JP3126378B2 - 遺伝子機能の多価リプレッサー - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 1.分野 この発明は、ウイルス遺伝子発現の分野に関するもの
であって、より具体的にはHTLV−Ｉのrex（ビリオンタ
ンパク質発現の調節因子）遺伝子、およびHIV−１のrev
のようなその他のレトロウイルス種におけるこれと同等
な遺伝子の表現型の発現に関するものである。

2.発明の背景 ウイルス、特にヒト免疫不全１型ウイルス（HIV−
１）またはヒト白血病Ｉ型ウイルス（HTLV−Ｉ）のよう
なヒト・レトロウイルスは、極めて重篤な疾患の原因と
なる因子である。HIV−１の場合の後天性免疫不全症候
群（AIDS）、およびHTLV−Ｉの場合の成人Ｔ細胞白血病
（ATL）および熱帯性痙れん性パラペプシスとして知ら
れる非ガン状態がこれに該当する。HTLV−IIは、病因学
上、ある種の異型Ｔ細胞毛状細胞性白血病に関連してい
る。どちらのウイルス群も、DNAウイルスと同様に、そ
の複製周期が遺伝子発現の「早期」相および「後期」相
に分かれている。遺伝子発現の「早期」相は調節タンパ
ク質の発現によって特徴付けられるが、「後期」相では
構造タンパク質が合成される。

HTLV−Ｉゲノムは、Taxと呼ばれるウイルス転写の活
性化因子を暗号化している。HIV−１においてTaxに相当
するものはTatと呼ばれる。TaxおよびTatは、主として
ウイルス遺伝子発現のためのレトロウイルスLTR（末端
反復配列）に作用するようである。またHTLV−ＩはRex
と呼ばれるウイルス構造遺伝子発現の活性化因子を暗号
化している。機能的なRexタンパク質は、スプライスさ
れていないウイルスmRNAの感染細胞の核から細胞質への
移送を増大するのに働く。これらのmRNA種は、そこでウ
イルスのゲノムを組立て、構造タンパク質を暗号化す
る。ヒト免疫不全１型ウイルス（HIV−１）は、Revと呼
ばれる相同タンパク質を暗号化している。rev遺伝子生
産物は、HTLV−Ｉ系におけるRexと同様にHIV−１の構造
タンパク質の発現に絶対に必要である。

これに関してその根底に存在している理由は、rev遺
伝子の生産物（および他のウイルス種におけるこれに対
応する生産物）が、感染細胞におけるウイルスmRNA転写
物をスプライスする様式の選択に対して劇的な効果を有
していることである。RevおよびRexの場合、この効果は
転写後調節、即ち完全鎖長のmRNA転写物の細胞質への移
送促進によって達成され、それによってHIV−１のGagお
よびEnvのようなウイルス構造タンパク質の発現が開始
され、それと同時に調節タンパク質の発現が抑制され
（例えばRexについては、M.ヒダから、EMBO・ジャーナ
ル、７巻、［1988年］、519頁参照］、または調節され
る（例えばRevについては、M.H.マリムら、ネーチャ
ー、335巻、［1988年］、181頁参照）。したがってRev
は、ウイルス調節タンパク質（TatおよびRev等）を暗号
化している完全にスプライスされたHIV−1 mRNAの発現
には必要でない。

HIV−１における上記の誘導選択性は、Rev機能に必要
なRev応答要素（RRE）と呼ばれるRNA標的配列に起因す
る。RREは、HIV−1 env遺伝子内に存在する巨大な234ヌ
クレオチドRNAの二次構造と一致している。HTLV−Ｉに
おけるこれと同等の構造は、Rex応答要素（RexREまたは
RRX）と呼ばれる。Revは、配列に特異的な態様でRNAの
核放出を調節することが判明した最初のタンパク質であ
ろうと思われる。

Rexを例にとって説明すれば、HTLV−I gagおよびenv
遺伝子発現の調節の際のRexタンパク質の完全な機能に
は、少なくとも３種類の機能的に異なった活性要素、即
ち、核および核小体局在化（細胞質のすべてのタンパク
質合成部位から核へ移送され、その核小体領域で濃縮さ
れる能力）、ウイルスRNA（複数）におけるRexRE（RR
X）配列の特異的認識（直接的または間接的な）およびR
exRE配列を含む部分的にスプライスされたウイルスmRNA
種の核小体から細胞質への放出を実質上仲介しているこ
の調節タンパク質の、現在なお未知の活性であるRexエ
フェクター活性が必要である。

これらの完全なRex機能の要素活性を備えているRexタ
ンパク質（即ち、機能的ドメイン）における構造局在化
に関してこの発明以前に知られていることは、Rexのア
ミノ末端の最初の20アミノ酸でプラスに荷電しているペ
プチドドメインが核小体局在化に必要であるということ
だけである（H.シオミら、セル、55巻、［1988年］、19
7〜209頁）。

上記のように、HTLV−Ｉに対するrex遺伝子生産物お
よびHIV−１に対するrev遺伝子生産物は、いずれもウイ
ルスの複製に必要である（例えばHIVについては、E.タ
ーウイリガーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、62
巻、［1988年］、655頁参照）。RexおよびRevの決定的
な重要性は、それらがその一次構造の相違にもかかわら
ず、機能的に関連しており、またHTLV−I Rexは他のウ
イルス種、即ちHIV−１でもその機能を発揮できる事実
によって強調される（L.リムスキーら、ネーチャー、33
5巻、［1988年］、738頁］。即ち、たとえ −RevおよびRexがヌクレオチドおよびアミノ酸水準でな
んら有意な相同性を共有せず、 −RREのヌクレオチド配列、およびそのステム構造およ
びループ構造がHTLV−ＩのRexRE（RRX）と異なってお
り、 −RexおよびRevタンパク質の二次構造のコンピューター
による予測がなんら有意な相似性を示さず、 −Revタンパク質が結合するのと同じように、Rexタンパ
ク質がRREの同一部分へ結合しないようであっても、 それにもかかわらず、HIV−１系で、Revタンパク質をRe
xタンパク質で置き換えることが可能であり、さらにご
く最近HIV−2 Rev（Rev2）をHTLV−I RexおよびHIV−1
Revで置き換えることができ、また類似のHTLV−II調節
タンパク質をHTLV−I Rexで置き換えできることが判明
した。この相補性は、例えば機能的なRexタンパク質を
トランスで提供することによってrev欠損型HIV−１プロ
ウイルスを十分救援し得るものである。これに反して、
rex欠損型HTLV−Ｉプロウイルスを機能的なRevタンパク
質によって救援する逆置換はできないようである。即
ち、この点に関して完全な対称性はない。この互換性の
欠如に対する原理はまだ解明されていないが、恐らくは
標的RNA配列認識に必要なこれらのタンパク質の機能的
な態様の相違に関連するのであろう。

調節タンパク質における突然変異は、優性な負の表現
型を有する遺伝子生産物を野生型機能へ産生し得る（I.
ヘルスコビッツ、ネーチャー、329巻［1987年］、317
頁）。関連のない数種のウイルスで最近発見されたトラ
ンス優性リプレッサーとして知られる少数の優性な負の
突然変異体タンパク質の一群は、新しい型の抗ウイルス
剤であると言われる。遺伝子分析では、負の突然変異は
遺伝子機能の低下もしくは喪失を起こすものである。優
性な負の突然変異体は、変異されなかった（即ち、野生
型配列を有する）同一遺伝子の異なったコピーが好適に
機能することを防止するものである。これに反して、劣
性の負の突然変異は野生型の相手をそのように抑制しな
い。また優性突然変異の幾つかは、その変異体と野生型
遺伝子が同一染色体（DNAまたはRNA分子）上に位置して
いる場合に限り、野生型遺伝子を抑制する。この場合、
この抑制型突然変異を「シス−作用型」であると言う。
一方、ある優性突然変異では、対応する野生型遺伝子が
離れた染色体上に存在している場合でもこれを抑制し得
る。この型を「トランス−作用型」優性突然変異、また
は一層簡単にトランス優性突然変異として分類する。

これらの所謂トランス優性遺伝子の幾つかは、真核生
物またはヘルペスウイルスの転写因子の遺伝子に関連し
て報告された（I.A.ホープおよびK.ストラール、セル、
46巻、［1986年］、885頁、R.ゲンツら、サイエンス、2
43巻、［1989年］、1695頁、S.J.トリーゼンバーグら、
ジーンズ・アンド・デベロップメント、２巻、［1988
年］、718頁、A.D.フリードマンら、ネーチャー、335
巻、［1988年］、452頁）。すなわち、単純ヘルペスウ
イルス・トランス−活性化因子VP16のある種の欠失変異
体は過発現されるとVP16機能を抑制し、それによって正
常な許容細胞でのHSV−１の複製を阻止する。またレト
ロウイルスに関し、例えばHTLV−IIのTaxタンパク質に
ついて（W.ワックスマンら、サイエンス、235巻、［198
7年］、674頁）、またこの発明の優先日当日以後におい
て、HIV−1 tat遺伝子（M.グリーンら、セル、58巻、
［1989年］、およびgag遺伝子（D.トロノら、セル、59
巻、［1989年］、113頁）についてトランス優性突然変
異体が報告された。

これら２つの調節タンパク質の構成および機能におけ
る相違点から、Rex構造をRevタンパク質またはその既知
の突然変異体の構造と比較しても、ウイルスタンパク質
のトランス優性リプレッサーを産生し得る突然変異体を
選択する指針は全く提供されないことが分かる。

上記の概念の治療適用の意味は、遺伝子操作によって
優性な負の突然変異を作り出し、それによって得られた
遺伝子が、それが発現されると、野生型機能の活性を破
壊する突然変異体の調節タンパク質を暗号化しているこ
とによって、有害遺伝子生産物の生産もしくは過生産を
抑制することであろう（I.ヘルスコビッツ、ネーチャ
ー、329巻、［1987年］、219頁）。このようにウイルス
感染、例えばレトロウイルス感染状態では、不可欠な調
節遺伝子に類似の抑制因子、例えばrevまたはrex遺伝子
の抑制因子を組み立てることによって、対応するウイル
ス機能のトランス優性リプレッサーを提供することは極
めて望ましいように思われる。この研究方法、即ち1988
年に最初に提案されたウイルス感染処置のための研究方
法（D.バルチモア、ネーチャー、335巻、［1988年］、3
95頁］は「細胞内免疫」に必要な手段を提供するはずで
ある。

3.発明の要旨 HTLV−I rex遺伝子および対応するHIV−1 rev遺伝子
の遺伝子操作による優性転換体を作成した。その生産物
は、HTLV−Ｉ、HTLV−II、またはHIV−１の複製をそれ
ぞれ阻止した。またrexまたはrev遺伝子の遺伝子操作に
よるこれらの優性転換体の幾つかの生産物は、HTLV−Ｉ
（および若干のHTLV−II例）およびHIV−１（および若
干のHIV−２およびSIV例）の複製を双方とも阻止した。

