet a Tat protein 72 aminosavas formájának csökkent expressziója bizonyít. Ezen transzdomináns Rex mutánsoknak a HIV-1 vírus replikációt blokkoló képességét is vizsgáltuk (17C. ábra). Egy Rev-hiányos HIV-1 provírus, a pHXB2-Bam-p3 [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, T313 (1988)] replikációját Rex és transzdomináns Rex mutánsok fokozatosan megnövelt mennyiségeinek a jelenlétében tanulmányoztuk COS sejteket transzfektálva ezekkel a plazmidokkal. Amint a HIV-1 p24 Gag protein szintetizált mennyisége mutatja a tenyészet felülúszójában, a transzdomináns Rex mutánsok (M6, M7 és Ml3) a HIV-1 replikáció gátlását dózistól függő mértékben eredményezik. Ezzel ellentétben a Rex recesszív negatív Ml mutánsának nem volt szignifikáns hatása a HIV-1 replikációra.
Az alábbi 12-es és 13-as példák különböző rex mutánsaival kapott észlelései együttesen azt jelzik, hogy a Rex proteinen belül közelítőleg körülhatárolt, legalább két különböző szerkezeti doménnek különböző aktivitásai vannak. így egy domént az Ml és M2 mutációk határoznak meg, amely dómén az N-terminálison helyezkedik el és magában foglalja az 5-7 és 14-15 aminosavakat, és úgy tűnik, hogy szerepet játszik a proteinnek a maghoz és ennél fogva a nukleoluszhoz való irányításában. Ez a pozitív töltésű dómén részt vehet a Rexnek a kötésében akár közvetlenül a RexRE-hez (RRX) vagy más proteinekhez, amelyek közvetlenül érintkeznek ezzel az RNS-elemmel. A második dómén, amelyet fent leírtunk, fontos a Rex effektorfunkcióhoz, és ezért transzdomináns represszorokat termelő módon mutálhatok.
A fenti 5.1, 5.2 és 5.3 fejezetekben leírt észleléseket a következőkben foglaljuk össze:
a) általánosan alkalmazható elvet állapítottunk meg vírusinhibitorok előállítására egy lényeges szabályzóprotein-mutációval, a Rex és Rév mutációjával;
b) ez az elv alkalmazhatónak látszik több vírusfajra ható mutáns szabályzóprotein előállítására; és
c) a szerkesztett és azonosított specifikus transzdomináns mutánsok a következők:
- HTLV-I Rex mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HTLV-I rex génfunkcióit:
- pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM17 és pcRex 13Δ15 (lásd 5.1 fejezetet és 1-3. példákat);
- M6, M7 és M13 (lásd 5.3 fejezetet és 12-13. példákat);
- HIV-1 Rév mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HIV-1 rév génfunkciót:
- ρΜΙΟ, ρΔ9/14 és ρΔ10/14 (lásd 5.2 fejezetet és a 4-11. példákat);
- pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32 (lásd 5.2 fejezetet a 1 la. és 1 lb. példákat);
- HTLV-I Rex mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HTLV—I rex génfunkciót és szintén hatásosan gátolják a HIV -1 rév génfunkciót:
- pcRexM2, pcRexM7 és pcRexM8 (lásd 5.1 fejezetet és a 3. példát);
- M6, M7 és M13 (lásd az 5.3 fejezetet és a 12-13. példákat);
- HTLV-I Rex mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HTLV-I és HTLV-II rex és a HIV-1 rév génfunkciót:
- M6, M7 és M13 (lásd az 5.3 fejezetet és a 12-13. példákat);
- HIV-1 Rév mutáns, amely hatásosan gátolja a HIV-1 rév génfunkciót és szintén hatásosan gátolja a HIV-2 rév és SIVmacrev génfunkciót:
- ρΜΙΟ (lásd az 5.2 fejezetet és a 1 lb. példát).
A következő példák szemléltetik a találmányt. Ezeket nem tekintjük a találmány oltalmi körét korlátozóknak.
6.1
1. példa
Transzdomináns HTLV—Igén szerkesztése
1. A rex kódolószekvencia klónozása az Ml 3 bakteriofág RF-DNS-ébe pg pcRex DNS-t kezeltünk HindlII és EcoRI restrikciós enzimek mindegyikének 10 egységével 20 μΐ restrikciós enzim inkubációs pufferben (10 mM Tris-HCl, pH=7,5; 10 mM MgCl2; 50 mM NaCl; 1 mM ditiotreitol) 37 °C-on 3 órán át. A reakcióelegyet közvetlenül felvittük egy 1%-os agaróz gélre [Seakem FMC Inc. Rockland, ME, USA), amely 1 pg/ml etidium-bromidot tartalmazott, és 50 V-nál és 25 mA-nál 4 órán át elektroforetizáltuk Tris-acetát pufferben [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982), Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 156. oldal]. Az elválasztott DNS-t 366 nm-nél UV-lámpával tettük láthatóvá, és az 1,5 kb méretű rex fragmentumnak megfelelő gélszeletet kivágtuk. A géldarabot 500 μΐ Tris-borát puffer (Maniatis, 156. oldal) tartalmú dialízishüvelybe helyeztük. A DNS-t elektroeluáltuk a pufferbe és -20 °C-on etanollal kicsaptuk.
pg N13mpl0 RF-DNS bakteriofágot HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel kezeltünk, és a 7,2 kb
HU 217 091 Β méretű Ml3 vektor fragmentumot egy 1%-os agarózgélből a fentiekkel azonos módon izoláltuk.
200 mg fág DNS-t és 1 pg cRex DNS-t összekevertünk 20 μΐ ligációs pufferben (50 mM Tris-HCl, pH=7,4; 10 mM MgCl2; 10 mM ditiotreitol; 1 mM ATP) 1 egység T4-DNS ligázzal és 15 órán át inkubáltuk 16 °C-on. Ezt a reakcióelegyet közvetlenül használtuk a transzformációra és a TG1 E. coli törzs lemezre terítéskor (Amersham protocol, 16-18. oldalak).
A megfelelő fág plakkok DNS-ét endonukleáz hasítással vizsgáltuk meg HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel, majd 10 pg/ml etidium-bromidot tartalmazó 1%-os agaróz gélen Tris-acetát pufferben analitikai gél-
| elektroforézisnek vetettük alá. A rex kódolószekvenciát |
| (1) 5’- TG GAC AGA GTC TTA GAT CTG GAT |
| BglII |
| (2) 5 ’ - AC TAT GTT CGG CCA GAT CTC ATC |
| BglII |
| (3) 5 ’ - CC TAC ATC GTC ACA GAT CTC TGG |
| BglII |
| (4) 5’- TCG GCT GAG CTC TTA GAT CTC TTA |
| BglII |
| (5) 5 ’ - AG CTC TAC AGT TCA GAT CTC CTC |
| BglII |
| (6) 5’- GT TCC TTA TCC CTA GAT CTC CCT |
| BglII |
| (7) 5’- CT CCT TCC CCA CCA GAT CTA CCT |
tartalmazó bakteriofágot azonosítottuk, és azt mplOrexnek neveztük el.
Az egyszálas mplOrex DNS-t nagy léptékű előállítási előírás szerint izoláltuk (Amersham protocol 24-25. oldalak).
2. Az mplOrex-ben lévő rexet kódolószekvencia mutagenezise
A mutagenezis előfeltételeként szükséges volt megfelelő egyszálas DNS-molekulát szintetizálni. 29 oligonukleotidot állítottunk elő (lásd 4. ábra), amelyek végül 30 mutánshoz vezettek, amelyek közül a következő hét oligonukleotid közvetlenül vagy közvetve (lásd 2. példa) olyan mutánsokhoz vezetett, amelyekről azt állapítottuk meg, hogy transzdomináns fenotípusok:
| ACC | CAG | TCT | -3 |
| GTC | ACG | CCC | -3 |
| CCA | CCT | GTC | -3 |
| TCC | CTC | GA | -3 |
| GAC | TCC | CCT | -3 |
| CCT | TCC | CCA | -3 |
| CTA | AGA | CCC | -3 |
Bgl II
A rex proteinben az (1) oligonukleotid a fenil-alanin (30-as hely), fenil-alanin (31-es hely) és szerin (32-es hely) aminosavakat leucin (30-as hely), aszparaginsav (31-es hely) és leucin (32-es hely) aminosavakkal helyettesíti. 35
A (2) oligonukleotid a Rex proteinben az alanin (58-as hely) és tirozin (59-es hely) aminosavmaradékokat aszparaginsav (58-as hely) és leucin (59-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
A (3) oligonukleotid a Rex proteinben a prolin (63as hely) és tirozin (64-es hely) aminosavmaradékokat aszparaginsav (63-as hely) és leucin (64-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
A (4) oligonukleotid a Rex proteinben a tirozin (87es hely), szerin (88-as hely) és szerin (89-es hely) aminosavmaradékokat leucin (87-es hely), aszparaginsav (88-as hely) és leucin (89-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
Az (5) oligonukleotid a leucin (90-es hely) és szerin (91-es hely) aminosavmaradékokat aszparaginsav (90es hely) és leucin (91-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
A (6) oligonukleotid a szerin (94-es hely) aminosavmaradékot leucin aminosavval helyettesíti.
A (7) oligonukleotid a Rex proteinben az arginin (100-as hely) és glutaminsav (101-es hely) aminosavmaradékokat aszparaginsav (100-as hely) és leucin (101-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
Minden oligonukleotid BglII restrikciós helyeket visz be a rex kódolószekvencia leolvasási keretébe.
Az oligonukleotidokat egy Applied Biosystems 3 80A szilárd hordozó szintetizátorral szintetizáltuk βciano-etil-foszforamidit-kémiát alkalmazva. A tisztítást 8%-os poliakrilamidgél-elektroforézissel, ezt követően a fő termék eluciójával és etanolos kicsapásával végeztük. Az oligonukleotidok foszforilációját ATP-vel és polinukleotid kinázzal végeztük, amint azt az Amersham protocol 13. oldalán leírják. Az oligonukleotidra irányuló mutagenezis reakciót az Amersham protocol 13-16. oldalain leírtak szerint végeztük. Ezt követte a transzformáció és a TG1 E. coli törzs lemezekre terítése, amint azt a 21-24. oldalakon leírtuk. A különböző plakkok DNS-ét restrikciós endonukleázos analízissel végzett szűrővizsgálatnak vetettük alá BglII és EcoRI enzimeket alkalmazva.
Mind a hét mutációból egy kiónt azonosítottunk, amelyek a rex kódolószekvenciában tartalmazzák a mutációt. Ezeket a kiónokat a következőképpen neveztük el: mpl0rexM2, pml0rexM7, mpl0rexM8, mpl0rexM13, mpl0rexM14, mplOrexMló és mpl0rexM17. Egy további kiónt, az mpl0rexM15-öt használtuk fel a deléciós mutáns szerkesztéséhez (lásd
2. példa).
3. A mutált rex gének ismételt klónozása emlős expressziós plazmidokban
A mutált rex géneket visszavittük az Μ13 bakteriofág vektorból az eredeti expressziós plazmidba. 5 pg pcREx DNS-t inkubáltunk 10 egység HindlII és 10 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal 37 °C-on 3 órán át. A reakcióelegyet közvetlenül felvittük egy 1%-os
HU 217 091 Β agarózgélre, amely 10 μg/ml etidium-bromidot tartalmazott, és Tris-acetát pufferben 50 V-nál és 25 mA-nál 4 órán át elektroforetizáltuk. A HindlII-EcoRI vektor fragmentumot a megfelelő gélszeletből elektroeluáltuk és etanollal kicsaptuk.
A 2. pontban leírtak szerint kapott mutánsok 5 pgját azonos módon kezeltük, és izoltáltuk a rex kódolószekvenciát tartalmazó fragmentumokat.
Az izolált vektor fragmentum 200 ng-ját és 1 μg izolált rex-szekvenciát összekevertünk külön-külön 20 μΐ ligációs pufferben 1 egység T4-DNS ligázzal és 15 órán át 15 °C-on inkubáltuk. A kapott reakcióelegyet közvetlenül felhasználtuk a HB101 E. coli törzs transzformálására. A különböző baktériumtelepek DNS-eit HindlII, Asp718 és BglII restrikciós endonukleázok felhasználásával, majd 1%-os agarózgél-elektroforézissel analizáltuk. Az így azonosított, rex gént hordozó plazmidokat a következőképpen neveztük el: pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRecM14, pcRexM 15, pcRexM 16 és pcRexM 17.
