HU211530A9 - Multivalent repressor of gene function - Google Patents
Multivalent repressor of gene function Download PDFInfo
- Publication number
- HU211530A9 HU211530A9 HU95P/P00249P HU9500249P HU211530A9 HU 211530 A9 HU211530 A9 HU 211530A9 HU 9500249 P HU9500249 P HU 9500249P HU 211530 A9 HU211530 A9 HU 211530A9
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- protein
- gene
- rex
- hiv
- htlv
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 276
- 101710150336 Protein Rex Proteins 0.000 claims abstract description 261
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims abstract description 103
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 claims abstract description 102
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 95
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 27
- 241000894007 species Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 128
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 97
- 108700026241 pX Genes Proteins 0.000 claims description 49
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 47
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 43
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 40
- 101900102211 Human T-cell leukemia virus 1 Protein Rex Proteins 0.000 claims description 34
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 34
- 108700020121 Human Immunodeficiency Virus-1 rev Proteins 0.000 claims description 33
- 101150103375 rex gene Proteins 0.000 claims description 31
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 25
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 24
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 16
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 claims description 13
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 9
- 108700020123 Human Immunodeficiency Virus-2 rev Proteins 0.000 claims description 7
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims description 7
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 5
- 241000713730 Equine infectious anemia virus Species 0.000 claims description 4
- 101000756400 Human T-cell leukemia virus 2 Protein Rex Proteins 0.000 claims description 4
- 241000713325 Visna/maedi virus Species 0.000 claims description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 3
- 241000713704 Bovine immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims 1
- 108700010908 HIV-1 proteins Proteins 0.000 claims 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 abstract description 62
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 abstract description 61
- 230000037430 deletion Effects 0.000 abstract description 36
- 238000012217 deletion Methods 0.000 abstract description 36
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 abstract description 35
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 abstract description 11
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 11
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 4
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 abstract description 3
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 115
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 99
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 86
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 55
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 52
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 49
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 47
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 22
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 20
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 20
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 20
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 20
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 20
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 20
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 19
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 18
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 16
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 16
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 16
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 16
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 14
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 12
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 12
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 12
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 12
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 12
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 11
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 11
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 10
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 10
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 108010038751 tax Gene Products Proteins 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 9
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 9
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 9
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 9
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N Cysteine Chemical compound SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710177291 Gag polyprotein Proteins 0.000 description 8
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 8
- 241000713311 Simian immunodeficiency virus Species 0.000 description 8
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 8
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010068250 Herpes Simplex Virus Protein Vmw65 Proteins 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241001559589 Cullen Species 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000001566 pro-viral effect Effects 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 3
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N sivmac Chemical compound O=C([C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O FLNVBBPBGKOJHN-KKAOYSRWSA-N 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710085461 Alpha-tubulin N-acetyltransferase 1 Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 101900141355 Human T-cell leukemia virus 1 Protein Tax-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- BXKDSDJJOVIHMX-UHFFFAOYSA-N edrophonium chloride Chemical compound [Cl-].CC[N+](C)(C)C1=CC=CC(O)=C1 BXKDSDJJOVIHMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700004026 gag Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 201000009277 hairy cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 108700004030 rev Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150098213 rev gene Proteins 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 230000006648 viral gene expression Effects 0.000 description 2
- YBNPKPVDURZUQN-KNIFDHDWSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;(2s)-2-amino-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YBNPKPVDURZUQN-KNIFDHDWSA-N 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 101100323157 Arabidopsis thaliana LAP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101100098985 Caenorhabditis elegans cct-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241001101077 Crex Species 0.000 description 1
- 229920001393 Crofelemer Polymers 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000702188 Enterobacteria phage M1 Species 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108700018638 Human T-lymphotrophic virus 2 tax Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000701460 JC polyomavirus Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- WJBLNOPPDWQMCH-MBPVOVBZSA-N Nalmefene Chemical compound N1([C@@H]2CC3=CC=C(C=4O[C@@H]5[C@](C3=4)([C@]2(CCC5=C)O)CC1)O)CC1CC1 WJBLNOPPDWQMCH-MBPVOVBZSA-N 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010038997 Retroviral infections Diseases 0.000 description 1
- 101001039853 Sonchus yellow net virus Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 206010044696 Tropical spastic paresis Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010052104 Viral Regulatory and Accessory Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N aspartyl-leucine Chemical compound CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC(O)=O ZVDPYSVOZFINEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 1
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000009109 curative therapy Methods 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003871 intestinal function Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 231100000150 mutagenicity / genotoxicity testing Toxicity 0.000 description 1
- 230000001473 noxious effect Effects 0.000 description 1
- -1 nucleation Proteins 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 108700004029 pol Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108010066381 preproinsulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012205 qualitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229940116238 revex Drugs 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 108700004027 tat Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 101150027303 tax gene Proteins 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000035903 transrepression Effects 0.000 description 1
- 208000006961 tropical spastic paraparesis Diseases 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1036—Retroviridae, e.g. leukemia viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/14011—Deltaretrovirus, e.g. bovine leukeamia virus
- C12N2740/14022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
- C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány a vírusok gén expressziójának a területével foglalkozik, közelebbről a HTLV-I rex [regulator of virion-protein expresszion = virion-protein expresszió szabályzó, a továbbiakban rex] génjének és ennek más relrovírus fajban lévő megfelelő génjeinek, így a HÍV-1 rev-nek a fenotípusos expressziójával foglalkozik.
2. Háttér
A vírusok, különösen az 1-es típusú humán immunhiányos vírushoz [HIV-1] vagy az I-es típusú humán leukémia vírushoz [HTLV-I] hasonló humán retrovírusok igen veszélyes betegségek okozói. Ez a HIV-1 esetében a szerzett immunhiányos tünet [Acquired Immuné Deficiency Syndrome, AIDS] és a HTLV-I esetében a felnőttkori T-sejt leukémia [Aduit T-cell Leukémia, továbbiakban ATL], valamint a trópusi szpasztikus parapesis-ként ismert nem rákos állapotok. A HTLV-II etiológiailag összefüggésben van különböző T-sejt hajas sejtes leukémia egyes eseteivel. Mindkét vírus csoport replikációs ciklusa hasonlóan a DNS vírusokhoz, a gén expresszió egy „korai és egy „késői” szakaszára oszlik. A gén expresszió „korai” fázisát a szabályozó proteinek expressziója jellemzi, míg a „késői” fázisban a szerkezeti proteinek szintetizálódnak.
A HTLV-I genom a vírus transzkripció egy Tax-nak nevezett aktivátorát kódolja. A Tax-nak a HÍV-1-ben lévő megfelelőjét Tat-nak nevezik. A tax és a Tat valószínűleg elsődlegesen a retrovirális LTR-re [long terminál repeat = hosszú terminális ismétlődés, továbbiakban LTR] hat a virális gén expresszi óban. Ezen kívül a HTLV-I kódol egy vírus szerkezeti gén expresszió aktivátort, amelyet Rex-nek neveznek. Egy funkcionális Rex protein a felelős a nem összeillesztett vírus mRNS-nek a magból a citoplazmába történő megnövekedett transzportjáért a fertőzött sejtekben. Ott ezek az mRNS fajok a vírus genomot alkotják, és kódolják a szerkezeti proteineket. Az 1-es típusú humán immunhiányos vírus [HIV-1] egy Rev-nek nevezett homológ proteint kódol. A rév gén terméke, úgymint a tax a HTLV-I rendszerben, feltétlenül szükséges a HIV-1 szerkezeti fehérjék expressziójához.
Ennek alapvető magyarázata az, hogy a rév gén termékének [más vírus fajokban ennek megfelelőinek] dramatikus hatása van a fertőzött sejtekben a vírus mRNS transzkriptumok összeillesztési módjának a kiválasztásában. Ezt a hatást a Rév és Rex esetében a transzkripció utáni szabályzással éri el, nevezetesen a teljes hosszúságú mRNS transzkriptum citoplazmába való transzportjának fokozásával, ami által a vírus szerkezeti proteinek, mint főleg a Gag és Env a HIV-1 esetében, expressziója beindul, és a szabályzó proteinek expressziója ezzel járóan visszaszorul [lásd például a Rex esetében: M. Hidaka és munkatársai, EMBO J.. 7, 519 (1988)] vagy módosul [lásd például a Rév esetében: Μ. H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181. (1988)]. Tehát a Rév nem szükséges egy teljesen összeillesztett HIV-1 mRNS expressziójához, amely a vírus szabályzó proteineket, beleértve a Tat-ot és a Rev-et kódolja.
A HÍV-1-ben az indukció fent említett szelektivitása a Rév funkcióhoz szükséges RNS cél-szekvenciának tulajdonítható, amelyet Rév válasz elemnek neveznek. [Rév Response Element, továbbiakban RRE]. Az RRE megegyezik a HIV-1 env génen belül jelenlevő egy nagy, 234 nukleotidból álló RNS másodlagos szerkezetnek. A HTLV-I-ben a megfelelő szerkezetet Rex válasz elemnek nevezik [Rex Response Element, továbbiakban RexRe vagy RRX], A Rév az első proteinnek tűnik, amelyről úgy látszik, hogy az RNS magból való kijutását szekvencia specifikus módon szabályozza.
Szemléltetésként a Rex-et véve, a Rex proteinnek a HTLV-I gag és env gének expresszióját szabályzó teljes funkciója legalább három, funkcionálisan eltérő aktivitást igényel: magban és nukleoluszban való elhelyezkedése, azaz annak képessége, hogy minden protein citoplazmatikus szintézisének a helyéről átvihető a magba és ott a nukleolusz területén koncentrálódik; a RexRE [RRX] szekvencia specifikus felismerése [közvetlenül vagy közvetetten] a vírus RNS-ekben; és Rex effektor aktivitás, ennek a szabályzó proteinnek jelenleg még nem ismert aktivitása, amely ténylegesen közvetíti a részben összeillesztett vírus mRNS faj kijutását a magból a citoplazmába, amely mRNS tartalmazza a RexRE szekvenciát.
A rex proteinjében azon szerkezeti helyeket tekintetbe véve, ahol a teljes Rex funkció ezen összetevő aktivitásai vannak [azaz a funkcionális domének], a jelen találmány bejelentése előtt mindössze az volt ismeretes, hogy a Rex aminoterminálisán lévő első 20 aminosavában egy pozitív töltésű peptid dómén szükséges a nukleoluszban való elhelyezkedéshez [H. Siomi és munkatársai, Cell, 55, 197-209 (1988)].
Amint a fentiekben említettük, a HTLV-I esetében a Rex gén termék és a HIV-1 esetében a rév gén termék szükséges a vírus szaporodásához [lásd például a HÍV esetében: E. Terwilliger és munkatársai, J. Virol, 62, 655 (1988)]. A Rex és Rév döntő fontosságát kihangsúlyozza az a tény, hogy a különböző elsődleges szerkezetük ellenére funkcionálisan rokonok, és a HTLV-I Rex képes kifejteni hatását más vírus fajokban is, így HÍV-1-ben is [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738 (1988)], annak ellenére, hogy:
- Rév és Rex nem rendelkeznek szignifikáns homológiával sem nukleotid, sem aminosav szinten,
- a nukleotid szekvenciák és az RRE törzs és hurok szerkezetei eltérőek a RexRE [RRX]-étől a HTLV-I-ben,
- a Rex és Rév proteinek másodlagos szerkezetének számítógépes előjelzése nem mutat szignifikáns hasonlóságokat, és
- úgy tűnik, hogy a Rex protein az RRE-nek nem azon helyéhez kötődik, mint a Rév protein, azonban mégis lehetséges a Rév proteint helyettesíteni a Rex proteinnel a HIV-1 rendszerben, valamint a legutóbbi időben azt tapasztalták, hogy a HTLV-I Rex és a HIV-1 Rév képesek helyettesíteni a HIV-2 Rev-et [Rev2] és, hogy a HTLV-I Rex helyettesíteni képes az
HU 211 530 A9 analóg HTLV-II szabályzó proteint is. Ez a kiegészítés elegendő például egy transz funkcionális Rex proteinnel rendelkező rev-hiányos HIV-1 provírust megvédeni. Másrészről, egy rex-hiányos HTLV-I provírus megmentése fordított helyettesítéssel nem látszik megvalósíthatónak. így ebből a szempontból nem teljes a szimmetria. Ezen megfordíthatóság hiányának az alapját még nem értjük, de valószínűleg kapcsolatban van ezen proteinek funkcionális jellegével, amelyek szükségesek a cél-RNS szekvencia felismeréséhez.
A szabályzó proteinekben történő mutációk a vad típusú funkcióval szemben egy domináns negatív fenotípusú gén terméket adhatnak [I. Herskowitz, Natúré, 329, 317 (1987)]. Domináns negatív mutáns proteinek, amelyek transzdomináns represszorként ismertek, amelyeknek kis csoportját az utóbbi időben fedezték fel különböző nem rokon vírusokban, a vírusellenes hatású szerek új csoportját képezik. A genetikai analízisekben a negatív mutációk azok, amelyek a gén funkció csökkenését vagy elvesztését okozzák. Domináns negatív mutációk azok, amelyek megakadályozzák, hogy ugyanazon gén másolatai, amelyek nem mutáltak [azaz, amelyek szekvenciája vad típusú] helyesen működjenek. Másrészről a recesszív negatív mutációk nem gátolják a vad típusú megfelelőjüket. Továbbá, néhány domináns mutáció a vad típusú géneket csak akkor gátolja, ha a mutáns és a vad típusú gének azonos kromoszómán helyezkednek el [DNS vagy RNS molekula]. Ebben az esetben a gátló mutációról azt mondják, hogy az „cisz-aktivitású” [„cis-acting”]. Másrészről, egy domináns mutáció gátolhatja a megfelelő vad típusú gént akkor is, ha az egy különálló kromoszómán helyezkedik el. Ezt a típust „transz-módon ható” [„trans-acting”] mutációnak, vagy egyszerűen transzdomináns mutációnak tekintjük.
Ezen úgynevezett transzdomináns gének közül néhányat leírtak, ezek az eukarióta vagy Herpes vírus transzkripciós faktorok génjeire vonatkoznak [I. A. Hope és K. Struhl, Cell, 46, 885 (1986); R. Gentz és munkatársai Science, 243, 1695 (1989); S. J. Triezenberg és munkatársai, Gén. & Devel., 2, 718 (1988); A. D. Friedman és munkatársai Natúré, 335 452 (1988)]. így, ha a Herpes simplex vírus néhány deléciós mutáns túlságos mértékben kifejezett [overexpressed], a VP16 transz-aktivátor gátolja a VP16 funkciót, ezáltal kizárva a HSV-1 vírusok replikációját a normálisan ezt lehetővé tevő sejtekben. A retrovírusok tekintetében szintén leírtak transzdomináns mutánsokat, például a HTLV-II Tax protein esetében [W. Wachsman és munkatársai, Science 235, 674 (1987)] és a jelen találmány prioritási időpontja után a HIV-1 tat [M. Green és munkatársai, Cell, 58, 215 (1989)] és gag génjei [D. Trono és munkatársai, Cell, 59, 113 (1989)] esetében.
Ezen a két szabályzó protein összetétele és funkciói közötti különbségek jelzik, hogy a Rex szerkezet öszszehasonlítása a Rév proteinével vagy annak ismert mutánsaival, nem ad útmutatást a mutációk kiválasztására, amelyek a vírus proteinek transzdomináns represszorait képezhetik.
A fenti fogalmak terápiás alkalmazása magában foglalhatja az ártalmas gén termékek termelésének vagy túltermelésének a gátlását a gén oly módon történő megváltoztatásával, hogy az domináns negatív mutációkat hozzon létre, amely által a létrejövő gén olyan szabályzó proteineket kódol, amelyek ha kifejeződnek, megszüntetik a vad típusú funkció aktivitását [H.Herskowitz, Natúré, 329, 219 (1987)]. Vírus, pédául retrovírus fertőzések esetében igen kívánatosnak látszik a vírus funkció megfelelő transzdomináns, például a rév vagy rex gén, inhibitorainak a biztosítása az esszenciális szabályzó gének hasonló inhibitorainak a szerkesztésével. Ez a törekvés az „intracelluláris immunizáció” kívánt eszközeit biztosíthatja a vírus fertőzések kezelésének 1988-ban először javasolt megvalósítására [D. Baltimore, Natúré, 335, 395 (1988)].
3. A találmány összefoglalása
A HTLV-I rex, illetve a HIV-1 rév gén transzdomináns változatait állították elő, amelynek a terméke blokkolja a HTLV-I, HTLV-II, illetve a HIV-1 replikációt. Továbbá, a rex vagy rév gén ezen szerkesztett transzdomináns változatainak a terméke blokkolja a HTLV-I [és egyes esetekben a HTLV-II] és a HÍV-1 [és egyes esetekben a HIV-2 és SIV] replikációját.
Ez az első közölt eset olyan vírus represszorok előállítására, amelyek egynél több vírus fajra hatnak, azaz transzdomináns gén termékek, amelyek egynél több vírus faj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját represszálják.
A találmány olyan proteineket kódoló génekre vonatkozik, amelyek transzdomináns módon represszálják egynél több vírus faj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját és így egynél több vírus faj replikációját blokkolják, főleg az alábbiakban ismertetett pcRexM2-ben, pcRexM7-ben és pcRexM8-ban, az M6, M7 és Ml3-ban és a pMlO-ben lévő mutáns génekre vonatkozik.
Olyan proteineket kódoló génekre is vonatkozik, amelyek transzdomináns módon represszálják a HTLVI és/vagy HTLV-II rex gén fenotípusos expresszióját és olyan proteineket kódoló génekre, amelyek transzdomináns módon HIV-1 és/vagy HIV-2 és/vagy SIV rév gén fenotípusos expresszióját, főleg az alábbiakban ismertetett pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM17 és pcRexl3 15 plazmidokban; a pMlO, p 9/14, pM21, pM22, pM27, pM29 és pM32-ben; és az M6, M7 és Ml3-ban lévő mutáns génekre.
Vonatkozik ezen gének előállításának egy eljárására, amely magában foglalja a megfelelő vad típusú géneknek egy megfelelő expressziós rendszerből való izolálását, ennek a génnek megfelelő klónozó rendszerbe történő elhelyezését, a kívánt mutáció génbe való bevitelét és a kapott mutáns génnek a kívánt mutációt tartalmazó kiónból való kinyerését. Vonatkozik még egy eljárásra a fentiekben meghatározott proteinek előállítására, amely a fent meghatározott mutáns gén egy megfelelő expressziós és szaporító rendszerben történő expresszióját és szaporítását és a kifejezett termék abból való kinyerését foglalja magában.
Vonatkozik olyan proteinekre is, amelyek transzdo3
HU 211 530 A9 mináns módon represszálják több, mint egy vírus faj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját és így blokkolják több mint egy vírus faj replikációját, különösen az alábbiakban leírt pcRexM2, pcRexM7 és pcRexM8; az M6, M7 és Ml3; és pMlO mutáns proteinjeire.
Vonatkozik egy vektorra is, például egy retrovirális vagy plazmid vektorra, amely a fentiekben meghatározott gént olyan formában tartalmazza, amely alkalmas arra, hogy funkcionális állapotban szabaduljon fel az emlős cél-sejtben in vivő vagy in vitro.
Vonatkozik még egy gyógyszerkészítményre, amely a fentiekben meghatározott gént vagy proteint olyan megfelelő formában tartalmazza, amely alkalmas a kívánt profilaktikus vagy terápiás hatás elérésére és gyógyászatilag megfelelő vivőanyagot vagy hígítóanyagot tartalmaz, például egy beteg testéből kivett sejt formájában, amelyet in vitro kezelünk a visszavitel előtt.
Vonatkozik még vírus fertőzések kezelésének egy módszerére, amely a fentiekben meghatározott gén vagy protein olyan megfelelő formában való beadásából áll, amellyel elérhető az ilyen kezelést igénylő betegeknek a kívánt megelőző vagy terápiás hatású kezelése, például a beteg testéből kivett és visszavitel előtt in vitro kezelt sejtek formájában.
„Kezelés” alatt a vírus fertőzések profilaktikus, valamint gyógyító kezelését értjük, a „gyógyító” hatás alatt a vírus fertőzés latens állapotban való stabilizálását értjük.
Vonatkozik még az itt meghatározott génekre, proteinekre és DNS szegmentumokra, amelyeket gyógyászati célra alkalmazunk.
A találmány vonatkozik még a fent leírt gének és proteinek funkcionális fragmentum vagy származék formáira, azaz olyan fragmentumokra vagy származékokra, amelyek funkcionálisan egyenértékűek. „Funkcionális fragmentum vagy származék” alatt olyan fragmentumot vagy származékot értünk, amelynek olyan farmakológiai aktivitása van, amely minőségileg azonos az ép mutáns gén vagy fehérje farmakológiai aktivitásával és mennyiségileg azonos vagy eltérő, azaz nagyobb vagy kisebb, mint az ép mutáns gén vagy protein farmakológiai aktivitása, például körülbelül 1%-tól körülbelül 10 000%-ig, főleg körülbelül 10%tól körülbelül 1000%-ig.
A találmány vonatkozik még az itt meghatározott génekből, proteinekből és DNS szegmentumokból származó inhibitorokra is, amelyek képesek utánozni a transzdomináns, azaz elsősorban az RNS-t kötő domént a fent leírt mutáns Rex vagy Rév proteinben, így kis molekulatömegű inhibitorokra vagy semlegesítő monoklonális antitestekre. A kis molekulatömeg itt egy körülbelül 10 kd alatti, elsősorban körülbelül 1 kd alatti molekulatömeget jelent.