この成績は、１種類以上のウイルス種で作用するウイ
ルス性リプレッサー生産物、即ち１種類以上のウイルス
種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現を抑制するトラ
ンス優性な遺伝子生産物が生じることを報告した最初の
ものであろうと思われる。

このようにこの発明は、１種類以上のウイルス種の機
能的に等価な遺伝子の表現型発現をトランス優性に抑制
し、それによって１種類以上のウイルス種の複製を阻止
するタンパク質を暗号化している遺伝子、特に以下に報
告するpcRexM2、pcRexM7およびpcRexM8、M6、M7およびM
13、およびpM10における突然変異遺伝子に関するもので
ある。

この発明はまた、HTLV−Ｉおよび／またはHTLV−IIの
rex遺伝子の表現型発現をトランス優性に抑制するタン
パク質を暗号化している遺伝子、ならびにHIV−１およ
び／またはHIV−２および／またはSIVのrev遺伝子の表
現型発現をトランス優性に抑制するタンパク質を暗号化
している遺伝子に関するものであって、特に以下に報告
するpcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM17およびpcRex
13Δ15、pM10、ｐΔ9/14、ｐΔ10/14、pM21、pM22、pM2
7、pM28、pM29およびpM32、およびM6、M7およびM13にお
ける突然変異体遺伝子に関するものである。

この発明はまた、好適な発現系から対応する野生型遺
伝子を単離し、この遺伝子を好適なクローニング系へ加
え、所望の突然変異を該遺伝子へ導入し、所望の突然変
異を保有するクローンから、生じた突然変体異遺伝子を
回収することを含むこれらの遺伝子の生産方法に関す
る。この発明はまた、好適な発現系および増幅系で上記
の突然変異遺伝子を発現し、これを増幅して、発現した
生産物を回収することを含む上記のタンパク質の生産方
法に関する。

この発明はまた、１種類以上のウイルス種の機能的に
等価な遺伝子の表現型発現をトランス優性に抑制し、そ
れによって１種類以上のウイルス種の複製を阻止するタ
ンパク質、特に以下に報告するpcRexM2、pcRexM7および
pcRexM8、M6、M7およびM13、およびpM10の突然変異体タ
ンパク質に関するものである。

この発明はまた、HTLV−Ｉおよび／またはHTLV−IIの
rex遺伝子の表現型発現をトランス優性に抑制するタン
パク質、およびHIV−１および／またはHIV−２および／
またはSIVのrev遺伝子の表現型発現をトランス優性に抑
制するタンパク質に関するものであって、特に以下に報
告するpcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM17およびpcR
ex13Δ15、pM10、ｐΔ9/14、ｐΔ10/14、pM21、pM22、p
M27、pM28、pM29およびpM32、およびM6、M7およびM13の
突然変異体タンパク質に関する。

またこの発明は、生体内または生体外で、上記の遺伝
子を標的哺乳動物細胞へ機能的な状態で送達するのに好
適な形で含んでいるベクター、例えばレトロウイルスベ
クターまたはプラスミドベクターに関する。

またこの発明は、上記の遺伝子またはタンパク質を、
所望の予防的または治療的効果を達成する好適な形で、
例えば患者の身体から採取し、再挿入する前に生体外で
処理した細胞の形で、製薬上許容し得る担体または希釈
剤とともに含有する医薬組成物に関する。

またこの発明は、上記の遺伝子またはタンパク質を、
所望の予防的または治療的効果を達成するのに好適な形
で、例えば患者の体から採取し、再挿入する前に生体外
で処理した細胞の形で、そのような処置を必要とする対
象へ投与することを含んでなるウイルス感染の処置方法
に関する。

「処置」の語は、ウイルス感染の予防的および治療的
処置の意味であって、ここで「治療的」とはウイルス感
染を潜伏段階で安定化させることを含む。

またこの発明は、ここに定義した遺伝子、タンパク質
およびDNAセグメントの医薬品としての使用に関する。

またこの発明は、機能的な断片または誘導体、即ち機
能的に等価である断片または誘導体の形の上記の遺伝子
およびタンパク質に関する。「機能的な断片または誘導
体」の語は、インタクトな突然変異遺伝子またはタンパ
ク質の薬理学的活性と質的に同一で、量的に同一または
異なった、即ちインタクトな突然変異遺伝子またはタン
パク質の薬理学的活性より一層強いかまたは弱い、例え
ば約１％〜約10000％、特に約10％〜約1000％の薬理学
的活性を有する断片または誘導体を意味する。

またこの発明は、本明細書に示した遺伝子、タンパク
質およびDNAセグメントから誘導され、トランス優性
（即ち、上記の突然変異体RexまたはRevタンパク質で、
主としてRNA結合ドメイン）を真似ることができる低分
子量の抑制因子または中和モノクローナル抗体のような
抑制因子に関する。ここで低分子量とは約10kD以下の分
子量、ことに約1kD以下の分子量を意味する。

この発明はさらに、以下に挙げる諸態様に関する。

−第１および第２ドメインを含んでなるHIV−1 Rev機能
のトランス優性リプレッサー。ここで第１ドメインは野
生型HIV−1 Revの特異的結合機能を実質上保有し、第２
ドメインは野生型HIV−1 Revの活性化機能を保有せず、
また第２ドメインは１またはそれ以上の突然変異体によ
って野生型HIV−1 Revから修飾されたものであり、好ま
しくは第１ドメインは野生型Revのおよそのアミノ酸位
置10〜およそのアミノ酸位置68からなり、修飾された第
２ドメインは野生型Revのおよそのアミノ酸位置68〜お
よそのアミノ酸位置90から誘導され、ことに上記の１ま
たはそれ以上の突然変異は、野生型Revのおよそのアミ
ノ酸位置68とおよそのアミノ酸位置90の間、好ましくは
約78〜約86の間、特に約78〜約83または約84の間で起こ
るミスセンス変異または欠失変異であって、野生型HIV
−1 Revの第１ドメインの特異的結合機能は、実質上機
能的に残存し、特に以下に報告するリプレッサーpM10、
pM21、pM22、pM27、pM28、pM29およびpM32、および機能
的なその断片または誘導体である。

−野生型HIV−1 Revの特異的結合機能を実質上保有する
第１ドメインを含んでいるHIV−1 Rev機能のトランス優
性リプレッサー。このトランス優性リプレッサーは野生
型HIV−1 Revの活性化機能を有せず、好ましくは第１ド
メインは野生型Revのおよそのアミノ酸位置10〜およそ
のアミノ酸位置68を含んでおり、トランス優性リプレッ
サーは野生型Revのおよそのアミノ酸位置68〜少なくと
もおよそのアミノ酸位置90を欠いている、特に以下に報
告するリプレッサーｐΔ9/14およびｐΔ10/14、または
機能的なその断片または誘導体である。

−HTLV−I Rexタンパク質の機能のトランス優性リプレ
ッサーを暗号化しているDNAセグメント。このリプレッ
サーは、Rexタンパク質のエフェクター活性を有する野
生型Rexタンパク質のペプチドドメインにおいて、少な
くとも１種類のトランス優性な負の突然変異によってRe
xタンパク質の野生型から修飾されたものであり、この
リプレッサーは、Rexタンパク質の野生型形態の核小体
局在化活性を実質上保有しており、好ましくは野生型Re
xタンパク質のペプチドドメインが、およそのアミノ酸
位置59〜およそのアミノ酸位置121、特に59、60、64、6
5、119、120および121のアミノ酸位置の任意の１つに含
んでいるDNAセグメント、特に下記の突然変異体rex遺伝
子、M6、M7、M13、およびHTLV−I Rexタンパク質機能の
トランス優性な抑制を示すその変異体および誘導体の何
れかを含んでいるDNAセグメント。

−野生型形態から、好ましくはHIV−1 revタンパク質の
機能またはHTLV−II Rexタンパクの機能の何れかの抑制
能を保有するように修飾されたHTLV−I Rexタンパク質
機能の対応するトランス優性リプレッサー。

−（ｉ）−Rexタンパク質によって認識される調節応答
要素、および少なくとも１個の未使用のスプライス部位
（即ち、スプライス認識配列によって結合され、ただし
該mRNAからスプライスされたものではない領域またはイ
ントロン）を含んでいるmRNAを暗号化しているDNAセグ
メント、 −発現すると、核からのmRNAの放出を誘発するタンパ
ク質生産物を生産することが可能なrex遺伝子を暗号化
しているDNAセグメント、 −rex遺伝子を暗号化しているDNAセグメントおよびmR
NAを暗号化しているDNAセグメントによって形質転換さ
れ、rex遺伝子のタンパク質生産物発現能およびmRNA発
現能を保有する宿主を含んでなる遺伝子系を提供し、 （ii）この遺伝子系の細胞を含んでいる培養を、Rexタ
ンパク質の特異的抑制因子であることが疑われる因子が
細胞へ侵入するような条件下で、該因子と接触させ、 （iii）未使用のスプライス部位を含んでいるmRNAの核
からの放出に対するこの因子の効果を測定し、 （iv）スプライス部位を使用したmRNAのスプライス形態
の核からの放出に対する該因子の効果を測定し、 それによって未使用のスプライス部位を含んでいるmRNA
の放出が低下し、それと同時にmRNAのスプライス形態が
低下しなければ、該因子がHTLV−I rex遺伝子の活性ま
たはrex遺伝子生産物の活性の特異的な抑制因子、即
ち、Rexタンパク質によって認識される、好ましくはHTL
V−Ｉ、HTLV−IIおよびHIV−１から選ばれたウイルスの
mRNAから誘導されたmRNA調節要素であることを示す 段階を含んでなるRexタンパク質の遺伝子活性化機能の
特異的抑制因子の同定方法。

−未使用のスプライス部位を含んでいるmRNAで暗号化さ
れた第１タンパク質の生産水準を測定することによっ
て、好ましくは未使用のスプライス部位を含んでいるmR
NAの放出の低下を検出し、mRNAのスプライス形態で暗号
化された第２タンパク質の生産水準を測定することによ
って、好ましくはmRNAのスプライス形態の放出の増大を
検出する上記の同定方法。

−調節応答要素およびスプライス部位を含んでいるmRNA
が、RexおよびTaxタンパク質のコード領域、完全なenv
遺伝子、Rex応答要素および３′LTR全体を含んでいるHT
LV−Ｉプロウイルスの３′末端を含んでなるプラスミ
ド、好ましくは下記に説明するプラスミドpgTAX−LTRに
よって暗号化されており、好ましくはrex遺伝子をプラ
スミドpRexへ提供することからなる上記の同定方法。