2. példa
Deléciós mutáció szerkesztése a rex kódolószekvenciában μg pcRexM 13 DNS-t kezeltünk BglII és EcoRI 10 egységeivel. A nagyobb DNS-fragmentumot és a rex kódolószekvencia 5’-részét izoláltuk a fent leírtak szerint. Párhuzamosan 5 μg pcRexM 15-öt kezeltünk hasonló módon, és izoláltuk a kisebb DNS-fragmentumot, amely a rex kódolószekvencia 3’-as részét tartalmazza.
Az izolált pcRexM 13 DNS-fragmentum 200 ng mennyiségét összekevertük az izolált pcRexM 15 DNSfragmentummal, és 20 μΐ ligációs pufferben 1 egység T4-NDS ligáz jelenlétében 16 °C-on 15 órán át inkubáltuk. Ez a művelet egy olyan rex kódolószekvenciát eredményezett, amelyben a 87-es, 88-as és 89-es aminosavhelyek azonosak a pcRexM 13-as kiónéval, és a 90-94-es helyek deletáltak.
Ezután a reakcióelegyet közvetlenül felhasználtuk a HB101 E. coli törzs transzformálására. A különböző kiónok DNS-ét szűrővizsgálatnak vetettük alá restrikciós endonukleázos emésztéssel HindlII, Asp718 és BglII enzimeket alkalmazva. Egy pozitív kiónt azonosítottunk, és azt pcRexl3A15-nek neveztük.
3. példa
Biológiai aktivitás
a) A mutáns gének biológiai aktivitása emlőssejtekben
A vad típusú rex és mindegyik mutáns rex génexpressziós vektor 0,25 μg-ját összekevertük 0,25 μg genomiális tat (transzaktivátor) pgtat expressziós vektorral [Μ. H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181 (1988)] és COS sejtvonalba transzfektáltuk, amint azt Cullen leírja [B. R. Cullen, Meth. Enzymol., 152, 684-703 (1987)]. 60 órás poszttranszfekciós tenyészeteket 3 órán át jeleztünk 300 μΟΐ/ιπΙ 35S-ciszteinnel, és analizáltuk a HIV-1 Tat és a HTLV-I Rex protein expresszióját immunprecipitációs módszenei. A Tat 1-61 aminosavmaradékaival szembeni nyúl-antipeptidantitestet és a Rex 173-189 aminosavmaradékaival szembeni nyúl-antipeptidantitestet alkalmaztunk ebben a kísérletben, amint az Cullen leírja [B. R. Cullen, J. Virol., 62, 2498—2501 (1988)]. A kicsapott proteineket újra szétválasztottuk SDS/poliakrilamid gélben és autoradiográfiával láthatóvá tettük.
A pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14 és pcRex 13Δ15 vektorokban lévő rex mutáns gének a rex hatásnak egy negatív fenotípusát eredményezik ebben a vizsgálati rendszerben (lásd 2B. ábra, D, E, F, Η, I és K sávok), míg a kontrollok (B és C sávok) és más mutánsok (G sáv) pozitív fenotípust adnak.
Ezen fenotípusosan negatív Rex mutáns kiónok mindegyike képes egy Rex-specifikus proteint termelni, amelyet a fent leírt poliklonális anti-Rex antitest felismer (2A. ábra, C-E és G-I sávok). Ezzel ellentétben a pcRexM 16 kiónban lévő mutáció a Rex-specifikus antitest által fel nem ismerhető proteint eredményez; ez annak tulajdonítható, hogy a protein felezési ideje csökkent (nem mutatjuk be).
b) A vad típusú HIV-1 rex és/vagy HTLV-I rex funkció transzdomináns repressziója pcRexM2-vel, pcRexM7-tel, pcRexM8-cal, pcRexM13-mal, pcRexM14-gyel, pcRexM17-tel és pcRexl3A15-tel Ugyanazt a kísérleti sort alkalmaztuk a rex mutánsok azon képességének a meghatározására, hogy transzban gátolják-e a vad típusú Rév és Rex proteinfunkciót. 0,25 pg pgtat genomiális tat expressziós vektort, 0,25 pg vad típusú rév (pcRev) vagy a vad típusú rex (pcRex) expressziós plazmidot és a rex mutáns expressziós plazmid (5 pg) mindegyikének a feleslegét külön összekevertük és COS sejtekbe transzfektáltuk. A mutánsok vad típusú Rév és Rex funkcióra gyakorolt hatását Tatspecifikus immunprecipitációval mértük a fent leírtak szerint.
Ennek a kísérletnek az eredménye azt mutatta, hogy a hat rex mutáns, a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 és pcRexl3A15 rendelkezik a vad típusú rex által közvetített transzaktiválást gátló képességgel (lásd 2C. ábra, C, D, E, G, H és I sávok), és hogy négy rex mutáns, a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8 és (részben) a pcRexM 13 rendelkezik a vad típusú rév által közvetített transzaktiválási képességgel.
A kísérletek ezen sora igazolja proteinszinten a Rév és/vagy Rex funkció transzdomináns represszióját a fenti rex mutánsokkal.
Az 1-3. példák eredményei láthatóan mutatják a HTLV-I Rex proteinben két funkcionális dómén létét. Az aminoterminális irányában két mutáns van (pcRexM7 58-as, 59-es aminosavhelyek és pcRexM8 63as és 64-es aminosavhelyek), amelyek a Rév és Rex proteinekben transzdominánsak. Egy második csomópont, amely csak a Rex proteinre transzdomináns mutánsokat tartalmaz, a kódolószekvenciának a középrészén helyezkedik el. Az ezen kívüli rev/rex transzdomináns mutáns (pcRexM2, 30-32-es aminosavhelyek), amely a maglokalizációs szignál és a csomópont között helyezkedik el, magában foglalja a 7-es és 8-as mutánsokat, és része lehet egy harmadik funkcionális doménnek vagy másképpen a bevitt aminosavválto15
HU 217 091 Β zás megzavarhatja a protein harmadlagos szerkezetét, amely a megfigyelt transzdomináns fenotípust eredményezi.
6.2
4. példa
Csoportos pont- és deléciós mutációk a Revben
A Rév protein in vivő a szerinen foszforilált és túlnyomóan a sejtmagban helyezkedik el, ahol a nukleoluszokban koncentrálódik. Az alább leírt mutációs analízis más faktorok mellett kiemeli ezen tulajdonságokat, mint a HIV-1 szerkezeti génexpresszió transzaktivátorának a Rév funkció számára való fontosságát.
Csoportos pontmutációkat (pM) vittünk be a HIV-1 Rex HXB-3 törzsbe oligonukleotidra irányuló mutagenezissel, amint azt Taylor leírja [Taylor, Nucleic Acids Rés., 73, 8765-8785 (1985)]. Pontosabban, egy bakteriofág M13 mutagenezis rendszert alkalmaztunk (Amersham Corp. Arlington Heights, IL, USA) a célzott nukleotid helyettesítésének bevitelére a teljes hosszúságú cDNS rév másolatokba, amelyet a pcREV expressziós vektor kódol [Malim és munkatársai, Naure, 335,181-183 (1988)]. A pcREV DNS és megfelelő aminosavszekvenciáját a 6. ábra mutatja be.
A csoportos pontmutációk sorozatát vittük a Revbe (lásd Ml-14, 5. ábra), klónoztuk, és szekvenciájukat didezoxinukleotid-szekvenálási rendszerrel bizonyítottuk (Stratagene, La Jola, CA, USA). A mutációk egyenletesen oszlanak el a Revben, és arra szolgálnak, hogy a benne lévő 11-es szerinmaradékot célozzák meg. Minden egyes mutációt körülvevő DNS-szekvencia (pMl -pM14) a 7. ábrában látható, a megváltozott nukleotidokat aláhúztuk.
A megvizsgált mutációk legtöbbje a kodonokban aszparaginsav- (Asp) és leucin- (Leu) helyettesítést eredményezett, ezeket a maradékokat bekereteztük az 5. ábrában. A mutációkra való hivatkozás megkönnyítésére a Révén belüli elhelyezkedésük szerint jelöltük azokat, például a pMl az N-terminálishoz legközelebbi mutáció és a pM14 a C-terminálishoz legközelebbi mutáció.
A különböző pM mutánsok pontos szerkezetén a 7. ábrában látható, hogy az illető mutációk nagyobb része csak két kodont érint. Ezen általánosítás alól kivétel az M4 és M13, amelyek három kodont érintenek és az M6, amely négy kodont érint. A legtöbb esetben az aminosavhelyettesítések egy két aminosavas téves mutációból erednek, azonban a pM6-ban az Asp és Leu négy argininmaradékot helyettesít, ezáltal egy két aminosavas deléciót eredményez, míg a pM4 és pMl 3 még egy kapcsolódó aminosavhelyettesítést foglal magában, amelyet nem figyeltünk meg az eredeti REV-ben. A pM 14-ben a helyettesítés az aszparaginsav tirozinra való helyettesítését jelenti a 23-as helyen, míg a pM 13-ban valin helyettesíti a 109-es helyen lévő izoleucint. Ezek a további változások egyetlen bázishibából erednek az egyszálas DNS oligonukleotid indítóanyagban, amelyet a mutagenezis eljárásban alkalmazunk.
Minden pontmutáció egyedül álló BglII helyek képződését eredményezi, kivéve a pM7-et, amelyet két szomszédos szerinmaradék egyszerű deléciójával szerkesztettünk (lásd 5. ábra). A BglII helyeket mind ugyanabba a transzlációs keretbe inszertáltuk, ezáltal megkönnyítve a Rév ezt követő N-terminális és C-terminális deléciós mutánsainak (ρΔ) a szerkesztését. A ρΔ mutánsokat a deléció helye szerint jelöltük, például ρΔΙ 1/14 a bevitt pMl 1 és pM14 mutációk között tartalmaz deléciót.
5. példa
A Rév mutánsok expressziója
A pBC12/CMV vektoron alapuló [B. R. Cullen, Cell, 46, 973—982 (1986)] eredeti citomegalovírus azonnali korai promoterét alkalmaztuk negatív kontrollként. A pgTAT expressziós vektor genomiális tat gént is felhasználtuk itt, valamint a pBCl 2/RSV/SEAP kiválasztott alkalikus foszfatáz génexpressziós gént is [Malim és munkatársai, lásd fent, illetve Berger és munkatársai, Gene, 66, 1-10 (1988)].
A pcREV expressziós vektort módosítottuk, hogy az itt leírt pM és ρΔ rév mutánsokat kifejezze. A HIV-1 rév és tat mutánsokban való expressziójának a vizsgálatára minőségi vizsgálatot alkalmaztunk, amely a módosított pcREV-nek a pgTAT-tal együtt COS sejtekbe való kotranszfekciójából áll [Malim és munkatársai, lásd fent; és Malim és munkatársai, Natúré, 338, 254-257 (1989)]. Pontosabban, COS sejttenyészeteket (35 mm) kotranszfektáltunk DNS által közvetített transzfekciókkal, amint azt Cullen leírja [Meth. Enzymol., 752, 684-703 (1987)] 0,25 pg pgTAT-ot és 0,25 pg vad típusú vagy egy módosított pcREV expressziós vektort alkalmazva DEAE dextránnal és klorokinnal.
Hatvanórás poszttranszfekcióval a tenyészeteket [35S]-ciszteinnel és [32P]-szervetlen foszfáttal ([32P]-Pi) párhuzamosan jeleztünk Malim által leírt módon [Malim és munkatársai, lásd fent; és Hauber és munkatársai, J. Virol., 62, 4801-4804 (1988)]. Ezután a sejteket lizáltuk RIPA pufferrel, és a rév és tat expresszió relatív szintjét a tenyészetben immunprecipitációs analízissel vizsgáltuk nyúl poliklonális antipeptidantiszérumot használva [Malim és munkatársai (1988), lásd fent; és Cullen és munkatársai, J. Virol., 62, 2498-2501 (1988)]. Még pontosabban, a Rév 1-20 aminosavmaradékaival szembeni (RÉV-1/20) antiszérumot használtunk a pM5 és pM6 által kódolt mutáns proteinek immunprecipitációjához, míg a Rév 27-51 aminosavmaradékaival szembeni antiszérumot (REV27/51) használtuk minden más mutáns protein immunprecipitációjához. A tat expresszió immunprecipitációs analízisét a Tat 1-61 aminosavmaradékaival (TAT1/61) szembeni nyúl poliklonális antipeptidantiszérummal végeztük.
Az immunprecipitációval kicsapott proteineket 14%-os szakaszos SDS-akrilamid gélen elektroforetizálva választottuk szét és autoradiográfiával tettük láthatóvá. Ezen kísérletek eredményeit a 8. ábrában mutatjuk be, ahol az ismert molekulatömegű markerek elmozdulását az ábra jobb oldalán tüntettük fel.