A további szempontokat, amelyekre a találmány vonatkozik, az alábbiak tartalmazzák:
- HIV-1 Rév funkcióinak egy transzdomináns represszora, amely egy első és egy második doménből áll, az első dómén lényegében a vad típusú
HIV-1 Rév specifikus kötő funkcióival rendelkezik és a második dómén nem rendelkezik a vad típusú HIV-1 Rév aküvációs funkcióval, a második dómén a vad típusú HIV-1 Rev-ből módosított egy vagy több mutációval; előnyösen az első dómén tartalmazza a vad típusú Rév körülbelül 10-es aminosav helyétől körülbelül a 68-as aminosav helyig terjedő részt és a módosított második dómén a vad típusú Rév körülbelül 68-as aminosav helyétől a körülbelül 90-es aminosav helyig terjedő részéből származik; különösen a fenti egy vagy több mutáció téves vagy deléciós mutációk, amelyek a vad típusú Rev-nek körülbelül a 68-as aminosav helye és körülbelül a 90-es aminosav helye között mennek végbe, előnyösen körülbelül a 78-astól körülbelül a 86osig, különösen körülbelül a 78-astól körülbelül a 83-as vagy 84-esig mennek végbe, a vad típusú HÍV-1 Rév első doménjének a specifikus kötő funkciói lényegében funkcionálisan épek maradnak, főleg az alább leírt pM 10, pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32 represszorok vagy ezeknek egy funkcionális fragmentuma vagy származéka;
- a HÍV Rév funckiónak egy transzdomináns represszora, amely tartalmaz egy első domént, amely lényegében rendelkezik a vad típusú HIV1 Rév specifikus kötő funkcióival, ez a transzdomináns represszor nem rendelkezik a vad típusú HIV-1 Rév aktivációs funkcióival; előnyösen az első dómén tartalmazza a vad típusú Rev-nek körülbelül a 10-es aminosav helyétől körülbelül a 68-as aminosav helyig terjedő részét, és a transzdomináns represszor nem tartalmazza a vad típusú Rev-nek körülbelül a 68-as aminosav helyétől legalább a 90-es aminosav helyig terjedő részét; főleg az alábbiakban leírt ρΔ9/14 és ρΔΙΟ/14 represszorok vagy ezeknek egy funkcionális fragmentuma vagy származéka;
- egy DNS szegmentum, amely a HTLV-I Rex protein funkciójának a transzdomináns represzszorát kódolja, a represszor a Rex protein vad típusú formájából módosított legalább egy transzdomináns negatív mutációval a vad típusú Rex protein peptid doménjében, amely a Rex protein effektor aktivitását fejti ki, ez a represzszor lényegében rendelkezik a Rex protein vad típusú formájának a magban elhelyezkedő aktivitásával; előnyösen egy ilyen DNS szegmentum, amelyben a vad típusú Rex protein peptid doménje tartalmazza körülbelül az 59-es aminosav helytől a körülbelül 121-es aminosav helyig, különösen a következő aminosav helyek bármelyikében: 59, 60, 64, 65, 119, 120 és 121; főleg egy DNS szegmentum, amely a következő mutáns rex gének bármelyikét tartalmazza; M6, M7, Ml3 és ezek variánsai és származékai; amelyek a HTLV-I Rex protein funkció transzdomináns represszióját mutatják;
- a HTLV-I Rex protein funkciójának megfelelő transzdomináns represszora a vad típusú formá4
HU 211 530 A9 ból úgy módosítva, hogy az előnyösen rendelkezik azon képességgel, hogy represszálja akár a HIV-1 Rév protein funkcióját, akár a HTLV-II Rex protein funkcióját;
- egy eljárás a Rex protein gén aktiváló funkciójának a specifikus gátlásának az azonosítására, amely a következő lépésekből áll:
i) rendelkezésre bocsát egy genetikus rendszert, amely tartalmaz:
- egy olyan DNS szegmentumot, amely kódol egy mRNS-t, amely tartalmaz egy szabályzó válasz elemet, amelyet felismer a Rex protein, és legalább egy nem használt összeillesztési helyet [azaz egy régiót vagy intront, amely az összeillesztés felismerési szekvenciához kapcsolt, de amely nem összeillesztett az mRNS-en kívül];
- egy DNS szegmentum, amely kódol egy rex gént, amely képes kifejeződni egy protein termék termelése céljából, amely indukálja az mRNS kijutását a magból;
- egy rex gént kódoló DNS szemgentummal és az mRNS-t kódoló DNS szegmentummal transzformáit gazdasejt, amely rendelkezik a rex gén protein termékének és az mRNS-nek a kifejező képességével;
ii) ezt a genetikus rendszert tartalmazó sejtek érintkeztetésbe hozása a Rex protein feltételezett specifikus inhibitoraként ható szerrel olyan körülmények között, amikor a szer belép a sejtekbe;
iii) ezen szernek az mRNS-nek a magból történő kijutására kifejtett hatásának a meghatározása, amely felhasználja a nem használt összeillesztési helyet; és iv) ezen szernek az mRNS-nek az összeillesztett formájának a magból történő kijutására kifejtett hatásának a meghatározása, amely az összeillesztési helyet használja; és
- az mRNS összeillesztett formája, amelyben az összeillesztési hely használt, ami által a nem használt összeillesztési helyet tartalmazó mRNS kijutásának a csökkenése az mRNS összeillesztett formája kijutásának a változatlan mértékével együtt azt jelzi, hogy ez a szer a HTLV-I rex-gén vagy a rex gén egy termékének az aktivitásának egy specifikus inhibitora; az mRNS szabályzó elem, amelyet felismer a Rex protein, amely előnyösen a HTLV-I-ből, HTLV-II-ből és HÍV-1-ből választott vírus mRNS-éből származik;
- a fentiekben meghatározott azonosítási módszer, amelyben a nem használt összeillesztési helyet tartalmazó mRNS kijutásának a csökkenése előnyösen kimutatható az első protein termelési szintjének a meghatározásával, amelyet a nem használt összeillesztési helyet tartalmazó mRNS kódol, és az mRNS összeillesztett formájának a megnövekedett kijutása előnyösen kimutatható a második protein termelési szintjének a meghatározásával, amelyet az mRNS összeillesztett formája kódol;
- a fentiekben ismertetett azonosítási módszer, amelyben a szabályzó válasz elemet és az összeillesztési helyet tartalmazó mRNS-t egy olyan plazmid kódolja, amely tartalmazza a HTLV-I provírus 3’-végét, beleértve a Rex és Tax proteinek kódoló régióját, a teljes env gént, a Rex válasz elemet és a teljes r’ LTR-et; előnyös az alábbiakban leírt pgTAX-LTR plazmid, és a rex gén, amely előnyösen a pRex plazmidon van;
- plazmid pgTAX-LTR;
- a Rex protein gén aktivációs funkciója specifikus inhibitorának a fenti azonosítási módszernek megfelelő azonosítására szolgáló szűrővizsgálati szerekből álló reagens készlet, amely a következőket tartalmazza:
- egy olyan mRNS-t kódoló DNS szegmentumot, amely tartalmaz egy szabályzó válasz elemet, amelyet felismer a Rex protein és legalább egy nem használt összeillesztési helyet;
- egy olyan rex gént kódoló DNS szegmentum, amely képes oly módon kifejeződni, hogy egy protein terméket hozzon létre, amely indukálja az mRNS kijutását a magból; és
- egy tartály, amely tartalmazza a rex gént kódoló DNS szegmentummal és az mRNS-t kódoló DNS szegmentummal transzformált gazdasejtet, amely sejt képes kifejezni a rex gén protein terméket és az mRNS-t;
- a HIV-1, HTLV-I vagy HTLV-II replikáció gátlásának egy módszere, amely a fent meghatározott DNS szegmentum egy olyan sejtbe való beviteléből áll, amely rendelkezik ezen vírusok egyike replikációjának a képességével és azzal a képességgel, hogy kifejezze a DNS szegmentumot a HTLV-I Rex funkció transzdomináns repressziójának a termelése céljából; és
- egy módszer a HIV-1, HIV-2 és SIV, különösen a HIV-1 replikációjának a gátlására, amely a HIV-1 Rex funkció egy transzdomináns represszorának a HIV-1-gyei fertőzött sejtbe való beviteléből áll.
4. Az ábrák magyarázata
4.1. az 5.1. és 6.1. fejezetekre vonatkozó ábrák
1. ábra: a HTLV-I rex nukleotid és aminosav szekvenciája [az oligonukleotidokkal változtatott aminosav-helyeket (1) (87-es, 88-as, 89es aminosav-helyeket) és (2) (94-es hely) megjelöltük, a 82-es, 90-es, 91-es és 97-es helyekhez hasonlóan. A teljes szekvencia 567 nuleotidot tartalmaz, és 189 aminosavat kódol.
1A. ábra: a HTLV-I rex génbe bevitt 29 mutáció helye. A HTLV-I rex gén egy 189 aminosavból álló proteint kódol. Egy helyre irányuló mutagenezist alkalmazva téves helyettesítéseket végeztünk meghatározott aminosav maradékok esetében (bekeretezéssel jelöltük) és ezeket a rex génen belüli elhelyezkedésüknek megfelelően neveztük el. (Az ábrán az egybetűs aminosav-kódokat használjuk.)
2A. ábra: a rex immunprecipitációja
A rex immunprecipitáció utáni 30 rex mutánsból
7-nek az SDS/poliakrilamid gélelektroforézise (SDS = sodium-dodecyl-sulfate, nátrium-dodecilszulfát, továb5
HU 211 530 A9 biakban SDS) (azt mutatja, hogy a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM13, pcRexMM, pcRexM17 és pcRexl3A15 még termelnek Rex proteint):
A: pgtat (a Rex antitest negatív kontrollja)
B: pcRex C: pcRexM2 D: pcRexM7 E: pcRexM8 F: pcRexM13 G: pcRexMM
H: pcRexM17 (az ebben a sorrendben lévő kisebb molekulatömeg valószínűleg ennek a proteinnek a módosításakor végbement változásnak tulajdonítható, például foszforilációnak),
1: pcRexl3Á15
2B. ábra: Mutánsok biológiai fenotípusai:
A 2A ábrához Hasonlóan Tat immunprecipitáció után:
A: pgtat + pXF3
B: pgtat + pcRev
C: pgtat + pcRex
D: pgtat + pcRexM =
E: pgtat + pcRexM7
F: pgtat + pcRexM8
G: pgtat + pcRexM 13
H: pgtat + pcRexM 14
I: pgtat + pcRexM 17
K: pgtat + pcRex 13Δ15
2C ábra: a 2B ábrához hasonló [azt mutatja, hogy néhány Rex mutáns a vad típusú Rex-szel szemben transzdomináns, nevezetesen: a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexMM, pcRexM17 és pcRexl3A15 mutánsok]:
A: pgtat + pXF3 + pXF3
B: pgtat + pcRex + pXF3
C: pgtat + pcRex + pcRexM2
D: pgtat + pcRex + pcRexM7
E: pgtat + pcRex + pcRexM8
F: pgtat + pcRex + pcRexM 13
G: pgtat + pcRex + pcRexM 14
H: pgtat + pcRex + pcRexM 17
T: pgtat + pcRex + pcRexl 3Δ15
2D ábra: a 2B ábrához hasonló [azt mutatja, hogy néhány Rex mutáns a vad típusú Rev-vel szemben transzdomináns, nevezetesen a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8 és részben pcRexM 13 mutánsok]:
A: pgtat + pXF3 + pXF3
B: pgtat + pcRev + pXF3
C: pgtat + pcRev + PcRexM2
D: pgtat + pcRev + pcRexM7
E: pgtat + pcRev + pcRexM8
F: pgtat + pcRev + pcRexM 13
G: pgtat + pcRev + pcRexM 14
H: pgtat + pcRev + pcRexM 17
I: pgtat + pcRev + pcRexl 3Δ15
3. ábra: szerkesztett Rex mutánsok
4. ábra: a rex kódoló szekvencia mutagenezise céljából szintetizált 29 oligonukleotid szekvenciája.
4.2. Az 5.2. és 6.2. fejezetekre vonatkozó ábrák
5. ábra: a HIV-1 rév génbe bevitt mutációk helye. A
HIV-1 rév gén egy 116 aminosavból áll, a bemutatott jósolt szerkezetű proteint kódol. A rév két kódoló exonja közötti határt megjelöltük [SP]. Csoportos pont-mutációkat [pM] végeztünk oligonukleotid irányítású mutagenezissel, amint azt a bekeretezett maradékok mutatják. Ezeket a mutációkat a Rev-en belüli elhelyezkedésüknek megfelelően neveztük el, az N-terminálist pM 1-gyel és a C-terminálison lévőt pM14-gyel. Minden bevitt mutációra két-négy szomszédos aminosav van hatással, és mindegyik, kivéve a pM7-et, a rév gén szekvenciába egy egyedülálló BglII helyet vitt be. Ezek a bevitt helyek megkönnyítik az ezt követő Nés C-terminális deléciós ]ρΔ] mutánsok szerkesztését. A ρΔ mutánsokat a deléció kiterjedése szerint neveztük el, például ρΔΙ 1/14 a bevitt pMll és pM14 mutációk között deletált. (Az ábrán egybetűs aminosav-kódokat használunk.)
5Aábra: a HIV-1 rév génbe bevitt további téves és deléciós mutációk helye [- = deletált aminosav].
6. ábra: a pcREV DNS és megfelelő aminosav szekvenciája.
7. ábra: az m 1-M14 mutációs helyeken megfelelő
DNS szekvencia.
8. ábra: a HIV-1 rév és tat transzaktivátorok immunprecipitációja.
9. ábra: HIV-1 provirális védő vizsgálat.
10. ábra: a rév és kiválasztott Rév mutánsok sejten belüli elhelyezkedésének a megállapítása közvetett immunfluoreszcenciával.
llAés 11B ábrák: a Rév mutánsok analízise domináns negatív fenotípus keresése céljából.
12. ábra: a Rév funkció kompetitív gátlása.
12Aábra: a HIV-1 rév transzaktivátor dómén szerkezete. A 116 aminosavból álló teljes hosszúságú proteint egy intronnal elválasztott két exon kódolja, amely nagymértékben megfelel a vírus env génnek. A „kötő” és az „aktiváló” domének a vonalkázott keretekben vannak, amelyek magukban foglalják a 2356-os, illetve a 78-83-as maradékokat. S összekapcsolási hely; NL = a magban való elhelyezkedéshez fontos erősen bázikus régió, amely jelentős azonosságot mutat az „Arg-gazdag” RNS kötő résszel.
4.3. Az 5.3. és 6.3. fejezetekhez tartozó ábrák
13. ábra: [A] a HIV-1 Rex protein aminosav szekvenciája és a bevitt 25 pontmutáció mindegyikének a helye. A bekeretezett aminosavak mindegyikét kódoló nukleotidot eltávolítottuk és a keretben levő oligonukleotiddal helyettesítettük, amely aszparatil-leucin dipep6
HU 211 530 A9 tidet kódol. (Az ábrán egybetűs aminosavkódokat használunk.) [B] a Rex-re érzékeny pgTAX-LTR expressziós vektor szerkezete. A CR-1 HTLV-I provírus 3’ végét a gén térkép 5013-as helyén lévő [M. Seiki és munkatársai, Proo. Nat. Acad. Sci. USA, 80, 3618-3622 (1983)] HindlII helyéről a 3’LTR-ren keresztül inszertáltuk a pBC 12/CMV expressziós vektorba, Ez a fragmentum tartalmazza a Tax kódoló két exont [üres keretek], a teljes env gént és a HTLV-I teljes 3’-LTR-rét, beleértve a RexRE-t [RRX] is [S. M. Hanley és munkatársai, Genes Develop., 3, 1534-1544(1989)].
14. ábra: [A] a Rex ellentétben a Rév-vei és IL-2-vel, aktiválja a HTLV-I Env protein pgTAX-LTR vektor általi expresszióját. A COS sejtek még nem összefolyó [subconfluent] tenyészetet pgTAX-LTR-rel és pREX-szel [L. Rimsky és munkatársai, Natura, 335, 738 (1988)], pREV-vel [M. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181-183 (1988)] vagy pCMV-IL-2-vel [B. R. Cullen, Cell, 46, 973-982 (1986)] kontraszfektáltuk. Az utolsó sávban a sejteket pgTAX-LTR távollétében pREX-szel transzfektáltuk. Az Env protein termelést immunprecipitációval és gélelektroforézissel analizáltuk. Az ismert molekulatömegű standardokat baloldalt jelöltük. [B] A rex mutánsok Rex funkciójának az analízise. A pBC 13/CMV expressziós vektorba történt inszerció után a 25 rex mutáns mindegyikét [Ml-Ml8 és M21-M27 jelűek, lásd a 13A ábrát; az M19 és M20-szal jelölteket nem szerkesztettük meg] kontranszfektáltuk a pgTAX-LTR-rel és a tenyészetek Rex függő HTLV-I Env protein expresszióját analizáltuk a 12. példában leírt módon.
15. ábra: a HTLV-I Env, Tax és Rex proteinek szimultán immunprecipitációs analízise COS sejtekben, amelyeket pgTAX-LTR-rel és az inaktív [Ml, M2, M6, M7, Ml3] vagy gyengített [Ml5] Rex mutánsokkal vagy a vad típusú pRex-szel, pRev-vel és pCMV-IL-2 vektorokkal kontraszfektáltuk. [A] Env termelés; [B] Tax termelés; [C] vad típusú és mutáns Rex protein termelés.
16. ábra: a HTLV-I Rex mutánsok sejten belüli elhelyezkedése immunfluoreszcencia alapján. A vad típusú M6, M7 és M13 Rex proteinek a nukleoluszokban és a magban helyezkednek el a kifejező sejtekben. Ezzel ellentétben az Μ1 Rex prtoeint csak a citoplazmában mutattuk ki, míg az M2 protein az egész sejtben eloszlik. Az M15 mutáns a kifejező sejtek magjában helyezkedik el, de ellentétben a vad típusú Rex proteinnel, a nukleoluszból kizártnak tűnik.
17. ábra: [A] a rex mutánsok vad típusú Rex protein funkcióját gátló képességének az analízise. Minden tenyészetet pgTAX-LTR-rel, pREX-szel és valamelyik Rex mutánssal [16-os sávok], pREX-szel [7-es sáv] pREV-vel [8-as sáv] vagy pCMV-Il-2-vel [9-es sáv] kontranszfektáltuk. A HTLV-I Env termelést a 14. ábrában leírtak szerint analizáltuk.
[B] a THLV-I rex transzdomináns mutánsok gátolják a HIV-1 Rév protein funkcióját. Sejteket pgTAT-tal, pREV-vel és pBC/CMV-IL-2-vei vagy M6, M7 és Ml3 transzdomináns Rex mutánsokkal kontranszfektáltunk és vizsgáltuk a Tat protein 72 aminosavas, megrövidített formájának a Rév által indukált termelését [2-es sáv]. Az M6, M7 és Ml3 [3-5-ös sávok] teljesen gátolják a HIV-1 Rév proteint, minthogy a Tat proteinnek csak a teljes hosszúságú 86 aminosavat tartalmazó formája volt kimutatható.
[C] a HTLV-I transzdomináns Rex mutánsok blokkolják a Rev-hiányos HIV-1 provírus replikációjának a Rex általi kivédését. Sejteket rev-hiányos HIV-1 provírus plazmiddal és pREX-szel kontranszfektáltunk Ml, M7 és M13 mutánsok jelzett mértékű feleslegének a jelenlétében. Mértük a HIV-1 p24 Gag protein szintjét a felülúszóban.
5. Részletes leírás
A jelen találmányban alkalmazott eljárások és technikák a szakterületen ismertek.
Vírus fajták alatt azt értjük, hogy azok rendszertanilag eltérő fajok, így a HTLV-I, HTLV-II, SIV, HIV-1 és HIV-2. A találmány főleg a retrovírusok területére, különösebben a humán retrovírusokra vonatkozik.
A gének, amelyek expressziójának a represszálása a jelen találmány célja, előnyösen olyan gének, amelyek egy nem kívánatos tulajdonságot kódolnak, mint például egy funkciót, amely a provírus aktiválódását és fertőző részecskékké való érését eredményezi, például a HIV-1 és HIV-2 rev-je.
A rév és a Rév alkalmazása itt HIV-1 rev-et, illetve HIV-1 Rev-et jelent, ha másként nem jelöljük. így más vírus fajok, mint a HIV-2 egyenértékű rev-jét és Revjét „HIV-2 rév [rev-2]”-nek, illetve „HIV-2 Rév [Rev2]”-nek jelöltük, stb.
Amennyiben ezek előállítása itt nincs részletesen leírva, a kiindulási anyagként alkalmazott vegyületek, vektorok, sejtvonalak, stb. vagy reagensek ismert és nyilvánosan hozzáférhetők vagy szokásos módon előállíthatók ismert és közönségesen hozzáférhető anyagokból vagy egyenértékű anyagok állíthatók elő szokásos módon ismert és közönségesen beszerezhető anyagokból. Ily módon a Rex gén kinyerhető a HTLV-I-ből és a rév gén a HÍV-1-ből előállított bármely izolált anyagból és a pgTAX-LTR előállítható például HUT102-ből vagy MTI-bői. Más módon géneket kémiai szintézissel is lehet alkotni olyan genetikai kód7
HU 211 530 A9 nak megfelelően, amely a kívánt aminosav szekvenciával rendelkező proteint termeli. A Rex és Rév transzdomináns represszorát standard rekombináns DNS módszerrel vagy standard kémiai peptid szintézis módszerekkel vagy ezen módszerek kombinációjával állítjuk elő, amelyek mindegyike ismert.
5.7.
A találmány egyik szempontból a HTLV-I-ben a Rex funkció transzdomináns represszorával foglalkozik, különösen a HTLV-I-ben a Rex funkció olyan transzdomináns represszoraival, amelyek szintén hatásosak a funkcionálisan egyenértékű, de szerkezetileg nem rokon Rév funkcióval a HÍV-1-ben.
Különösen módosított kódoló szekvenciákat szerkesztettünk és fejeztünk ki és azt találtuk, hogy rendelkeznek a fenti tulajdonsággal.
A vad típusú rex kódoló szekvenciát [lásd 1. ábra] megváltoztattuk egy beszerezhető mutagenezis rendszer segítségével, amely megfelel az „oligonukleotidra irányuló in vitro mutagenezis rendszer, 2. változatnak [’Oligonucleotide-directed in vitro mutagenesis system Version2”, Amersham, England (1988), Code RPN, 1523, itt a továbbiakban ezt „Amersham protocol”-ként rövidítjük]. A végső expressziós vektorok szerkesztéséi egymást követő lépésekben hajtottuk végre:
(1) a rex kódoló szekvenciát tartalmazó bakteriofág Μ13 vektor előállítása, (2) a rex kódoló szekvencia mutagenezise és (3) a mutált gén újra klónozása emlős expressziós plazmidokba.
mutánst szerkesztettünk, beleértve egy deléciós mutánst is. A 29 egy helyre irányuló mutáció helyét és természetét a 3. ábrában adtuk meg. A mutagenezishez felhasznált megfelelő oligonukleotidokat a 4. ábrán soroltuk fel. Ezek mind hordoznak egy Bg 1II restrikciós helyet.