−プラスミドpgTAX−LTR。

−Rexタンパク質によって認識される調節応答要素を含
んでいるmRNA、および少なくとも１個の未使用のスプラ
イス部位を暗号化しているDNAセグメント、 −発現されると、核からのmRNAの放出を誘発するタン
パク質生産物を生産することが可能なrex遺伝子を暗号
化しているDNAセグメント、 −rex遺伝子を暗号化しているDNAセグメント、および
mRNAを暗号化しているDNAセグメントによって形質転換
された細胞であって、rex遺伝子のタンパク質生産物発
現能およびmRNA発現能を保有する宿主細胞を含有する容
器 を含んでなる上記の同定方法によってRexタンパク質の
遺伝子活性化機能の特異的抑制因子を同定するためのス
クリーニング用試薬キット。

−HIV−１、HTLV−Ｉ、またはHTLV−IIウイルスのうち
の１つを複製する能力を有する細胞へ上記のDNAセグメ
ントを導入して、該DNAセグメントを発現し、HTLV−I R
ex機能のトランス優性リプレッサーを生産することを含
むこれらのウイルスの複製を抑制する方法。

−HIV−１で感染した細胞へHIV−1 Rev機能のトランス
優性リプレッーを導入することを含むHIV−１、HIV−２
およびSV、特にHIV−１の複製の抑制方法。

4.図面の説明 ［4.1］5.1および6.1項のための図面 第１図:HTLV−I rexのヌクレオチドおよびアミノ酸配
列［オリゴヌクレオチドによって置換されたアミノ酸位
置（１）（アミノ酸位置87、88、89）および（２）（ア
ミノ酸位置94）、およびアミノ酸位置82、90、91、97を
番号で示した］。完全配列は567個のヌクレオチドを含
んでおり、189個のアミノ酸を暗号化している。

第1A図:HTLV−I rex遺伝子へ導入した29ケ所の突然変
異の位置。HTLV−I rex遺伝子は189個のアミノ酸タンパ
ク質を暗号化している。部位特異的突然変異誘発法を用
い、特定のアミノ酸残基でミスセンス置換を導入し（枠
で囲んで示す）、rex遺伝子内の位置にしたがってそれ
ぞれ命名した。

第2A図:Rex免疫沈降 Rex免疫沈降後、30種のrex突然変異体のうち７種のSD
S/ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析（pcRexM2、pcR
exM7、pcRexM8、pcRexM13、pcRexM14、pcRexM17およびp
cRex13Δ15は、なおRexタンパク質を生産していること
が判る）。

A.pgtat（Rex抗体の陰性対照） B.pcRex C.pcRexM2 D.pcRexM7 E.pcRexM8 F.pcRexM13 G.pcRexM14 H.pcRexM17（このレーンにおける低分子量は、恐らく例
えばリン酸化によるこのタンパク質の修飾の変化に起因
するものであろう） I.pcRex13Δ15 第2B図：突然変異体の生物学的表現型 第2A図関連、Tat免疫沈降後。

A.pgtat＋pXF3 B.pgtat＋pcRev C.pgtat＋pcRex D.pgtat＋pcRexM2 E.pgtat＋pcRexM7 F.pgtat＋pcRexM8 G.pgtat＋pcRexM13 H.pgtat＋pcRexM14 I.pgtat＋pcRexM17 K.pgtat＋pcRex13Δ15 第2C図：第2B図関連（幾つかのRex突然変異体、即ちp
cRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM14、pcRexM17および
pcRex13Δ15は、野生型Rexよりもトランス優性である） A.pgtat＋pXF3＋pXF3 B.pgtat＋pcRex＋pXF3 C.pgtat＋pcRex＋pcRexM2 D.pgtat＋pcRex＋pcRexM7 E.pgtat＋pcRex＋pcRexM8 F.pgtat＋pcRex＋pcRexM13 G.pgtat＋pcRex＋pcRexM14 H.pgtat＋pcRex＋pcRexM17 I.pgtat＋pcRex＋pcRex13Δ15 第2D図：第2B図関連（幾つかのRex突然変異体、即ちp
cRexM2、pcRexM7、pcRexM8およびpcRexM13は、野生型Re
vよりも部分的にトランス優性である） A.pgtat＋pXF3＋pXF3 B.pgtat＋pcRev＋pXF3 C.pgtat＋pcRev＋pcRexM2 D.pgtat＋pcRev＋pcRexM7 E.pgtat＋pcRev＋pcRexM8 F.pgtat＋pcRev＋pcRexM13 G.pgtat＋pcRev＋pcRexM14 H.pgtat＋pcRev＋pcRexM17 I.pgtat＋pcRev＋pcRex13Δ15 第３図：組み立てられたRex突然変異体 第４図:rex暗号配列を突然変異誘発するために合成さ
れた29種のオリゴヌクレオチド配列 ［4.2］5.2および6.2項のための図面 第５図:HIV−1 rev遺伝子へ導入された突然変異の位
置。HIV−1 rev遺伝子は予測した配列で示される116個
のアミノ酸タンパク質を暗号化している。revの２つの
暗号エキソン間の境界を示す（SP）。オリゴヌクレオチ
ドの指令による突然変異誘発によって、集中発生させた
点変異（pM）を導入した（枠で囲って示した残基）。こ
れらの突然変異は、Rev内のそれぞれの位置によって、
最もＮ−末端をpM1、最もＣ−末端をpM14と命名した。
導入された突然変異は、すべて２〜４個の隣接アミノ酸
に影響を与え、すべて（pM7を除いて）独特のBgl II部
位をrev遺伝子配列へ導入した。これらの導入部位は、
それに続くＮ−およびＣ−末端の欠失（ｐΔ）変異体の
組み立てを促進した。ｐΔ変異体は欠失の範囲によって
命名され、例えばｐΔ11/14は導入したpM11およびpM14
突然変異の間を欠失している。

第5A図:HIV−1 rev遺伝子へさらに導入されたミスセ
ンスおよび欠失変異の位置（−は欠失したアミノ酸）。

第６図:pcREVのDNAおよび対応するアミノ酸配列。

第７図：突然変異部位M1〜M14に対応するDNA配列。

第８図:HIV−1 revおよびtatのトランス−活性化因子
の免疫沈降。

第９図:HIV−１プロウイルスの救援検定。

第10図：間接免疫蛍光法によるRevおよび選ばれたRev
突然変異体の亜細胞位置測定。

第11Aおよび11B図:Rev突然変異体の優性な負の表現型
分析。

第12図:Rev機能の競合抑制。

第12A図:HIV−1 revトランス−活性化因子のドメイン
構造。116個のアミノ酸の完全鎖長タンパク質は、ウイ
ルスのenv遺伝子と極めて符合するイントロンによって
分割された２つのエキソンによって暗号化されている。
「結合」および「活性化」ドメインは、それぞれ（およ
そ）23〜56および78〜83の残基を含んでおり、ハッチン
グ枠で囲って示す。Ｓはスプライス部位。NLは、「Arg
に富んだ」RNA結合モチーフによってかなりの独自性を
共有している核局在化に重要な高塩基性領域。

［4.3］5.3および6.3項のための図面 第13図： （Ａ）HTLV−Ｉ Rexタンパク質のアミノ酸配列および
導入された25ケ所の点変異の個々の位置。それぞれ枠組
みで囲ったアミノ酸を暗号化しているヌクレオチドを除
き、アスパラギン酸−ロイシン−ジペプチドを暗号化し
たオリゴヌクレオチドで、枠組みのまま置き換えた。

（Ｂ）Rex応答性pgTAX−LTR発現ベクターの構造。Hind
III部位［マップ位置5013（M.セイキら、プロシーディ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシズ・オブ・ザ・USA、80巻、［1983年］、3618
〜3622頁）］から３′LTRまでのCR−1 HTLV−Ｉプロウ
イルスの３′末端を、pBC12/CMV発現ベクターへ挿入し
た。この断片は、Taxの２つの暗号エキソン（白枠）、
完全なenv遺伝子、およびRexRE（RRX）を含んだHTLV−
Ｉの３′LTRの全体を含んでいる（S.M.ハンリーら、ジ
ーンズ・アンド・デベロップメント、３巻、［1989
年］、1534〜1544頁）。

第14図： （Ａ）RexはpgTAX−LTRベクターによってHTLV−I Envタ
ンパク質の発現を活性化する（RevまたはIL−２は活性
化しない）。COS細胞の亜集密的培養を、pgTAX−LTRとp
REX（L.リムスキーら、ネーチャー、［1988年］、738
頁）、pREV（M.H.マリムら、ネーチャー、335巻、［198
8年］、181〜183頁）、またはpCMV−IL−２（B.R.カレ
ン、セル、46巻、［1986年］、973〜982頁）で、同時ト
ランスフェクトした。最終レーンは、pgTAX−LTRの存在
なしでpREXで細胞をトランスフェクトしたものである。
Envタンパク質生産を免疫沈降およびゲル電気泳動法に
よって分析した。分子量既知の標準の移動を左側に示し
た。

（Ｂ）rex突然変異体のRex機能分析。25種のrex突然変
異体（M1〜M18およびM21〜M27と命名（第13A図参照）、
M19およびM20と命名した突然変異体は組み立てなかっ
た）をpBC12/CMV発現ベクターへ挿入した後、それぞれp
gTAX−LTRと同時トランスフェクトし、実施例12に記載
したように、培養をRex特異的HTLV−I Envタンパク質発
現について分析した。

第15図:pgTAX−LTRと、不活性な（M1、M2、M6、M7、M
13）、または損傷された（M15）Rex突然変異体ベクタ
ー、または野生型pREX、pREVおよびpCMV−IL−２ベクタ
ーで同時トランスフェクトしたCOS細胞におけるHTLV−I
Env、TaxおよびRexタンパク質の免疫沈降による同時分
析。（Ａ）はEnv生産、（Ｂ）はTax生産、（Ｃ）は野生
型および突然変異体Rexタンパク質生産。

第16図:HTLV−I Rex突然変異体の免疫蛍光法による亜
細胞的位置確認。野生型、M6、M7およびM13Rexタンパク
質は発現細胞の核小体および核に局在している。これと
は対照的にM1 Rexタンパク質は細胞質でのみ検出される
が、M2タンパク質は細胞全体にわたって分布している。
M15突然変異体は発現細胞の核に局在しているが、野生
型Rexタンパク質とは対照的に核小体から排除されるよ
うである。

第17図： （Ａ）rex突然変異体の野生型Rexタンパク質機能の抑制
能の分析。各培養をpgTAX−LTR、pREXと、何れか１つの
Rex突然変異体（レーン１〜６）、pREX（レーン７）、p
REV（レーン８）、またはpCMV−IL−２（レーン９）で
同時トランスフェクトした。HTLV−I Env生産を第14図
と同様に分析した。

（Ｂ）HTLV−I rexトランス優性突然変異体は、HIV−1
Revタンパク質の機能を抑制する。細胞をpgTAT、pREV
と、pBC/CMV−IL−２、またはM6、M7、M13トランス優性
Rex突然変異体で同時トランスフェクトさせ、先端を切
り取られた72アミノ酸の形のTatタンパク質のRev誘導生
産について検定した（レーン２）。M6、M7、M13（レー
ン３〜５）はHIV−1 Revタンパク質を完全に抑制し、Ta
tタンパク質の安全鎖長の86アミノ酸の形だけが検出さ
れた。