A [35S]-ciszteinnel és [32P]-Pi-vel jelzett tenyészetek immunprecipitációját anti-Rev antiszérummal végeztük, és ezeket a 8A. és 8C. ábrákban mutatjuk be.
HU 217 091 Β
A [35S]-ciszteinnel jelzett tenyészetek immunprecipitációja eredményeképpen a téves (pM) mutánsok nagyobb részében olyan intenzitású és mobilitású sávok képződnek, amelyek hasonlóak a vad típusúéhoz (8A. ábra, 1-14. sávok). Kivétel ez alól az általánosítás alól a pM6 mutáns, amely egy kismértékben gyorsabban elmozduló intenzív sávot ad (Mr~18 kd) és a pMl, amely egy szignifikánsan lassabb elmozdulású sávot ad.
A tat expresszió anti-Tat antiszérummal végzett immunprecipitációs analízis lehetővé teszi a rév funkció minőségi analízisét pgTAT-ot alkalmazva modellindikátorként. Amint a fentiekben jeleztük, rév távollétében a pgTAT egy teljesen összeillesztett citoplazmatikus tat mRNS-t fejez ki, amely kizárólag a tat protein kétexonos 86 aminosavas formáját kódolja. Rév jelenlétében azonban a pgTAT az össze nem illesztett tat mRNS citoplazmatikus expresszióját indukálja, amely a megrövidített, 72 aminosavas hosszúságú protein egyexonos formáját kódolja.
A vad típusú rév 19 kilodalton (kD) relatív molekulatömeg (Mr) szerint vándorol, és könnyen kimutatható a 8. ábrában (0. sáv), míg a tat 86 aminosavas és a 72 aminosavas formái 15,5 kd, illetve 14 kd szerint vándorolnak. Az áltranszfektált tenyészetek ezen kísérleti körülmények között nem adnak specifikus jelet [Malim és munkatársai (1988), lásd fent], míg a 8B. ábrában bemutatott viszgálat a teljes tat protein hasonló szintjének a szintézisét mutatja a mutáns expressziós vektorokkal transzfektált tenyészetekben, mint az indikátor konstrukciójú pgTattal kotranszfektált tenyészet esetében. Ez feltételezhetővé teszi, hogy a mutáns Rév proteinek egyike sem volt toxikus a transzfektált sejtekre.
Ez az analízis azt is mutatja, hogy a Rév téves mutánsai közül 5 és a deléciós mutánsai közül 2 hatástalan (4-7., 10., 16. és 20. sávok), míg az összes többi Rév mutáns teljes mértékben képes indukálni a 72 aminosavas Tat expressziót. Az inaktív, téves mutációk közül négy egy csoportban helyezkedik el a 23-as és 56-os aminosavmaradékok között (M4-M7), míg az ötödik inaktív mutánst (pMlO) két teljesen működő mutáns választja el és a 78 és 79-es maradékokat érinti. A Révnek akár az N-terminális (ρΔ1/2) közelében 4 maradék vagy a C-terminálisa közelében 21 maradék deléciójának (pAl 1/14) csekély vagy semmi hatása nincs a rév funkcióra. Ezzel szemben a 9-es és 17-es helyek közötti maradékok (ρΔ1/3) további deléciója a rév funkció elvesztését eredményezi.
6. példa
A rév mutánsok transzaktivációs kapacitása
Abból a célból, hogy pontosabban kiértékeljük a rév mutánsok transzaktivációs képességét, transzban azok alkalmasságának a megvédésére, a HÍV-1-nek egy replikációhiányos rév mutánsát vizsgáltuk. Ennek az analízisnek a céljaira a pHIV-1 rév vektor rév HIV-1 provírusát alkalmaztuk, amelyet Feinberg pHXB2Bam-p3nak nevezett [Feinberg és munkatársai, Cell, 46, 807-817 (1986)], amely az 59-es aminosavnál a rév második kódolóexonjában egy leolvasási keret eltolódásos mutációt tartalmaz, amely a provírust alkalmatlanná teszi a replikációra, azaz alkalmatlanná arra, hogy egy hatásos Rév proteint termeljen COS sejtekbe transzfektálva, és nem jön létre kotranszfekció HIV-1 rév expresszióra képes vektorral transzban [Rimsky és munkatársai, Natúré, 335,738-740 (1989)].
A mutánsok rév provírust segítő képességét a 9. ábrában megadott módon analizáltuk vírusreplikációval a tenyészet felülúszójába kijutó HIV-1 p24 Gag protein (pg/ml) szintjének a mennyiségi mérésével, az oldható p24 Gag expresszió mérésére ELISA-vizsgálati módszert alkalmaztunk (DuPont-NEN Inc. Billerica, MA, USA) az előállító által megadott standardokat használva.
A kontroll céljaira a transzfekciós hatékonyságot ellenőriztük a tenyészeteket Revre nem érzékeny pBC12/RSV/SEAP vektorral (12,5 ng/tenyészet) kotranszfektálva, amely egy kiválasztott alkalikus foszfatáz (SEAP) génexpressziós vektor. Ennek megfelelően a SEAP-szinteket párhuzamosan mértük a felülúszó p24 Gag szintjével. Ezenkívül néhány tenyészetet kotranszfektáltunk 125 ng bBcl2/CMV (NEG) negatív kontrollvektorral vagy egy vad típusú rév génexpreszsziós vektorral (pcREV).
COS sejttenyészeteket (35 mm) kotranszfektáltunk 250 ng pHIV-1 rewel és 125 ng kontrollvektorral vagy a módosított mutánst tartalmazó vektorok egyikével. A felülúszóból 65 órával a transzfekció után mintát vettünk és mértük a p24 Gag proteinexpressziós szintet. A SEAP-szinteket párhuzamosan mértük. A kapott eredményeket a 9. ábrában adjuk meg, a felülúszó SEAP szintjei csekély változásainak a korrekciójával (az átlag SEAP-aktivitást 1,00 egységnek véve, a megfigyelt standard deviáció ±0,14 volt, és 1,30 és 0,79 között volt).
A SEAP-aktivitás felülúszóban lévő szintjének kis eltérése volt látható ebben a kísérletben, így egyenértékű transzfekciós hatékonyságot mutatott, és bizonyította, hogy a mutáns nem indukál sejttoxicitást. A pHIV-1 rév transzfekció egyedül nem eredményezi a p24 Gag protein kimutathatóságát a tenyészet felülúszójában (NEG sáv), míg egy vad típusú rév génexpressziós vektor hatásosan kiegészítette a pHIV-ΙΔ Rév képességét, hogy indukálja a p24 Gag-termelést (pcREV sáv).
Ezenkívül minden, a pgTAT-οπ alapuló vizsgálatban pozitívnak talált Rév mutánst a 8B. ábrában mutatunk be, amely a kivédő vizsgálatban (rescue assay) a vad típusú rév szerkezetnél talált aktivitás 50-100%-a közötti aktivitásszintet elérte, az Ml kivételével, amely -30% aktivitást ért el, egy olyan csökkenést, amely az Ml mutáns csökkent in vivő stabilitását tükrözheti. Minden mutáns, amelyet a 8B. ábrában negatívan jelöltünk, kivédő vizsgálatban (rescue assay) teljesen negatív volt (azaz -10 pg/ml p24 Gag), kivéve az M7-et, amely alig termelt a felülúszóban kimutatható szintű p24 Gag proteint.
7. példa
A Rév protein biológiai aktivitásához nem szükséges a foszforiláció
Az in vivő kifejezett HIV-1 Rév protein egy vagy több szerinmaradéka foszforilált. Az 5. ábrában felsorolt
HU 217 091 Β mutációk a rév kódolószekvencián belül a 11 szerinmaradék mindegyikét érinti. Ezért a tamszfektált COS sejttenyészetekben átmenetileg kifejezett immunprecipitált [32p]_pi jelzett Rév proteineket megfigyeltük, hogy a HIV-1 rév in vivő foszforilációs helyeit azonosítsuk (8C. ábra). A revbe való [32P]-Pi-belépülés szintjének a [35S]-citeszin-beépüléssel való összehasonlítását a párhuzamosan transzfektált tenyészetben (8A. ábra) használtuk fel az egyedi mutációk foszfátbeépülés szintjére gyakorolt hatásának megállapítására. Ezen összehasonlítás eredményeit az I. táblázatban foglaltuk össze.
I. táblázat
A HÍV -1 rév gén mutánsok fenotípusos analízise
| Klón | Rcv- funkció’ | Foszfo- rilálás | Sejten belüli elhelyezkedés | Transzdo- mináns rcprcssziód |
| vad típus | + | N | ||
| Ml | + | + | ||
| M2 | + | + | N | |
| M3 | + | + | N>C | |
| M4 | - | + | N>C | - |
| M5 | - | ± | C>N | - |
| M6 | - | - | C>N | - |
| M7 | - | + | N>C | - |
| M8 | + | + | N>C | |
| M9 | + | + | N | |
| M10 | - | + | N | + + |
| MII | + | N | ||
| M12 | + | + | N | |
| M13 | + | + | N | |
| M14 | N | |||
| Δ1/2 | + | ± | N | |
| Δ1/3 | - | - | N>C | - |
| Δ9/14 | - | nd | nd | |
| Δ10/14 | - | ± | N | |
| Δ11/14 | + | ± | N | |
| Δ12/14 | ± | N | ||
| j Δ13/14 | + | + | N |
a + + : 50-100% vad típus (wild tipe, Wt=vt); +: 5-50% vit;-: 5% vt;
b + +: összehasonlítható a vt-vel; +: 30-60% vt; ±: 5-20% vt; nincs kimutatható foszforiláció; nd: nem vizsgáltuk (nőt done);
c ?: immunfluorcszccnciával nem mutatható ki; nd: nem vizsgáltuk (nőt done);
d + +: nagymértékben transzdomináns; + : mérsékelten transzdomináns; -: nem mutatható ki transzdominancia.
Az I. táblázatban összegezett analíziseredmények alapján négy téves mutációt azonosítottunk, amelyek csökkent foszforilációt eredményeztek. Ezek közül az
M2 és M12 mérsékelt hatást fejt ki a foszfátbeépülésre (-30%, illetve -60% gátlás), míg az M5 és M6 igen nagy mértékben csökkentik a foszfátbeépülés szintjét. Az M5 és M6 mutációknak a rév foszforilációjára kifejtett nagymértékű hatásának a lehetséges okát az alábbiakban tárgyaljuk részletesen, ezek a mutációk nem érintik a szerinmaradékok egyikét sem.
A Revben lévő foszfátreceptor szerinmaradékok további helyének a megállapítására a deléciós mutánsok (ρΔ) foszforilációjának mértékét tanulmányoztuk (8C. ábra, 15-20. sávok). Ez az analízis azt mutatja, hogy a ρΔ13/14 mutáció normálisan foszforilált, míg a ρΔ12/14 deléció és a nagyobb C-terminális deléciók csak csekély szintű foszforilációt (-90% gátlás) mutattak. Hasonló módon a ρΔ1/2 Rév mutáns, amelyet hatásosan jeleztünk [35S]-ciszteinnel, szintén alacsony szintű [32P]-Pibelépülést mutatott (-90% gátlás).
Nem világos, hogy azon delécióknak, amelyek az M2 és M12 mutációk helyére terjednek ki, miért nagyobb a hatásuk a foszforiláció szintjére, mint ezek téves mutációinak. Azonban az eredmények megegyeznek azzal a feltételezéssel, hogy a Rév protein a szerinfoszforiláció két elsődleges helyét tartalmazza, az egyik a 8-as maradékban van (M2), és a második a 99-es maradékban (Ml2). Bármelyik esetben azon mutánsok, amelyekben nincsenek meg ezek a maradékok (azaz a pM2, ρΔ1/2, pM12, ρΔ12/14) közelítőleg a Rev-aktivitás vad típusának a szintjét mutatják. Ezért levontuk azt a következtetést, hogy a Rév foszforilációja nem feltétlenül szükséges a HIV-1 szabályzóprotein transzaktivációs funkciójához a transzfektált sejtekben.
8. példa
A Rév elhelyezkedése a sejtmagban
Azt, hogy a Rév protein túlnyomóan a sejtmagban helyezkedik el, főleg a kifejező sejtek nukleoluszaiban, a mutánsok analízisével bizonyítottuk közvetett immunfluoreszcencia alkalmazásával. A transzfektált COS sejttenyészetek fáziskontraszt és megfelelő immunfluoreszcens vizsgálataival kapott eredmények a 10. ábrán láthatók.