A rex kódoló szekvenciát pcRex (= pRex) plazmidból izoláltuk [L.Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738 (1988]. A vad rex típusú gén más forrásai hozzáférhetők, így a rex gén klónozható például hasonló módon, mint azt a HTLV-I gag, pol, env és tax gének esetében B. K. De és A. Srinivasen [Nucl. Ac. Rés., 77, No5. 2142 (1989] leírják, a szokásos HTLV-I sejtvonalak teljes genomján kívül, mint példul HŰTI 02 (TIB 162) és azMZ2 [J. G. Sodroski és munkatársai, Science, 225 381 (1984); I. Miyoshi és munkatársai, Natúré, 294 770 (1981); V. Manzari és munkatársai, PNAS, 80,1574 (1983)] például polimeráz láncreakciót használva.
A tat és rév kódoló szekvenciákat pgTat és pcRev plazmidokból izoláltuk [Μ. H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181 (1988)]. Más módon is izolálhatók, például HÍV provírus kiónból, mint a λΗΧΒΖ (Aids Research and Referene Reagent Program, 1989. június, NIH, kalagógus szám 70).
Az előállított különböző rex gének biológiai aktivitását a HÍV-1 rev és a HTLV-I rex gén termékek hatásának érzékeny mérésével vizsgáltuk a különböző gének COS sejtekben való expressziójával [Gluzman és munkatársai, Cell, 23, 175 (1981)]. A vírus szerkezeti proteinek szintézisének a megindításához hasonlóan, a Rév és a Rex proteinek indukálják a HIV-1 Tat szabályzó protein megrövidített formájának a termelését [H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181-183 (1988); L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738-741 (1988)]. Egy genomenális HIV-1 tat génnek egy funkcionális HIV-1 rév vagy egy HTLV-I rex génnel együtt történő koexpressziója egy nem összeillesztett tat mRNS citplazmatikus expressziójához vezet, amely a Tat-nak egy megrövidített egy-exonos formáját kódolja, amely 72 aminosav hosszúságú. A funkcionális Rév vagy Rex protein hiánya lehetővé teszi a 86 aminosavból álló teljes hosszúságú Tat protein expresszióját, amely a Tat két-exonos formájának felel meg. így a rév vagy rex funkció egy aktív transzrepresszorának a jelenléte a 72 aminosavból álló Tat protein csökkent vagy megszűnő termeléséhez vezet. Ez a különbség jól látható az immunprecipitációs analízis során.
Amint a 2C ábrából látható, a 30 mutánsból 6-ot találtunk, nevezetesen a pcRexM2-t. pcRexM7-t, pcRexM8-at, pcRexM 17-et és pcRex 13Á15-öt, amelynek transzdomináns Rex represszora volt. Ugyanezt tapasztaltuk a pcRev esetében (lásd 2D ábra), nevezetesen a pcRexM2-nél, pcRexM7-nél, pcRexM8-nál és részben a pcRexM 13-nál, amely jelzi, hogy a transzdominancia nem korlátozódik a HTLV-I génre, és a mutánsok némelyike, nevezetesen ebben a sajátos esetben a pcRexM2, pcRexM7 és a pcRexM8, mindkét gén esetében transzdominánsok.
Minthogy az először kapott eredmények közül néhány azt jelezte, hogy a legeredményesebb mutációk a 87-es és 94-es aminosav helyek között vannak, és így úgytűnt, hogy a rex/rev gén egy része a körülbelül a 82-es és körülbelül a 97-es aminosav helyek között fekszik, különleges jelentősége volt transzdomináns Rex/Rev represszorok szerkesztésének, a további vizsgálatok azt mutatták, hogy a mutációk előnyös helyeinek a kiterjedése szélesebb a Rex proteinben, vagyis ezek legalább olyan közel fekhetnek az N-terminálishoz, mint a 22-es aminosav hely, és legalább olyan távol a C-terminálistól, mint a 101-es aminosav hely.
5.2.
A HÍV-1-ben lévő Rév funkcióra irányuló további vizsgálatok során szintén találtunk transzdomináns rév represszorokat. Lehetséges, hogy ezek legalább némelyike szintén gátolja a Rex funkciót a HTLV-I-ben vagy a HTLV-U-ben, de ezt itt nem vizsgáltuk.
Másrészről azt találtuk, hogy ezeknek legalább egy része gátolja a HIV-2-ben és SlV-^-ban a Rév funkciót.
Továbbiakban kiterjedt mutációs analízis a rev-en belül legalább két elkülönülő funkcionális dómén vázlatos leírásához vezetett, amelyek nélkülözhetetleneknek látszanak a transzaktiválásában. Ezeket a doméneket úgy képzeltük el, mint amelyek tartalmazzák a „kötő domént, amely a Rév proteint a megfelelő célszubsztráthoz irányítja, és egy „aktivációs domént”, amely lehetővé teszi a kötődés funkcionális következményeit, a transzkripcionális aktiválás szerepének a betöltését.
HU 211 530 A9
Következésképpen a rev-en belül két funkcionális domént határoztunk meg: egy kötő domént, amely valószínűleg a Rév proteint a célsejtjéhez irányítja és egy aktiválási domént, amely lehetővé teszi a nem teljesen összeillesztett azon RNS-ek kijutását a magból, amelyek a Gag és Env proteineket kódolják. A Rév aktiválási doménjének a mutációja hiányos Rév protein expresszióját eredményezi, amely a Rév funkció transzdomináns inhibitoraként hat. Az ilyen mutánsok jelentősen gátolják a HIV-1 replikációt, ha tenyészetben transzfektált sejtekben fejeződnek ki, és így szintén transzdominánsok, mint az 5.1. fejezetben leírt mutánsok.
Ezen második törekvésre vonatkozó részletes fel világsítást az alábbi 6.2. fejezetben adjuk meg. Az itt talált transzdomináns mutánsokat a következőképpen jelöltük: ρΜΙΟ, ρΔ9/14 és ρΔ10/14 (lásd a 4-11. példákat) és pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32 (lásd a 11a és 11b példákat), a ρΜΙΟ-ről megállapítottuk, hogy hatásosan gátolja nemcsak a HIV-1 rév gén funkciót, hanem a HIV-2 és SIVmac rév gén funkcióit is.
A fenti 9 transzdomináns mutánsok közül a ρΜΙΟ, pM21 és a pM32 előnyösek, különösen a ρΜΙΟ.
5.3.
Egy további, a HTLV-I-ben a Rex funkciójára irányuló, az 5.1-hez hasonló vizsgálataink eredményeképpen szintén találtunk transzdomináns represszorokat, és kifejlesztettünk egy módszert, amely lehetővé teszi a Rex aktivitások kimutatását és alkalmazható a Rex funkció olyan specifikus gátlóinak az azonosítására, amelyek általában nem akadályoznak más vírus vagy gazdasejt funkciókat. Ez a Rex inhibitor kimutatás egy olyan genetikus rendszert alkalmaz, amely egy Rex-érzékeny „riporter” gént tartalmaz, amely egy szabályzó elemet magában foglaló mRNS nem összeillesztett formáját, például egy RexRE-t [RRX] kódol. Ebben a rendszerben egy Rex funkcióval rendelkező protein indukálja ennek az össze nem illesztett mRNSnek a kijutását a sejtmagból a citoplazmába. A Rex funkció hiányában ez az mRNS a citoplazmában való kijutás előtt összekapcsolódik, amint azt a fentiekben jeleztük. Ezen genetikus rendszert tartalmazó sejtek érintkezése a Rex funkció egy várható inhibitorával, a HTLV-I Rex funkció specifikus gátlása megy végbe ennek a szemek a hatására, amelyet ennek a sajátos mRNS össze nem illesztett formájának a magból történő kijutásának a csökkenése jelez, miközben nem csökken ugyanannak az mRNS-nek az összeillesztett formájának a magból való kijutása. Ez a módszer alkalmas például a HTLV-I Rex protein kémiai inhibitorainak a kimutatására, például olyan inhibitorok kimutatására, amelyek képesek a mutáns Rex vagy Rév proteinben a transzdomináns domént utánozni, mint például kis molekulatömegű inhibitorok, valamint a Rex transzdomináns mutáns formák kimutatására, amelyek a Rex represszoraiként hatnak.
A rex gén transzdomináns negatív mutációnak az azonosítására egy sorozat pont-mutációt hajtottunk végre, amelyekben különböző helyeken két-három aminosavból álló szegmentumokat változtattunk meg a Rex protein lineáris szekvenciájában, és ezen mutánsok között a HTLV-I Rex proteinnek több transzdomináns represszorát azonosítottuk, amelyek közül több még transzdominánsan represszálja a HTLV-I Rex és/vagy a HIV-1 Rév protein funkcióit és így, hasonlóan az 5.1. fejezetben leírt mutánsok néhányához, szintén represszálják egy vírus faj funkcionálisan egyenértékű génjeinek a fenotípusos expresszióját.
Tehát, a találmány vonatkozik a Rex protein gén aktiválási funkciója specifikus inhibitorának az azonosítási eljárására is, amely a fenti 3. pontban meghatározott lépésekből áll. Amint fent említettük, a HTLV-II Rex protein képes a HIV-1 Rév protein funkcióját helyettesíteni. Ezen kívül most azt tapasztaltuk, hogy a Rex képes helyettesíteni az analóg HTLV-II szabályzó proteint. így ezen három vírus bármelyikéből származó mRNS-ek, amelyek tartalmazzák a Rex által felismert válaszelemet és legalább egy megfelelő nem használt összeillesztési helyet, felhasználhatók ebben az eljárásban.
Előnyösen a válaszelemet és az összeillesztési helyet tartalmazó mRNS-t egy olyan plazmid kódolja, amely tartalmazza a HTLV-I provírus 3’ végét, beleértve a Rex és Tax proteineket kódoló régiókat, a teljes env gént, a RexRE [RRE] Rex válasz alkotó elemet és a teljes 3’ LTR-et. Egy ilyen plazmidra példa a pgTAXLTR. Az egyszerűség kedvéért a mutáns analízisekben, amelyekben szükséges a mutáns rex gén másolatok és a vad típusú rex gén másolatok arányának az ellenőrzése, a pgTAX-LTR-en lévő rex gént egy recesszív negatív mutáció inaktiválja, és ebben a rendszerben az aktív rex gén a pREX-ként jelölt különálló plazmidon van. Azonban vegyületek vizsgálata esetén például az aktív rex gén ugyanabban a plazmidban vagy más DNS vektorban lehet, mint amelyet ennek a rendszernek az mRNS-e igényel. Továbbá, ez az aktív rex gén tartalmazhat természetes szekvencia variánst, amelyet ebben a találmányban alkalmazunk, vagy a rex génnek bármely más mutáns formáját, amely képes úgy kifejeződni, hogy egy olyan protein terméket hozzon létre, amely rendelkezik a Rex protein gén aktiváló funkciójával, beleértve a fenti mRNS magból való kijutásának az indukcióját.
A fent felsorolt genetikai rendszer elemei egy retrovírus teljes funkcionális genomját kódoló DNS szegmentum alkalmazásával is előállíthatók; ez alkalmazható fertőzött sejtek esetében is. Biztonsági meggondolásokból azonban, valamint az egyszerűség kedvéért, ez a genetikai rendszer előnyösen nem alkalmazható fertőző vírus termelésére. Ezt úgy tettük lehetővé, hogy a rendszerbe egy genetikai hibát vittünk, amely legalább egy vírus aktivitás expresszióját megakadályozza, amely nélkülözhetetlen bármely fertőző vírus szaporodásához, amelyekből valamelyik genetikai elemet felhasználtuk. Ezt meg lehet tenni például úgy, hogy a rendszerből kihagyjuk legalább egy részét egy vírus génnek vagy más mutációval.
Előnyös példáját adják a rex génnel és az mRNS-t kódoló DNS szegmentummal transzformált gazdasejt9
HU 211 530 A9 nek a COS sejtek, amelyeket a fent leírt plazmid vektorokkal transzfektáltunk. Itt a „transzformáció” kifejezés magában foglalja a „transzfekció” kifejezést, és egy vektor DNS-t magában foglaló genetikus transzformációt jelez, amely vektor DNS a fertőző szert kódolja, főleg egy vírust. Egy ilyen vektor transzfekciója után a tenyészetben lévő transzformált sejtek kisebb részéből szét lehet szórni más sejtek nagy részébe fertőző vírus részecskék segítségével, ezáltal egy, a gazdasejtek egy nagyobb részéhez lehet juttatni, amelyek az érdekességgel bíró géneket kifejezik. Ezen kívül ebben a genetikai rendszerben a gazdasejteknek a transzformációja nem kell hogy stabil szerkezetet eredményezzen; akár stabil, akár időleges gén expressziós rendszereket fel lehet használni a szükséges mRNS és rex gén előállítására. így az ismert expressziós rendszerek széles változata alkalmazható az inhibitorok jelen eljárás szerinti azonosítására.
Ebben az eljárásban az mRNS kijuttatásának a csökkenése, amely magában foglalja a nem használt összeillesztési helyet anélkül, hogy ennek az mRNSnek az összeillesztett formájának kivitele csökkenne, azt jelzi, hogy ez a szer a HTLV-I rex gén aktivitásának vagy a rex gén egy terméke aktivitásának egy specifikus inhibitora. A kémiai szerek esetében, amelyekről megállapítottuk, hogy a jelen eljárás alkalmazásakor specifikus inhibitorok, a hatás módja általában magában foglalhatja az mRNS transzkripciójának vagy transzlációjának a specifikus gátlását. Még valószínűbb módja a hatásnak a Rex protein egy vagy több aktivitásának a specifikus gátlásából áll, beleértve a magban való elhelyezkedést, a Rex válaszelem felismerést vagy a Rex effektor funkciót.
Előnyösen, az olyan mRNS-nek- amely tartalmazza a nem használt összeillesztési helyet - a magból való kijutásának a csökkenése az első protein termelési szintjének a meghatározásával mutatható ki, ezt az első proteint az az mRNS kódolja, amely tartalmazza a nem használt összeillesztési helyet (azaz az mRNS-nek csak a nem összeillesztett formája kódolja ezt az első fehérjét); az mRNS összeillesztett formájának a megnövekedett kijutása a magból kimutatható a második protein termelési szintjének a meghatározásával, ezt a második proteint ezen mRNS-nek az összeillesztett formája kódolja.
Előnyösen az össze nem illesztett formában lévő mRNS kódolja a HTLV-I Env proteineket. Ennek az mRNS-nek az összeillesztése egy rövidebb mRNS-t eredményez, amely egy másik HTLV-I proteint, a Taxot kódolja. Az alábbi 12. és 13. példákban például egy RexRE (RRE) elemet tartalmazó összes nem illesztett mRNS magból történő kijutását az Env protein expressziójával mutatjuk ki. Továbbá, az össze nem illesztett mRNS ilyen kijutásának a gátlása, amely a Rex funkció gátlásának az eredménye, kimutatható az Env protein termelésének a csökkenésével. Azonban, minthogy ez a csökkenés a hatóanyagnak a vírusra vagy a gazdasejtre kifejtett általános toxicitásának lehet az eredménye, a rex gén funkció specifikus gátlását az Env expresszió csökkenése és ezzel együtt az mRNS összeillesztett formája kijutásának szinten maradása jelzi, amely a HTLV-I Tax protein termelésének a szinten maradásában nyilvánul meg. így előnyös a HTLV-I Env, Tax és Rex protein expresszió egymás melletti analízisének az elvégzése.
Az alábbi 12. és 13. példákban például az Env és Tax proteinek expresszióját megfelelő antitestekkel való immunprecipitációval és a kapott csapadék elektroforetikus analízisével határoztuk meg. A Rex funkció specifikus gátlásának a nagyobb méretű szűrővizsgálata enzimhez kötött immunvizsgálatból (enzyme linked immunoassay, ELISA) állhat az Env és Tax esetében, vagy az mRNS-nek genetikai manipulációval való megváltoztatása más, alkalmasabb termékek előállítása céljából az összeillesztett és össze nem illesztett formák kimutatására. Például az mRNS-t meg lehet változtatni úgy, hogy egy olyan eznimet fogja kódoljon, amely azután a színes hidrolízis terméket eredményez, ilyen például az E.coli β-galaktozidáz. Ha ennek az enzimnek a génjét az env gén helyére inszertáljuk, az össze nem illesztett mRNS ezt az enzimet kódolni, míg az összeillesztett forma ezt nem kódolja. Egy másik, hasonlóan megfelelő indikátor gén kódolható az mRNS-be úgy, hogy az az összeillesztett mRNS formában fejeződjön ki, például a Tax szekvenciához való fúzióval. A gyors és hatásos nagy tömegű szűrővizsgálatra irányuló további törekvések könnyen nyilvánvalóvá válnak a szakemberek számára.
A találmány egy másik szempontja egy reagens készlet előállítása a fenti módszernek megfelelően a Rex protein gén aktiválási funkciója specifikus inhibitorainak az azonosítására, amely magában foglalja a fenti 3. fejezetben leírt komponenseket. Ez a készlet esetleg még tartalmaz a következőkből valamit: sejt tenyészeteknél alkalmazott tápközeg; a „riporter” mRNS összeillesztett vagy össze nem illesztett formája magból való kijutási szintjének a meghatározására alkalmazott reagensek, akár közvetlenül, például nukleinsav hibridizációval vagy közvetetten, például ennek az mRNS-nek az összeillesztett vagy össze nem illesztett formájának a protein termékének az immunológiai kimutatásával; és a fenti reagens készlet komponensei bármelyikének az alkalmazására vonatkozó útmutatások a találmány módszereivel dolgozók számára.
A fenti módszert felhasználtuk különböző rex gén mutánsoknak domináns negatív mutációra irányuló szűrővizsgálatokban. Ha ezeket a rex gén mutánsokat együtt fejezzük ki a plazmid pgTAX-LTR-rel a találmány szerinti Rex inhibitor kimutatási rendszerben, a mutációk olyan csoportját találjuk, hasonlóan az 5.1. fejezetben leírttal, amelyben a Rex proteinben aminosav helyettesítések vannak az 59-60, 64-65 és a 119— 121 helyeken, amely azt eredményezi a proteinekben, hogy nemcsak a Rex funkció hiányzik, hanem azok a vad típusú Rex protein funkciójának a transzdomináns represszoraiként is hatnak és, amelyek még a vad típusú Rév protein funckiójának a transzdomináns represszoraiként is hatnak.
Ez a mutációs analízis a negatív mutánsok egy második csoportját is létrehozta, amelyek a Rex 5-7 és
HU 211 530 A9
14-15 aminosav helyein szubsztitúciókat tartalmaznak, és amelyek nem rendelkeznek Rex funkcióval. Ezek a mutáns proteinek nem irányulnak megfelelően a sejtmag felé és nem transzdominánsok. Továbbá, a negatív mutánsoknak egy harmadik csoportját találtuk, amelyet egyetlen mutáns példáz, amelyben a Rex 141—143-as aminosav helyein szubsztituált, ez megtartja részben a Rex funkciót és a mag felé irányul, de nem lokalizálódik a mag nukleolusz régiójában. Ez a mutáns protein nem transzdomináns represszora a HTLV-I Rex funkciónak. Ezen eredmények felvetik a lehetőséget, hogy a nukleoluszban való lokalizáció más szekvenciákkal jár, mint az amino-terminálison azonosított pozitív töltésű maradékok [H. Siomi és munkatársai, Cell, 55, 197— 209 (1988)]. Ezen kívül a tapasztaltak feltételezhetővé teszik, hogy egy Rex protein mutáns a Rex funkció transzdomináns represszoraként szolgál és, hogy a mutánsok a Rex protein számára nemcsak a maghoz irányuló aktivitása szükséges, hanem egy különálló nukleolusz lokalizációs aktivitás is.
Ezek az észlelések a Rex mutánsokkal kapcsolatban a Rex proteinen belül legalább két funkcionálisan különböző peptid dómén közeli kötődését mutatják, az első részt vesz a maghoz és nukleoluszhoz való irányításban és egy második az effektor aktivitásában vesz részt. A maghoz való irányítottsággal nem rendelkező Rex mutánsok a Rex amino-terminálisán a pozitív töltésű peptid doménben vannak, amelyről az előzőekben láttuk, hogy nukleolusz lokalizációs szignálként hatnak; ha az amino-terminális 20 aminosavat tartalmazó peptid egy másik proteinhez kapcsolódik DNS rekombinációval, ez a dómén indukálja ennek a proteinnek a maghoz való irányulását és a nukleoluszban való lokalizációját, hasonló módon mint azt a Rex esetében megfigyeltük [H. Siomi és munkatársai, (1988), lásd fent]. így nem valószínű, hogy a mutáns a Rex 141-143-as aminosav régiójában van, abban a régióban, amely szükséges a nukleoluszban való lokalizációhoz, még akkor sem, ha ez a mutáns a maghoz irányult, de nem lokalizálódott a mag nukleolusz régiójában. Valószínűbb, hogy ebben a mutánsban a változás inkább a rex nukleolusz lokalizációs funkcióra van hatással közvetve az aminoterminális doménben, például a megfelelő feltekeredésre hatva.
A Rex másik fő, funkcionálisan különálló doménje az 59-60 (tirozin-izoleucin) 64-65 (tirozin-triptofán) és 119-121 (treonin-fenilalanin-hisztidin) aminosavakat tartalmazza. Ezen különálló helyek mindegyikének a megváltozása (M6, M7 és Ml3 mutánsok) egy olyan Rex protein képződéséhez vezet, amelynek nincs biológiai aktivitása és nem rendelkezik transzdomináns gátló tulajdonságokkal. Öt különböző mutáció, amelynek nincs hatása a Rex funkcióra, a Rex protein lineáris szekvenciájában elválasztja az M6 és M7 régiókat az Ml3-tól, jelezvén, hogy ezen két különálló régió a funkcionális doménen belül megfelelő fehérje feltekeredést igényel. így a Rex protein teljes lineáris része tartalmazza az aminosavaknak ezen két régióját, amelyek a legfontosabbak a Rex effektor funkciójában és ezért azt a domént jelenti, amelyet mutálni kell a rex transzdomináns represszorának az előállítása céljából.