（Ｃ）HTLV−Ｉのトランス優性Rex突然変異体は、Rev欠
損型HIV−１プロウイルスの複製のRex救援を阻止する。
グラフに示した倍数だけそれぞれ過剰のM1、M6、M7、M1
3突然変異体の存在で、rev欠損型HIV−１プロウイルス
プラスミドとpREXで細胞を同時感染させた。HIV−1 p24
Gagタンパク質の上清濃度を測定した。

5.詳細な説明 この発明を実施する際に用いる方法および技術は、従
来技術既知のものである。

使用するウイルス種は、HTLV−Ｉ、HTLV−II、SIV、H
IV−１、HIV−２のような、分類学上、明瞭なウイルス
種を意味する。この発明は、特にレトロウイルスの分
野、とりわけヒト・レトロウイルスに関する。

その発現を抑制することがこの発明の最終目的である
遺伝子は、好ましくはプロウイルスを活性化して、感染
性粒子、例えばHIV−１およびHIV−２のrevのような感
染粒子へと成熟をもたらす機能のような好ましくない特
性を暗号化している遺伝子である。

本明細書で使用するrevおよびRevとは、特に特定しな
い限り、それぞれHIV−1 revおよびHIV−1 Revを意味す
る。したがってHIV−２のようなその他のウイルス種の
これに対応するrevおよびRevの場合は、それぞれ「HIV
−2 rev（rev2）」および「HIV−2 Rev（Rev2）」等の
ように特定して示す。

本明細書で特にその製法を説明しない場合、出発物
質、または試薬として使用する化合物、ベクター、細胞
系等は、既知で一般に入手可能なものであり、あるいは
既知で一般に入手可能な材料から通常の方法で入手し
得、または既知で一般に入手可能な材料から通常の方法
でそれと等価のものを生産し得るものである。例えばRe
x遺伝子はHTLV−Ｉの任意の単離物から、そしてRev遺伝
子はHIV−１の任意の単離物から回収し得、pgTAX−LTR
は、例えばHUT102またはMT1から回収し得る。別法とし
て、遺伝暗号にしたがって遺伝子を化学合成により作り
出し、必要なアミノ酸配列を有するタンパク質を生産し
得る。RexまたはRev機能のトランス優性リプレッサー
は、標準的な組み換えDNA法、またはペプチド合成のた
めの標準的な化学的方法、またはこれらの方法の組み合
わせによって生産され、それらはすべて通常の方法であ
る。

［5.1］ この発明の一態様は、HTLV−ＩにおけるRex機能のト
ランス優性リプレッサー、特に機能的に等価な、ただし
構造的には無関係なHIV−１におけるRev機能に対しても
同様に有効であるHTLV−ＩにおけるRex機能のトランス
優性リプレッサーに関する。

具体的には、修飾したrex暗号配列を組み立て、これ
を発現させて、上記の特性を有することを発見した。

「オリゴヌクレオチドの指令による生体外突然変異誘
発系、見解２」［アマーシャム、英国（1988年）、コー
ドRPN.1523）］（以下、「アマーシャム・プロトコー
ル」と略称する）にしたがい、購入可能な突然変異誘発
系を用いて野生型rex暗号配列（第１図参照）を変化さ
せた。目的の発現ベクターの組み立ては （１）rex暗号配列を保有するバクテリオファージM13ベ
クターの作成、 （２）rex暗号配列の突然変異誘発、 （３）突然変異遺伝子の哺乳動物発現プラスミドへの再
クローン化 により、逐次、尾部形成段階を実施した。

欠失変異体１つを含んだ突然変異体30種を組み立て
た。29種の部位特異的突然変異の位置および性質を第３
図に示す。突然変異誘発に使用した対応するオリゴヌク
レオチドを第４図に挙げた。これらはすべてBgl II制限
部位を保有している。

rex暗号配列をプラスミドpcRex（pREX）から単離した
（L.リムスキーら、ネーチャー、335巻、［1988年］、7
38頁）。野生型rex遺伝子のための他の供給源も入手可
能である。このように、例えばHTLV−Ｉのgag、pol、en
vおよびtax遺伝子について報告された類似の方法（B.K.
デおよびA.スリニバサン、ヌクレイック・アシッズ・リ
サーチ、17巻、５号、［1989年］、2142頁）によって、
HUT102（TIB162）およびMT2（J.G.ソドロスキーら、サ
イエンス、225巻、［1984年］、381頁、I.ミヨシら、ネ
ーチャー、294巻、［1981年］、770頁、V.マンザリら、
プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、80巻、［198
3年］、1574頁）のような株化したHTLV−Ｉ感染細胞系
の全ゲノムから、例えばポリメラーゼ連鎖反応を利用し
てrex遺伝子をクローン化し得る。

tatおよびrev暗号配列を、プラスミドpgTatおよびpcR
ev（M.H.マリムら、ネーチャー、335巻、［1988年］、1
81頁）から単離した。別法として、それらは例えばλHX
BZ（エイズ・リサーチ・アンド・リファレンス・リアジ
ェント・プログラム（1989年６月、NIH）、カタログ番
号70）のようなHIVプロウイルスクローンから単離し得
る。

得られた各種のrex遺伝子の生物学的活性を、COS細胞
におけるさまざまな遺伝子発現によるHIV−1 revおよび
HTLV−I rex遺伝子生産物の作用に対し感度の高い検定
により試験した（グルツマンら、セル、23巻、［1981
年］、175頁）。またウイルス構造タンパク質の合成が
開始されると、RevおよびRexタンパク質は、何れも先端
が切り取られた形のHIV−1 Tat調節タンパク質の生産を
誘導する（M.H.マリムら、ネーチャー、335巻、［1988
年］、181〜183頁、L.リムスキーら、ネーチャー、335
巻、［1988年］、738〜740頁）。ゲノムHIV−1 tat遺伝
子を機能的なHIV−1 rev遺伝子またはHTLV−I rex遺伝
子と一緒に同時発現すると、Tatの先端が切り取られた7
2アミノ酸鎖長のエキソン１個形を暗号化したスプライ
スされてないtatmRNAの細胞質発現をもたらす。機能的
なRevまたはRexタンパク質が存在しない場合は、Tatエ
キソン２個形に対応する86アミノ酸の完全鎖長のTatタ
ンパク質の発現を起こす。このようにrevまたはrex機能
の活性トランスリプレッサーの存在は、72アミノ酸のTa
tタンパク質の生産の低下または消滅をもたらす。この
相違は、免疫沈降分析によって容易に可視化することが
できる。

第2C図に示したように、30種の突然変異体のうちの６
種の、即ちpcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM14、pcR
exM17およびpcRex13Δ15は、トランス優性なRexリプレ
ッサーを有していることが判明した。またpcRevの場合
でも（第2D図参照）、これと同一の様式、即ちpcRexM
2、pcRexM7、pcRexM8、および部分的にpcRexM13で認め
られ、トランス優性はHTLV−Ｉ遺伝子に限定されたもの
ではなく、幾つかの変異体では、両方の遺伝子に対して
トランス優性であり、即ちこの特別な例としてpcRexM
2、pcRexM7およびpcRexM18が挙げられることが判明し
た。

最初に得られた幾つかの結果から、最も成功した突然
変異はアミノ酸位置87〜94の間に局在していることが判
り、したがっておよそのアミノ酸位置82〜およびそのア
ミノ酸位置97の間に存在しているrex/rev遺伝子の部分
は、トランス優性はRex/Revリプレッサーの操作に特別
の意味を有するものであるようであり、さらに試験の結
果から、Rexタンパク質に対する突然変異の好ましい位
置の範囲は一層広く、即ち、少なくともＮ−末端に近い
アミノ酸位置22からＣ−末端に向かってアミノ酸位置10
1までに存在し得ることが分かった。

［5.2］ さらにHIV−１におけるRev機能に焦点を合わせた研究
で、トランス優性なrevリプレッサーが発見された。こ
れらの幾つかは少なくともHTLV−ＩまたはHTLV−IIにお
けるRex機能を抑制する可能性があるが、ここでは試験
しなかった。

これに反してこれらの幾つかは、少なくともHIV−２
およびSIV_macにおけるREV機能を同様に抑制することが
判明した。

膨大な突然変異分析によって、トランス活性化に不可
欠と思われるrev内の少なくともさらに２つの異なった
機能的ドメインの輪郭が明らかになった。これらのドメ
インは、Revタンパク質をその好適な標的基質へ向かわ
せる「結合ドメイン」と、結合反応の機能的な結果であ
る転写活性化を発揮させる「活性化ドメイン」からなる
ものと想定される。

したがってrev内の２つの機能的ドメインは、Revタン
パク質を、その細胞標的へ向かわせると思われる結合ド
メインと、構造タンパク質GagおよびEnvを暗号化してい
る、不完全にスプライスされたRNA（複数）の核放出を
可能にする活性化ドメインであると定義した。Revの活
性化ドメインの突然変異は、Rev機能のトランス優性な
抑制因子として作用する欠損型Revタンパク質の発現を
もたらす。そのような突然変異体が、培養においてトラ
ンスフェクトされた細胞で発現すると、HIV−１の複製
を著しく抑制し、したがって5.1項で得られた突然変異
体と同様にトランス優性である。

この第２の研究に関する詳細な情報は、後述する6.2
項からも明白である。それによって発見されたトランス
優性な突然変異体はpM10、ｐΔ9/14、ｐΔ10/14（実施
例４〜11参照）、およびpM21、pM22、pM27、pM28、pM2
9、pM32（実施例11aおよび11b参照）であり、ここでpM1
0はHIV−1 rev遺伝子機能の抑制に有効であるばかりで
なく、HIV−2 revおよびSIV_macrev遺伝子機能の抑制に
もまた有効である。