A transzfektált COS sejteken belüli Rév protein helyének a megállapítására alkalmazott közvetett immunfluoreszcencia alkalmazásával. A transzfektált COS sejttenyészetek fáziskontraszt és megfelelő immunfluoreszcens vizsgálataival kapott eredmények a 10. ábrán láthatók.
A transzfektált COS sejteken belüli Rév protein helyének a megállapítására alkalmazott közvetett immunfluoreszcenciás módszert Cullen leírása szerint végeztük [B. R. Cullen, Meth. Enzymol., 152, 684 (1987); és B. R. Cullen, J. Virol., 62, 2498 (1988)], azzal az eltéréssel, hogy egy módosított paraformaldehiden alapuló sejtrögzítő eljárást alkalmaztunk [Ruben és munkatársai, J. Virol., 53, 1-8 (1989)]. Pontosabban, a sejteket nyúl poliklonális anti-Rev peptid antiszérummal, majd rodaminnal konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel kezeltük.
A primer nyúl anti-Rev antitestet 1:8000 arányú hígításban használtuk. A Rév mutánsok nagy részének az analíziséhez RÉV 1/20 antitestet alkalmaztunk, kivéve a
HU 217 091 Β ρΔ1/2 és ρΔ1/3 vektorokkal transzfektált tenyészeteket. Ezek esetében REV27/51 antitestet használtunk. A második antitestet, a rodaminnal konjugált kecske anti-nyúl IgG-t (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) 1:50 arányú hígításban használtuk.
A Rév mutánsok a sejten belüli elhelyezkedés szempontjából négy csoportra oszlanak, amelyeket az ábrában jelöltünk meg. A következő kategóriák voltak:
N: mag/nukleolusz, a citoplazmában nem kimutatható expresszióval;
N>C: csekély expresszió a citoplazmában;
N>C: nyilvánvaló citoplazmatikus expresszió, bizonyos magban lévő koncentrációval;
C>N: véletlenszerű eloszlás a sejtben.
Ezen eloszlásokat bemutató példák az ábrában találhatók, a Rév proteineket a képek alsó tábláinak az alsó, jobb sarkában jeleztük. Az ezzel a vizsgálattal kimutatott mindegyik Rév mutáns elhelyezkedését az I. táblázatban soroltuk fel.
Ezen eloszlásokat bemutató példák az ábrában találhatók, a Rév proteineket a képek alsó tábláinak az alsó, jobb sarkában jeleztük. Az ezzel a vizsgálattal kimutatott mindegyik Rév mutáns elhelyezkedését az I. táblázatban soroltuk fel.
Amint látható, a mutánsok nagyobb része egy teljesen vad típusú sejten belüli elhelyezkedést mutat (N), beleértve a pMlO transzaktivációs negatív kiónt (10D. ábra). Azonban több mutáns a citoplazmatikus fluoreszcenciának igen kis mértékű, de kimutatható szintjét termelte, ilyen a pM4 (10F. ábra). Ez a fenotípus nincs világos összefüggésben a biológiai aktivitással, minthogy az aktív mutáns (pM3, pM8) és inaktív mutánsok (pM4, pM7) rendelkeznek ezzel a tulajdonsággal. Ezenkívül egy eléggé terjedelmes deléciós mutáns, a ρΔ1/3 sejten belüli elhelyezkedése átmenetet képez a vad típusú minta és a Rév fő doménjében lévő mutációk által indukált minta között (N>C, 10H. ábra). Ez a deléció azonban nem a fő doménhoz közel helyezkedik el. Minthogy ennek az eltérő elhelyezkedésnek az oka nem világos, az összefügg a ρΔΙ/3-nál megfigyelt biológiai aktivitáshiánnyal.
A Rév argininben gazdag doménjének a mutációja (pM5, pM6), amely homológiát mutat az ismert magban való elhelyezkedési szingálokkal, a citoplazmatikus Rév protein magas szintjét eredményezi (C>N). Ezek a proteinek azonban nincsenek kizárva a sejtmagból (10J. ábra), feltételezhetővé téve, hogy a Rév bázikus doménje tulajdonképpen maglokalizációs szignál.
Érdekes arra emlékeztetni, hogy a pM5 és pM6 ín vivő nem volt szignifikáns mértékben foszforilálva annak ellenére, hogy a fentiekben a foszforiláció akceptorainak tartott helyeket megtartották. Ez azért lehetséges, mert a Rév foszforilációjáért felelős kináz a sejtmagra korlátozódik. Tehát lehetségesnek látszik, hogy a pM5 és pM6 Rév mutánsok nem megfelelő sejten belüli elhelyezkedése a felelős a foszforiláció alacsony szintjéért.
9. példa
A Rév funkció transzdomináns repressziója
A HIV-1 szerkezeti génexpressziót transzaktiváló képességüket elvesztett Rév mutánsok azon képességét vizsgáltuk, hogy gátolják-e transzban a vad típusú Rév proteinfunkciój át.
COS sejteket (35 mm) kotranszfektáltunk 250 ng pgTAT jelzőszerkezettel és 290 ng pBC12/CMV-vel (negatív kontroll) (11 A. ábra, 1-es sáv), 40 ng pcREV-vel (alacsony szint), 250 ng pBC12/CMV-vel (2-es sáv), 290 ng pcREV-vel (magas szint) (3-as sáv), 40 ng pcREV-vel, 250 ng pM4-gyel (4-es sáv), 40 ng pcREVvel, 250 ng pM7-tel (5-ös sáv), 40 ng pcREV-vel, 250 ng ρΜΙΟ-zel (6-os sáv). A transzfekció után hatvan órával a tenyészeteket [35S]-ciszteinnel jeleztük, és nyúl anti-Tat antiszérumot alkalmazva immunprecipitációnak vetettük alá.
Amint a 11 A. ábrában látható, a pM4 (4-es sáv) és pM7 (5-ös sáv) csekély hatást fejt ki a vad típusú Rév protein aktivitására, amint azt a 72 aminosavas Tat expresszió indukciójával mértük, míg a pMlO (6-os sáv), úgy tűnik, hogy teljesen gátolja a Rév funkciót. Ennek alapján feltételezhető, hogy a pM 10 a HIV-1 rév génfunkciónak egy specifikus inhibitorát kódolja.
Annak bizonyítására, hogy a pMlO valóban a tat 72 aminosavas formáját kódoló össze nem illesztett HIV-1 mRNS citoplazmatikus expressziójának a specifikus gátlásán keresztül hat, Malim [Malim és munkatársai (1988), lásd fent] SÍ nukleázvédő vizsgálatát alkalmaztuk. Ezzel a vizsgálattal (1 IB. ábra) mennyiségileg megállapítottuk a COS sejtek citoplazmájában kifejezett összeillesztett (spliced, S) és össze nem illesztett (unspliced, U) tat mRNS szintjét; 2,75 pg pBC12/CMV +2,5 pg pcREV (1-es sáv), 2,5 pg pgTAT+2,75 pg pBC12/CMV (2-es sáv), 2,5 pg pgTAT+0,25 pg pcREV+2,5 pg pBC12/CMV (3-as sáv), 2,5 pg pgTAT+2,75 pg pcREV (4-es sáv), 2,5 pg pgTAT+ 0,25 pg pcREV+2,5 pg pMlO (5-ös sáv), 2,5 pg pgTAT+0,25 pg pcREV+2,5 pg ρΔ10/14 (6-os sáv). Amint látható, a bevitt teljes DNS megmarad az egész 5,25 pg szinten, beleértve a kiindulási pBC12/CMV expressziós vektort, mint negatív kontrollt.
A transzfekció után 60 órával összegyűjtöttük a citoplazmatikus RNS-t analízis céljára, és 5 pg-os adagokat használtunk fel az SÍ nukleázvédő vizsgálatban. Az itt alkalmazott DNS-próba egy 798 bázispárt tartalmazó minta volt, amely Klenow DNS-polimerázzal végjelzett volt a tat első kódolóexonján belül elhelyezkedő XhoII helyen [Malim és munkatársai (1988), lásd fent]. A próba (I) célja az volt, hogy mennyiségileg meghatározza az össze nem illesztett (U) és az összeillesztett (S) citoplazmatikus tat mRNS-szintet a transzfektált COS-tenyészetben. Ezt a próbát használva az összeillesztett (S) tat mRNS-ről azt vártuk, hogy megvéd egy 202 nt mintafragmentumot, míg az össze nem illesztett (U) tat mRNS egy 506 nt fragmentumot véd meg. Az össze nem illesztett RNS relatív szintjét minden egyes sávban denzitometriásan határoztuk meg egy LKB „soft laser” számlálót használva. Az eredmények, amint a 11B. ábrában bemutatjuk, a következők: 2-es sáv: 14% össze nem illesztett, 3-as sáv: 63% össze nem illesztett, 4-es sáv: 82% össze nem illesztett, 5-ös sáv: 22% össze nem illesztett, 6-os sáv: 24% össze nem illesztett RNS.
HU 217 091 Β
Amint vártuk, a csak pgTAT-tal transzfektált sejtek citoplazmájában az összeillesztett tat mRNS volt túlnyomóan (11B. ábra, 2-es sáv), míg azon sejtek citoplazmájában, amelyek HIV-1 Rév proteint is kifejeznek, az össze nem illesztett tat mRNS a domináns a citoplazmában (1 IB. ábra, 3-as és 4-es sávok). Azonban a pgTAT-nak pcREV-vel és pM10-zel való együttes kifejezése megtartja a tat mRNS összeillesztett formájának a túlsúlyát (1 IB. ábra, 5-ös sáv).
Noha az 5-ös és 6-os sávokban lévő RNS teljes szintje némileg alacsonynak tűnik, azonban így nyilvánvaló, hogy a pMlO (5-ös sáv) képes volt szelektíven gátolni az össze nem illesztett tat mRNS Rév által indukált citoplazmatikus expresszióját a pgTAT vektorból. A pcREV és pMlO jelenlétében kimutatott össze nem illesztett tat mRNS relatív szintje hasonló a Rév távollétében megfigyelt szinthez.
Ez nyilvánvaló a ρΔ10/14 esetében (11B. ábra, 6-os sáv). Ezek az eredmények ezen kívül azt is bizonyítják, hogy a 3’-tól az M10 mutánsig terjedő rév gén deléció (ρΔΙ0/14) szintén kódolja a Rév funkciónak egy transzrepresszorát. Egy még kiterjedtebb deléció, amely túlmegy az M10 mutáció helyén, a ρΔ9/14-nek nevezett, szintén egy domináns negatív fenotípust képvisel (I. táblázat). Azonban egy deléció, amely az M8 mutáció helyéig teqed, már nem transzdomináns (az erre vonatkozó adatokat nem mutatjuk be).
10. példa
A pMlO Rév mutáns a rév funkció kompetitiv inhibitora
A 11 A. és 1 IB. ábrákban bemutatott kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a pMlO represszálni képes a vad típusú Rév funkciót, ha transzban van. Azonban ezeket a kísérleteket nagy feleslegben lévő pMlO jelenlétében végeztük. A Rév funkció transzgátlása hatásosságának a pontos mennyiségi meghatározására a pcREV egyetlen szintjén vizsgáltuk a pMlO növekvő szintjeinek azon képességét, hogy meggátolja-e a pHIV-1 rév provírus mutáns védelmét. Ez a kísérlet a pM4 és ρΔ10/14 Rév mutánsok növekvő szintjének a hatását is méri, valamint magának a vad típusú Revexpressziónak az egyszerűen növekvő szintjét.
COS sejttenyészeteket (35 mm) kotranszfektáltunk 25 ng pHIV-lArev-vel és 50 ng pcREV-vel, a pcREV (▼), pM4 (Δ), ρΔ10/14 (O) vagy pMlO () növekvő többszörös moláris feleslegeivel, amint azt a 12. ábrában jeleztük, azaz ez tízszeres felesleg, 500 ng plazmidszerkezettel való kotranszfekciót jelent. A teljes bevitt DNS-t 587,5 ng-en tartottuk, beleértve a pBC12/CMV kiindulási expressziós vektort, mint negatív kontrollt. Egy SEAP génexpressziós vektort kotranszfektáltunk belső kontrollként (12,5 ng/tenyészet). A felülúszóból a 15. órában mintát vettünk, és a felülúszó p24 Gag expressziós szintjének a mérésével vizsgáltuk.