A jelen észlelések nem irányulnak a rex doménre, amelyben a RexRE (RRX) felismeréséhez szükséges aktivitás van egy mRNS-ben. Tehát nem ismert, hogy vajon a Rex funkció transzdomináns represszoraként szolgáló mutánsnak szükséges-e megtartani a RexREhez vagy más vírus olyan felismerési eleméhez való (közvetlen vagy közvetett) kötődési képességét, amelyet a Rex felismer.
A találmány másik szempontja azzal a DNS szegmentummal foglalkozik, amely a HTLV-I Rex protein funkciójának egy transzdomináns represszorát kódolja, valamint magával ezzel a transzdomináns represszorral. Ez a represszor egy protein, amely a Rex protein vad típusú formájából módosított legalább egy mutációval, amely negatívan befolyásolja a Rex protein effektor aktivitását. Ez a represszor lényegében a Rex protein vad típusú formájának a nukleoluszban lévő aktivitásával rendelkezik. Főleg ennek a represszomak a negatív mutációja egyike azoknak, amelyek a vad típusú Rex protein peptid doménjében egy aminosavat érintenek, amely peptid dómén körülbelül az 59-es aminosav helytől körülbelül a 121-es aminosav helyig terjed, még pontosabban a következő helyek bármelyikében: 69, 60, 64, 119, 120 és 121. A Rex represszort kódoló DNS szegmentum lehet a következő rex gének bármelyike: M6, M7, M13 és ezek variánsai és származékai, amelyek a HTLV-I Rév protein funkció transzdomináns repressziós hatásával rendelkeznek.
Ennek a DNS szegmentumnak a szekvenciája a HTLV-I bármelyik izolált Rex génjéből származhat [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738-740 (1988); M. Seiki és munkatársai, Science, 227, 1227-1229 (1985)] vagy kémiai szintézissel előállítható. A Rex funkció transzdomináns represszorát standard rekombináns DNS módszerekkel vagy peptid szintézis standard kémiai módszereivel vagy ezen módszerek kombinációjával állítottuk elő, amelyek mindegyike jól ismert a géntechnológia területén.
Azokat a mutánsokat, amelyek negatívan hatnak a Rex protein effektor aktivitására, az alábbiakban írjuk le. Azonban a mutációk más típusai is, amelyek célja a protein szerkezetnek ugyanazon vagy közel ugyanazon aminosav helyeihez lokalizált hatás elérése, szintén nagyon valószínűen termelnek Rex variánsokat és származékokat, amelyek a jelen találmánynak megfelelően a HTLV-I Rex protein funkciónak transzdomináns represszorai. Ezek a lokalizált hibák lehetnek például az egyetlen aminosav deléciói vagy inszerciói, vagy kémiailag vagy szerkezetileg hasonló aminosavak helyettesítése. Másrészről, kiterjedtebb deléciók vagy inszerciók, vagy helyettesítések, amelyek széttörik a másodlagos szerkezetet (például a β-lap régióban egy prolin) valószínűleg hatással vannak a protein távollevő részeire a protein feltekeredésén keresztül; ezért ezek a mutációk a Rex effektor funkcióhoz szükséges doménen belül a megjelölt helyeken nem valószínű, hogy olyan mutáns Rex proteint hoznának létre, amelyek lényegében megtartják a Rex protein vad típusú formájának a nukleoluszban lévő aktivitását.
A fenti 5.3. fejezet transzdomináns Rex mutánsai11
HU 211 530 A9 nak a Rév funkciót gátló hatását vizsgáltuk és azt találtuk, hogy a HIV-1 Rev-nek is a represszorai. A transzdomináns Rex mutánsok ezen osztályának a lehetséges vírusellenes hatását a HÍV-1 replikáció gátlására irányuló vizsgálattal bizonyítottuk.
Ezen kívül és amint fent már említettük, most fedeztük fel, hogy a HTLV-I Rex funkcionálisan helyettesíteni képes az analóg HTLV-II szabályzó proteint akkor is, ha a HTLV-II-ben a megfelelő válaszelem nukleotid szekvenciája valamennyire eltér a HTLV-Iben lévő RexRE (RRX) törzs és hurok szerkezetétől.
A találmány foglalkozik még a HIV-1, HTLV-I és HTLV-Π replikáció gátlásának a módszerével, amely, amint fent meghatároztuk, egy DNS szegmentumnak egy sejtbe való beviteléből áll, amely a Rex funkció egy transzdomináns represszorát kódolja és amely sejt rendelkezik ezen vírusok egyikét replikáló képességgel. Ennek a sejtnek megvan azon képessége, hogy kifejezze a DNS szegmentumot a transzdomináns represszor termelésére. Ez a sejt lehet egy olyan, amelyet előzőleg megfertőzött egy vagy több ezen vírusok közül. vagy ezek a sejtek lehetnek egy vagy több vírus számára nem fertőzött cél-sejtek.
A fent említett genetikai rendszer előnyös megvalósítása céljából egy Rex-re érzékeny „riporter” plazmidot, a pgTAX-LTR-et állítottak elő (138. ábra). Részletezve, a pgTAX-LTR vektor tartalmazza a tax génnek a HTLV-I env génnel elválasztott két proteint kódoló exonját és a RexRE (RRE) tartalmú teljes HTLV-I 3’LTR-et. Ezen HTLV-I szekvenciák expresszióját elősegíti a humán citomegalovírus azonnali korai régiója és a patkány preproinzulin gén 3'régiója még poliadenilációs szekvenciákat biztosít. [B. R. Cullen, Cell, 46, 973-982 (1986)]. Ez a vektor az Env-et csak Rex jelenlétében termeli, azonban a Tax szintetizálódik a Rex jelenlétében és anélkül is. Ez a vektor maga nem termel Rex-et, amely az Sphl helyen lévő mutációnak tulajdonítható, amely egybeesik a Rex transzláció iniciációs kodonjával. A Rex távollétében a pgTAX-LTR Tax proteint termel az ebből a vektorból való összeillesztett mRNS transzlációjának válaszaként, amelyből gyakorlatilag minden env szekvencia hiányzik. Azonban, ha a pgTAX-LTR a pREX expressziós plazmiddal kotranszfektált, a HTLV-I Env protein szintézise aktivált. Ez a 62-68 kd méretű protein könnyen azonosítható anti-HTLV-I burkoló (envelope) monoklonális antitest 0,5 α-val való immunprecipitációval [S. Matsushita és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2672-2676 (1986)] (14A ábra, 1. sáv). Ezzel ellentétben nem mutatható ki HTLV-I Env protein, ha a pREXes akárpREV-vel (2. sáv), akár pCMV-Il-2-vel (3. sáv) helyettesítjük, amelyek a HIV-1 Rév proteint, illetve a humán IL-2 polipeptidet kódolják. Hasonló módon nem lehet Env proteint azonosítani, ha a sejteket pREX-szel transzfektáljuk pgTAX-LTR távollétében (4. sáv).
így a fent meghatározott genetikai rendszerben a pgTAX-LTR általi HTLV-I Env expresszió specifikusan indukálódik egy protein jelenlétében, amely a vad típusú Rex protein gén-aktiváló funkciójával rendelkezik. A rendszerben, amely magában foglal egy Rex funkcióval bíró proteint biztosító gént, ha az érintkezik egy Rex funkciót gátló szerrel, a Tat protein továbbtermelődik anélkül, hogy a szer hatással lenne valamilyen vírus vagy sejt aktivitására, amely nincs kapcsolatban a gén expresszióval vagy a gén termékével, amely Rex funkciót fejt ki. így, amint a 12. példában és a 15. ábrában jeleztük, a Rex funkció specifikus inhibitorainak az azonosítására szolgáló, a példában megadott módszer előnyösen magában foglalja a HTLV-I Env, Tax és Rex protein expresszió egyidejű analízisét.
Megjegyzendő, hogy a Rex funkciónak az alábbiakban és a 15. ábrában leírt módon transzdomináns represszorokkal való specifikus gátlása esetében a HTLV-I Tax protein termelése nyilvánvalóan megnövekszik. Ez feltehetően az Env mRNS összeillesztett forma magból való megnövekedett kijutásának az eredménye, amely kivitel a Rex funkció hiányának tulajdoníthatóan az összeillesztés előtt nem történt meg. Azonban, általában a Rex funkció specifikus inhibitora kivédheti az mRNS összeillesztését, de a nem összeillesztett RNS kijutását nem indukálja. Ennek megfelelően a Rex funkció specifikus inhibitorainak az azonosítását szolgáló jelen eljárás csak azt igényli, hogy az összeillesztett mRNS magból való kijutása ne csökkenjen, amely a jelen helyzetben a Tax proteint termeli.
Ennek a rendszernek a használatát az alábbi 12. példában magyarázzuk meg. Ebben a mutációs analízisben az Ml3 bakteriofágban ismét oligonukleotidra irányított mutagenezist alkalmaztunk a rex gén elsődleges szerkezetének a megváltoztatására 25 különböző helyen (13A ábra). A bekeretezett aminosavakat aszparaginsav-leucin dipeptiddel helyettesítettük oligonukleotid duplex kereten belüli inszerciójával, amely tartalmazza a diagnosztikus BglII restrikciós helyet. Ezen rex mutánsok mindegyikét ezután inszertáltuk a pBC12/CMV eukarióta expressziós vektorba [B. R. Cullen, Cell, 46, 973-982 (1986)] és a mutációkat DNS szekvenálással igazoltuk.
A rex mutációk mindegyikének meghatároztuk a biológiai aktivitását a pgTAX-LTR vektorral való kotranszfekcióval. Minthogy ezen rex mutánsok közül tizenkilenc vad típusú fenotípusnak mutatkozott, öt mutáns (Ml, M2, M6, M7 és Ml3) nem rendelkezett env gén aktivációs aktivitással és egy mutáns (Ml5) csak részleges funkcióval rendelkezett (14.B ábra). Ezután COS sejteket kotranszfektáltunk ezzel a hat rex defektív mutánssal és a pgTAX-LTR vektorral, majd elvégeztük egymás mellett a HTLV-I Env, Tax és Rex protein expressziójának az analízisét, amint azt a 12. példában leírjuk (lásd a 15A-C ábrákat is). Míg a HTLV-I Env csak a vad típusú Rex protein jelenlétében (15A ábra, 7. sáv) vagy a részben aktív Ml5 mutáns jelenlétében (15A ábra, 6. sáv) volt kimutatható, a 40 kd Tax protein minden tenyészetben kimutatható volt (15B ábra). Tehát az Ml, M2, M6, M7 és M13 mutánsok esetében megfigyelt env gén expresszió hiánya inkább a Rex biológiai aktivitás specifikus hiányának tulajdonítható, mint ezen proteinek nem specifikus, to12
HU 211 530 A9 xikus hatásainak a transzfektált COS tenyészetekben. Ezekben a tenyészetekben a mutáns Rex proteinek mindegyikét azonosítottuk, amely jelzi, hogy minden mutáns stabil módon kifejeződött. Az M2, M6 és M13 mutánsok vándorlása nem különböztethető meg a vad típusú Rex proteintől (15C ábra 2, 3, 5 és 7. sávok), míg az M7 és M15 proteinek egy kisebb molekulatömeget mutatnak (4. és 6. sávok) és az Ml mutáns protein elektroforetikusan kettős protein sávot mutat (1. sáv). Az Ml, M7 és M15 mutánsokban a protein kódoló régió szekvencia meghatározása szerint nincs más változás, mint amelyet a specifikus mutációkkal bevittünk. Tehát a méretben megmutatkozó ezen különbségek biokémiai alapja valószínűleg a mutáns Rex proteinek megváltozott poszt-transzlációs folyamatát mutatja.
A vad típusú Rex proteinhez hasonlóan a biológiailag inaktív M6, M7 vagy M13 Rex mutánsokkal transzfektált sejtek in situ immunfluoreszcens festése, amint azt a 12. példában részletesen leírjuk, azt mutatja, hogy normál módon célozzák meg a kifejező sejtek nukleoluszát és magját (16. ábra). Éles ellentétben az Ml mutáns protein csak a citoplazmatikus részben volt kimutatható, míg az M2 Rex mutáns közelítőleg homogén módon az egész sejtben. Ezekkel az észlelésekkel megegyező az a tény, hogy az Μ1 és M2 mutációk megváltozott bázikus aminosav maradékai a pozitív töltésű peptid doménen belül helyezkednek el, amely nukleoláris lokalizációs szignálként funckionál. A részben aktív M15 mutáció a mutáns Rex protein magban való elhelyezkedéséhez vezet, de eltérően a vad típusú Rex proteintől az M15 protein nem lokalizálódik egyébként a mag nukleolusz régiójában, tulajdonképpen az Ml5-ről úgy tűnik, hogy kizáródott a nukleoluszból (16. ábra). Ezek az eredmények feltételezhetővé teszik, hogy az N-terminálison a bázikus aminosavaktól távoli maradékok magukban foglalják vagy részt vesznek a Rex nukleoluszban való elhelyezkedésben.
Meghatároztuk a rex mutánsoknak a vad típusú HTLV-I Rex protein és a HIV-1 Rév protein biológiai aktivitását blokkoló képességét (17. ábra). Ha a COS sejteket a pgTAX-LTR-rel és pREX-szel kotranszfektáljuk (A. tábla) az M6, M7 és M13 mutánsoknak tízszeres molekuláris feleslege egy domináns negatív fenotípusban jelenik meg, amelyben a vad típusú Rex protein aktivitása jelentősen gátolt (3-5. sávok). Ezzel ellentétben az Ml, M2 és M15 proteinek recesszív negatív mutánsként hatnak, minthogy a vad típusú protein hatása nem változott (1., 2., 6. sávok). Hasonlóan a HIV-1 Rév proteinje nincs kölcsönhatásban a Rex proteinnel (8. sáv) sem az IL-2-vel (9. sáv).
Ezután a transzdomináns Rex mutánsok Rév funkcióit blokkoló képességét határoztuk meg a HIV-1 rendszerben (17B ábra). Ha a COS sejteket pgTat-tal és pRev-vel kotranszfektáltuk, az M6, M7 és M13 rex mutánsok tízszeres molekuláris feleslege gátolta a Rév protein hatását (3., 4., 5. sávok), amelyet a Tat protein 72 aminosavas formájának csökkent expressziója bizonyít. Ezen transzdomináns Rex mutánsoknak a HIV-1 vírus replikációt blokkoló képességét is vizsgáltuk (17C ábra). Egy Rev-hiányos HIV-1 provírus, a pHXB2-Bam-p3 [L. Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738 (1988)] replikációját Rex és transzdomináns Rex mutánsok fokozatosan megnövelt mennyiségeinek a jelenlétében tanulmányoztuk COS sejteket transzfektálva ezekkel a plazmidokkal. Amint a HIV-1 p24 Gag protein szintetizált mennyisége mutatja a tenyészet felülúszójában, a transzdomináns Rex mutánsok (M6, M7 és Ml3) a HIV-1 replikáció gátlását dózistól függő mértékben eredményezik. Ezzel ellentétben a Rex recesszív negatív Ml mutánsának nem volt szignifikáns hatása a HIV-1 replikációra.
Az alábbi 12-es és 13-as példák különböző rex mutánsaival kapott észlelései együttesen azt jelzik, hogy a Rex proteinen belül közelítőleg körülhatárolt, legalább két különböző szerkezeti doménnek különböző aktivitásai vannak. így egy domént az Ml és M2 mutációk határoznak meg, amely dómén az N-terminálison helyezkedik el és magában foglalja az 5-7 és 14-15 aminosavakat és úgy tűnik, hogy szerepet játszik a proteinnek a maghoz, és ennél fogva a nukleoluszhoz való irányításában. Ez a pozitív töltésű dómén részt vehet a Rex-nek a kötésében akár közvetlenül a RexRE-hez (RRX) vagy más proteinekhez, amelyek közvetlenül érintkeznek ezzel az RNS elemmel. A második dómén, amelyet fent leírtunk, fontos a Rex effektor funkcióhoz és ezért transzdomináns represszorokat termelő módon mutálhatók.
A fenti 5.1., 5.2. és 5.3. fejezetekben leírt észleléseket a következőkben foglaljuk össze:
a) általánosan alkalmazható elvet állapítottunk meg vírus inhibitorok előállítására egy lényeges szabályzó protein mutációval, a Rex és Rév mutációjával;
b) ez az elv alkalmazhatónak látszik több vírus fajra ható mutáns szabályzó protein előállítására; és
c) a szerkesztett és azonosított specifikus transzdomináns mutánsok a következők:
- HTLV-I Rex mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HTLV-I rex gén funkcióit:
- pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM17 és pcRex!3A15 (lásd az 5.1. fejezetet és az 1-3. példákat);
- M6, M7 és Ml3 (lásd az 5.3. fejezetet és a 12-13. példákat);
- HIV-1 Rév mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HIV-1 rév gén funkcióit:
- ρΜΙΟ, ρΔ9/14 és ρΔ 10/14 (lásd az 5.2. fejezetet és a 4-11. példákat);
- pM21, pM22, pM28, pM29 és pM32 (lásd az 5.2. fejezetet és a 11 a és 11b példákat);
- HTLV-I Rex mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HTLV-I rex gén funkciót és szintén hatásosan gátolják a HIV-1 rév gén funkciót:
- pcRexM2, pcRexM7 és pcRexM8 (lásd az 5.1. fejezetet és a 3. példát);
- M6, M7 és Ml3 (lásd az 5.3. fejezetet és a 12-13. példákat);
- HTLV-I Rex mutánsok, amelyek hatásosan gátolják a HTLV-I és HTLV-II rex és a HIV-1 rév gén funkcióit:
HU
211 530 A9
- M6, M7 és M13 (lásd az 5.3. fejezetet és a 12-13. példákat);
- HIV-I Rév mutáns, amely hatásosan gátolja a
HÍV-1 rév gén funkciót és szintén hatásosan gátolja a HIV-2 rév és SIVmac rév gén funkcióit: 5
- pMlO (lásd az 5.2. fejezetet és a 11b példát).
6. Példák
A következő példák szemléltetik a találmányt. Ezeket nem tekintjük a találmány oltalmi körét korlátozóknak.
6.1.
1. példa
Transzdomináns HTLV-I gén szerkesztése 1) A rex kódoló szekvencia klónozása az Ml 3 bakteriofág RF-DNS-ébe 15 μg pcRex DNS-t kezeltünk Hindin és EcoRI restrikciós enzimek mindegyikének 10 egységével 20 μΐ restrikciós enzim inkubációs pufferben (10 mM TrisHC1, pH = 7.5; 10 mM MgCI2; 50 mM NaCl; 1 mM ditiotreilol) 37 °C-on 3 órán át. A reakcióelegyet közvetle- 20 nül felvittük egy 1%-os agaróz gélre (Seakem FMC Inc. Rockland, ME, USA), amely 1 μg/ml etidium-bromidot tartalmazott és 50 V-nál és 25 mA-nál 4 -órán át elektroforetizáltuk Tris-acetát pufferben [T. Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982), 25 Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 156. oldal].
Az elválasztott DNS-t 366 nm-nél UV lámpával tettük láthatóvá és az 1,5 kb méretű rex fragmentumnak megfelelő gél szeletet kivágtunk. A géldarabot 500 μΐ Tris-borát puffer (Maniatis, 156. oldal) tartalmú dialízis hüvelybe 30 helyeztük. A DNS-t elektroeluáltuk a pufferbe és -20 ’Con etanollal kicsaptuk.
(1) 5' - TG GAC AGA GTC TTA GAT CTG GAT
BglII (2) 5' - AC TAT GTT CGG CCA GAT CTC ATC
BglII (3) 5' - CC TAC ATC GTC ACA GAT CTC TGG
BglII (4) 5' - TCG GCT CAG CTC TTA GAT CTC TTA
BglII {5) 5' - AG CTC TAC AGT TCA GAT CTC CTC
BglII μg M13mpl0 RF-DNS bakteriofágot HindlII és EcoRI restrikciós enzimekkel kezeltünk és a 7,2 kb méretű M13 vektor fragmentumot egy 1%-os agaróz gélből a fentiekkel azonos módon izoláltuk.
200 mg fág DNS-t és 1 μg cRex DNS-t összekevertünk 20 μΐ ligációs pufferben (50 mM Tris-HCl, pH = 7,4; 10 mM MgCl2; 10 mM ditiotreitol; 1 mM ATP) 1 egység T4-DNS ligázzal és 15 órán át inkubáltuk 16 ’C-on. Ezt a reakcióelegyet közvetlenül használtuk a transzformációra és a TG1 E.coli törzs lemezre terítéskor (Amersham protocol, 16-18. oldalak). Megfelelő fág plakkok DNS-ét endonukleáz hasítással vizsgáltuk meg Hindin és EcoRI restrikciós enzimekkel, majd 10 μg/ml etidium-bromidot tartalmazó 1%-os agaróz gélen Tris-acetát pufferben analitikai gélelektroforézisnek vetettük alá. A rex kódoló szekvenciát tartalmazó bakteriofágot azonosítottuk és azt mp lOrex-nek neveztük el.
Az egy-szálas mp lOrex DNS-t nagy léptékű előállítási előírás szerint izoláltuk (Amersham protocol 2425. oldalak).