上記の９種類のトランス優性な突然変異体のうち、好
ましいものはpM10、pM21、pM32であって、特にpM10が好
ましい。

［5.3］ 5.1項と同様にHTLV−ＩにおけるRex機能に焦点を合わ
せたもう一つの研究でも、トランス優性なrexリプレッ
サーが発見され、それによってRex活性の検出を可能と
する方法が開発された。この検出方法は、他のウイルス
または宿主細胞機能を一般に妨害することなく、Rex機
能の特異的抑制因子を同定するのに有用である。このRe
x抑制因子の検出方法は、調節要素、例えばRexRE（RR
X）を含むmRNAのスプライスされない形を暗号化してい
るRex応答性「リポーター」遺伝子を含む遺伝子系を利
用する。この系では、Rex機能を提供するタンパク質
が、このスプライスされていないmRNAを細胞核から細胞
質へ放出するのを誘導する。Rex機能が存在しない場合
は、このmRNAは上記のように細胞質へ放出される前にス
プライスされる。この遺伝子系を含んだ細胞が、Rex機
能の抑制因子であると疑われる因子と接触すると、この
因子によるHTLV−I Rex機能の特異的抑制は、この特有
なmRNAのスプライスされない形の核放出の減少によって
示されるが、同じmRNAのスプライスされた形の核放出の
減少を伴わない。この方法は、例えばHTLV−I Rexタン
パク質の化学的抑制因子（例えば突然変異体RexまたはR
evタンパク質中のトランス優性なドメインを真似ること
ができる抑制因子、例えば低分子量の化学的抑制因子）
およびRexリプレッサーとして作用するRexのトランス優
性な突然変異体形を検出するのに有用である。

rex遺伝子のトランス優性な負の突然変異を同定する
ため、Rexタンパク質の直線状配列の全体にわたってさ
まざまな部位で２または３個のアミノ酸セグメントを変
化させる一連の点突然変異を再び作成し、これらの突然
変異体の中で数個のHTLV−I Rexタンパク質機能のトラ
ンス優性リプレッサーを同定した。そのうちの幾つか
は、HTLV−II Rexおよび／またはHIV−1 Revタンパク質
機能を追加的にトランス優性に抑制し、したがってこれ
らは、5.1項で発見された幾つかの突然変異体と同様
に、１ウイルス種の機能的に等価な遺伝子の表現型発現
を抑制した。

したがってこの発明はまた、前記の３項で示した数段
階からなるRexタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的
な抑制因子を同定する方法に関する。前述のように、HT
LV−I Rexタンパク質はHIV−1 Revタンパク質の機能を
置き換えることができる。そのうえRexはまた、類似のH
TLV−II調節タンパク質を置き換えできることが分かっ
た。このように、Rexによって認識される応答要素と少
なくとも１個の好適な未使用のスプライス部位とを保有
する、これら３種のウイルスの少なくとも何れか１つに
由来するmRNAをこの方法に使用することができる。

好ましくは応答要素およびスプライス部位を含んでい
るmRNAは、RexおよびTaxタンパク質のコード領域、完全
なenv遺伝子、Rex応答要素RexRE（RRX）および３′LTR
全体からなるHTLV−Ｉプロウイルスの３′末端を含んだ
プラスミドによって暗号化されている。そのようなプラ
スミドの例は、pgTAX−LTRである。野生型rex遺伝子コ
ピーに対する突然変異体rex遺伝子のコピー比を調節す
る必要がある突然変異体分析では、便宜上、pgTAX−LTR
上のrex遺伝子を劣性の負の突然変異によって失活さ
せ、pREXと命名された別のプラスミドで活性rex遺伝子
をこの系に提供する。然しながら、例えば化学物質を試
験する場合は、この系に必要なmRNAとして、活性rex遺
伝子が同一のプラスミドまたは別のベクターDNAで提供
されるはずである。またこの活性rex遺伝子は、この発
明に使用した株とは別のHTLV−Ｉ株から単離された天然
配列の変異体を含んでいるかもしれず、あるいは発現し
て、上記のmRNAの核からの放出を誘導することを含め、
Rexタンパク質の遺伝子活性化機能を提供するタンパク
質生産物を生産することができる何か別のrex遺伝子の
突然変異形であるかもしれない。

またレトロウイルスの機能的ゲノム全体を暗号化した
DNAセグメントをこの遺伝子系の一部として使用するこ
とによって、上に挙げた遺伝子系の要素を提供すること
もできる。これは感染細胞へ適用できる。然し、安全性
の理由と便宜性のため、この遺伝子系は好ましくは感染
性ウイルスを生産することはできない。このことは、ど
の感染性ウイルスの生産にも不可欠な、少なくとも１ウ
イルス活性の発現から、ある遺伝子要素の使用を防止す
る遺伝的欠損系へ設計することによって達成される。こ
れは、例えば少なくとも１ウイルス遺伝子の一部をその
系から省くことにより、あるいはその他の突然変異によ
り達成し得る。

好ましくはrex遺伝子によって、またmRNAを暗号化し
たDNAセグメントによって形質転換された宿主細胞の例
として、前記のプラスミドベクターでトランスフェクト
されたCOS細胞が挙げられる。即ち、本明細書で用いる
「形質転換」の語は、「トランスフェクション」の語を
包含し、感染性因子、特にウイルスを暗号化しているベ
クターDNAを含んだ遺伝子の形質転換を示す。トランス
フェクションの後、そのようなベクターは、ついで培養
中の少数の形質転換細胞から感染性ウイルス粒子によっ
て他の多数の細胞へ広がることができ、それによって対
象遺伝子を発現する大量の宿主細胞試料を提供する。し
かもこの遺伝子系における宿主細胞の形質転換は、安定
な組み立て物を生じる必要はなく、安定な遺伝子発現
系、もしくは一過性の遺伝子発現系を利用して、必要な
mRNAおよびrex遺伝子を提供すればよい。したがって多
くの既知の発現系が、この発明方法による抑制因子の同
定に使用し得る。

この方法では、未使用のスプライス部位を含んだmRNA
の放出が減少するが、それと一緒にこのmRNAのスプライ
ス形の放出が減少しなければ、その因子が、HTLV−I re
x遺伝子活性またはrex遺伝子生産物活性の特異的な抑制
因子であることを示す。この発明方法を使用することに
よって特異的な抑制因子であることが判明した化学因子
の場合、その作用形式は、原則としてmRNAの転写または
翻訳の特異的な抑制を含み得る。然しながら一層可能性
のある作用形式は、核小体の局在化、Rex応答要素の認
識またはRexエフェクター機能等を含んだRexタンパク質
活性の１またはそれ以上の特異的な抑制である。

都合よいことに、未使用のスプライス部位を含んだmR
NAの核放出の減少は、第１タンパク質の生産水準を測定
することによって検出され、この第１タンパク質は未使
用のスプライス部位を含むmRNAによって暗号化されてい
る（即ち、mRNAのスプライスされていない形態だけがこ
の第１タンパク質を暗号化している）。そしてmRNAのス
プライスされた形の核放出の増大は第２タンパク質の生
産水準を測定することによって検出され、この第２タン
パク質は、このmRNAのスプライスされた形によって暗号
化されている。

好ましくはこのmRNAはスプライスされない形で、HTLV
−I Envタンパク質を暗号化している。このmRNAをスプ
ライスすると、もう一つのHTLV−Ｉタンパク質であるTa
xを暗号化した一層短いmRNAが生じる。例えば実施例12
および13において、RexRE（RRX）要素を保有しているス
プライスされないmRNAの核放出は、Envタンパク質の発
現によって検出される。さらに、Rex機能の抑制から生
じたスプライスされないmRNAのそのような放出の抑制
は、Envタンパク質生産の減少によって検出される。然
しながらこの減少は、ある因子のウイルスまたは宿主に
対するある種の一般的な毒性から生じたものかも知れな
いから、rex遺伝子機能の特異的な抑制は、Env発現の減
少と同時に、HTLV−I Taxタンパク質の生産が減少しな
いことを反映しているmRNAのスプライスされた形の放出
の減少が起こらないことによって示される。したがって
好ましくはHTLV−I Env、TaxおよびRexタンパク質発現
の同時分析を実施する。

例えば実施例12および13では、EnvおよびTaxタンパク
質の発現を、好適な抗体との免疫沈降と、それによって
生じた沈降物の電気泳動分析によって測定する。別法と
して、例えばRex機能の特異的抑制について試料の大規
模スクリーニングのため、EnvおよびTaxについて、例え
ば酵素結合免疫検定法（ELISA）、またはスプライス形
およびスプライスされない形の発現をもたらす何か一層
都合よい別の生産物を提供する遺伝子操作によるmRNAの
変形等が挙げられる。例えばmRNAを変化させて、エシェ
リキア・コリ−β−ガラクトシダーゼのような、加水分
解すると発色する無色の基質の添加によって検出できる
酵素を暗号化することも可能である。env遺伝子の代わ
りにこの酵素の遺伝子を挿入すると、スプライスされて
いないmRNA形態はこの酵素を生産するが、スプライスさ
れた形態はこれを生産しない。また別の類似の都合のよ
い指示遺伝子を、スプライスされたmRNA形でこれを発現
できるように（例えばTax配列へ融合することによっ
て）mRNAに暗号化することができる。迅速かつ効率的な
大量スクリーニングのために上記の方法をさらに変更す
ることは、当業者にとって容易に明らかなことであろ
う。

この発明のもう一つの態様は、上記の方法によってRe
xタンパク質の遺伝子活性化機能の特異的抑制因子を同
定するため、前記３項に挙げた構成要素を含んでなる因
子スクリーニング用試薬キットに関する。このキット
は、所望により、さらに下記の任意の構成要素、即ち、
細胞培養に使用する培地、リポーターmRNAのスプライス
された形またはスプライスされない形の何れかの核放出
水準を、このmRNAのスプライスされた形およびスプライ
スされない形のタンパク質生産物を、例えば核酸ハイブ
リッド形成によって直接的に、あるいは例えば免疫学的
検出によって間接的に測定するのに使用する試薬、およ
びこの発明方法の実施の際に、このキットの上記の任意
の構成要素を使用するための指示書を含む。

各種のrex遺伝子突然変異体を、優性な負の突然変異
についてスクリーニングするのに上記の方法を使用し
た。これらのrex遺伝子突然変異体を、この発明のRex抑
制因子検出系でプラスミドpgTAX−LTRと同時発現させる
と、5.1項と同様に、Rexタンパク質の59〜60位、64〜65
位、および119〜121位でアミノ酸置換を含んだ１種の突
然変異が認められた。これらはRex機能を欠いているば
かりでなく、野生型Rexタンパク質機能のトランス優性
リプレッサーとしても作用し、また野生型Revタンパク
質機能のトランス優性リプレッサーとしても作用するタ
ンパク質を生じた。

またこの突然変異分析では、Rexアミノ酸位置５〜７
および14〜15でRex機能を欠いた置換を含んでいる第２
の型の負の突然変異体を生じた。これらの変異体タンパ
ク質は細胞核へ好適に標的指向せず、トランス優性でも
なかった。さらにRexアミノ酸位置141〜143に置換を有
する単一な突然変異体Rexで例示される第３の型の負の
突然変異体は、部分的なRex機能を保有しており、核へ
標的指向したが、核の核小体領域内に局在化できなかっ
た。この変異体タンパク質もまた、HTLV−I Rex機能の
トランス優性リプレッサーではなかった。これらの結果
から、核小体局在化活性は、アミノ末端で確認されたプ
ラスに荷電した残基（H.シオミら、セル、55巻、［1988
年］、197〜209頁）以外の配列を含み得る可能性が生じ
た。しかもこの知見は、Rexタンパク質突然変異体がRex
機能のトランス優性リプレッサーとして作用するには、
変異体が、核標的指向性ばかりでなく、Rexタンパク質
の明白な核小体局在化活性を保有することが必要であり
得ることを示唆している。