Ennek a vizsgálatnak az eredményeit a 12. ábrában mutatjuk be, más versengő rév vektor távollétében nyert p24 expressziós szinthez viszonyítva, amely szintet 1,00-nak vettünk. Minden értéket a 25 ng pHIV- lArev, 50 ng pcREV, 12,5 ng pBC12/RSV/SEAP és 500 ng pBC12/CMV-vel transzfektált tenyészetekben észlelt p24 Gag expressziós szinthez viszonyítva fejezünk ki.
Ezt a kontrolltenyészetet (·), amely alapértéket képez, amellyel szemben a hozzáadott Rév mutánsok kompetitív hatásait mértük, önkényesen a p24 Gag expresszió
I, 00 egységének a szintjén határoztuk meg. Az itt bemutatott értékeket korrigáltuk a felülúszó SEAP-szintjeinek csekély változásaival (átlag SEAP-aktivitás 1,00+0,27 volt, 1,28-0,72 értékek között).
Amint leírtuk, azt találtuk, hogy a vad típusú rév expressziós pcREV vektor transzfekciójának a növekvő szintje enyhén pozitív hatást fejt ki a vírusreplikációra, maximálisan egy -70%-os növekedéshez vezetve a p24 Gag-nak a közegbe való kijutását. Ezzel ellentétben a pMlO vektor kotranszfekciójának igen nagyfokú gátló hatása van a HIV-1 struktúrgén-expreszszióra. A kapott inhibíció sémája olyan, amely várható volt a Rév funkció kompetitiv inhibitorától, amely ugyanazzal az affinitással rendelkezik a biológiai célpontjához, mint a vad típusú Rév. Tehát a pM 10-nek egy ekvimoláris mennyisége a p24 Gag expressziót felére csökkenti, a pMlO kétszeres feleslege az expressziót egyharmadára csökkenti, egy ötszörös felesleg az egyhatodára, míg egy tízszeres felesleg a p24 Gag expressziót -93%-ra csökkenti.
A ρΜΙΟ-en kívül a ρΔ10/14 kotranszfekció szintén csökkenti a p24 Gag expressziót, azonban a Revnek ez a nagy deléciós mutánsa nem volt olyan hatékony inhibitor, mint a pMlO. Valószínűnek látszik, hogy a ρΔ10/14 által kifejezett, erősen megrövidített protein kevésbé hatásos kompetitor, minthogy nem rendelkezik azon szekvenciákkal, amelyek elősegítik a Rév kötődését a biológiai célpontjához.
Végül a pM4 kotranszfekciójának szintén volt gátló hatása, noha ez csekély volt, a legnagyobb alkalmazott adag esetében kevesebb, mint kétszeres (32%). Ez a hatás valószínűleg az RRE-kötéssel nem rokon aktivitásból származik.
II. példa
A HIV-1 Rév transzaktivátor dómén szerkezete
Amint a fentiekben tárgyaltuk, a HIV-1 transzaktív géntermék Rév téves és deléciós mutánsai sorozatának a biológiai aktivitásának a megállapítására átmeneti génexpressziós analízist használtunk transzfektált sejtekben. Az eredmények bizonyítják a Révén belül két funkcionáló dómén lehetséges létét, amint azt a 12A ábrában vázlatosan megadjuk, ahol az S egy összeillesztési helyet képez. Továbbá, ez a két dómén nélkülözhetetlen lehet a transzaktiváláshoz (keresztben vonalkázott rész).
Ezen domének közül az elsőt (az RNS-kötő dómén) a négy téves pM4, pM5, pM6 és pM7 mutáns határozza meg, amely körülbelül 35 aminosavat tartalmazó régióra terjed ki a körülbelül 10-es aminosavhely és körülbelül a 68-as aminosavhely között a vad típusú Rev-ben, és nagymértékben bázikus elemeket tartalmaz, amelyek feltétlenül szükségesek a Rév magban való lokalizációjához. Tartalmaz még egy maglokalizációs (nuclear localization, NL) szignált (árnyékolt rész). Az ebben a doménben megváltozott mutánsok egy recesszív fenotípust mutatnak.
HU 217 091 Β
Ezzel ellentétben a második doménen belüli mutációk (az aktivációs dómén), amelyek középpontja közelítőleg a 79-es aminosavmaradék körül van, és amelyeket többek között a pMlO téves mutáns és a ρΔ9/14 és ρΔ10/15 deléciós mutánsok határoznak meg, szintén a Rév funkció elvesztését eredményezik, de figyelemre méltó az ezen mutánsok által képzett negatív fenotípusú transzdomináns. A Rév két régiója (a 12A. ábrában vonalkázottan jelzett) nélkülözhetőnek látszik a proteinfunkcióhoz. Amint itt leírtuk, a Rév aktivációs doménben lévő mutációk defektív (hiányos) Revet adnak, és olyan proteinek termelését eredményezik, amelyek kompetitív gátolják a vad típusú Rév funkcióját. Ez a transzrepresszió elegendő ahhoz, hogy jelentősen csökkentse vagy visszaszorítsa a HIV-1 replikációt a transzfektált sejtekben. A pMlO és rokon deléciós mutánsok által mutatott domináns negatív fenotípusok molekuláris alapja még nem ismert. Azonban az a megfigyelés, hogy a téves (M10) és deléciós (Δ9/14, Δ10/14) mutánsok képesek gátolni a Rév funkciót „transzban”, feltételezhetővé teszi, hogy ezért inkább egy tulajdonság elvesztése, mint szerzése a felelős. Egy lehetőség az, hogy a defektív Rév proteinmolekulák képesek lehetnek kevert multimereket képezni vad típusú Rév proteinalegységekkel, és így gátolják transzdomináns módon a vad típusú proteinfunkcióját. Azonban jelenleg nem ismert, hogy a Rév in vivő monomerként vagy multimerként fejti-e ki a hatását. Egy másik feltételezés szerint, amely prokarióta és eurkarióta transzkripciós faktorok egy számának a funkcionális vizsgálatát magában foglaló korábbi munkán alapszik, az, hogy a transzkripciós transzaktivátorok két különböző funkcionális domént tartalmaznak, egy specifikus „kötő domént”, amely a proteint a megfelelő célszubsztrátjához irányítja és egy „aktivációs domént”, amely lehetővé teszi a kötődés funkcionális következményének a létrejöttét, ebben az esetben a transzkripciós aktiválást. Több rendszerben úgy tűnik, hogy a kötő dómén egy szekven ciaspecifikus DNS-kötő elemet tartalmaz; azonban legalább egy esetben, amely a herpes simplex vírus, típus-1 (HSV-1) VP16 transzaktivátor, úgy tűnik, hogy a kötő dómén ehelyett egy specifikus kölcsönhatást közvetít a celluláris transzkripciós faktorral, amely viszont a HSV-1 genomban a célszekvenciához kötődik. Fontossággal bír, hogy a kötő dómén mutációja hajlamos egy negatív fenotípust eredményezni, amely mérsékelt szinten recesszív az expresszióra. Ezzel ellentétben a transzkripciós faktor aktivációs doménjének a mutációja vagy deléciója a mutánsokban egy domináns negatív fenotípust eredményezhet. Ezekről a mutánsokról, amelyek megtartják az ép kötődomént, feltételeztük, hogy versengenek a megfelelő sejt celluláris célpontjához való kötődésben a vad típusú transzaktivátorral, de ezért nem képesek aktiválni a transzkripciót, ha egyszer a kötődés létrejött. A HSV-1 VP16 esetében azt tapasztaltuk, hogy ennek a transzdomináns mutánsnak nagymértékben történő expressziója hatásosan gátolja a vad típusú VP16 funkciót, és ezért meggátolja a HSV—1 replikációt a normálisan ezt lehetővé tevő sejtekben.
Noha a rév géntermék a génexpressziónak egy poszttranszkripciós transzregulátora, valószínűnek tűnik, hogy a két különálló funkcionális doménelgondolás ebben az esetben alkalmazható. Nevezetesen, a Rév funkciók nagymértékben szekvenciaspecifikus módon az RNS célszekvenciájukkal, az RRE-vel való közvetlen kölcsönhatáson keresztül hatnak [Μ. H. Malim és munkatársai, Cell, 60, 675-683 (1990)], és ezért olyan szekvenciát kell tartalmazniuk, amely ezt a specifitást biztosítja. Amint a kötődés létrejött, ezt a történést egy aktivációs történéssé kell transzlatálni, ebben az esetben a HIV-1 szerkezeti proteineket kódoló nem teljes, összeillesztett RNS-ek magból való kijutásának. Ez utóbbi doménben végbement mutációk így a vad típusú Rév funkció kompetitív inhibitorait eredményezik. Ez a Rév pMlO és pA10/14 mutánsok esetében megfigyelt fenotípus, és ezen mutánsok jelezhetik egy különálló aktivációs dómén létét. Viszont a második Rév protein inkább N-terminális nélkülözhetetlen régiója, amelyet mutációs analízissel határoztunk meg, ugyanolyan funkcióval rendelkezhet, mint a „kötődomének”-nél meghatározott különböző transzkripciós faktorokban. Az ebben a doménben megváltozott mutánsok (például a pM4, a pM7) tulajdonképpen általában egy recesszív negatív fenotípust mutatnak, noha egy alacsony, de szignifikáns gátlás megfigyelhető a magas expressziós szinten. További transzdomináns mutánsokat találtunk (lásd 5A. ábra és 1 la. és 1 lb. példák), amelyek lehetővé teszik a Rév aktivációs dómén pontosabb lokalizációját, amely körülbelül a 68-as aminosavhelytől körülbelül a 90-es aminosavhelyig teljed, pontosabban körülbelül a 78-as helytől körülbelül a 86-os helyig, és még pontosabban a körülbelül 78-as helytől körülbelül a 83-as vagy 84-es helyéig terjed a vad típusú Revnek.
11a. példa
További transzdomináns HIV-1 Rév mutánsok
További HIV-1 rév mutánsokat állítottunk elő a fentiekben, a 6.2 fejezetben leírtakhoz hasonlóan. Ezeket az 5A. ábrában és a II. táblázatban megadottak szerint jelöltük és jellemeztük. Az in vivő fenotípust Malim szerint [Μ. H. Malim és munkatársai, Cell, 58, 205-214 (1989)] határoztuk meg (minden vizsgálatot a transzfekciós hatás belső kontrolljával végeztünk el).
A 4-11. példákban leírtakon kívül a következő további mutánsokról állapítottuk meg, hogy transzdominánsan gátolják a vad típusú HIV-1 Rév funkciót: pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32.
II. táblázat
További HIV-1 rév génmutánsok fenotípusos analízise
| Klón | Fenotípus’ | Transzdomináns reprcssziób |
| pBC12/CMV (csak vektor) | 0 | |
| pM15 | + | |
| pM16 | + | |
| pM17 | + |
HU 217 091 Β
II. táblázat (folytatás)
| Klón | Fcnotípus* | Transzdomináns repressziób |
| pM18 | + | |
| pM19 | + | |
| pM20 | + | |
| pM21 | - | 97 |
| pM22 | - | 93 |
| pM23 | + | |
| pM24 | + | |
| pM25 | + | |
| ρΔ9/19 | - | |
| ρΔ18/Ι9 | + | |
| ρΔ 18/23 | - | |
| ρΔ22/14 | - | |
| ρΔ23/14 | + | |
| ρΜ27 | - | 92 |
| ρΜ28 | - | 92 |
| ρΜ29 | - | 91 |
| ρΜ32 | - | 97 |
| ρΜ33 | + | |
| ρΜ34 | + | |
| ρΜ35 | + | |
| ρΜ36 | -¼ |
a + + :40-100% (a vad típusú Rcv aktivitáshoz viszonyítva); +:
5-39%; 5% b A vad típusú Rcv funkció %-os gátlása, a vad típusú Rcv tízszeresének megfelelő Rév mutánsfelcslcggcl.
Ilb. példa
A HÍV-2 és SIV Rév funkcióra kifejtett hatás
A 4 -11. példák transzdomináns HIV-1 rév génmutánsainak a multivalens képességét analizáltuk a fentiekben a 6.2 fejezetben már leírt és Malim által leírt módszerrel [Μ. H. Malim, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8222-8226 (1989)]. A kapott eredmények azt mutatják, hogy legalább a pMlO mutáns rendelkezik azzal a képességgel, hogy nemcsak a HÍV-1 rév gén fenotípusos expresszióját gátolja, hanem ezenkívül a HIV-2 és SrVmac rév génfunkciót is, amint az látható például a HIV-2 rév esetében a HIV-2 Rév funkció erős gátlásából, amikor pMlO feleslege együtt fejeződik ki a vad típusú HIV-2 rév génnel, az össze nem illesztett mRNS és egyexonos tat citoplazmában való expressziójának a gátlásán keresztül.