2. Az mp lOrex-ben lévő rex-et kódoló szekvencia mutagenezise
A mutagenezis előfeltételeként szükséges volt megfelelő egy-szálas DNS molekulát szintetizálni. 29 oligonukleotidot állítottunk elő (lásd 4. ábra), amelyek végül 30 mutánshoz vezettek, amelyek közül a következő hét oligonukleotid közvetlenül vagy közvetve (lásd 2. példa) olyan mutánsokhoz vezetett, amelyekről azt állapítottuk meg, hogy transzdomináns fenotípusok:
ACC CAG TCT -3'
GTC ACG CCC - 3'
CCA CCT GTC - 3'
TCC CTC GA - 3'
GAC TCC CCT -3' (6) 5' - GT TCC TTA TCC CTA GAT CTC CCT CCT TCC CCA - 3' BglII (7) 5 - CT CCT TCC CCA CCA GAT CTA CCT CTA AGA CCC - 3
BglII
A rex proteinben az (1) oligonukleotid fenilalanin (30as hely), fenilalanin (31-es hely)'és szerin (32-es hely) aminosavakat leucin (30-as hely), aszparaginsav (31-es hely) és leucin (32-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
A (2) oligonukleotid a Rex proteinben az alanin (58-as hely), és tirozin (59-es hely) aminosav maradé55 kokat aszparaginsav (58-as hely) és leucin (59-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
A (3) oligonukleotid a Rex proteinben a prolin (63-as hely) és tirozin (64-es hely) aminosav maradékokat aszparaginsav (63-as hely) és leucin (64-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
HU 211 530 A9
A (4) oligonukleotid a Rex proteinben a tirozin (87-es hely), szerin (88-as hely) és szerint (89-es hely) aminosav maradékokat leucin (87-es hely), aszparaginsav (88-as hely) és leucin (89-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
Az (5) oligonukleotid a leucin (90-es hely) és szerin (91-es hely) amonisav maradékokat aszparaginsav (90-es hely) és leucin (91-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
A (6) oligonukleotid a szerin (94-es hely) aminosav maradékot leucin aminosavakkal helyettesíti.
A (7) oligonukleotid a Rex proteinben az arginin (100-as hely) és glutaminsav (101-es hely) aminosav maradékokat aszparaginsav (100-as hely) és leucin (101-es hely) aminosavakkal helyettesíti.
Minden oligonukleotid BglII restrikciós helyeket visz be a rex kódoló szekvencia leolvasási keretébe.
Az oligonukleotidokat egy Applied Biosystems 38OA szilárd hordozó szintetizátorral szintetizáltuk βciano-etil-foszforamidit kémiát alkalmazva. A tisztítást 8%-os poliakrilamid géles elektroforézissel, ezt követően a fő termék elúciójával és etanolos kicsapásával végeztük. Az oligonukleotidok foszforilációját ATP-vei és polinukleotid kinázzal végeztük, amint azt az Amersham protocol 13. oldalán leírják. Az oligonukleotidra irányuló mutagenezis reakciót az Amersham protocol 13-16. oldalain leírtak szerint végeztük. Ezt követte a transzformáció és a TG 1 E.coli törzs lemezekre terítése, amint azt a 21-24. oldalakon leírtuk. A különböző plakkok DNS-ét restrikciós endonukleázos analízissel végzett szűrővizsgálatnak vetettük alá BglII és EcoRI enzimeket alkalmazva.
Mind a hét mutációból egy kiónt azonosítottunk, amelyek a rex kódoló szekvenciában tartalmazzák a mutációt. Ezeket a kiónokat a következőképpen neveztük el: mp 10rexM2, mp 10rexM7, mp 10rexM8, mp 10rexM13, mp 10rexM14, mp 10rexM16 és mp 10rexM17. Egy további kiónt, az mp 10rexM15-öt használtuk fel a deléciós mutáns szerkesztéséhez (lásd 2. példa).
3. A mutált rex gének ismételt klónozása emlős expressziós plazmidokban.
A mutált rex géneket visszavittük az M13 bakteriofág vektorból az eredeti expressziós plazmidba. 5 pg pcRex DNS-t inkubáltunk 10 egység HindlII és 10 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal 37 °C-on 3 órán át. A reakcióelegyet közvetlenül felvittük egy 1 %os agaróz gélre, amely 10 pg/ml etidium-bromidot tartalmazott és Tris-acetát pufferben 50 V-nál és 25 mAnál 4 órán át elektroforetizáltuk. A HindlII-EcoRI vektor fragmentumot a megfelelő gél szeletből elektroeluáltuk és etanollal kicsaptuk.
A 2. pontban leírtak szerint kapott mutánsok 5 pgját azonos módon kezeltük és izoláltuk a rex kódoló szekvenciát tartalmazó fragmentumokat.
Az izolált vektor fragmentum 200 ng-ját és 1 pg izolált rex szekvenciát összekevertünk külön-külön 20 pl ligációs pufferben összekevertünk külön-külön 20 pl ligációs pufferben 1 egység T4-DNS-ligázzal és 15 órán át 15 °C-on inkubáltuk. A kapott reakcióelegyet közvetlenül felhasználtuk a HB 101 E. coli törzs transzformálására. A különböző baktérium telepek DNS-eit HindlII, Asp718 és BglII, restrikciós endonukleázok felhasználásával, majd 1%-os agaróz gél elektroforézissel analizáltuk. Az így azonosított, rex gént hordozó plazmidokat a következőképpen neveztük el: pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM5, pcRexM16 és pcRexM17.
2. példa
Deléciós mutáció szerkesztése a rex kódoló szekvenciában pg pcrexM13 DNS-t kezeltük BglII és EcoRI 10 egységeivel. A nagyobb DNS fragmentumot és a rex kódoló szekvencia 5’ részét izoláltuk a fent leírtak szerint. Párhuzamosan 5 pg pcRexM15-öt kezeltünk hasonló módon és izoláltuk a kisebb DNS fragmentumot, amely a rex kódoló szekvencia 3’-as részét tartalmazza.
Az izolált pcRexM13 DNS fragmentum 200 ng mennyiségét összekevertük az izolált pcRexM15 DNS fragmentummal és 20 pl ligációs pufferben 1 egység T4-DNS ligáz jelenlétében 16 °C-on 15 órán át inkubáltuk. Ez a művelet egy olyan rex kódoló szekvenciát eredményezett, amelyben a 87-es, 88-as és 89-es aminosav helyek azonosak a pcRexM 13-as klónéval és a 90-94-es helyek deletáltak.
Ezután a reakcióelegyet közvetlenül felhasználtuk a HB101 E. coli törzs transzformálására. A különböző kiónok DNS-ét szűrővizsgálatnak vetettük alá restrikciós endonukleázos emésztéssel HindlII, Asp718 és BglII enzimeket alkalmazva. Egy pozitív kiónt azonosítottunk és azt pcRex 13Δ15-nek neveztük.
3. példa
Biológiai aktivitás
a) A mutáns gének biológiai aktivitása emlős sejtekben
A vad típusú rex és mindegyik mutáns rex gén expressziós vektor 0,25 pg-ját összekevertük 0,25 pg genomiális tat (transzaktivátor) pgtat expressziós vektorral [Μ. H. Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181 (1988)] és COS sejtvonalba transzfektáltuk, amint azt Cullen leírja [B. R. Cullen Meth. Enzymol. 152, 684703 (1987)]. 60 órás poszt-transzfekciós tenyészeteket 3 órán át jeleztünk 300 pCi/ml 35S-ciszteinnel és analizáltuk a HIV-1 Tat és a HTLV-I Rex protein expresszióját immunprecipitációs módszerrel. A Tat 1-61 aminosav maradékaival szembeni nyúl anti-peptid antitestet és a Rex 173-189 aminosav maradékaival szembeni nyúl anti-peptid antitestet alkalmaztunk ebben a kísérletben, amint azt Cullen leírja [B. R. Cullen, J. Virol., 62, 2498-2501 (1988)]. A kicsapott proteineket újra szétválasztottuk SDS/poliakrilamidgélben és autoreadiográfiával láthatóvá tettük.
A pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14 és pcRex 13Δ15 vektorokban lévő rex mutáns gének a rex hatásnak egy negatív fenotípusát eredményezik ebben a vizsgálati rendszerben (lásd 2B ábra, D, E, F, Η, I és K sávok), míg a kontrollok (B és C sávok) és más mutánsok (G sáv) pozitív fenotípust adnak.
HU 211 530 A9
Ezen fenotípusosan negatív Rex mutáns kiónok mindegyike képes egy Rex-specifikus proteint termelni, amelyet a fent leírt poliklonális anti-Rex antitest felismer (2A ábra, C-E és G-I sávok). Ezzel ellentétben a pcRexMló kiónban lévő mutáció a Rex-specifikus antitest által fel nem ismerhető proteint eredményez; ez annak tulajdonítható, hogy a protein felezési ideje csökkent (nem mutatjuk be).
b) A vad típusú HIV-1 rex és/vagy HTLV-I rex funkció transzdomináns repressziója pcRexM2-vel, pcRexM7-tel, pcRexM8-cal, pcRexM13-mal, pcRexM14-gyel, pcRexM17-tel és pcRexl3A15-tel Ugyanazt a kísérleti sort alkalmaztuk a rex mutánsok azon képességének a meghatározására, hogy transz-ban gátolják-e a vad típusú Rév és Rex protein funkciót. 0,25 gg pgtat genomiális tat expressziós vektort, 0,25 gg vad típusú rév (pcRev) vagy a vad típusú rex (pcRex) expressziós plazmidot és a rex mutáns expressziós plazmid (5 gg) mindegyikének a feleslegét külön összekevertük és COS sejtekbe transzfektáltuk. A mutánsok vad típusú Rév és Rex funkcióra gyakorolt hatását Tat-specifikus immunprecipitációval mértük a fent leírtak szerint.
Ennek a kísérletnek az eredménye azt mutatta, hogy a hat rex mutáns, a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM14, pcRexM17 és pcRex 13Δ15 rendelkezik a vad típusú rex által közvetített transzaktiválást gátló képességgel (lásd 2C ábra, C, D, E, G, H és I sávok), és, hogy négy rex mutáns, a pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8 és (részben) a pcRexM13 rendelkezik a vad típusú rév által közvetített transzaktiválási képességgel.
A kísérletek ezen sora igazolja protein szinten a Rév és/vagy Rex funkció transzdomináns represszióját a fenti rex mutánsokkal.
Az 1-3. példák eredményei láthatóan mutatják a HTLV-I Rex proteinben két funkcionális dómén létét. Az aminoterminális irányban két mutáns van (pcRexM7 58-as. 59-es aminosav helyek és pcRexM8 63-as és 64-es aminosav helyek), amelyek a Rév és Rex proteinekben transzdominánsak. Egy második csomópont, amely csak a Rex proteinre transzdomináns mutánsokat tartalmaz, a kódoló szekvenciának a középrészén helyezkedik el. Az ezen kívüli rev/rex transzdomináns mutáns (pcRexM2, 30-32-es aminosav helyek), amely a mag lokalizációs szignál és a csomópont között helyezkedik el, magában foglalja a 7-es és
8-as mutánsokat és része lehet egy harmadik funkcionális doménnek vagy másképpen a bevitt aminosav változás megzavarhatja a protein harmadlagos szerkezetét, amely a megfigyelt transzdomináns fenotípust eredményezi.
6.2
4. példa
Csoportos pont és deléciós mutációk a Rev-ben
A Rév protein in vivő a szerinen foszforilált és túlnyomóan a sejtmagban helyezkedik el, ahol a nukleoluszokban koncentrálódik. Az alább leírt mutációs analízis más faktorok mellett kiemeli ezen tulajdonságoknak, mint a HIV-1 szerkezeti gén expresszió transzaktivátorának a Rév funkció számára való fontosságát.
Csoportos pont-mutációkat (pM) vittünk be a HIV1 Rex HXB-3 törzsbe oligonukleotidra irányuló mutagenezissel, amint azt Taylor leírja [Taylor, Nucleic Acids Rés. 13, 8765-8785 (1985)]. Pontosabban, egy bakteriofág Μ13 mutagenezis rendszert alkalmaztunk (Amersham Corp. Arlington Heights, IL, USA) a célzott nukleotid helyettesítésének bevitelére a teljes hosszúságú cDNS rév másolatokba, amelyet a pcREV expressziós vektor kódol [Malim és munkatársai, Natúré, 335, 181-183 (1988)]. A pcREV DNS és megfelelő aminosav szekvenciáját a 6. ábra mutatja be.
A csoportos pont-mutációk sorozatát vittük a Révbe (lásd M1-14, 5. ábra), klónoztuk és szekvenciájukat didezoxinukleotid szekvenálási rendszerrel bizonyítottuk (Stratagene, La Jola, CA, USA). A mutációk egyenletesen oszlanak el a Rev-ben és arra szolgálnak, hogy a benne lévő 11-es szerin maradékot célozzák meg. Minden egyes mutációt körülvevő DNS szekvencia (pMl-pM14) a 7. ábrán látható, a megváltozott nukleotidokat aláhúztuk.
A megvizsgált mutációk legtöbbje a kodonokban aszparaginsav (Asp) és leucin (Leu) helyettesítést eredményezett, ezeket a maradékokat bekereteztük az 5. ábrában. A mutációkra való hivatkozás megkönnyítésére a Rev-en belüli elhelyezkedésük szerint jelöltük azokat, például a pMl az N-terminálishoz legközelebbi mutáció és a pl4 a C-terminálishoz legközelebbi mutáció.
A különböző pM mutánsok pontos szerkezetén a 7. ábrán látható, hogy az illető mutációk nagyobb része csak két kodont érint. Ezen általánosítás alól kivétel az M4 és Ml3, amelyek három kodont érintenek és az M6, amely négy kodont érint. A legtöbb esetben az aminosav helyettesítések egy két aminosavas téves mutációból erednek, azonban a pM6-ban az Asp és Leu négy arginin maradékot helyettesít, ezáltal egy két-aminosavas deléciót eredményez, míg a pM4 és pMl 3 még egy kapcsolódó aminosav helyettesítést foglal magában, amelyet nem figyeltünk meg az eredeti REV-ben. A pM 14-ben a helyettesítés az aszparaginsav tirozinra való helyettesítését jelenti a 23-as helyen, míg a pM 13-ban valin helyettesíti a 109-es helyen lévő izoleucint. Ezek a további változások egyetlen bázis hibából erednek az egyszálas DNS oligonukleotid indítóanyagban, amelyet a mutagenezis eljárásban alkalmaztunk.
Minden pontmutáció egyedülálló Bg III helyek képződését eredményezi, kivéve a pM7-et, amelyet két szomszédos szerin maradék egyszerű deléciójával szerkesztettünk (lásd 5. ábra). ABglII helyeket mind ugyanabba a transzlációs keretbe inszertáltuk, ezáltal megkönnyítve a Rév ezt követő N-terminális és C-terminális deléciós mutánsainak (ρΔ) a szerkesztését. A ρΔ mutánsokat a deléció helye szerint jelöltük, például ρΔΙ 1/14 a bevitt pM 11 és pM 14 mutációk között tartalmaz deléciót.
5. péda
A Rév mutánsok expressziója
A pBC12/CMV vektoron alapuló [B. R. Cullen, Cell, 46, 973-982 (1986)] eredeti citomegalovírus
HU 211 530 A9 azonnali korai promoterét alkalmaztuk negatív kontrollként. A pgTAT expressziós vektor genomiális tat gént is felhasználtuk itt, valamint a pBC 1”/RSV/SEAP kiválasztott alkalikus foszfatáz gén expressziós gént is [Malim és munkatársai, lásd fent; illetve Berger és munkatársai, gene, 66, 1-10 (1988)].
A pcREV expressziós vektort módosítottuk, hogy az itt leírt pM és pArev mutánsokat kifejezze. A HIV-1 rév és tat mutánsokban való expressziójának a vizsgálatára minőségi vizsgálatot alkalmaztunk, amely a módosított pcREV-nek a pgTAT-tal együtt COS sejtekbe való kotranszfekciójából áll [Malim és munkatársai, lásd fent; és Malim és munkatársai, Natúré, 338, 254257 (1989)]. Pontosabban, COS sejt tenyészeteket (35 mm) kotranszfektáltunk DNS által közvetített transzfekciókkal, amint azt Cullen leírja [Meth. Enzymol. 152, 684-703 (1987)] 0,25 gg pgTAT-ot és 0,25 gg vad típusú vagy egy módosított pcREV expressziós vektort alkalmazva DEAE dextránnal és klorokinnal.
Hatvan órás poszttranszfekcióval a tenyészeteket [35S]-ciszteinnel és [32P]-szervetlen foszfáttal ([32P-Pi]) párhuzamosan jeleztünk Malim által leírt módon [Malim és munkatársai, lásd fent; és Hauber és munkatársai, J. Virol., 62, 4801-4804 (1988)]. Ezután a sejteket lizáltuk RIPA pufferrel és a rév és tat expresszió relatív szintjét a tenyészetben immunprecipitációs analízissel vizsgáltuk nyíl poliklonális antipeptid antiszérumot használva [Malim és munkatársai, (1988) lásd fent és Cullen és munkatársai, J. Virol., 62, 2498-2501 (1988)]. Még pontosabban. a Rév 1-20 aminosav maradékaival szembeni (RÉV-1/20 (antiszérumot használtunk a pM5 és pM6 által kódolt mutáns proteinek immunprecipitációjához, mi a Rév 27-51 aminosav maradékaival szembeni antiszérumot (RÉV 27/51) használtuk minden más mutáns protein immunprecipitációjához. A tat expresszió immunprecipitációs analízisét a Tat 1-61 aminosav maradékaival (TAT 1/61) szembeni nyúl poliklonális antipeptid antiszérummal végeztük.
Az immunprecipitációval kicsapott proteineket 14%-os szakaszos SDS-akrilamid gélen elektroforetizálva választottuk szét és autoradiográfiával tettük láthatóvá. Ezen kísérletek eredményeit a 8. ábrán mutatjuk be, ahol az ismert molekulatömegű markerek elmozdulását az ábra jobb oldalán tüntettük fel.
A [35S]-ciszteinnel és [32P]-Pi-vel jelzett tenyészetek immunprecipitációját anti-Rev antiszérummal végeztük, és ezeket a 8A és 8C ábrákban mutatjuk be. A [35S]-ciszteinnel jelzett tenyészetek immunprecipitációja eredményeképpen a téves (pM) mutánsok nagyobb részében olyan intenzitású és molibitású sávok képződnek, amelyek hasonlóak a vad típusúéhoz (8Aábra, 1-14. sávok). Kivétel ez alól az általánosítás alól a pM6 mutáns, amely egy kis mértékben gyorsabban elmozduló intenzív sávot ad (Mr - 18 kd) és a pM 1, amely egy szignifikánsan lassabb elmozdulású sávot ad.
A tat expresszió anti-Tat antiszérummal végzett immunprecipitációs analízis lehetővé teszi a rév funkció minőségi analízisét pgTAT-ot alkalmazva model indikátorként. Amint a fentiekben jeleztük, rév távollétében a pgTAT egy teljesen összeillesztett citoplazmatikus tat mRNS-t fejez ki, amely kizárólag a tat protein két exonos 86 aminosavas formáját kódolja. Rév jelenlétében azonban a pgTAT az össze nem illesztett tat mRNS citoplazmatikus expresszióját indukálja, amely a megrövidített, 72 aminosavas hosszúságú protein egy exonos fomáját kódolja.
A vad típusú rév 19 kilodalton (kD) relatív molekulatömeg (Mr) szerint vándorol és könnyen kimutatható a 8. ábrában (0. sáv), míg a tat 86 aminosavas és a 72 aminosavas formái 15,5 kd, illetve 14 kd szerint vándorolnak. Az ál-transzfektált tenyészetek ezen kísérleti körülmények között nem adnak specifikus jelet [Malim és munkatársai, (1988), lásd fent], míg a 8B ábrában bemutatott vizsgálat a teljes tat protein hasonló szintjének a szintézisét mutatja a mutáns expressziós vektorokkal transzfektált tenyészetekben, mint az indikátor konstrukciójú pgTat-tal kotranszfektált tenyészet esetében. Ez feltételezhetővé teszi, hogy a mutáns Rév proteinek egyike sem volt toxikus a transzfektált sejtekre.
Ez az analízis azt is mutatja, hogy a Rév téves mutánsai közül 5 és a deléciós mutánsai közül 2 hatástalan (4-7, 10, 16 és 20 sávok), míg az összes többi Rév mutáns teljes mértékben képes indukálni a 72 aminosavas Tat expressziót. Az inaktív, téves mutációk közül négy egy csoportban helyezkedik el a 23-as és 56-os aminosav maradékok között (M4-M7), míg az ötödik inaktív mutánst (pMlO) két teljesen működő mutáns választja el és a 78 és 79-es maradékokat érinti. A Rev-nek akár az N-terminális (ρΔ1/2) közelében 4 maradék, vagy a C-terminálisa közelében a 21 maradék deléciójának (ρΔ11/14) csekély vagy semmi hatása nincs a rév funkcióra. Ezzel szemben a 9-es és 17-es helyek közötti maradékok (ρΔ1/3) további deléciója a rév funkció elvesztését eredményezi.
6. példa
A rév mutánsok transz-aktivációs kapacitása
Abból a célból, hogy pontosabban kiértékeljük a rév mutánsok transzaktivációs képességét, transz-ban azok alkalmasságának a megvédésére, a HIV-1-nek egy replikáció hiányos rév mutánsát vizsgáltuk. Ennek az analízisnek a céljaira a pHIV-1 rév vektor rév HIV-1 provírusát alkalmaztuk, amelyet Feinberg pHXB2Bam-p3-nak nevezett [Feinberg és munkatársai, Cell, 46, 807-817 (1986)], amely az 59-es aminosavnál a rév második kódoló exonjában egy leolvasási keret eltolódásos mutációt tartalmaz, amely a provírust alkalmatlanná teszi a replikációra, azaz alkalmatlanná arra, hogy egy hatásos Rév proteint termeljen COS sejtekbe transzfektálva és nem jön létre kotranszfekció HIV-1 rév expresszióra képes vektorral transz-ban [Rimsky és munkatársai, Natúré, 335, 738-740 (1989)]. A mutánsok rév provírust segítő képességét a 9. ábrában megadott módon analizáltuk vírus replikációval a tenyészet felülúszójába kijutó HIV-1 p24 Gag protein (pg/ml) szintjének a mennyiségi mérésével, az oldható p24 Gag expresszió mérésére ELISA vizsgálati módszert alkalmaztunk (DoPont-NEN Inc. Billerica, MA, USA) az előállító által megadott standardokat használva.
HU 211 530 A9
A kontroll céljaira a transzfekciós hatékonyságot ellenőriztük a tenyészeteket Rev-re nem érzékeny pBC12/RSV/SEAP vektorral (12,5 ng/tenyészet) kotranszfektálva, amely egy kiválasztott alkalikus foszfatáz (SEAP) gén expressziós vektor. Ennek megfelelően a SEAP szinteket párhuzamosan mértük a felülúszó p24 Gag szintjével. Ezen kívül néhány tenyészetet kotranszfektáltunk 125 ng bBC 12/CMV (NEG) negatív kontroll vektorral vagy egy vad típusú rév gén expressziós vektorral (pcREV).