またここで、Rex突然変異体に関するこれらの知見
は、核および核小体標的指向に関与している第１ドメイ
ンと、エフェクター活性に関与している第２ドメインか
らなる少なくとも２つの機能的に異なったペプチドドメ
インのRexタンパク質内のおよその範囲を特定する。核
標的指向性が不十分であるRex突然変異体は、先に核小
体局在化シグナルとして機能することが判明したRexの
アミノ末端で、プラスに荷電しているペプチドドメイン
に位置している。組み換えDNA手技によって、アミノ末
端の20アミノ酸を含んでいるペプチドを他のタンパク質
へ付着させると、このドメインはRexで観察されたのと
同様の形式で、そのタンパク質の核標的指向性および核
小体局在化を何れも誘導した（H.シオミら、［1988
年］、前掲）。このように、たとえRexアミノ酸位置141
〜143における突然変異体が核へ標的指向するにして
も、核の核小体領域に局在化できないことから、この変
異体が核小体局在化に必要な領域にあるようには思われ
ない。この突然変異体における変化は、むしろアミノ末
端ドメインでのRex核小体の局在化機能に、例えば適当
なタンパク質の折り畳みを妨害することを介して間接的
に影響するらしいと考えるのが最も妥当であろう。

機能的に明白なRexの第２主要ドメインは、アミノ酸5
9〜60（チロシン−イソロイシン）、64〜65（チロシン
−トリプトファン）、および119〜121（スルオニン−フ
ェニルアラニン−ヒスチジン）を包含する。これらの離
れた部位をそれぞれの位置で変化させると（M6、M7およ
びM13突然変異体）、生物学的活性を欠き、それと同時
にトランス優性な抑制特性を現すRexタンパク質の生産
をもたらす。Rex機能に対して効果を示さない５種類の
異なった突然変異は、Rexタンパク質の直線状配列にお
いて、M6およびM7領域をM13領域から分離し、これら２
つの離れた領域でのこの機能的ドメイン内の相互作用
が、適当なタンパク質の折り畳みを必要とするらしいこ
とを示す。即ち、Rexエフェクター機能にとって最も決
定的なこれら２つのアミノ酸領域を包含しているRexタ
ンパク質の完全な直線状部分は、Rexタンパク質のエフ
ェクター機能に寄与しているようであり、したがってこ
のドメインを突然変異させることはRexのトランス優性
リプレッサーの生産を意味する。

この知見は、mRNAでRexRE（RRX）の認識に必要な活性
が位置しているRexのドメインを指摘しない。したがっ
てRex機能のトランス優性リプレッサーとして作用する
ために、突然変異体rexタンパク質がRexREへの結合能を
（直接的または間接的に）保有しなければならないの
か、あるいはRexによって認識される何か他のウイルス
認識の要素への結合能を保有しなければならないのかは
分からない。

この発明のもう一つの態様は、HTLV−I Rexタンパク
質機能のトランス優性リプレッサーを暗号化しているDN
Aセグメントおよびそのようなトランス優性リプレッサ
ーに関する。このリプレッサーは、Rexタンパク質のエ
フェクター活性へマイナスに影響する少なくとも１つの
突然変異によってRexタンパク質の野生型形態から修飾
されたタンパク質である。このリプレッサーはまた、Re
xタンパク質の野生型形態の核小体局在化活性を実質上
保有している。特にこのリプレッサーの負の突然変異
は、野生型Rexタンパク質のおよそのアミノ酸位置59か
らおよそのアミノ酸位置121までを含んでいるペプチド
ドメイン、より詳細には下記に示す59、60、64、65、11
9、120および121の任意の位置にあるアミノ酸に影響を
与えるものである。Rexリプレッサーを暗号化しているD
NAセグメントを例示すれば、下記の突然変異体rex遺伝
子、M6、M7、M13の何れか、およびHTLV−I Revタンパク
質機能のトランス優性な抑制を示すその変異体および誘
導体である。

このDNAセグメントの配列は、HTLV−Ｉの任意の単離
体のRex遺伝子（L.リムスキーら、ネーチャー、335巻、
［1988年］、738〜740頁、M.セイキら、サイエンス、22
7巻、［1985年］、1227〜1229頁）から誘導され、また
は化学的合成によって作り出される。Rex機能のトラン
ス優性リプレッサーは、標準的な組み換えDNA法、また
はペプチド合成のための標準的な化学的方法、またはこ
れらの方法の組み合わせによって作成される。これらの
方法はすべて遺伝子操作技術で周知の方法である。

ここでRexタンパク質のエフェクター活性にマイナス
に影響する突然変異を例示する。然しこれらと同一のア
ミノ酸位置またはこれに近接した位置に限局して、タン
パク質構造に効果を生じるように設計された他の型の突
然変異でも、この発明によるHTLV−I Rexタンパク質機
能のトランス優性な抑制を示すRexの変異体および誘導
体を生産する可能性は極めて高い。そのような限局的な
欠損は、例えば単一アミノ酸の欠失または挿入、または
化学的または構造的に類似したアミノ酸の置換等であ
る。これに反して、一層広範囲な欠失または挿入、また
は２次構造（例えば、β−シート領域内のプロリン）を
破壊する置換は、タンパク質の折り畳みに対する影響を
介してタンパク質の固有部分に効果を及ぼす可能性が高
い。したがってRexエフェクター機能に必要なドメイン
内の与えられた位置で起こるそのような突然変異は、Re
xタンパク質の野生型形態の核小体局在化活性を実質上
保有する突然変異体Rexタンパク質を生産することはあ
り得ない。

上記の5.3項のトランス優性Rex突然変異体を、Rev機
能抑制について同様に試験し、これらの変異体がHIV−1
Revのリプレッサーでもあることが判明した。この型の
トランス優性Rex突然変異体の抗ウイルス作用の可能性
をHIV−１複製の抑制検定を用いて証明した。

また既述したように、たとえばHTLV−II内の対応する
応答要素のヌクレオチド配列が、HTLV−Ｉ内のRexRE（R
RX）のヌクレオチド配列と若干異なったステム構造およ
びループ構造を有しているとしても、HTLV−I Rexが類
似体HTLV−II調節タンパク質に機能的に置き換わり得る
ことがこの研究で判明した。

したがってこの発明はさらに、HIV−１、HTLV−Ｉお
よびHTLV−IIウイルスのうちの１つを複製する複製能を
有する細胞へ、Rex機能のトランス優性リプレッサーを
暗号化した上記のDNAセグメントを導入することからな
るこれらのウイルスの複製の抑制方法に関する。この細
胞はまた、トランス優性リプレッサーを生産するDNAセ
グメントの発現能を有する。この細胞は１またはそれ以
上のこれらのウイルスによって予め感染したものであっ
てもよく、あるいはこの細胞は１またはそれ以上のこれ
らのウイルスに未感染の標的細胞であってもよい。

上述の遺伝子系の好ましい態様として、Rex応答性リ
ポータープラスミドpgTAX−LTRを作成した（第13B
図）。要約すれば、pgTAX−LTRベクターは、HTLV−I en
v遺伝子によって分けられたtax遺伝子の２つのタンパク
質暗号エキソンと、RexRE（RRE）を含んだ完全なHTLV−
I 3′LTRを含んでいる。これらのHTLV−Ｉ配列の発現
は、ヒト・シトメガロウイルスの即時早期領域によって
促進され、追加的なポリアデニル化配列はラット・プレ
プロインスリン遺伝子の３′領域（B.R.カレン、セル、
46巻、［1986年］、973〜982頁）によって提供される。
このベクターは、Rexが存在する場合だけEnvを生産する
が、Rexが存在しても、しなくてもTaxを合成する。この
ベクターは、Rex翻訳開始コドンと一致するSph I部位に
突然変異を導入しているため、それ自身はRexを生産し
ない。Rexが存在しないと、pgTAX−LTRは、env配列のす
べてを事実上欠いているこのベクターから、スプライス
されたmRNA種の翻訳を反映したTaxタンパク質を生産す
る。然しpgTAX−LTRをrex発現プラスミドpREXと同時ト
ランスフェクトすると、HTLV−I Envタンパク質の合成
が活性化される。この62〜68kDタンパク質は、抗HTLV−
Ｉエンベロープ・モノクローナル抗体0.5αとの免疫沈
降による立証によって容易に確認される（S.マツシタ
ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、83巻、
［1986年］、2672〜2676頁）（第14A図、レーン１）。
これとは対照的に、pREXをpREV（レーン２）またはpCMV
−IL−２（レーン３）の何れかで置き換えても（これら
はそれぞれHIV−1 Revタンパク質およびヒト・IL−２ポ
リペプチドを暗号化している）、HTLV−I Envタンパク
質は検出されない。同様に、pgTAX−LTRの存在なしで
は、細胞をpREXでトランスフェクトしてもEnvタンパク
質は同定されなかった（レーン４）。

このように上記の遺伝子系では、pgTAX−LTRによるHT
LV−I Env発現は、野生型Rexタンパク質の遺伝子活性化
機能を保有するタンパク質の存在によって特異的に誘導
される。Rex機能を保有するタンパク質を提供する遺伝
子を含んだ系で、因子との接触がRex機能を抑制するな
ら、その因子がRex機能を提供する遺伝子または遺伝子
生産物の発現と無関係なあるウイルス活性もしくは細胞
活性に影響する場合を除いて、即ち、因子がその遺伝子
またはその生産物の特異的抑制因子でない場合を除い
て、Taxタンパク質は生産され続ける。したがって実施
例12および第15図に示したように、Rex機能の特異的な
抑制因子を同定する典型的な方法は、HTLV−I Env、Tax
およびRexタンパク質発現の同時分析を都合よく含んで
いる。

第15図および下記に示すトランス優性リプレッサーに
よってRex機能が特異的に抑制される場合、HTLV−I Tax
タンパク質の生産が明らかに増大することは注目し得
る。これは恐らく、Rex機能を欠くためにスプライシン
グ前は放出されなかったEnvmRNAが、スプライスされた
形で核放出の増大を来した結果であろう。然し原則的
に、Rex機能の特異的抑制因子はmRNAのスプライシング
を防止し得るが、スプライスされないRNAの放出を誘導
し得ない。したがってRex機能の特異的な抑制因子を同
定するこの方法は、現状では、Taxタンパク質を生産す
るスプライスされたmRNAの核放出の減少がない場合に限
り必要である。