6.3
12. példa
A Rex funkció analízise
A rex mutánsok Rex funkciójának a vizsgálatára (14. ábra) minden mutáns DNS-t pgTAX-LTR-rel kotranszfektáltunk COS sejtekbe DEAE dextránt alkalmazva [Β. P. Cullen, Meth. Enzymol., 152, 692-693 (1987)]. Minden plazmidot 1,25 pg/ml koncentrációban adtunk. A transzfekció után 48 órával a sejteket metabolikusan [35S]-ciszteinnel jeleztük két órán át, sejtkivonatot készítettünk, és a mintákat 0,5 a-humán monoklonális antitesttel immunprecipitáltuk, amely specifikusan reagál a HTLV-I burkoló proteinjével. Az immunprecipitátumokat SDS-10% poliakrilamid gélen analizáltuk.
A HTLV-I Env, Tax és Rex proteintermelés egyidejű analízise céljából (15. ábra) COS sejteket kotranszfektáltunk pgTAX-LTR-rel (0,1 pg/ml), és a mutáns Rex proteineket kódoló vektorokkal (1 pg/ml) vagy a vad típusú pREX, pREV és pCMV-TL-2 vektorokkal (1 pg/ml). A HTLV-I proteinek immunprecipitációs analíziséhez a következő antitesteket alkalmaztuk: Env, 0,5 α-antitest, Tax, Tax-specifikus antipeptid nyúl antiszérum [a feltalálók egyike által előállított, de előállítható W. Wachsman és munkatársai, Science, 235, 674-677 (1987) szerint is], Rex, Rex-specifikus antipeptid nyúl antiszérum [a feltalálók egyike által előállított, de előállítható H. Siemi és munkatársai, Cell, 55, 197-209 (1988) szerint is]. Minden esetben a radioaktívan jelzett sejtkivonatot használtuk a három immunprecipitáció és elektroforetikus analízis céljára; a kapott autoradiogramnak csak az ide vonatkozó részeit mutatjuk be a 15. ábra tábláiban.
A HTLV-I Rex mutánsok sejten belüli immunfluoreszcenciás lokalizációjára (16. ábra) COS sejteket transzfektáltunk a jelzett expressziós plazmidokkal, és 48 óra után paraformaldehiddel fixáltuk azokat. Ezután a sejteket fokozatosan festettük nyúl anti-Rex peptid antiszérummal (1:100 arányú hígítás) és kecske rodaminnal konjugált anti-nyúl IgG-vel, amint azt korábban leírtuk [B. R. Cullen (1987), lásd fent],
13. példa
A Rex és Rév funkció gátlása
A rex mutánsok vad típusú Rex proteinfunkcióját gátló képességének a vizsgálata céljából (17A. ábra) COS-tenyészeteket kotranszfektáltunk a következő három plazmiddal: pgTAX-LTR (1,25 pg/ml), pREX (0,1 pg/ml) és 1 pg/ml Rex mutánsokkal (1-6. sávok), pREX (7-es sáv), pREV (8-as sáv) vagy pCMV-IL-2vel (9-es sáv). Az Env-termelést analizáltuk 0,5 a monoklonális antitesttel való immunprecipitációval és SDS-10% poliakrilamid géles elektroforézissel. A HTV-1 Rév proteinfunkció gátlásának az analízise céljából COS sejteket kotranszfektáltunk pgTAT-tal, pREV-vel és pBC/CMV-IL-2 tízszeres moláris feleslegével vagy M6, M7 és M13 transzdomináns Rex mutánsokkal. 48 órás tenyésztés és [35S]-ciszteinnel való bioszintetikus jelzés után a sejtkivonatokban immunprecipitációval vizsgáltuk a Tat protein megrövidített, 72 aminosavas formájának a Rév által indukált termelését (2-es sáv). 10:1 moláris arány esetében az M6, M7 és M13 mutánsok (3-5. sávok) teljesen gátolják a HIV-1 Rév protein hatását, amint azt csak a Tat protein teljes hosszúságú, 86 aminosavas formája esetében mutattunk ki. A HIV-1 replikáció gátlásának az analízise céljából COS sejteket kotranszfektáltunk a rev-hiányos HIV-1 provírus plazmid pHXB2-Bam-p3-mal [M. R. Feinberg
HU 217 091 Β és munkatársai, Cell, 46, 807-817 (1986)] és pREXszel az Ml, M6, M7 és Ml 3 mutánsok jelzett feleslegének a jelenlétében. A transzfekciós elegy teljes DNSkoncentrációja állandó szinten maradt különböző mennyiségű pBC/CMV-Il—2 eredeti vektor hozzáadásakor. A transzfekció után három nappal a felülúszó a HIV-1 p24 Gag proteinszintjét ELISA-módszerrel mértük (Coulter Immunology készlet). Az M6, M7 és Ml3 mutánsok a HÍV-1 p24-termelés dózisfuggő mértékű gátlását okozták, míg a recesszív negatív Μ1 mutáns esetében ez nem történt meg.
7.
Farmakológiai szempontok
A HIV-1 az AIDS túlnyomó etiológiai oka; a HTLV-I többek között AtL-t okoz; a HTLV-II etiológiailag rokon a T-sejt hajas sejtes leukémiaváltozat egyes eseteivel. A HTV-l Rév és a HTLV-I Rex transzaktivátorokat nélkülözhetetleneknek találtuk a tenyészetben a vírusreplikációhoz, és ezért a Rév és Rex a kemoterápiás beavatkozás lehetséges célpontjai lehetnek az érintett betegekben.
Az itt leírtak szerint a Rév és/vagy Rexnek vannak olyan mutánsai, amelyek a vad típusú Rév és/vagy Rex funkció kompetitív inhibitoraiként hatnak, és amelyek ezért a HIV-1 és/vagy HTLV-I és/vagy HTLV-II replikáció hatásos gátlójaként hatnak. Ezek a mutánsok így felhasználhatók a fertőzésnek kitett betegek limfoid sejtjeinek a megvédésére. Ezen várt eredmény megvalósíthatóságának a jele az a megfigyelés, hogy a HSV-1 nélkülözhetetlen VP16 transzaktivátorának az analóg transzdomináns származékának az expressziója hatékonyan ellenállóvá teszi a HSV-1 fertőzéssel szemben a normális körülmények között érzékeny sejtpopulációt [A. D. Friedman és munkatársai, Natúré, 335, 452-454 (1988)]. Továbbá, megfelelő átvitt gént tartalmazó egerek immunisnak látszanak a HSV-1 fertőzéssel szemben.
A Rex és Rév transzdomináns represszorait kódoló mutáns rex és rév gének így „intracelluláris immunogének”-ként való felhasználásra alkalmasak a HTLV-I vagy HTLV-II által okozott betegségek kezelésére, illetve a HIV-1 által indukált betegségre, beleértve az AIDS és ARS (ARC) kezelését is. Továbbá, minthogy a találmány transzdomináns Rex mutáns proteinjeinek legalább egy része rendelkezik azzal a sajátossággal, hogy képes gátolni a HTLV-I Rex és HIV-1 Rév protein aktivitást, így ezek alkalmasak mindkét vírustípussal történt fertőzés kezelésére. Ez a tulajdonság különleges értékű azon betegek esetében, akiknél nem megkülönböztetett a fertőzés oka ezen két anyag között.
A jelen találmány előtt sehol nem írták le egy olyan terápiás szer létét, amely több, mint egy vírusfaj esetében hatásos lenne. A fenti elgondolás a széles körű alkalmazhatóságra való tekintettel nemcsak a Revet és Rexet kódoló vírusfajok által okozott betegségek terápiájában alkalmazható, hanem további vírusbetegségekben is, amelyek hasonlóan szabályozott génekkel rendelkeznek.
A találmány így javasolt vírus-, főleg retrovírus-betegségek, mint az ATL (aduit T-cell leukémia, felnőttkori T-sejt leukémia), az ARS vagy ARC (AIDS-szel rokon tünet vagy komplex), SIV (simian immundeficiency vírus), mint a SIVmac, FIV (feline immundeficiency vírus), EIAV (equine infectious anémia vírus), visna vírus és marha immunhiányos vírus fertőzésének megelőzésére és kezelésére, különösen humán retrovírus-betegségek, még pontosabban rex vagy rév génekkel vagy ezek ekvivalenseivel szabályozott patogénekkel okozott humán retrovírus-betegségekkel [mint ATL, AIDS és ARS (ARC)] szemben.
Különösen előnyös ezért a represszorhatás multivalens tulajdonsága, minthogy ez előnyös a többszörös, különösen a kettős vírusfertőzés esetében, mint amilyet gyakran látni az i. v. gyógyszert kapók esetében, akik HÍV-1-gyel és HTLV-I-gyel együttesen fertőzöttek, vagy egyetlen vírussal való fertőzés esetében, amely további fertőzés megnövekedett veszélyével jár, mint amilyen a HIV-fertőzés, vagy olyan esetek megelőzésére, amikor kívánatos védelmet nyújtani olyan fertőzésekkel szemben, amelyeket különböző vírusfajok okoznak.
Ettől a multivalens hatástól normálisan az lenne várható, hogy leginkább bizonyos típusú, valamennyire rokon vírusok, például retrovírusok gátlásában hatásosak, azonban ezek nem korlátozódnak szükségszerűen szigorúan vett rokon vírusokra, mint akár DNS-vírusra vagy RNS-(retro)-vírusra: ismertek kölcsönhatások a DNSvírusok és -retrovírusok fertőzőképességének a szintje között, így a HIV-1 és JC-vírus, egy humán papovavírus között [H. Gendelman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9759-9763 (1986); H. Tada és munkatársai, ugyanott, 87, 3479-3483 (1990)], és közös szabályzó mechanizmus működhet filogenikusan távoli vírusfajokban, amelyekre a fenti multivalens transzdominancia elvét alkalmazni lehet.
A találmány terápiás lehetősége nyilvánvaló, minthogy a HTLV-I Rex funkciójának és a HIV-1 Rév funkciójának a repressziója blokkolja a vírusreplikációt, így kivédi a fertőző vírusrészecske képződését és így várhatóan fenntartja a fertőzés látens állapotát. Tehát az egyének HIV-1 vírussal már fertőzött sejtjei, de amelyek genomjukba már integrálódott transzdomináns represszorgénnel rendelkeznek, működőképesek maradnak, és az egyének meghatározatlan ideig a betegség tüneteitől mentesek maradnak hosszú ideig tartó kezelés igénye nélkül.
Ebben a megvilágításban a jelen találmány szerinti gének önmagukban gyógyszerek, egyszeri vagy többszörös kezelés céljára akár közvetlenül in vivő vagy közvetve in vitro alkalmasak, előnyösen egy vektor részeként, például egy retrovírus vagy plazmid vektorként olyan megfelelő formában, amellyel elérhető a funkcionális formában való felszabadulás a célzott emlős sejtekben; például vírusreplikáció transzdomináns inhibitorait kódoló gének inszerciója hatásos lehet in vivő bevíve a betegek sejtjeibe közvetlenül implantálva a fertőzött egyénekből származó limfoid sejtek genomjába, majd ezeket a sejteket a donorbetegekbe az inszerció elvégzése után visszajuttatva. Minthogy a HTLV-I és a HTLV-II, valamint a HIV-1 különböző T-sejt
HU 217 091 Β típusokban replikálódik, így a betegség, amelyet okoznak, különösen alkalmasnak látszik ezen kezelésre.
Ezen alkalmazás hasonló lehet T. Friedman [T. Friedman, Science, 244, Υ2Ί5 (1989. június 16.) vagy P. M. Lehn, Boné Marrow Transplant, 1, 243 (1987)] génterápiás elképzeléséhez: például AIDS/ATL-es betegekből kivonunk hematipoietikus őssejteket és in vitro tenyésztjük azokat a találmány szerinti mutált géneket, amelyek a represszálható funkció domináns represszorát kódolják, így a Rex/Rex funkciót, ezekbe a sejtekbe implantáljuk retrovirális vektorokat alkalmazva; az új, vírusnak ellenálló utódokat termelő őssejteket visszavisszük az eredeti beteg immunrendszerébe, ahol ezek várhatóan szaporodásukkal, szelektív előnyük következtében túlnövik a nem kezelt őssejteket; kellő időben a hematopoietikus sejtek populációja teljesen olyan sejtekből fog állni, amelyek a transzdomináns faktort termelik és vírusrezisztensek.