COS sejt tenyészeteket (35 mm) kotranszfektáltunk 250 ng pHIV-1 rév-vei és 125 ng kontroll vektorral vagy a módosított mutánst tartalmazó vektorok egyikével. A felülúszó közegből 65 órával a transzfekció után mintát vettünk és mértük a p24 Gag protein expressziós szintet. A SEAP szinteket párhuzamosan mértük. A kapott eredményeket a 9. ábrában adjuk meg, a felülúszó SEAP szintjei csekély változásainak a korrekciójával (az átlag SEAP aktivitást 1,00 egységnek véve, a megfigyelt standard deviáció ±0,14 volt, és 1,30 és 0,79 között volt).
A SEAP aktivitás felülúszóban lévő szintjének kis eltérése volt látható ebben a kísérletben, így egyenértékű transzfekciós hatékonyságot mutatott és bizonyította, hogy a mutáns nem indukál sejt toxicitást. A pHIV-1 rév transzfekció egyedül nem eredményezi a p24 Gag protein kimutathatóságát a tenyészet felülúszójában (NEG sáv), míg egy vad típusú rév gén expressziós vektor hatásosan kiegészítette a pHIVlARev képességét, hogy indukálja a p24 Gag kiválasztását (pcREV sáv).
Ezen kívül minden, a pgTAT-on alapuló vizsgálatban pozitívnek talált Rév mutánst a 8B ábrában mutatunk be, amelyek a kivédő vizsgálatban (rescue assay) a vad típusú rév szerkezetnél talált aktivitás 50-100%a közötti aktivitás szintet elérte, az Ml kivételével, amely -30% aktivitást ért el, egy olyan csökkenést, amely az Ml mutáns csökkent in vivő stabilitását tükrözheti. Minden mutáns, amelyet a 8B ábrában negatívan jelöltünk. kivédő vizsgálatban (rescue assay) teljesen negatívok voltak (azaz -10 pg/ml p24 Gag), kivéve az Μ-7-et, amely alig termelt a felülúszóban kimutatható szintű p24 Gag proteint.
7. példa
A Rév protein biológiai aktivitásához nem szükséges a foszforiláció
Az in vivő kifejezett HIV-1 Rév protein egy vagy több szerin maradéka foszforilált. Az 5. ábrában felsorolt mutációk a rév kódoló szekvencián belül a 11 szerin maradék mindegyikét érinti. Ezért a transzfektált COS sejt tenyészetekben átmenetileg kifejezett immunprecipitált [32P]-Pi jelzett Rév proteineket megfigyeltük, hogy a HIV-1 rév in vivő foszforilációs helyeit azonosítsuk (8C ábra). A rev-be való [32P]-Pi beépülés szintjének a [35S]cisztein beépüléssel való összehasolítását a párhuzamosan transzfektált tenyészetben (8A ábra) használtuk fel az egyedi mutációk foszfát beépülés szintjére gyakorolt hatásának megállapítására. Ezen összehasonlítás eredményit az I. táblázatban foglaltuk össze.
/. TÁBLÁZAT
A HIV-1 rév mutánsok fenotípusos analízise
| Klón | Rév funkció3 | Foszforilá- lás | Sejten belüli elhelyezkedés | Transzdo- mináns represszió6 |
| vad típus | + | + | N | |
| Ml | + | + | 7 | |
| M2 | + | + | N | |
| M3 | + | + | N>C | |
| M4 | - | + | N>C | - |
| M5 | - | ± | C>N | - |
| M6 | - | - | C>N | - |
| M7 | - | + | N>C | - |
| M8 | + | + | N>C | |
| M9 | + | + | N | |
| M10 | - | + | N | + |
| MII | + | + | N | |
| M12 | + | + | N | |
| M13 | + | + | N | |
| M14 | + | + | N | |
| Δ1/2 | + | ± | N | |
| Δ1/3 | - | - | N>C | |
| Δ9/14 | - | nd | nd | + |
| Δ10/14 | - | ± | N | + |
| Δ11/14 | + | + | N | |
| Δ12/14 | + | ± | N | |
| Δ13/14 | + | + | N |
a ++, 50-100% vad típus [wild tipe, Wt = vt; +, 5-50% vt; 5% vt; b ++, összehasonlítható a vt-vel; +. 30-60% vt; ±, 5-20% vt; -, nincs kimutatható foszforiláció; nd. nem vizsgáltuk (nőt done) c ?. immunfluoreszcenciával nem mutatható ki; nd, nem vizsgáltuk (nőt done);
d ++, nagy mértékben franszdomináns; + mérsékelten transzdomináns. nem mutatható ki tra/írzdominancia.
Az I. táblázatban összegezett analíziseredmények alapján négy téves mutációt azonosítottunk, amelyek csökkent foszforilációt eredményeztek. Ezek közül az M2 és Μ12 mérsékelt hatást fejt ki a foszfát beépülésre (-30%, illetve -60% gátlás), míg az M5 és M6 igen nagy mértékben csökkentik a foszfát beépülés szintjét. Az M5 és M6 mutációknak a rév foszforilációjára kifejtett nagymértékű hatásának a lehetséges okát az alábbiakban tárgyaljuk részletesen, ezek a mutációk nem érintik a szerin maradékok egyikét sem.
A Rev-ben lévőfoszfát receptor szerin maradékok további helyének a megállapítására a deléciós mutánsok (ρΔ) foszforilációjának a szintjét tanulmányoztuk (8C ábra, 15-20. sávok). Ez az analízis azt mutatta, hogy a ρΔ 13/14 mutáció normálisan foszforilált, míg a ρΔ12/14 deléció és a nagyobb C-terminális deléciók csak csekély szintű foszforilációt (-90% gátlás) mutat18
HU 211 530 A9 tak. Hasonló módon a ρΔ1-2 Rév mutáns, amelyet hatásosan jeleztünk [35S] ciszteinnel, szintén alacsony szintű [32P]-Pi beépülést mutatott (-90% gátlás).
Nem világos, hogy azon delécióknak, amelyek az M2 és M12 mutációk helyére tetjednek ki, miért nagyobb a hatásuk a foszforiláció szintjére, mint ezek téves mutációinak. Azonban az eredmények megegyeznek azzal a feltételezéssel, hogy a Rév protein a szerin foszforiláció két elsődleges helyét tartalmazza, az egyik a 8-as maradékban van, (M2) és a második a 99-es maradékban (Ml2). Bármelyik esetben azon mutánsok, amelyekben nincsenek meg ezek a maradékok (azaz a pM2, ρΔ1/2, pM12, ρΔ12/14) közelítőleg a Rév aktivitás vad típusának a szintjét mutatják. Ezért levontuk azt a következtetést, hogy a Rév foszforilációja nem feltétlenül szükséges a HIV-1 szabályzó protein transzaktivációs funkciójához a transzfektált sejtekben.
8. példa
A Rév elhelyezkedése a magban
Azt, hogy a Rév protein túlnyomóan a magban helyezkedik el, főleg a kifejező sejtek nukleoluszuaiban, a mutánsok analízisével bizonyítottuk közvetett immunfluoreszcencia alkalmazásával. A transzfektált COS sejt tenyészetek fáziskontraszt és megfelelő immunfluoreszcens vizsgálataival kapott eredmények a 10. ábrában láthatók.
A transzfektált COS sejteken belüli Rév protein helyének a megállapítására alkalmazott közvetett immunfluoreszcencia alkalmazásával. A transzfektált COS sejt tenyészetek fázis-kontraszt és megfelelő immunfluoreszcens vizsgálataival kapott eredmények a 10. ábrában láthatók.
A transzfektált COS sejteken belüli Rév protein helyének a megállapítására alkalmazott közvetett immunfluoreszcenciás módszert Cullen leírása szerint végeztük [B. R. Cullen, Meth. Enzymol., 152, 684 (1987) és B. R. Cullen, J. Virol. 62, 2498 (1988)], azzal az eltéréssel, hogy egy módosított paraformaldehiden alapuló sejt rögzítő eljárást alkalmaztunk [Ruben és munkatársai, J. Virol., 53, 1-8 (1989)]. Pontosabban, a sejteket nyúl poliklonális anti-Rev peptid antiszérummal, majd rodaminnal konjugált kecske anti-nyúl IgG-vel kezeltük.
A primer nyúl anti-Rev antitestet 1:8000 arányú hígításban használtuk. A Rév mutánsok nagy részének az analíziséhez RÉV 1/20 antitestet alkalmaztunk, kivéve a ρΔ1/2 és ρΔ1/3 vektorokkal transzfektált tenyészeteket. Ezek esetében. REV27/51 antitestet használtunk. A második antitestet, a rodaminnal konjugált kecske anti-nyúl IgG-t (Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN, USA) 1:50 arányú hígításban használtuk.
A Rév mutánsok a sejten belüli elhelyezkedés szempontjából négy csoportra oszlanak, amelyeket az ábrában jelöltük meg. A következő kategóriák voltak:
N, mag/nukleolusz, a citoplazmában nem kimutatható expresszióval;
N>C, csekély expresszó a citoplazmában;
N>1, nyilvánvaló citoplazmatikus expresszió, bizonyos magban lévő koncentrációval; C>N, véletlenszerű elosztás a sejtben.
Ezen elosztásokat bemutató példák az ábrában találhatók, a Rév proteineket a képek alsó tábláinak az alsó, jobb sarkában jeleztük. Az ezzel a vizsgálattal kimutatott mindegyik Rév mutáns elhelyezkedését az I. táblázatban soroltuk fel.
Ezen elosztásokat bemutató példák az ábrában találhatók, a Rév proteineket a képek alsó tábláinak az alsó, jobb sarkában jeleztük. Az ezzel a vizsgálattal kimutatott mindegyik Rév mutáns elhelyezkedését az I. táblázatban soroltuk fel.
Amint látható, a mutánsok nagy része egy teljesen vad típusú sejten belüli elhelyezkedést mutat (N), beleértve a pMlO transzaktivációs negatív kiónt (10D ábra). Azonban több mutáns a citoplazmatikus fluoreszcenciának igen kis mértékű, de kimutatható szintjét termelte, ilyen a pM4 (10F ábra). Ez a fenotípus nincs világos összefüggésben a biológiai aktivitással, minthogy az aktív mutáns (pM3, pM8) és inaktív mutánsok (pM4, pM7) rendelkeznek ezzel a tulajdonságokkal. Ezen kívül egy eléggé terjedelmes deléciós mutáns, a ρΔ1/3 sejtben belüli elhelyezkedése átmenetet képez a vad típusú minta és a Rév fő doménjében lévő mutációk által indukált minta között (N>C, 10H ábra). Ez a deléció azonban nem a fő doménhoz közel helyezkedik el. Minthogy ennek az eltérő elhelyezkedésnek az oka nem világos, az összefügg a ρΔΙ/3-nál megfigyelt biológiai aktivitás hiánnyal.
A Rév argininben gazdag doménjének a mutációja (pM5, pM6), amely homológiát mutat az ismert magban való elhelyezkedési szignálokkal, a citoplazmatikus Rév protein magas szintjét eredményezi (C>N). Ezek a proteinek azonban nincsenek kizárva a sejtmagból (10J ábra) feltételezhetővé téve, hogy a Rév bázikus doménje tulajdonképpen mag-lokalizációs szignál.
Érdekes arra emlékeztetni, hogy a pM5 és pM6 in vivő nem volt szignifikáns mértékben foszforilálva annak ellenére, hogy a fentiekben a foszforiláció akceptorainak tartott helyeket megtartották. Ez azért lehetséges, mert a Rév foszforilációjáért felelős kináz a sejtmagra korlátozódik. Tehát lehetségesnek látszik, hogy a pM5 és pM6 Rév mutánsok nem megfelelő sejten belüli elhelyezkedése a felelős a foszforiláció alacsony szintjéért.
9. példa
A Rév funkció transzdomináns repressziója
A HIV-1 szerkezeti gén expressziót transzaktiváló képességüket elvesztett Rév mutánsok azon képességét vizsgáltuk, hogy gátolják-e transz-ban a vad típusú Rév protein funkcióját.
COS sejteket (35 mm) kotranszfektáltunk 250 ng pgTAT jelző szerkezettel és 290 ng pBCl”/CMV-vel (negatív kontroll) (11A ábra, 1-es sáv); 40 ng pcREVvel (alacsony szint), 250 ng pBC12/CMV-vel (2-es sáv); 290 ng pcREV-vel (magas szint) (3-as sáv); 40 ng pcREV-vel, 250 ng pM4-gyel (4-es sáv); 40 ng pcREVvel, 250 ng pM7-tel (5-ös sáv); 40 ng pcREV-vel, 250 ng ρΜΙΟ-zel (6-os sáv). A transzfekció után hatvan órával a tenyészeteket [35S]-ciszteinnel jeleztük és nyúl anti-Tat antiszérumot alkalmazva immunprecipitációnak vetettük alá.
HU 211 530 A9
Amint a 11A ábrában látható, a pM4 (4-es sáv) és pM7 (5-ös sáv) cskély hatást fejt ki a vad típusú Rév protein aktivitására, amint azt a 72 aminosavas Tat expresszió indukciójával mértük, míg a pMlO (6-os sáv) úgy tűnik, hogy teljesen gátolja a Rév funkciót. Ennek alapján feltételezhető, hogy a pMlO a HIV-1 rév gén funkciónak egy specifikus inhibitorát kódolja.
Annak bizonyítására, hogy a pMlO valóban tat 72 aminosavas formáját kódoló össze nem illesztett HÍV-1 mRNS citoplazmatikus expressziójának a specifikus megelőzésén keresztül hat, Malim [Malim és munkatársai, (1988) lásd fent] SÍ nukleáz védő vizsgálatát alkalmaztuk. Ezzel a vizsgálattal (11B ábra) mennyiségileg megállapítottuk a COS sejtek citoplazmájában kifejezett összeillesztett (spliced, S) és össze nem illesztett (unspliced, U) tat mRNS szintjét; 2,75 pg pBC12/CMV + 2,5 μg pcREV (1-es sáv); 2,5 pg pgTAT + 2,75 pg pBC12/CMV (2-es sáv); 2,5 pg pgTAT + 0,25 pg pcREV + 2,5 pg pBC 12/CMV (3-as sáv); 2,5 pg pgTAT + 2,75 pg pcREV (4-es sáv); 2,5 pg pgTAT + 0,25 pg pcREV + 2,5 pg pMlO (5-ös sáv); 2,5 pg pgTAT + 0,25 pg pcREV + 2,5 pg ρΔ10/14 (6-os sáv). Amint látható, a bevitt teljes DNS megmarad az egész 5,25 pg szinten, beleértve a kiindulási pBCl 2/CMV expressziós vektort, mint negatív kontrollt.
A transzfekció után 60 órával összegyűjtöttük a citoplazmatikus RNS-t analízis céljára és 5 pg-os adagokat használtunk fel az SÍ nukleáz védő vizsgálatban. Az itt alkalmazott DNS próba egy 798 bázis párt tartalmazó minta volt. amely Klenow DNS polimezázzal vég-jelzett volt a tat első kódoló exonján elhelyezkedő XhoII helyen [Malim és munkatársai (1988) lásd fent]. A próba (I) célja az volt, hogy mennyiségileg meghatározza az össze nem illesztett (U) és az összeillesztett (S) citoplazmatikus tat mRNS szintet a transzfektált COS tenyészetben. Ezt a próbát használva az összeillesztett (S) tat mRNS-ről előre vártuk, hogy megvéd egy 202 nt minta fragmentumot, míg az össze nem illesztett (U) tat mRNS egy 506 nt fragmentumot véd meg. Az össze nem illesztett RNS relatív szintjét minden egyes sávban denzitometriásan határoztuk meg egy LKB „soft laser” számlálót használva. Az eredmények, amint a 11b ábrában bemutatjuk, a következők: 2-es sáv: 14% össze nem illesztett; 3-as sáv: 63% össze nem illesztett; 4-es sáv: 82% össze nem illesztett; 5-ös sáv: 22% össze nem illesztett; 6-os sáv: 24% össze nem illesztett RNS.
Amint vártuk, a csak pgTAT-tal transzfektált sejtek citoplazmájában az összeillesztett tat mRNS volt túlnyomóan (11B ábra, 2-es sáv), míg azon sejtek citoplazmájában, amelyek HIV-1 Rév proteint is kifejeznek, az össze nem illesztett tat mRNS a domináns a citoplazmában (1 IB ábra, 3-as és 4-es sávok). Azonban a pgTAT-nak pcREV-vel és ρΜΙΟ-zel való együttes kifejezése megtartja a tat mRNS összeillesztett formájának túlsúlyát (1 IB ábra, 5-ös sáv).
Noha az 5-ös és 6-os sávokban lévő RNS teljes szintje némileg alacsonynak tűnik, azonban így nyilvánvaló, hogy a pMlO (5-ös sáv) képes volt szelektíven gátolni az össze nem illesztett tat mRNS által indukált citoplazmatikus expresszióját a pgTAT vektorból. A pcREV és pMlO jelenlétében kimutatott össze nem illesztett tat mRNS relatív szintje hasonló a Rév távollétében megfigyelt szinthez.
Ez nyilvánvaló a ρΔ10/14 esetében (11B ábra, 6-os sáv). Ezek az eredmények ezen kívül azt is bizonyítják, hogy a 3’-től az M10 mutánsig terjedő rév gén deléció (ρΔ10/14) szintén kódolja a Rév funkciónak egy transzrepresszorát. Egy még kiterjedtebb deléció, amely túlmegy az M10 mutáció helyén, a pA9/14-nek nevezett, szintén egy domináns negatív fenotípust képvisel (I. táblázat). Azonban egy deléció, amely az M8 mutáció helyéig terjed, már nem transzdomináns (az erre vonatkozó adatokat nem mutatjuk be).
10. példa
A pMlO Rév mutáns a rév funkció kompetitív inhibitora
A 11A és 11B ábrákban bemutatott kísérleti eredmények azt mutatják, hogy a pMlO represszálni képes vad típusú Rév funkciót, ha transz-ban van. Azonban ezeket a kísérleteket nagy feleslegben lévő pMlO jelenlétében végeztük. A Rév funkció transz-gátlása hatásosságának a pontos mennyiségi meghatározására a pcREV egyetlen szintjén vizsgáltuk a pMlO növekvő szintjeinek azon képességét, hogy meggátolja-e a pHIV-1 rév provírus mutáns védelmét. Ez a kísérlet a pM4 és ρΔ10/14 Rév mutánsok növekvő szintjének a hatását is méri, valamint magának a vad típusú Revexpressziónak az egyszerűen növekvő szintjét.
COS sejt tenyészeteket (35 mm) kotranszfektáltunk 25 ng pHIV-lArev-vel és 50 ng pcREV-vei, a pcREV (▼), pM4 (Δ), ρΔ10/14 ( ) vagy pMlO ( ) növekvő többszörös moláris feleslegeivel, amint azt a 12. ábrában jeleztük, azaz ez tízszeres felesleg, 500 ng plazmid szerkezettel való kotranszfekciót jelent. A teljes bevitt DNS-t 587,5 ng-en tartottuk, beleértve a pBCl 2/CMV kiindulási expressziós vektort, mint negatív kontrollt. Egy SEAP gén expressziós vektort kotranszfektáltunk belső kontrollként (12,5 ng/tenyészet). A felülúszó közegből a 15. órában mintát vettünk és a felülúszó p24 Gag expresszió szintjének a mérésével vizsgáltuk.
Ennek a vizsgálatnak az eredményeit a 12. ábrában mutatjuk be, más versengő rév vektor távollétében nyert p24 expressziós szinthez viszonyítva, amely szintet 1,00-nak vettünk. Minden értéket a 25 ng pHIVΙΔτεν, 50 ng pcREV, 12,5 ng pBC12/RSV/SEAP és 500 ng pBCl 2/CMV-vei transzfektált tenyészetekben észlelt p24 Gag expressziós szinthez viszonyítva fejezünk ki. Ezt a kontrol tenyészetet (·), amely alapértéket képez, amellyel szemben a hozzáadott Rév mutánsok kompetitív hatásait mértük, önkényesen a p24 Gag expresszió 1,00 egységének a szintjén határoztuk meg. Az itt bemutatott értékeket korrigáltuk a felülúszó SEAP szintjeinek csekély változásaival (átlag SEAP aktivitás 1,00±0,27 volt, 1,28-0,72 értékek között).
Amint leírtuk, hogy a vad típusú rév expressziós pcREV vektor transzfekciójának a növekvő szintje enyhén pozitív hatást fejt ki a vírus replikációra, maximálisan egy -70%-os növekedéshez vezetve a p24
HU 211 530 A9
Gag-nak a közegbe való kijutását. Ezzel ellentétben a pMlO vektor kotranszfektációjának igen nagyfokú gátló hatása van a HIV-1 szerkezeti gén expresszióra. A kapott inhibició sémája olyan, amely várható volt a Rév funkció kompetitív inhibitorától, amely ugyanazzal az affinitással rendelkezik a biológiai célpontjához, mint a vad típusú Rév. Tehát a pM 10-nek egy ekvimoláris mennyisége a p24 Gag expressziót felére csökkenti, a pMlO kétszeres feleslege az expressziót egyharmadára csökkenti, egy ötszörös felesleg az egy hatodára, míg egy tízszeres felesleg a p24 Gag expressziót -93%-ra csökkenti.
A ρΜΙΟ-en kívül a ρΔ10/14 kotranszfekció szintén csökkenti a p24 Gag expressziét, azonban a Rev-nek ez a nagy deléciós mutánsa nem volt olyan hatékony inhibitor, mint a pMlO. Valószínűnek látszik, hogy a ρΔ10/14 által kifejezett erősen megrövidített protein kevésbé hatásos kompetitor, minthogy nem rendelkezik azon szekvenciákkal, amelyek elősegítik a Rév kötődését a biológiai célpontjához.
Végül a pM4 kotranszfekciójának szintén volt gátló hatása, noha ez csekély volt, a legnagyobb alkalmazott adag esetében kevesebb, mint kétszeres (32%). Ez a hatás valószínűleg az RRE kötéssel nem rokon aktivitásból származik.