この系の使用方法を実施例12に例示した。この突然変
異分析では、M13バクテリオファージで、オリゴヌクレ
オチドの指令による突然変異誘発を再び使用し、25ケ所
の別々の部位でrex遺伝子の１次配列を変化させた（第1
3A図）。特徴的なBgl II制限部位を同様に含んでいる枠
組みにしたオリゴヌクレオチド２重ラセンの挿入によっ
て、四角で囲ったアミノ酸を、ジペプチドアスパラギン
酸−ロイシンで置き換えた。ついでこれらのrex突然変
異体をそれぞれpBC12/CMV真核性発現ベクターへ挿入し
（B.R.カレン、セル、46巻、［1986年］、973〜982
頁）、DNA配列決定によって突然変異を証明した。

pgTAX−LTRベクターで同時トランスフェクトすること
により、rex突然変異体の生物活性をそれぞれ測定し
た。これらのrex突然変異体のうちの19種は野生型の表
現型を示したが、５種類の突然変異体（M1、M2、M6、M7
およびM13）は明瞭なenv遺伝子活性化作用を欠いてお
り、１突然変異体（M15）は部分的な機能だけを示した
（第14B図）。つぎにCOS細胞をこれら６種のrex欠損型
突然変異体およびpgTAX−LTRベクターで同時トランスフ
ェクトし、ついで実施例12に示したようにHTLV−I En
v、TaxおよびRexタンパク質発現の同時分析を実施した
（第15A〜Ｃ図参照）。HTLV−I Envは、野生型Rexタン
パク質（第15A図、レーン７）または部分的に活性なM15
突然変異体（第15A図、レーン６）の存在した場合にの
み検出されたが、40kD Taxタンパク質はすべての培養で
検出された（第15B図）。このようにM1、M2、M6、M7お
よびM13突然変異体で観察されたenv遺伝子発現の欠如
は、トランスフェクトされたCOS培養におけるこれらの
タンパク質の非特異的な毒性効果というより、むしろRe
x生物学的活性の特異的な喪失に起因するものである。
また突然変異体Rexタンパク質は何れもこれらの培養で
確認され、すべての変異体が安定した形で発現すること
が判明した（第15C図）。M2、M6およびM13突然変異体は
野生型Rexタンパク質と区別し難いパターンで移動し
（第15C図、レーン２、３、５、７）、一方、M7およびM
15タンパク質は、一層小さい見掛けの分子量を示し（レ
ーン４および６）、M1突然変異体は、電気泳動でタンパ
ク質の二重線を生じた（レーン１）。M1、M7およびM15
突然変異体におけるタンパク質コード領域の配列決定で
は、導入した特異的な突然変異以外には何らの変化も見
いだせなかった。したがってこれらのサイズの見掛け上
の相違に関する生化学的な根拠は、これらの変異体タン
パク質の翻訳後プロセシングの変化を反映しているので
あろうと思われる。

野生型Rexタンパク質と同様に、生物学的に不活性なM
6、M7またはM13 Rex突然変異体でトランスフェクトした
細胞のイン・サイチュ免疫蛍光染色では（詳細は実施例
12参照）、発現細胞の核小体および核への正常な標的指
向性が認められた（第16図）。コントラストを強める
と、M1変異体タンパク質は細胞質区画でのみ検出可能で
あったが、M2 Rex変異体は細胞全体にほぼ均質な形で分
布していた。M1およびM2変異体が、核小体局在化のシグ
ナルとして機能する、プラスに荷電したペプチドドメイ
ン内にだけ存在している塩基性アミノ酸残基を変化させ
る事実は、これらの知見と一致する。部分的に活性なM1
5突然変異は変異体Rexタンパク質の核局在化のパターン
をもたらすが、野生型Rexタンパク質とは異なり、M15タ
ンパク質は核の核小体領域内へさらに局在化せず、実際
はM15は核小体から排除されるようである（第16図）。
これらの成績は、Ｎ−末端で塩基性アミノ酸から離れて
いる残基がRexの核小体局在化に関与し、もしくは寄与
し得ることを示唆している。

また野生型HTLV−I Rexタンパク質および野生型HIV−
1 Revタンパク質の生物学的活性に対するrex突然変異体
の阻止能を測定した（第17図）。COS細胞をpgTAX−LTR
およびpREXで同時トランスフェクトすると（パネル
Ａ）、M6、M7およびM13変異体の10倍モル過剰は優性な
負の表現型を示し、野生型Rexタンパク質の活性を著し
く抑制した（レーン３〜５）。これと対照的にM1、M2お
よびM15タンパク質は、野生型タンパク質の作用を変化
しないので、劣性の負の突然変異体として作用した（レ
ーン１、２、６）。同様にHIV−１のRevタンパク質は、
Rexタンパク質（レーン８）およびIL−２（レーン９）
の作用を妨害しなかった。

つぎにトランス優性なRex突然変異体のHIV−１系にお
けるRev機能に対する阻止能を測定した（第17B図）。CO
S細胞においてpgTATおよびpREVで同時トランスフェクト
すると、M6、M7またはM13 Rex突然変異体の10倍モル過
剰はTatタンパク質の72アミノ酸形の発現が減少するこ
とによって立証されるRevタンパク質の作用の抑制を示
した（レーン３、４、５）。またこれらのトランス優性
Rex突然変異体のHIV−１ウイルス複製阻止能を検討した
（第17C図）。Rexおよび段階的な量のトランス優性なRe
x変異体の存在で、Rev欠損型HIV−１プロウイルスpHXB2
−Bam−p3（L.リムスキーら、ネーチャー、335巻、［19
88年］、738頁）の複製を、これらのプラスミドによるC
OS細胞のトランスフェクションにより検討した。培養上
清中のHIV−1 p24 Gagタンパク質の合成水準によって分
かるように、トランス優性なRex突然変異体（M6、M7お
よびM13）は投与量に比例するHIV−１複製の抑制を生じ
た。これとは対照的に、rexの劣性の負のM1突然変異体
はHIV−１の複製に対して有意な効果を示さなかった。

これと同時に、実施例12および13の各種のrex突然変
異体に関するこれらの知見から、異なった活性を有する
少なくとも２つの異なった構造ドメインのRexタンパク
質内のおよその境界が判明した。即ち、１つのドメイン
はM1およびM2突然変異によって特定され、Ｎ−末端に位
置し、アミノ酸５〜７および14〜15を含み、タンパク質
を核へ標的指向させ、それから核小体へ標的指向させす
る役割を果たしているようである。このプラスに荷電し
ているドメインはまた、直接RexRE（RRX）へ、あるいは
このRNA要素へ直接接触する他のタンパク質へのRex結合
に関与し得る。上述の第２ドメインはRexエフェクター
機能にとって不可欠であり、したがって突然変異して、
トランス優性なリプレッサーを生産することができる。

以上の5.1、5.2および5.3項の知見を要約すれば （ａ）決定的な調節タンパク質（RexおよびRevのよう
な）を突然変異することによってウイルス抑制因子を生
産する一般に適用可能な原則を発見した。

（ｂ）この原則は複数のウイルス種に作用する突然変異
体調節タンパク質の生産に適用可能なようである。

（ｃ）組み立てて、同定した特異的にトランス優性な突
然変異体は −HTLV−I rex遺伝子機能の抑制に有効なHTLV−IRex突
然変異体 −pcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM17およびpcRex
13Δ15（5.1項および実施例１〜３参照）、 −M6、M7およびM13（5.3項および実施例12〜13参
照）、 −HIV−1 rev遺伝子機能の抑制に有効なHIV−1 Rev突然
変異体 −pM10、ｐΔ9/14およびｐΔ10/14（5.2項および実施
例４〜11参照）、 −pM21、pM22、pM27、pM28、pM29およびpM32（5.2項
および実施例11a〜11b参照）、 −HTLV−I rex遺伝子機能の抑制に有効で、HIV−1 rev
遺伝子機能の抑制にも有効なHTLV−I Rex突然変異体 −pcRexM2、pcRexM7およびpcRexM8（5.1項および実施
例３参照）、 −M6、M7およびM13（5.3項および実施例12〜13参
照）、 −HTLV−I rexおよびHTLV−II rexおよびHIV−1 rev遺
伝子機能の抑制に有効なHTLV−I Rex突然変異体 −M6、M7およびM13（5.3項および実施例12〜13参
照）、 −HIV−1 rev遺伝子機能の抑制に有効で、HIV−2 revお
よびSIV_acrev遺伝子機能の抑制にも有効なHIV−1 Rev突
然変異体 −pM10（5.2項および実施例11b参照） と結論する。

6.実施例 以下に実施例をあげてこの発明を説明する。これらの
実施例は単に発明を説明するためのものであって、発明
の範囲を限定するものではない。

［6.1］ ［実施例１］ トランス優性HTLV−I rex遺伝子の組み立て （１）rex暗号配列のバクテリオファージM13 RF−DNAへ
のクローン化 pcRex DNA 5μｇを、制限酵素インキュベーション緩
衝液（10mMトリス−HCl（pH7.5）、10mM MgCl₂、50mM N
aCl、1mMジチオトレイトール）20μｌ中で、制限酵素HI
nd IIIおよびEcoR I各10単位で37℃で３時間処理した。
反応混合物を、１μg/ml臭化エチジウム含有１％アガロ
ースゲル（シーケムFMC社、ロックランド、ME、米国）
へ直接負荷し、トリス−酢酸緩衝液（T.マニアチスら、
モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリー・マニ
ュアル［1982年］、コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー、ニューヨーク、156頁）中、50V、25mAで
４時間電気泳動を行った。分離したDNAを366nmのUVラン
プで可視化し、1.5kbのrex断片を含有する好適なゲル切
片を切り出した。このゲル切片をトリス−ほう酸緩衝液
500μｌを含有する透析バッグへ加えた（マニアチス、1
56頁）。DNAを緩衝液へ電気泳動溶出し、−20℃でエタ
ノール沈殿させた。

バクテリオファージM13mp10 RF−DNA 5μｇを制限酵
素HInd IIIおよびEcoR Iで処理し、同様に１％アガロー
スゲルから7.2kbのベクターM13断片を単離した。

ライゲーション緩衝液（50mMトリス−HCl（pH7.4）、
10mM MgCl₂、10mMジチオトレイトール、1mM ATP）20μ
ｌ中で、ファージDNA 200ngおよびcRex DNA1μｇをT4−
DNA−リガーゼ１単位と混合し、16℃で15時間インキュ
ベートした。この反応混合物を直接使用して、エシェリ
キア・コリTG1株を形質転換し、培養した（アマーシャ
ム・プロトコール、16〜18頁）。

好適なファージプラークのDNAを制限酵素HInd IIIお
よびEcoR Iによるエンドヌクレアーゼ切断によって検査
し、ついでトリス−酢酸緩衝液中、10μg/ml臭化エチジ
ウム含有１％アガロースゲルにより分析的ゲル電気泳動
を行った。rex暗号配列を保有していたバクテリオファ
ージを同定し、これをmp10rexと命名した。

大規模生産プロトコール（アマーシャム・プロトコー
ル、24〜25頁）を使用して１本鎖mp10rex DNAを単離し
た。

（２）mp10rex中のrex暗号配列の突然変異誘発 突然変異誘発の必要条件として、好適な１本鎖DNA分
子の合成が必要であった。29種類のオリゴヌクレオチド
を作成し（第４図参照）、結局30種の突然変異体が得ら
れた。そのうち、下記の７種のオリゴヌクレオチドか
ら、トランス優性な表現型の点で好結果であることが分
かった突然変異体が直接または間接的に（実施例２参
照）得られた。