Ennek megvalósítási módszerei a szakterületen már ismertek, lásd például a 4 868 116 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat. Vektorokat, például a találmány szerinti mutáns géneket a célzott emlős sejtekben, így csontvelősejtekben felszabadító retrovirális vagy plazmid vektorokat leírnak például a Science, 244, 1275 (1989. június 16.) közleményben. így például különböző Rév és/vagy Rex transzdomináns géneket klónoztunk retrovirális vektorrendszerekben. A retrovírusok által közvetített gének felszabadulása után, például a HÍV-1gyel fertőzött humán sejtvonalakban, a transzdomináns mutánsok gátló hatása könnyen bizonyítható a vírusképződés gátlása alapján.
A fenti terápiás elképzelés egy példája az intracelluláris immunizációnak, amelyet D. Baltimore [Natúré, 335, 395 (1988)] tűzött ki célul. Röviden az elképzelés a következőkből áll: egy kiválasztott vírus bizonyos életfunkciójának egy represszorát kódoló génnek egy olyan sajátos célsejtbe való inszerciója, amelyet ez a vírus megfertőzött (például bizonyos T-sejtek a vírus által okozott AIDS esetében). Ezen elképzelésnek az alkalmazása bármely vírus transzdomináns represszorával való terápia céljára attól a körülménytől függ, hogy ezen mutáns proteineket kódoló gének számára alkalmas vektorok és ezen vektorokat a megfelelő sejtekbe való inszerciójának a módszerei, amelyeket modellrendszerekben megvizsgálna, hatásos és biztonságos intracelluláris felszabadító rendszert képeznek-e humán vagy állati alkalmazás esetében. Az elképzelést csak nehézségekkel lehet felhasználni vizsgálatok kísérletes igazolására az etikai megszorítások miatt, amelyek jelenleg meggátolják a génterápiát, azonban az első ilyen genetikai, nem terápiás célú kísérletek már elkezdődtek. Azt várjuk, hogy röviddel azután, hogy az eljárás ártalmatlanságát bizonyították, ezeket az úttörő kísérleteket hasonló célú terápiás célú kísérletek fogják követni, először az életet veszélyeztető esetekben, mint például az AIDS-betegség, a jelen találmány alkalmasnak látszik ezen kísérletekben a korai kipróbálásra [lásd: T. Friedman, Science, 244, 1279 (1989. június 16.), második rész, „Infectious diseases”].
A találmány felhasználásának egy további módja nem egy gén, hanem egy, a találmány szerinti represszor protein célsejtekbe való inszercióját foglalja magában. Például a szájon át vagy parenterálisan való alkalmazást szokásos módon hajtjuk végre olyan formában, amely lehetővé teszi az intracelluláris bejutást, így például liposzóma által közvetített bejutást és felszabadulást.
Ezekben az alkalmazásokban természetesen a pontos adagolás függ az alkalmazott vegyülettől, az adagolás módjától és a kívánt kezeléstől; sajátos esetben legalkalmasabb adagolás meghatározása a szakembertől függ.
A találmány továbbá javallt transzdominancián alapuló vírusellenes szerek tervezésére és előállítására való felhasználásra. Egy eszközt találtunk vírus génfunkciókkal való műveletekre, amelyek különböző vírusfajok esetében általánosan alkalmazhatónak látszanak, noha a különböző vírusokban ezek szerkezeti alapja nagymértékben változik. Ez a nem várt észlelés utat nyit a vírusreplikáció további specifikus, kis molekulatömegű, lehetőleg nem peptid transzdomináns inhibitorainak a tervezését célzó tanulmányozásoknak, különösen olyan inhibitorok tervezésére elsősorban, amelyek képesek utánozni a transzdomináns, elsősorban a Rév vagy Rex proteinekben az RNS-kötő doméneket, ilyenek a kis molekulatömegű inhibitorok vagy semlegesítő monoklonális antitestek.
Meg kell érteni, hogy különböző kombinációkat vagy változtatásokat lehet végrehajtani a fent leírt találmány formájában és részleteiben anélkül, hogy annak oltalmi körétől eltérnénk.
Szintén meg kell érteni, hogy a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak a fent leírt mutánsok mellett olyanok, amelyek a már megszerkesztett specifikus mutánsokat és az itt leírtakat magukban foglalják, de amelyeket nem jellemeztünk részletesebb vizsgálatokkal, így a transzdomináns és/vagy multivalens inhibitorokat és a fentiekben leírt elveknek megfelelő további mutánsokat, de amelyeket itt nem adtunk meg specifikusan.
Claims (54)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Egy mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy egy, a HIV-1 vad típusú rév gén fenotípusos expresszióját transzdominánsan represszáló proteint kódol, amely protein egy vagy több mutációt hordoz a HÍV -1 vad típusú Rév protein 68-as és 90-es aminosavpozíciói között. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 2. Az 1. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy a mutációk misszensz vagy deléciós mutációk.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 3. A 2. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy a mutációk misszensz mutációk.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 4. Az 1. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy olyan proteint kódol, amely a HÍV -1 vad típusú Rév protein 78-as és 79-es pozíciójában mutációkat hordoz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.HU 217 091 Β
- 5. A 4. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzaljellemezve, hogy a mutációk misszensz mutációk.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 6. A 4. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy olyan proteint kódol, amely a HIV-1 vad típusú Rév protein 78-as pozíciójában egy Asp-ot és 79-es pozíciójában egy Leu-t tartalmaz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 7. Egy mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy egy, a HIV-1 vad típusú rév gén fenotípusos expresszióját transzdominánsan represszáló mutáns HIV-1 Rév proteint kódol, amely mutáns HIV-1 Rév protein tartalmaz egy első és egy második domént, ahol az első dómén vad típusú HIV-1 Rév protein 10-től 68-ig terjedő aminosavait és a második dómén a vad típusú HIV-1 Rév protein 68-tól 90-ig terjedő aminosavait tartalmazza, továbbá a második dómén egy vagy több mutációval módosított.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 8. A 7. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzaljellemezve, hogy a mutációk misszensz vagy deléciós mutációk.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 9. A 7. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzaljellemezve, hogy az M10, Δ9/14 vagy A10/14 mutáns proteint kódolja.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 10. Egy mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy az M10 mutáns proteint kódolja.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 11. A 10. igénypont szerinti M10 mutáns proteint kódoló mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy egy 6. ábra szerinti, módosított vad típusú gén, amely a vad típusú Rév protein 78-as pozíciójában egy Asp-ot és 79-es pozíciójában egy Leu-t kódol.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 12. A 11. igénypont szerinti mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy a vad típusú Rév protein 78-as pozíciójában lévő Asp-ot és a 79-es pozíciójában lévő Leu-t kódoló GATCTG nukleotidokat tartalmazza. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 13. Egy mutáns rév gén, azzal jellemezve, hogy egy, a HIV-1 vad típusú rév gén fenotípusos expresszióját transzdominánsan represszáló mutáns HIV-1 Rév proteint kódol, amely mutáns HIV-1 Rév protein tartalmaz egy első domént, amely lényegében a vad típusú HÍV -1 Rév specifikus kötőfunkcióit hordozza, és egy második, az említett vad típusú HIV-1 Rév aktivációs funkcióival nem rendelkező domént, amely a vad típusú HIV-1 Rév protein 68-tól 90-ig terjedő aminosavait tartalmazza, továbbá a második dómén egy vagy több mutációval módosított.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 14. Eljárás egy mutáns rév gén előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas expressziós rendszerből a megfelelő vad típusú gént izoláljuk, az izolált gént egy alkalmas klónozórendszerbe inszertáljuk, a kívánt mutációt a génbe bevezetjük, és az így kapott, kívánt mutációt hordozó mutáns rév gént a klónokból kinyeijük. Elsőbbsége: 1989.05.25.
- 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M10 proteint kódoló gént állítjuk elő. Elsőbbsége: 1989. 05. 25.
- 16. Eljárás egy 1. igénypont szerinti mutáns rév gén által kódolt protein előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas expressziós és amplifikációs rendszerben egy 1. igénypont szerinti mutáns rév gént expresszálunk és amplifikálunk, és az így kapott proteint a rendszerből kinyerjük.Elsőbbsége: 1989. 05. 25.
- 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az M10 mutáns proteint állítjuk elő. Elsőbbsége: 1989. 05. 25.
- 18. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti mutáns rév gént és egy hordozót vagy hígítót tartalmaz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 19. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy 7. igénypont szerinti mutáns rév gént és egy hordozót vagy hígítót tartalmaz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 20. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti mutáns rév gént tartalmazza. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 21. Egy vektor, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerinti mutáns rév gént tartalmaz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 22. Egy vektor, azzal jellemezve, hogy egy 7. igénypont szerinti mutáns rév gént tartalmaz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 23. A 21. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy egy retrovirális vektor.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 24. A 21. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy egy plazmidvektor.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 25. Egy vektor, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti mutáns rév gént hordozza.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 26. A 25. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti mutáns rév gént hordozza.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 27. A 25. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a mutáns Ml 0 proteint kódoló mutáns rév gént hordozó retrovirális vektor.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 28. Egy protein, azzal jellemezve, hogy egy, az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti mutáns rév gén kódolja.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 29. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 2. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 30. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 3. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 31. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 4. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.HU217 091 Β
- 32. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy az 5. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 33. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 6. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 34. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 7. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 35. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 8. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 36. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 9. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 37. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 10. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 38. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy all. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 39. A 28. igénypont szerinti protein, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja. Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 40. Egy protein, azzal jellemezve, hogy a 27. igénypont szerinti mutáns rév gén kódolja.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 41. Egy mutáns rex gén vagy egy funkcionális fragmense vagy származéka, azzal jellemezve, hogy egy, a vad típusú HTLV-I rex gén fenotípusos expresszióját transzdominánsan expresszáló proteint kódol, amely protein egy mutációt hordoz a vad típusú Rex protein 22-es és 101-es pozíciójú aminosavai között, vagy az 59-es és 121-es pozíciójú aminosavai között.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 42. A 41. igénypont szerinti mutáns rex gén, azzal jellemezve, hogy a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM17 vagy pcRex 13Δ15.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 43. Egy mutáns rex gén által kódolt mutáns HTLV-I Rex protein vagy egy funkcionális fragmense vagy származéka, azzal jellemezve, hogy egy mutációt hordoz a vad típusú Rex protein 22-es és 101-es pozíciójú aminosavai között, vagy a vad típusú Rex protein 59-es és 121-es pozíciójú aminosavai között.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 44. A 43. igénypont szerinti mutáns HTLV-I Rex protein, azzal jellemezve, hogy a mutációt a 82-es és 97-es, előnyösen a 87-es és 94-es pozíciójú aminosavak között; vagy az 59., 60., 64., 65., 119., 120. vagy 121. pozíciójú aminosavban hordozza.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 45. A 43. igénypont szerinti mutáns HTLV-I Rex protein, azzal jellemezve, hogy az M6, M7 vagy Ml3 mutáns protein.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 46. DNS-szegmens, azzal jellemezve, hogy a HTLV-I Rex proteinfunkciójának transzdomináns represszorát kódolja, ahol a represszort a Rex protein vad típusú formájának módosításával úgy kaptuk meg, hogy a vad típusú Rex protein effektoraktivitást hordozó peptiddoménjébe legalább egy transzdomináns negatív mutációt bevittünk, és a represszor lényegében a Rex protein vad típusú formájának nukleoláris lokalizációs aktivitásával rendelkezik.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 47. A HTLV-I Rex proteinfunkció egy transzdomináns represszora, azzal jellemezve, hogy a Rex protein vad típusú formájából származik legalább egy transzdomináns negatív mutációnak a vad típusú Rex proteinnek - a Rex protein effektoraktivitását hordozó - peptiddoménjébe való bevitelével, ahol a represszor lényegében a Rex protein vad típusú formájának nukleoláris lokalizációs aktivitásával rendelkezik.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 48. Eljárás egy 41. vagy 42. igénypont szerinti mutáns rex gén előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas expressziós rendszerből a megfelelő vad típusú gént izoláljuk, az izolált gént egy alkalmas klónozórendszerbe inszertáljuk, a kívánt mutációt a génbe bevezetjük, és az így kapott, kívánt mutációt hordozó mutáns rex gént a kiónokból kinyerjük.Módosítási elsőbbsége: 1989. 05. 25.
- 49. Eljárás egy 43-45. igénypontok bármelyike szerinti mutáns HTLV-I Rex protein előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas expressziós és amplifikációs rendszerben egy 41. vagy 42. igénypont szerinti mutáns rex gént expresszálunk és amplifikálunk, és az így kapott proteint a rendszerből kinyerjük.Módosítási elsőbbsége: 1989. 05. 25.