11. példa
A HIV-1 Rév transzaktivátor dómén szerkezete
Amint a fentiekben tárgyaltuk, a HIV-1 transz-aktív gén termék Rév téves és deléciós mutánsai sorozatának a biológiai aktivitásának a megállapítására átmeneti gén expressziós analízist használtunk transzfektált sejtekben. Az eredmények bizonyítják a Rev-en belül két funkcionáló dómén lehetséges létét, amint azt a 12A ábrában vázlatosan megadjuk, ahol az S egy összeillesztési helyet képez. Továbbá, ez a két dómén nélkülözhetetlen lehet transzaktiváláshoz (keresztben vonalkázott rész).
Ezen domének közül az elsőt (az RNS kötő dómén) a négy téves pM4, pM5, pM6 és pM7 mutáns határozza meg, amely körülbelül 35 aminosavat tartalmazó régióra terjed ki a körülbelül 10-es aminosav hely és körülbelül a 68-as aminosav hely között a vad típusú Rev-ben és nagy mértékben bázikus elemeket tartalmaz, amelyek feltétlenül szükségesek a Rév magban való lokalizációjához. Tartalmaz még egy mag lokalizációs (nuclear localization, NL) szignált (árnyékolt rész). Az ebben a doménben megváltozott mutánsok egy recesszív fenotípust mutatnak.
Ezzel ellentétben a második doménen belüli mutációk (az aktivációs dómén), amelyek középpontja közelítőleg a 79-es aminosav maradék köröl van és, amelyeket többek között a pMlO téves mutáns és a ρΔ9/14 és ρΔ 10/15 deléciós mutánsok határoznak meg, szintén a Rév funkció elvesztését eredményezik, de figyelemreméltó az ezen mutánsok által képzett negatív fenotípusú transzdomináns. A Rév két régiója (a 12A ábrában vonalkázottan jelzett) nélkülözhetőnek látszik a protein funkcióhoz. Amint itt leírtuk, a Rév aktivációs doménben lévő mutációk defektív (hiányos) Rev-et adnak és olyan proteinek termelését eredményezik, amelyek kompetitív gátolják a vad típusú Rév funkcióját. Ez a transz-represszió elegendő ahhoz, hogy jelentősen csökkentse vagy visszaszorítsa a HIV-1 replikációt transzfektált sejtekben. ApMIO és rokon deléciós mutánsok által mutatott domináns negatív fenotípusok molekuláris alapja még nem ismert. Azonban az a megfigyelés, hogy a téves (M10) és deléciós (Δ 9/14, Δ10/14) mutánsok képesek gátolni a Rév funkciót „transzban”, feltételezhetővé teszi, hogy ezért inkább egy tulajdonság elvesztése, mint szerzése a felelős. Egy lehetőség az, hogy a defektív Rév protein molekulák képesek lehetnek kevert multimereket képezni vad típusú Rév protein alegységekkel és így gátolják transzdomináns módon a vad típusú protein funkcióját. Azonban jelenleg nem ismert, hogy a Rév in vivő monemerként vagy multimerként fejti-e ki a hatását. Egy másik feltételezés szerint, amely prokariota és aukariota transzkripciós faktorok egy számának a funkcionális vizsgálatát magában foglaló korábbi munkán alapszik az, hogy a transzkripciós transzaktivátorok két különböző funkcionális domént tartalmaznak, egy specifikus „kötő domént”, amely a proteint a megfelelő cél-szubsztrátjához irányítja, és egy „aktivációs domént”, amely lehetővé teszi a kötődés funkcionális következményének a létrejöttét, ebben az esetben a transzkripciós aktiválást. Több rendszerben úgy tűnik, hogy a kötő dómén egy szekvencia-specifikus DNS kötő elemet tartalmaz; azonban legalább egy esetben, amely a herpes simplex vírus, típus-] (HSV-1) VP16 transzaktivátor, úgy tűnik, hogy a kötő dómén ehelyett egy specifikus kölcsönhatást közvetít a celluláris transzkripciós faktorral, amely viszont a HSV-1 genomban a cél-szekvenciához kötődik. Fontossággal bir, hogy a kötő dómén mutációja hajlamos egy negatív fenotípust eredményezni, amely mérsékelt szinten recesszív az expresszióra. Ezzel ellentétben a transzkripciós faktor aktivációs doménjének a mutációja vagy deléciója a mutánsokban egy domináns negatív fenotípust eredményezhet. Ezekről a mutánsokról, amelyek megtartják az ép kötő domént feltételeztük, hogy versengenek a megfelelő sejt celluláris való kötődésben a vad típusú transzaktivátorral, de ezért nem képesek aktiválni a transzkripciót, ha egyszer a kötődés létrejött. A HSV-1 VP16 esetében azt tapasztaltuk, hogy ennek a transzdomináns mutánsnak nagymértékben történő expressziója hatásosan gátolja a vad típusú VP16 funkciót és ezért meggátolja a HSV-1 replikációt a normálisan ezt lehetővé tevő sejtekben.
Noha a rév gén termék a gén expressziójának egy poszttranszkripciós transz-regulátora, valószínűnek tűnik, hogy a két különálló funcionális dómén elgondolás ebben az esetben alkalmazható. Nevezetesen, a Rév funkciók nagymértékben szekvencia specifikus módon az RNS cél-szekvenciájukkal, az RRE-vel való közvetlen kölcsönhatáson keresztül hatnak [Μ. H. Malim és munkatársai, Cell, 60, 675-683 (1990)] és ezért olyan szekvenciát kell tartalmazniuk, amely ezt a specifitást biztosítja. Amint a kötődés létrejött, ezt a történést egy aktivációs történéssé kell transzlatálni, ebben az eset21
HU 211 530 A9 ben a HIV-1 szerkezeti proteineket kódoló nem teljes, összeillesztett RNS-ek magból való kijutásának. Ez utóbbi doménben végbement mutációk így a vad típusú Rév funkció kompetitív inhibitorait eredményezik. Ez a Rév pMlO és ρΔ10/14 mutánsok esetében megfigyelt fenotípus és ezen mutánsok jelezhetik egy különálló altivációs dómén létét. Viszont a második Rév protein inkább N-terminális nélkülözhetetlen régiója, amelyet mutációs analízissel határoztunk meg, ugyanolyan funkcióval rendelkezhet, mint a „kötő domének”-nél meghatározott különböző transzkripciós faktorokban. Az ebben a doménben megváltozott mutánsok (például a pM4, a pM7) tulajdonképpen általában egy recesszív negatív fenotípust mutatnak, noha egy alacsony, de szignifikáns gátlás megfigyelhető a magas expressziós szinten. További transzdomináns mutánsokat találtunk (lásd 5A ábra és 11 a és 11b példák), amelyek lehetővé teszik a Rév aktivációs dómén pontosabb lokalizációját, amely körülbelül a 68-as aminosav helytől körülbelül a 90-es aminosav helyig terjed, pontosabban körülbelül a 78-as helytől körülbelül a 86-os helyig és még pontosabban a körülbelül 78-as helytől körülbelül a 83-as vagy 84-es helyéig terjed a vad típusú Rev-nek.
11a példa
További transzdomináns HIV-1 Rév mutánsok
További HIV-1 Rév mutánsokat állítottunk elő a fentiekben, a 6.2 fejezetben leírtakhoz hasonlóan. Ezeket az 5A ábrában és a II. táblázatban megadottak szerint jelöltük és jellemeztük. Az in vivő fenotípust Malim szerint [Μ. H. Malim és munkatársai, Cell, 58. 205-214 (1989)] határoztuk meg (minden vizsgálatot a transzfekciós hatás belső kontrolljával végeztünk el).
A 4-11. példákban leírtakon kívül a következő további mutánsokról állapítottuk meg, hogy transzdominánsan gátolján a vad típusú HIV-1 Rév funkciót: pM21. pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32
II. TÁBLÁZAT
További HIV-1 rév gén mutánsok fenotípusos analízise
| Klón | Fenotípus3 | Transzdomináns represszió6 |
| pBC12/CMV (csak vektor) | 0 | |
| pml5 | + | |
| pM16 | + | |
| pM17 | + | |
| pM18 | + | |
| pM19 | + | |
| pM20 | + | |
| pM21 | - | 97 |
| pM22 | - | 93 |
| pM23 | ||
| pM24 | + | |
| pM25 | + | |
| ρΔ9/19 | - |
| Klón | Fenotípus3 | Transzdomináns represszió6 |
| ρΔΐβ/19 | + | |
| ρΔΐδ/23 | - | |
| ρΔ22/14 | - | |
| ρΔ23/14 | + | |
| ρΜ27 | - | 92 |
| ρΜ28 | - | 92 |
| ρΜ29 | - | 91 |
| ρΜ32 | - | 97 |
| ρΜ33 | + | |
| ρΜ34 | + | |
| ρΜ35 | + | |
| ρΜ36 | + |
a. ++ 40-100% (a vad típusú Rév aktivitásához viszonyítva) +5-39%
-5%
b. a vad típusú Rév funkció %-os gátlása, a vad típusú Rév tízszeresének megfelelő Rév mutáns felesleggel.
11b példa
A HIV-2 és SIV Rév funkcióra kifejtett hatás
A 4-11. példák transzdomináns HIV-1 rév gén mutánsainak a multivalens képességét analizáltuk a fentiekben a 6.2 fejezetben már leírt és Malim által leírt módszerrel [Μ. H. Malim, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 8222-8226 (1989)]. A kapott eredmények azt mutatják, hogy legalább a pM 10 mutáns rendelkezik azzal a képességgel, hogy nemcsak HIV-1 rév gén fenotípusos expresszióját gátolja, hanem ezen kívül a HIV-2 és SIV^ rev gén funkciót is, amint az látható például a HIV-2 rev esetében a HIV-2 Rev funkció erős gátlásából, amikor pMlO feleslege együtt fejeződik ki a vad típusú HIV-2 rev génnel, az össze nem illesztett mRNS és egy-exonos tat citoplazmában való expressziójának a gátlásán keresztül.
6.3
12. példa
A Rex funkció analízise
A rex mutánsok Rex funkciójának a vizsgálatára (14. ábra) minden mutáns DNS-t pgTAX-LTR-rel kotranszfektáltunk COS sejtekbe DEAE dextránt alkalmazva [B, P. Cullen, Meth. Enzymol., 152, 692-693 (1987)]. Minden plazmidot 1,25 gg/ml koncentrációban adtunk. A transzfekció után 48 órával a sejteket metabolitikusan [35S]-ciszteinnel jeleztük két órán át, sejtkivonatot készítettünk és a mintákat 0,5 a-humán monoklonális antitesttel immunprecipitáltuk, amely specifikusan reagá a HTLV-I burkoló proteinjével. Az immunprecipitátumokat SDS-10% poliakrilamid gélen analizáltuk.
A HTLV-I Env, Tax és Rex protein termelés egyidejűleg analízise céljából (15. ábra) COS sejteket kotranszfektáltunk pgTAX-LTR-rel (0,1 gg/ml) és a mutáns Rex proteineket kódoló vektorokkal (1 gg/ml)
HU 211 530 A9 vagy a vad ü'pusú pREX, pREV és pCMV-TL-2 vektorokkal (1 pg/ml). A HTLV-I proteinek immunprecipitációs analíziséhez a következő antitesteket alkalmaztuk: Env, 0,5 α-antitest; Tax specifikus antipeptid nyúl antiszérum [a feltalálók egyike által előállított, de előállítható W. Wachsman és munkatársai, Science, 235, 674677 (1987) szerint is]; Rex, Rex-specifikus antipeptid nyúl antiszérum [a feltalálók egyike által előállított, de előállítható H. Siemi és munkatársai, Cell, 55, 197-209 (1988) szerint is]. Minden esetben a radioaktíven jelzett sejtkivonatot használtuk a három immunprecipitáció és elektroforetikus analízis céljára; a kapott autoradiogramnak csak az ide vonatkozó részeit mutatjuk be a 15. ábra tábláiban.
A HTLV-I Rex mutánsok sejten belüli immunfluoreszcenciás lokalizációjára (16. ábra) COS sejteket transzfektáltunk a jelzett expressziós plazmidokkal és 48 óra után paraformaldehiddel fixáltuk azokat. Ezután a sejteket fokozatosan festettük nyúl anti-Rex peptid antiszérummal (1:100 arányú hígítás) és kecske rodaminnal konjugált anti-nyúl IgG-vel, amint azt korábban leírtuk [B. R. Cullen (1987), lásd fent].
13. példa
A Rex és Rév funkció gátlása
A rex mutánsok vad típusú Rex protein funkcióját gátló képességének a vizsgálata céljából (17A ábra) COS tenyészeteket kotranszfektáltunk a következő három plazmiddal: pgTAX-LTR (1,25 pg/ml), pREX (0,1 pg/ml) és 1 pg/ml Rex mutánsokkal (1-6. sávok), pREX (7-es sáv), pREV (8-as sáv) vagy pCMV-IL-2vel (9-es sáv). Az Env termelést analizáltuk 0,5 a monoklonális antitesttel való immunprecipitációval és SDS-10% poliakrilamid géles elektroforézissel. A HIV-I Rév protein funkció gátlásának az analízise céljából COS sejteket kotranszfektáltunk pgTAT-tal, pREV-vel és pBC/CMV-IL-2 tízszeres moláris feleslegével vagy M6, M7 és Ml3 transzdomináns Rex mutánsokkal. 48 órás tenyésztés és [35S]-ciszteinnel való bioszintetikus jelzés után a sejtkivonatokban immunprecipitációval vizsgáltuk a Tat protein megrövidített, 72 aminosavas formájának a Rév által indukált termelését (2-es sáv). 10:1 moláris arány esetében az M6, M7 és Ml3 mutánsok (3-5. sávok) teljesen gátolják a HIV-1 Rév protein hatását, amint azt csak a Tat protein teljes hosszúságú, 86 aminosavas formája esetében mutattunk ki. A HIV-1 replikáció gátlásának az analízise céljából COS sejteket kotranszfektáltunk a rev-hiányos HÍV-1 provírus plazmid pHXB2-Bam-p3mal [M. R. Feinberg és munkatársai, Cell, 46, 807-817 (1986)] és pRex-szel az Ml, M6, M7 és Μ13 mutánsok jelzett feleslegének a jelenlétében. A transzfekciós elegy teljes DNS koncentrációja állandóan szinten maradt különböző mennyiségű pBC/CMV-Il-2 eredeti vektor hozzáadásakor. A transzfekció után három nappal a felülúszó a HIV-1 p24 Gag protein szintjét EL1SA módszerrel mértük (Coulter Immunology készlet). Az M6, M7 és M13 mutánsok a HIV-1 p24 termelés dózisfüggő mértékű gátlását okozták, míg a recesszív negatív MI mutáns esetében ez nem történt meg.
7.
Farmakológiai szempontok
A HIV-1 az AIDS túlnyomó etiológiai oka; a HTLV-I többek között ATL-t okoz; a HTLV-Π etiológiailag rokon a T-sejt hajas sejtes leukémia változat egyes eseteivel. A HIV-1 Rév és a HTLV-I Rex transzaktivátorokat nélkülözhetetlennek tatáltuk a tenyészetben a vírus replikációhoz és ezért a Rév és Rex a kemoterápiás beavatkozás lehetséges célpontjai lehetnek az érintett betegekben.
Az itt leírtak szerint a Rév és/vagy Rex-nek vannak olyan mutánsai, amelyek a vad típusú Rév és/vagy Rex funkció kompetitív inhibitoraiként hatnak, és amelyek ezért a HÍV-1 és/vagy HTLV-I és/vagy HTL-Π replikáció hatásos gátlójaként hatnak. Ezek a mutánsok így felhasználhatók a fertőzésnek kitett betegek limfoid sejtjeinek a megvédésére. Ezen várt eredmény megvalósíthatóságának a jele az a mefigyelés, hogy a HSV-1 nélkülözhetetlen VP16 transzaktivátorának az analóg transzdomináns származékának az expressziója hatékonyan ellenállóvá teszi a HSV-1 fertőzéssel szemben a normális körülmények között érzékeny sejt-populációt [A. D. Friedman és munkatársai, Natúré, 335, 452454 (1988)]. Továbbá megfelelő átvitt gént tartalmazó egerek immunisnak látszanak a HSV-1 fertőzéssel szemben.
A Rex és Rév transzdomináns represszorait kódoló mutáns rex és rév gének így „intracelluláris immunogének”-ként való felhasználásra alkalmasak a HTLV-I vagy HTLV-Π által okozott betegségek kezelésére, illetve a HIV-1 által indukált betegsége, beleértve az AIDS és ARS (ARC) kezelését is. Továbbá, minthogy a találmány transzdomináns Rex mutáns proteinjeinek legalább egy része rendelkezik azzal a sajátossággal, hogy képes gátolni a HTLV-I Rex és HÍV-1 Rév protein aktivitást, így ezek alkalmasak mindkét vírus típussal történt fertőzés kezelésére. Ez a tulajdonság különleges értékű azon betegek esetében, akiknél nem megkülönböztetett a fertőzés oka ezen két anyag között.
A jelen találmány előtt sehol nem írták le egy olyan terápiás szer létét, amely több, mint egy vírus faj esetében hatásos lenne. A fenti elgondolás a széles körű alkalmazhatóságra való tekintettel nemcsak a Rev-et és Rex-et kódoló vírus fajok által okozott betegségek terápiájában alkalmazható, hanem további vírus betegségekben is, amelyek hasonlóan szabályozott génekkel rendelkeznek.
A találmány így javasolt vírus, főleg retrovírus betegségek, mint az ATL (aduit T-cell leukémia, felnőttkori T-sejt leukémia), az ARS vagy ARC (AIDS-szel rokon tünet vagy komplex), SIV (simian immundeficiency vírus), mint a SIVmac· FIV (feline immundeficiency vírus), EIAV (equine infectious anémia vírus), visna vírus és marha immunhiányos vírus fertőzésének megelőzésére és kezelésére, különösen humán retrovírus betegségek, még pontosabban rex vagy rév génekkel vagy ezek ekvivalenseivel szabályozott patogénekkel okozott humán retrovírus betegségekkel [mint ATL, AIDS és ARS (ARC)] szemben.
Különösen előnyös ezért a represszor hatás multivalens tulajdonsága, minthogy ez előnyös a többszö23
HU 211 530 A9 rös, különösen a kettős vírus fertőzés esetében, mint amilyet gyakran látni az i.v. gyógyszert kapók esetében, akik HIV-1-gyei és HTLV-I-gyel együttesen fertőzöttek, vagy egyetlen vírussal való fertőzés esetében, amely további fertőzés megnövekedett veszélyével jár, mint amilyen a HÍV fertőzés, vagy olyan esetek megelőzésére, amikor kívánatos védelmet nyújtani olyan fertőzésekkel szemben, amelyeket különböző vírus fajok okoznak.
Ettől a multivalens hatástól normálisan az lenne várható, hogy leginkább bizonyos típusú, valamennyire rokon vírusok, például retrovírusok gátlásában hatásosak, azonban ezek nem korlátozódnak szükségszerűen szigorúan vett rokon vírusokra, mint akár DNS vírusra vagy RNS (retro) vírusra: ismertek kölcsönhatások a DNS vírusok és retrovírusok fertőzésképességének a szintje között, így a HIV-1 és JC vírus, egy humán papova-vírus között [H. Gendelman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 9759-9763 (1986); H. Tada és munkatársai, u.o. 87, 3479-3483 (1990)] és közös szabályzó mechanizmus működhet filogenikusan távoli vírus fajokban, amelyekre a fenti multivalens transzdominancia elvét alkalmazni lehet.
A találmány terápiás lehetősége nyilvánvaló, minthogy a HTLV-I Rex funkciójának és a HIV-1 Rév funkciójának a repressziója blokkolja a vírus replikációt, így kivédi a fertőző vírus részecske képződését és így várhatóan fenntartja a fertőzés látens állapotát. Tehát az egyének HIV-1 vírussal már fertőzött sejtjei, de amelyek genomjukba már integrálódott transzdomináns represszor génnel rendelkeznek, működőképesek maradnak és az egyének meghatározatlan ideig a betegség tüneteitől mentesek maradnak hosszú ideig tartó kezelés igénye nélkül.
Ebben a megvilágításban a jelen találmány szerinti gének önmagukban gyógyszerek, egyszeri vagy többszörös kezelés céljára akár közvetlenül in vivő, vagy közvetve in vitro alkalmasak, előnyösen egy vektor részeként, például egy retrovírus vagy plazmid vektorként olyan megfelelő formában, amellyel elérhető a funkcionális formában való felszabadulás a célzott emlős sejtekben; például vírus replikáció transzdomináns inhibitorait kódoló gének inszerciója hatásos lehet in vivő bevive a beteg sejtjeibe közvetlenül implantálva a fertőzött egyénekből származó limfoid sejtek genomjába, majd ezeket a sejteket a donor betegekbe az inszerció elvégzése után visszajuttatva. Minthogy a HTLV-I és a HTL-II, valamint a HIV-1 különböző T-sejt típusokban replikálódik, így a betegség, amelyet okoznak, különösen alkalmasnak látszik ezen kezelésre.
Ezen alkalmazás hasonló lehet T. Friedman [T. Friedman, Science, 244, 1275 (1989. június 16.) vagy P. M. Lehn, Boné Marrow Transplant, 1 243 (1987)] génterápiás elképzeléséhez: például AIDS/ATL-es betegekből kivonunk hematipoietikus őssejteket és in vitro tenyészjük azokat, a találmány szerinti mutált géneket, amelyek a represszálható funkció domináns represszorát kódolják, így a Rev/Rex funkciót, ezekbe a sejtekbe implantáljuk retrovirális vektorokat alkalmazva; az új, vírusnak ellenálló utódokat terjelő őssejteket visszavisszük az eredeti beteg immunrendszerébe, ahol ezek várhatóan szaporodásukkal, szelektív előnyük következtében túlnövik a nem kezelt őssejteket; kellő időben a hematopoietikus sejtek populációja olyan sejtekből fog állni, amelyek a transzdomináns faktort termelik és vírus-rezisztensek.