- 50. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy egy 41. vagy 42. igénypont szerinti rex gént és egy hordozót vagy hígítót tartalmaz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 51. Egy vektor, azzal jellemezve, hogy egy 41. vagy 42. igénypont szerinti rex gént tartalmaz.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 52. Az 51. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy retrovirális vektor.Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.
- 53. Eljárás egy, a Rex protein génaktivációs funkciója specifikus inhibitorának azonosítására, azzal jellemezve, hogy (i) létrehozunk egy genetikai rendszert, amely tartalmaz:- egy DNS-szegmenst, amely egy mRNS-t kódol, amely magában foglal egy szabályozó válaszelemet, melyet a Rex protein felismer és legalább egy nem használt összeillesztési helyet;- egy DNS-szegmenst, amely egy 41. igénypont szerinti mutáns rex gént kódol, melynek kifejeződésekor egy olyan proteintermék keletkezik, amely indukálja az mRNS kijutását a magból;- egy, az említett két DNS-szegmenssel transzformált gazdasejtet, amely expresszálja mind az mRNS-t, mind a Rex proteint;(ii) az (i) pontban létrehozott genetikai rendszer sejtjeit tartalmazó tenyészetet érintkezésbe hozzuk a vizsgált szerrel, amely a Rex protein feltételezett inhibitoraHU 217 091 Β olyan körülmények között, amikor a szer bejut a sejtekbe;(iii) meghatározzuk a vizsgált szemek a nem használt összeillesztési helyet magában foglaló mRNS magból való kijutására kifejtett hatását;(iv) meghatározzuk a vizsgált szemek az mRNS összeillesztett formájának a magból való kijutására kifejtett hatását; és összehasonlítjuk a kétféle mRNS magból való kijutásának mértékét, ami a nem használt összeillesztési helyet tartalmazó mRNS kijutásának csökkenő mértéke és az mRNS összeillesztett formája kijutásának változatlan mértéke esetén azt jelzi, hogy a vizsgált szer a HTLV-I rex gén vagy a rex gén terméke aktivitásának specifikus inhibitora.Módosítási elsőbbsége: 1989. 05. 25.
- 54. Reagenskészlet a Rex protein génaktivációs funkciója specifikus inhibitorának azonosítására szolgáló, 53. igénypont szerinti szűrővizsgálathoz, amely tartalmaz:5 - egy DNS-szegmenst, amely egy mRNS-t kódol, amely magában foglal egy szabályozó válaszelemet, melyet a Rex protein felismer, és legalább egy nem használt összeillesztési helyet;- egy DNS-szegmenst, amely egy 41. igénypont sze10 rinti mutáns rex gént kódol, melynek kifejeződésekor egy olyan proteintermék keletkezik, amely indukálja az mRNS kijutását a magból;- egy tartályt, amely az említett két DNS-szegmenssel transzformált gazdasejtet tartalmazza, amely expresz15 szálja mind az mRNS-t, mind a Rex proteint.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35687889A | 1989-05-25 | 1989-05-25 | |
| GB898915602A GB8915602D0 (en) | 1989-07-07 | 1989-07-07 | Multivalent repressor of gene function |
| GB898924396A GB8924396D0 (en) | 1989-10-30 | 1989-10-30 | Multivalent repressor of gene function |
| US44267089A | 1989-11-29 | 1989-11-29 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU904245D0 HU904245D0 (en) | 1991-06-28 |
| HUT56135A HUT56135A (en) | 1991-07-29 |
| HU217091B true HU217091B (hu) | 1999-11-29 |
Family
ID=27450368
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU904245A HU217091B (hu) | 1989-05-25 | 1990-05-23 | HIV-replikáció transzdomináns represszorait kódoló mutáns gének és represszorok, valamint rekombináns eljárás az előállításukra |
| HU95P/P00249P HU211530A9 (en) | 1989-05-25 | 1995-06-19 | Multivalent repressor of gene function |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00249P HU211530A9 (en) | 1989-05-25 | 1995-06-19 | Multivalent repressor of gene function |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0406557B1 (hu) |
| JP (2) | JP3126378B2 (hu) |
| KR (1) | KR100215949B1 (hu) |
| AT (1) | ATE207122T1 (hu) |
| AU (2) | AU648256B2 (hu) |
| CA (1) | CA2032158C (hu) |
| DE (1) | DE69033829T2 (hu) |
| DK (1) | DK0406557T3 (hu) |
| ES (1) | ES2166748T3 (hu) |
| FI (1) | FI110437B (hu) |
| HU (2) | HU217091B (hu) |
| IL (1) | IL94482A (hu) |
| WO (1) | WO1990014427A2 (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992006990A1 (en) * | 1990-10-17 | 1992-04-30 | The United States Of America, Represented By The Secretary, United States Department Of Commerce | Molecular clones of hiv-1 and uses thereof |
| US5534408A (en) * | 1993-09-24 | 1996-07-09 | University Of Massachusetts Medical Center | 2-deoxystreptamine aminoglycoside inhibition of HIV RRE/Rev binding |
| US5650306A (en) * | 1993-06-07 | 1997-07-22 | University Of Michigan | Recombinant nucleic acids for inhibiting HIV gene expression |
| WO1995004546A1 (en) * | 1993-08-06 | 1995-02-16 | Kai Juhani Ernst Krohn | Novel mutated human and simian immunodeficiency viruses and vaccines containing said viruses |
| US6228369B1 (en) | 1993-12-13 | 2001-05-08 | Transgene S.A. | Composition of trans-dominant variants of viral proteins for obtaining an anti-viral effect |
| US5981258A (en) * | 1993-12-13 | 1999-11-09 | Transgene S.A. | Composition of trans-dominant variants of viral proteins for obtaining an antiviral effect |
| FR2713651B1 (fr) * | 1993-12-13 | 1996-04-19 | Transgene Sa | Nouvelle composition pour un effet antiviral. |
| CN1991365A (zh) | 1996-01-26 | 2007-07-04 | 沃尔科股份有限公司 | 根据人类hiv病毒株的表型药物敏感性控制hiv阳性病人化疗的方法 |
| CA2254819A1 (en) * | 1996-06-06 | 1997-12-11 | Novartis Ag | Inhibition of hiv-1 replication by antisense rna expression |
| NZ333188A (en) * | 1996-06-06 | 2001-06-29 | Systemix Inc | Use of DNA scaffold attachments regions to modify expression of a heterologous gene |
| US6776986B1 (en) | 1996-06-06 | 2004-08-17 | Novartis Ag | Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression |
| AU770885B2 (en) * | 1998-12-22 | 2004-03-04 | Ppd Development, Lp | Genetic suppressor elements against human immunodeficiency virus |
| AU2493300A (en) * | 1999-01-06 | 2000-07-24 | Regents Of The University Of California, The | Modulation of hiv replication using sam68 |
| US7300790B2 (en) | 2003-01-23 | 2007-11-27 | Iogenetics, Llc | Transgenic animals expressing transdominant negative retroviral nucleic acids and proteins |
| JP5653549B1 (ja) | 2014-05-30 | 2015-01-14 | 株式会社松風 | イオン徐放性歯科用レジン系仮封材組成物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4935372A (en) * | 1986-05-20 | 1990-06-19 | Dana Farber Cancer Institute | Art nucleotide segments, vectors, cell lines methods of preparation and use |
-
1990
- 1990-05-23 CA CA002032158A patent/CA2032158C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 AT AT90109892T patent/ATE207122T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-23 ES ES90109892T patent/ES2166748T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 WO PCT/EP1990/000831 patent/WO1990014427A2/en active IP Right Grant
- 1990-05-23 KR KR1019910700090A patent/KR100215949B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-05-23 JP JP02507933A patent/JP3126378B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 DK DK90109892T patent/DK0406557T3/da active
- 1990-05-23 AU AU57388/90A patent/AU648256B2/en not_active Expired
- 1990-05-23 HU HU904245A patent/HU217091B/hu unknown
- 1990-05-23 EP EP90109892A patent/EP0406557B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 DE DE69033829T patent/DE69033829T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 IL IL9448290A patent/IL94482A/xx not_active IP Right Cessation
-
1991
- 1991-01-24 FI FI910371A patent/FI110437B/fi active
-
1994
- 1994-07-20 AU AU67573/94A patent/AU678478B2/en not_active Expired
-
1995
- 1995-06-19 HU HU95P/P00249P patent/HU211530A9/hu unknown
-
1997
- 1997-11-19 JP JP31805597A patent/JP3159671B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU678478B2 (en) | 1997-05-29 |
| CA2032158A1 (en) | 1990-11-26 |
| AU5738890A (en) | 1990-12-18 |
| CA2032158C (en) | 2009-09-15 |
| HUT56135A (en) | 1991-07-29 |
| ES2166748T3 (es) | 2002-05-01 |
| IL94482A0 (en) | 1991-03-10 |
| EP0406557B1 (en) | 2001-10-17 |
| DK0406557T3 (da) | 2002-02-11 |
| KR100215949B1 (ko) | 1999-08-16 |
| AU6757394A (en) | 1994-11-17 |
| WO1990014427A3 (en) | 1991-01-10 |
| EP0406557A3 (en) | 1991-05-02 |
| FI110437B (fi) | 2003-01-31 |
| DE69033829D1 (de) | 2001-11-22 |
| JP3126378B2 (ja) | 2001-01-22 |
| HU904245D0 (en) | 1991-06-28 |
| KR920701440A (ko) | 1992-08-11 |
| DE69033829T2 (de) | 2002-04-04 |
| FI910371A0 (fi) | 1991-01-24 |
| JPH10165188A (ja) | 1998-06-23 |
| IL94482A (en) | 2003-09-17 |
| JPH04500009A (ja) | 1992-01-09 |
| ATE207122T1 (de) | 2001-11-15 |
| JP3159671B2 (ja) | 2001-04-23 |
| WO1990014427A2 (en) | 1990-11-29 |
| HU211530A9 (en) | 1995-11-28 |
| EP0406557A2 (en) | 1991-01-09 |
| AU648256B2 (en) | 1994-04-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ruben et al. | Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus tat protein | |
| Green et al. | Mutational analysis of HIV-1 Tat minimal domain peptides: identification of trans-dominant mutants that suppress HIV-LTR-driven gene expression | |
| Ballaun et al. | Functional analysis of human T-cell leukemia virus type I rex-response element: direct RNA binding of Rex protein correlates with in vivo activity | |
| Malim et al. | Functional dissection of the HIV-1 Rev trans-activator—derivation of a trans-dominant repressor of Rev function | |
| US8197821B2 (en) | Human immunodeficiency virus integrase—Transportin—SR protein—protein interactions | |
| HU217091B (hu) | HIV-replikáció transzdomináns represszorait kódoló mutáns gének és represszorok, valamint rekombináns eljárás az előállításukra | |
| WO1994003596A1 (en) | Antisense viruses and antisense-ribozyme viruses | |
| Hofacre et al. | Jaagsiekte sheep retrovirus encodes a regulatory factor, Rej, required for synthesis of Gag protein | |
| US7846677B2 (en) | Inhibition of HIV-1 virion production by a transdominant mutant of integrase interactor 1 (INI1)/hSNF5 | |
| Böhnlein et al. | Transdominant repressors for human T-cell leukemia virus type I Rex and human immunodeficiency virus type 1 Rev function | |
| US5871958A (en) | Mutant rev genes encoding transdominant repressors of HIV replication | |
| US6339150B1 (en) | Mutant rex genes encoding transdominant repressors of HIV/HTLV replication | |
| AU720284B2 (en) | Multivalent repressor of gene function | |
| US5652340A (en) | Matrix-associating DNA-binding protein, nucleic acids encoding the same and methods for detecting the nucleic acids | |
| WO1994004567A9 (en) | A matrix-associating dna-protein, nucleic acids encoding the same and methods for detecting the nucleic acids | |
| IE83555B1 (en) | Multivalent repressor of gene function | |
| Kushtai | The role of c-fos proto-oncogene in regulation of MHC genes expression | |
| Bakker | The regulation of RNA processing by the Rex protein of human T cell leukemia virus type II | |
| McDonald | Molecular analysis of HIV-1 Rev | |
| Delahunty | Studies of retroviral protein-nucleic acid interactions | |
| Kabrun | Biochemical and biological characterization of c and v-rel | |
| WO1998035234A1 (en) | Identifying agents for treating lentiviral infection | |
| Hodge | Regulation of human immunodeficiency virus expression by viral and cellular factors | |
| WO1997001648A1 (en) | A novel human protein critical for hiv replication | |
| Ogert | Avian retroviral RNA export |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: NOVARTIS AG, CH Owner name: DUKE UNIVERSITY, US |