Ennek megvalósítási módszerei a szakterületen már ismertek, lásd pédául a 4 868 116 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat. Vektorokat, például a találmány szerinti mutáns géneket a célzott emlős sejtekben, így csontvelő sejtekben felszabadító retrovirális vagy plazmid vektorokat leírnak például a Science, 244, 1275 (1989. június 16.) közleményben. így például különböző Rév és/vagy Rex transzdomináns géneket klónoztunk retrovirális vektor rendszerekben. A retrovírusok által közvetített gének felszabadulása után, például a HIV-1-gyei fertőzött humán sejtvonalakban, a transzdomináns mutánsok gátló hatása könnyen bizonyítható a vírus képződés gátlása alapján.
A fenti terápiás elképzelés egy példája az intracelluláris immunizációnak, amelyet D. Baltimore [Natúré, 335, 395 (1988)] tűzött ki célul. Röviden az elképzelés a következőkből áll: egy kiválasztott vírus bizonyos életfunkciójának egy represszorát kódoló génnek egy olyan sajátos célsejtbe való inszerciója, amelyet ez a vírus megfertőzött (például bizonyos T-sejtek a vírus által okozott AIDS esetében). Ezen elképzelésnek az alkalmazása bármely vírus transzdomináns represszorával való terápia céljára a körülménytől függ, hogy ezen mutáns proteineket kódoló gének számára alkalmas vektorok és ezen vektorokat a megfelelő sejtekbe való inszerciójának a módszerei, amelyeket model rendszerekben megvizsgálva, hatásos és biztonságos intracelluláris felszabadító rendszert képeznek-e humán vagy állati alkalmazás esetében. Az elképzelést csak nehézségekkel lehet felhasználni vizsgálatok kísérletes igazolására az etikai megszorítások miatt, amelyek jelenleg meggátolják a génterápiát, azonban az első ilyen genetikai, nem terápiás célú kísérletek már elkezdődtek. Azt várjuk, hogy röviddel azután, hogy az eljárás ártalmatlanságát bizonyították, ezeket az úttörő kísérleteket hasonló célú terápiás célú kísérletek fogják követni, először az életet veszélyeztető esetekben, mint például az AIDS betegség, a jelen találmány alkalmasnak látszik ezen kísérletekben a korai kipróbálásra [lásd: T. Friedman, Science, 244, 1279 (1989. június
16.), második rész, „Infectious diseases”].
A találmány felhasználásának egy további módja nem egy gén, hanem egy, a találmány szerinti represzszor protein célsejtekbe való inszercióját foglalja magában. Például a szájon át vagy parenterálisan való alkalmazást szokásos módon hajtjuk végre olyan formában, amely lehetővé teszi az intracelluláris bejutást, így például lipozoma által közvetített bejutást és felszabadulást.
Ezekben az alkalmazásokban természetesen a pontos adagolás függ az alkalmazott vegyülettől, az adagolás módjától és a kívánt kezeléstől; sajátos esetben legalkalmasabb adagolás meghatározása a szakembertől függ.
HU 211 530 A9
A találmány továbbá javait transzdominancián alapuló vírusellenes szerek tervezésére és előállítására való felhasználásra. Egy eszközt találtunk vírus gén funkciókkal való műveletekre, amelyek különböző vírus fajok esetében általánosan alkalmazhatónak látszanak, noha a különböző vírusokban ezek szerkezeti alapja nagy mértékben változik. Ez a nem várt észlelés utat nyit a vírus replikáció további specifikus, kis molekulatömegű, lehetőleg nem peptid transzdomináns inhibitorainak a tervezését célzó tanulmányozásoknak, különösen olyan inhibitorok tervezésére elsősorban, amelyek képesek utánozni a transzdomináns, elsősorban a Rév vagy Rex proteinekben az RNS-kötő doméneket, ilyenek a kis molekulatömegű inhibitorok vagy semlegesítő monoklonális antitestek.
Meg kell érteni, hogy különböző kombinációkat vagy változtatásokat lehet végrehajtani a fent leírt találmány formájában és részleteiben anélkül, hogy annak oltalmi körétől eltérnénk.
Szintén meg kell érteni, hogy a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak a fent leírt mutánsok mellett olyanok, amelyek a már megszerkesztett specifikus mutánsokat és az itt leírtakat magukban foglalják, de amelyeket nem jellemeztünk részletesebb vizsgálatokkal, így a transzdomináns és/vagy multivalens inhibitorokat és a fentiekben leírt elveknek megfelelő további mutánsokat, de amelyeket itt nem adtunk meg specifikusan.
Claims (33)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Egy proteint kódoló gén, amely transzdominánsan represszálja több, mint egy vírus faj funkcionálisan egyenértékű génjeinek fenotípusos expresszióját; vagy ennek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 2. Egy protein, amely transzdominánsan represszálja több, mint egy vírus faj funkcionálisan egyenértékű génjeinek fenotípusos expresszióját és így gátolja több, mint egy vírus faj replikációját vagy ennek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 3. Az 1. igénypont szerinti gén vagy a 2. igénypont szerinti protein, ahol az általuk represszált gének a HTLV-I rex, HTLV-II rex, HIV-1 rév, HIV-2 rév, SIV rév, EIAV rév, visna vírus rév és marha immunhiányos vírus rév kettő vagy több tagjából kiválasztottak; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 4. A 3. igénypont szerinti gén vagy protein, vagy fragmensük vagy származékuk, amelyek által represzszált gének a HTLV-I rex és HÍV-1 rév.
- 5. A 3. igénypont szerinti gén vagy protein, vagy fragmensük vagy származékuk, anelyek által represzszált gének a HIV-1 rév és HIV-2 rév.
- 6. Az 1. igénypont szerinti gén, amely a HTLV-I Rex proteint kódolja vagy a 2. igénypont szerinti protein, amely egy HTLV-I Rex protein, amely az 1. ábra szerinti vad típusú Rex protein körülbelül 22-es és 101-es aminosav helyei között tartalmaz mutációt, vagy amely az 1. ábra szerinti vad típusú Rex protein körülbelül 59-es és 121 -es aminosav helyei között tartalmaz mutációt; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 7. Az 1. igénypont szerinti HIV-1 Rév proteint kódoló gén vagy a 2. igénypont szerinti protein, amely egy HIV-1 protein, és amely a 6. ábra szerinti vad típusú RÉV protein körülbelül 68-as és 90-es aminosav helyei között tartalmaz mutációt, vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 8. Az 1. igénypont szerinti gén vagy a 2. igénypont szerinti protein, amelyet az előzőekben leírt pcRexM2, pcRexM7 és pcRexM8-ból; az előzőekben leírt M6, M7 és Ml3-ból; és az előzőekben leírt pm 10-ből származó génből vagy proteinből választunk ki; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 9. A 8. igénypont szerinti gén vagy protein vagy fragmensük vagy származékuk az előzőekben leírt pM 10-ből.
- 10. A 8. igénypont szerinti gén vagy protein vagy fragmensük vagy származékuk az előzőekben leírt pcRexM7-ből.
- 11. Egy gén, amely egy proteint kódol vagy egy protein, amely transzdominánsan represszálja a HTLV rex gén fenotípusos expresszióját; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 12. A 11. igénypont szerinti gén vagy protein, amely represszálja a HTLV-I rex gén fenotípusos expresszióját; vagy funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 13. A 11. igénypont szerinti gén, amely egy HTLV-I rex proteint kódol vagy all. igénypont szerinti protein, amely egy HTLV-I Rex protein és az 1. ábra szerinti vad típusú Rex protein körülbelül 22-es és 101-es aminosav helyei között mutációt tartalmaz; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 14. A 11. igénypont szerinti gén vagy protein, amelyet az előzőekben leírt pcRexM2, pcRexM7, pcRexM8, pcRexM17 és pcRexl3A15; az előzőekben leírt M6, M7 és Ml3 génekből vagy proteinekből, vagy ezekből származókból választunk ki; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 15. A 14. igénypont szerinti gén vagy protein vagy fragmensük vagy származékuk az előzőekben leírt pcRexM7-ből.
- 16. Gén, amely egy proteint kódol vagy egy protein, amelyek transzdominánsan represszálják a HIV-1, HIV-2, SIV, EIAV, visna vírus vagy marha immunhiányos rév gén fenotípusos expresszióját; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 17. A 16. igénypont szerinti gén vagy protein, amelyek represszálják a HIV-1 és HIV-2 rév gén fenotípusos expresszióját; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 18. A 16. igénypont szerinti gén vagy protein, amely a HIV-1 rév gén fenotípusos expresszióját represszálja; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 19. A 16. igénypont szerinti HIV-1 Rév proteint kódoló gén vagy a 16. igénypontnak megfelelő protein, amely HIV-1 Rév protein, amelyek a 6. ábra szerinti vad típusú Rév protein körülbelül 68-as és 90-es ami25HU 211 530 A9 nosav helyei között mutációt tartalmaznak; vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 20. A 6. vagy 13. igénypont szerinti gén, amely mutációt tartalmaz a körülbelül 82 és körülbelül 97 közötti vagy a körülbelül 59, 60, 64, 65, 119, 120 vagy 121 aminosav-helyzetben.
- 21. A 6. vagy 13. igénypont szerinti gén, amely mutációt tartalmaz a körülbelül 87 és körülbelül 94 közötti aminosav-helyzetben.
- 22. A 7. vagy 19. igénypont szerinti gén, amely mutációt tartalmaz a körülbelül 78 és körülbelül 86 közötti aminosav-helyzetben.
- 23. A 7. vagy 19. igénypont szerinti gén, amely mutációt tartalmaz a körülbelül 78 és körülbelül 83 vagy 84 közötti aminosav-helyzetben.
- 24. A 16. igénypont szerinti gén vagy protein, amelyet az előzőekben leírt ρΜΙΟ, ρΔ9/14 és ρΔ10/14; az előzőekben leírt pM21, pM22, pM27, pM28, pM29 és pM32 génekből vagy proteinekből választunk ki vagy származtathatók; ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka.
- 25. A 24. igénypont szerinti gén vagy protein, vagy fragmensük vagy származékuk, amelyet az előzőekben leírt ρΜΙΟ, pM21 és pM32 génből vagy proteinből választunk ki.
- 26. A 24. igénypont szerinti gén vagy protein vagy fragmentuma vagy származéka az előzőekben leírt pM 10-ből.
- 27. Eljárás az 1., 11. és 16. igénypontok bármelyike szerinti gén előállítására, amely a következőkből áll: a megfelelő vad típusú génnek a megfelelő expressziós rendszerből való izolálása, ennek a génnek a bevitele egy megfelelő klónozó rendszerbe, a kívánt mutáció bevitele a génbe és az eredményként kapott és a kívánt mutált gén kinyerése a kívánt mutációt tartalmazó kiónokból.
- 28. Eljárás a 2., 11. és 16. igénypontok bármelyike szerinti protein előállítására, amely magában foglalja az 1„ 11. és 16. igénypontok bármelyike szerinti mutáns gén expresszióját és amplifikációját egy megfelelő expressziós és amplifikáló rendszerben, valamint az eredményként kapott termék abból való kinyerését.
- 29. Gyógyszerkészítmény, amely az 1., 11. és 16. igénypontok bármelyikének megfelelő gént vagy a 2., 11. és 16. igénypontok bármelyikének megfelelő proteint vagy ezek funkcionális fragmentumát vagy származékát olyan megfelelő, gyógyászatilag alkalmas vivőanyaggal vagy hígítóanyaggal együtt tartalmazó formában tartalmazza, amellyel elérhető a kívánt profilaktikus vagy más terápiás hatás.
- 30. Vírusfertőzések kezelési módszere, amely magában foglalja az 1., 11. és 16. igénypontok bármelyike szerinti gén vagy a 2., 11. és 16. igénypontok bármelyike szerinti protein vagy ezek funkcionális fragmentuma vagy származéka kívánt profilaktikus vagy terápiás célra megfelelő formában való beadását egy ilyen kezelést igénylő betegnek.
- 31. A HIV-1 replikáció gátlásának módszere oly módon, hogy a HIV-1-gyei fertőzött sejtbe a HIV-1 Rév egy transzdomináns represszorát visszük be.
- 32. Vektor, amely az 1., 11. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti gént, vagy ennek funkcionális fragmentumát vagy származékát olyan megfelelő formában tartalmazza, amely alkalmas a funkcionális forma bejuttatására.
- 33. Egy proteint kódoló gén, amely transzdominánsan represszálja több, mint egy vírusfaj funkcionálisan egyenértékű génjeinek expresszióját, az így kódolt protein, ezt a gént tartalmazó gyógyszerkészítmény és ezt a gént tartalmazó vektor a találmány szerint, lényegében az előzőekben leírtak szerint hivatkozással bármelyik példára.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US35687889A | 1989-05-25 | 1989-05-25 | |
| GB898915602A GB8915602D0 (en) | 1989-07-07 | 1989-07-07 | Multivalent repressor of gene function |
| GB898924396A GB8924396D0 (en) | 1989-10-30 | 1989-10-30 | Multivalent repressor of gene function |
| US44267089A | 1989-11-29 | 1989-11-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU211530A9 true HU211530A9 (en) | 1995-11-28 |
Family
ID=27450368
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU904245A HU217091B (hu) | 1989-05-25 | 1990-05-23 | HIV-replikáció transzdomináns represszorait kódoló mutáns gének és represszorok, valamint rekombináns eljárás az előállításukra |
| HU95P/P00249P HU211530A9 (en) | 1989-05-25 | 1995-06-19 | Multivalent repressor of gene function |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU904245A HU217091B (hu) | 1989-05-25 | 1990-05-23 | HIV-replikáció transzdomináns represszorait kódoló mutáns gének és represszorok, valamint rekombináns eljárás az előállításukra |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0406557B1 (hu) |
| JP (2) | JP3126378B2 (hu) |
| KR (1) | KR100215949B1 (hu) |
| AT (1) | ATE207122T1 (hu) |
| AU (2) | AU648256B2 (hu) |
| CA (1) | CA2032158C (hu) |
| DE (1) | DE69033829T2 (hu) |
| DK (1) | DK0406557T3 (hu) |
| ES (1) | ES2166748T3 (hu) |
| FI (1) | FI110437B (hu) |
| HU (2) | HU217091B (hu) |
| IL (1) | IL94482A (hu) |
| WO (1) | WO1990014427A2 (hu) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2767078B2 (ja) * | 1990-10-17 | 1998-06-18 | アメリカ合衆国 | Ｈｉｖ―１の分子クローンとその使用法 |
| US5534408A (en) * | 1993-09-24 | 1996-07-09 | University Of Massachusetts Medical Center | 2-deoxystreptamine aminoglycoside inhibition of HIV RRE/Rev binding |
| US5650306A (en) * | 1993-06-07 | 1997-07-22 | University Of Michigan | Recombinant nucleic acids for inhibiting HIV gene expression |
| AU7263994A (en) * | 1993-08-06 | 1995-02-28 | Kai Juhani Ernst Krohn | Novel mutated human and simian immunodeficiency viruses and vaccines containing said viruses |
| FR2713651B1 (fr) * | 1993-12-13 | 1996-04-19 | Transgene Sa | Nouvelle composition pour un effet antiviral. |
| US5981258A (en) * | 1993-12-13 | 1999-11-09 | Transgene S.A. | Composition of trans-dominant variants of viral proteins for obtaining an antiviral effect |
| US6228369B1 (en) | 1993-12-13 | 2001-05-08 | Transgene S.A. | Composition of trans-dominant variants of viral proteins for obtaining an anti-viral effect |
| DE69712731T2 (de) | 1996-01-26 | 2003-02-06 | Virco Nv | Verfahren zur überwachung der chemotherapie von hiv-positiven patienten basierend auf der phenotypischen medikamentempfindlichkeit vom hiv stamm des patienten |
| WO1997046673A2 (en) * | 1996-06-06 | 1997-12-11 | Novartis Ag | Inhibition of hiv-1 replication by antisense rna expression |
| US6776986B1 (en) | 1996-06-06 | 2004-08-17 | Novartis Ag | Inhibition of HIV-1 replication by antisense RNA expression |
| IL127215A0 (en) * | 1996-06-06 | 1999-09-22 | Novartis Ag | Vectors comprising sar elements |
| EP1144621A2 (en) * | 1998-12-22 | 2001-10-17 | Subsidiary N0. 3, INC. | Genetic suppressor elements against human immunodeficiency virus |
| WO2000040606A2 (en) * | 1999-01-06 | 2000-07-13 | The Regents Of The University Of California | Modulation of hiv replication using sam68 |
| WO2004064501A2 (en) | 2003-01-23 | 2004-08-05 | Gala Design Inc. | Transgenic animals expressing transdominant negative retroviral nucleic acids and proteins |
| JP5653549B1 (ja) | 2014-05-30 | 2015-01-14 | 株式会社松風 | イオン徐放性歯科用レジン系仮封材組成物 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4935372A (en) * | 1986-05-20 | 1990-06-19 | Dana Farber Cancer Institute | Art nucleotide segments, vectors, cell lines methods of preparation and use |
-
1990
- 1990-05-23 EP EP90109892A patent/EP0406557B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 ES ES90109892T patent/ES2166748T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 HU HU904245A patent/HU217091B/hu unknown
- 1990-05-23 IL IL9448290A patent/IL94482A/xx not_active IP Right Cessation
- 1990-05-23 DK DK90109892T patent/DK0406557T3/da active
- 1990-05-23 KR KR1019910700090A patent/KR100215949B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1990-05-23 AU AU57388/90A patent/AU648256B2/en not_active Expired
- 1990-05-23 JP JP02507933A patent/JP3126378B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 WO PCT/EP1990/000831 patent/WO1990014427A2/en active IP Right Grant
- 1990-05-23 AT AT90109892T patent/ATE207122T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-05-23 DE DE69033829T patent/DE69033829T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-05-23 CA CA002032158A patent/CA2032158C/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-01-24 FI FI910371A patent/FI110437B/fi active
-
1994
- 1994-07-20 AU AU67573/94A patent/AU678478B2/en not_active Expired
-
1995
- 1995-06-19 HU HU95P/P00249P patent/HU211530A9/hu unknown
-
1997
- 1997-11-19 JP JP31805597A patent/JP3159671B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU6757394A (en) | 1994-11-17 |
| AU678478B2 (en) | 1997-05-29 |
| HU217091B (hu) | 1999-11-29 |
| FI110437B (fi) | 2003-01-31 |
| JPH04500009A (ja) | 1992-01-09 |
| KR920701440A (ko) | 1992-08-11 |
| JPH10165188A (ja) | 1998-06-23 |
| CA2032158A1 (en) | 1990-11-26 |
| EP0406557B1 (en) | 2001-10-17 |
| ES2166748T3 (es) | 2002-05-01 |
| HU904245D0 (en) | 1991-06-28 |
| JP3126378B2 (ja) | 2001-01-22 |
| HUT56135A (en) | 1991-07-29 |
| FI910371A0 (fi) | 1991-01-24 |
| KR100215949B1 (ko) | 1999-08-16 |
| IL94482A (en) | 2003-09-17 |
| DK0406557T3 (da) | 2002-02-11 |
| IL94482A0 (en) | 1991-03-10 |
| AU5738890A (en) | 1990-12-18 |
| WO1990014427A2 (en) | 1990-11-29 |
| DE69033829T2 (de) | 2002-04-04 |
| JP3159671B2 (ja) | 2001-04-23 |
| EP0406557A2 (en) | 1991-01-09 |
| WO1990014427A3 (en) | 1991-01-10 |
| EP0406557A3 (en) | 1991-05-02 |
| ATE207122T1 (de) | 2001-11-15 |
| AU648256B2 (en) | 1994-04-21 |
| CA2032158C (en) | 2009-09-15 |
| DE69033829D1 (de) | 2001-11-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ruben et al. | Structural and functional characterization of human immunodeficiency virus tat protein | |
| Ballaun et al. | Functional analysis of human T-cell leukemia virus type I rex-response element: direct RNA binding of Rex protein correlates with in vivo activity | |
| Green et al. | Mutational analysis of HIV-1 Tat minimal domain peptides: identification of trans-dominant mutants that suppress HIV-LTR-driven gene expression | |
| Malim et al. | Functional dissection of the HIV-1 Rev trans-activator—derivation of a trans-dominant repressor of Rev function | |
| Hope et al. | Effector domains of human immunodeficiency virus type 1 Rev and human T-cell leukemia virus type I Rex are functionally interchangeable and share an essential peptide motif | |
| Martin-Serrano et al. | Role of ESCRT-I in retroviral budding | |
| Malim et al. | Mutational definition of the human immunodeficiency virus type 1 Rev activation domain | |
| Qian et al. | Two functional domains of the influenza virus NS1 protein are required for regulation of nuclear export of mRNA | |
| US8197821B2 (en) | Human immunodeficiency virus integrase—Transportin—SR protein—protein interactions | |
| HU211530A9 (en) | Multivalent repressor of gene function | |
| Grassmann et al. | In vitro binding of human T-cell leukemia virus rex proteins to the rex-response element of viral transcripts | |
| Tiley et al. | Visna virus encodes a post-transcriptional regulator of viral structural gene expression. | |
| Hofacre et al. | Jaagsiekte sheep retrovirus encodes a regulatory factor, Rej, required for synthesis of Gag protein | |
| Böhnlein et al. | Transdominant repressors for human T-cell leukemia virus type I Rex and human immunodeficiency virus type 1 Rev function | |
| Ciminale et al. | Inhibition of human T-cell leukemia virus type 2 Rex function by truncated forms of Rex encoded in alternatively spliced mRNAs | |
| Narayan et al. | Functional domain structure of human T-cell leukemia virus type 2 rex | |
| Hofer et al. | Mutational analysis of the human T-cell leukemia virus type I trans-acting rex gene product | |
| US5871958A (en) | Mutant rev genes encoding transdominant repressors of HIV replication | |
| US5605802A (en) | Method for identifying agents which block infection of cells by HIV | |
| US6339150B1 (en) | Mutant rex genes encoding transdominant repressors of HIV/HTLV replication | |
| AU720284B2 (en) | Multivalent repressor of gene function | |
| US6987003B1 (en) | Mammalian stauffen and use thereof | |
| IE83555B1 (en) | Multivalent repressor of gene function | |
| WO1997001648A1 (en) | A novel human protein critical for hiv replication | |
| Kushtai | The role of c-fos proto-oncogene in regulation of MHC genes expression |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: NOVARTIS AG, CH Owner name: DUKE UNIVERSITY, US |