オリゴヌクレオチド（１）は、Rexタンパク質のアミ
ノ酸残基フェニルアラニン（アミノ酸位置30）、フェニ
ルアラニン（アミノ酸位置31）およびセリン（アミノ酸
位置32）を、アミノ酸ロイシン（アミノ酸位置30）、ア
スパラギン酸（アミノ酸位置31）およびロイシン（アミ
ノ酸位置32）で置き換えている。

オリゴヌクレオチド（２）は、Rexタンパク質のアミ
ノ酸残基アラニン（アミノ酸位置58）およびチロシン
（アミノ酸位置59）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミ
ノ酸位置58）およびロイシン（アミノ酸位置59）で置き
換えている。

オリゴヌクレオチド（３）は、Rexタンパク質のアミ
ノ酸残基プロリン（アミノ酸位置63）およびチロシン
（アミノ酸位置64）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミ
ノ酸位置63）およびロイシン（アミノ酸位置64）で置き
換えている。

オリゴヌクレオチド（４）は、Rexタンパク質のアミ
ノ酸残基チロシン（アミノ酸位置87）、セリン（アミノ
酸位置88）およびセリン（アミノ酸位置89）を、アミノ
酸ロイシン（アミノ酸位置87）、アスパラギン酸（アミ
ノ酸位置88）およびロイシン（アミノ酸位置89）で置き
換えている。

オリゴヌクレオチド（５）は、Rexタンパク質のアミ
ノ酸残基ロイシン（アミノ酸位置90）およびセリン（ア
ミノ酸位置91）を、アミノ酸アスパラギン酸（アミノ酸
位置90）およびロイシン（アミノ酸位置91）で置き換え
ている。

オリゴヌクレオチド（６）は、Rexタンパク質のアミ
ノ酸残基セリン（アミノ酸位置94）を、アミノ酸ロイシ
ンで置き換えている。

オリゴヌクレオチド（７）は、Rexタンパク質のアミ
ノ酸残基アルギニン（アミノ酸位置100）およびグルタ
ミン酸（アミノ酸位置101）を、アミノ酸アスパラギン
酸（アミノ酸位置100）およびロイシン（アミノ酸位置1
01）で置き換えている。

すべてのオリゴヌクレオチドは、rex暗号配列の枠内
にBgl II制限部位を導入してある。

オリゴヌクレオチドは、β−シアノ−エチルホスホア
ミダイト化学を使用したアプライド・バイオシステムズ
380A・シンセサイザーで固体支持体により合成した。精
製は、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、
ついで主要生産物を溶出およびエタノール沈殿すること
によって行った。ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼ
を使用するオリゴヌクレオチドのリン酸化をアマーシャ
ム・プロトコール（13頁）の記載にしたがって実施し
た。オリゴヌクレオチドの指令による突然変異誘発反応
をアマーシヤム・プロトコール（13〜16頁）にしたがっ
て実施した。ついでこれを形質転換し、エシェリキア・
コリTG1株から平板培養した（アマーシヤム・プロトコ
ール16〜18頁）。異なったプラークのDNAを、酵素Bgl I
IおよびEcoR Iを使用する制限エンドヌクレアーゼ分析
によってスクリーニングした。

７種の突然変異のすべてから、rex暗号配列に導入さ
れた突然変異を保有している１クローンが確認された。
これらのクローンをmp10rexM2、mp10rexM7、mp10rexM
8、mp10rexM13、mp10rexM14、mp10rexM16およびmp10rex
M17と命名した。さらにもう一つのクローンmp10rexM15
を、欠失変異体の組み立てに使用した（実施例２参
照）。

（３）突然変異rex遺伝子の哺乳動物発現プラスミドへ
の再クローン化 突然変異させたrex遺伝子をバクテリオファージM13ベ
クターから起原種の発現プラスミドへ戻した。pcRex DN
A 5μｇを制限エンドヌクレアーゼHInd III 10単位およ
びEcoR I 10単位と37℃で３時間インキュベートした。
反応混合物を10μg/ml臭化エチジウム含有１％アガロー
スゲルへ直接負荷し、トリス−酢酸緩衝液中、50V、25m
Aで４時間電気泳動を行った。好適なゲル切片から、HIn
d III−EcoR Iベクター断片を電気泳動溶出し、エタノ
ール沈殿した。

（２）で得られた突然変異体５μｇを同様に処理し
て、rex暗号配列を含んだ断片を単離した。

単離したベクター断片200ngおよび単離したrex配列１
μｇを、T4−DNA−リガーゼ１単位の存在でライゲーシ
ョン緩衝液20μｌに別々に混合し、16℃で15時間インキ
ュベートした。得られた反応混合物を直接使用して、エ
シェリキア・コリHB101株を形質転換した。制限エンド
ヌクレアーゼHInd III、Asp718およびBgl IIを使用し
て、異なった細菌コロニーのDNAを分析し、これを１％
アガロースゲルで分析的ゲル電気泳動に掛けた。このよ
うにしてrex遺伝子を保有していることを確認したプラ
スミドを、それぞれpcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRex
M13、pcRexM14、pcRexM15、pcRexM16およびpcRexM17と
命名した。

［実施例２］ rex暗号配列中の欠失変異の組み立て pcRexM13 DNA 5μｇを制限酵素Bgl IIおよびEcoR Iそ
れぞれ10単位で処理した。ベクター主鎖およびrex暗号
配列の５′部分を含んでいる大きい方のDNA断片を前記
と同様に単離した。これと並行してpcRexM15 DNA 5μｇ
を類似の方法で処理し、rex暗号配列の３′部分を含ん
でいる小さい方のDNA断片を単離した。

単離したpcRexM13 DNA断片200ngを、単離したpcRexM1
5 DNA断片１μｇと混合し、T4−DNAリガーゼ１単位の存
在でライゲーション緩衝液20μｌ中、16℃で15時間イン
キュベートした。この操作の結果、アミノ酸位置87、88
および89がクローンpcRexM13と同一であり、アミノ酸位
置90〜94を欠失しているrex暗号配列を得た。

ついで反応混合物を直接使用して、エシェリキア・コ
リHB101株を形質転換した。異なったクローンのDNAを、
酵素HInd III、Asp718およびBgl IIを使用する制限エン
ドヌクレアーゼ消化によりスクリーニングした。陽性で
あったクローンを同定し、これをpcRex13Δ15と命名し
た。

［実施例３］ 生物学的活性 （ａ）突然変異体遺伝子の哺乳動物細胞における生物学
的活性 rex野生型遺伝子および各突然変異体rex遺伝子発現ベ
クター0.25μｇを、ゲノムtat（トランス−活性化因
子）発現ベクターpgtat（M.H.マリムら、ネーチャー、3
35巻、［1988年］、181頁）0.25μｇと混合し、これを
カレンが報告したようにCos細胞系へ同時トランスフェ
クトした（B.R.カレン、メソッズ・イン・エンジモロジ
ー、152巻、［1987年］、684〜703頁）。60時間のトラ
ンスフェクション後、培養を³⁵S−システイン300μCi/m
lで３時間標識し、HIV−1 TatおよびHTLV−I Rexタンパ
ク質の発現を免疫沈降分析により分析した。カレンが報
告したように、Tatのアミノ酸残基１〜61に対する家兎
抗ペプチド抗体、およびRexのアミノ酸残基173〜189に
対する家兎抗ペプチド抗体をこの実験に使用した（B.R.
カレン、ジャーナル・オブ・ビロロジー、62巻、［1988
年］、2498〜2501頁）。沈降したタンパク質をSDS/ポリ
アクリルアミドゲルで分離し、オートラジオグラフィー
により可視化した。

ベクターpcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM14、pcR
exM17およびpcRex13Δ15に暗号化されているrex遺伝子
は、この検定系で、rex作用に対する負の表現型を生じ
たが（第2B図、レーンＤ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、ＩおよびＫ）、
対照（レーンＢおよびＣ）およびその他の突然変異体
（レーンＧ）は正の表現型を生じた。

これらの表現型で負のRex突然変異体クローンは、す
べて上記のポリクローナル抗Rex抗体によって認識され
るRex特異的なタンパク質を生産することができる（第2
A図、レーンＣ〜ＥおよびＧ〜Ｉ参照）。これに対し
て、クローンpcRexM16における突然変異はRex特異的抗
体によって検出不可能なタンパク質を生じた。このこと
はタンパク質の半減期の短縮（成績は示さず）に起因す
るものであると信じられる。

（ｂ）pcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM13、pcRexM1
4、pcRexM17およびpcRex13Δ15による野生型HIV−1 rev
および／またはHTLV−I rex機能のトランス優性な抑制 前記と同一の実験装置を使用して、野生型RevおよびR
exタンパク質の機能をトランスで抑制するrex突然変異
体の抑制能を検討した。ゲノムtat発現ベクターpgtat
0.25μｇ、野生型rev（pcRev）または野生型rex（pcre
x）発現プラスミド0.25μｇ、および各rex突然変異体発
現プラスミドの過剰量（５μｇ）を別々に混合し、これ
らをCos細胞へトランスフェクトした。突然変異体の野
生型RevまたはRex機能に対する影響を、上記のTat特異
的免疫沈降法によって測定した。

この実験の結果から、６種のrex突然変異体、pcRexM
2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM14、pcRexM17およびpcRex
13Δ14は、野生型rex依存性トランス−活性化の抑制能
を有することが判明した（第2C図、レーンＣ、Ｄ、Ｅ、
Ｇ、Ｈ、Ｉ）。このうち４種のrex突然変異体pcRexM2、
pcRexM7、pcRexM8、およびpcRexM13（部分的に）は野生
型rex依存性トランス−活性化作用の抑制能を有してい
たが（第2D図、レーンＣ、Ｄ、Ｅ、Ｆ）、ある種の突然
変異体、即ちこの場合、pcRexM2、pcRexM7およびpcRexM
8は、野生型rexおよび野生型rev依存性トランス−活性
化をともに抑制することができた。

この実験系では、上記のrex突然変異体によるRevおよ
び／またはRex機能のトランス優性な抑制を、タンパク
質レベルで証明した。

また実施例１〜３の成績は、HTLV−I Rexタンパク質
に２つの機能的ドメインが存在することを示しているよ
うである。アミノ末端の方向へ向けて、RevおよびRexタ
ンパク質双方に対してトランス優性である２つの突然変
異体が存在する［pcRexM7（アミノ酸位置58、59）およ
びpcRexM8（アミノ酸位置63、64）］。Rexタンパク質だ
けにトランス優性な突然変異体を含んでいる第２のクラ
スターは、暗号配列の中央部に位置している。核局在化
シグナルと突然変異体７および８からなるクラスターの
間に位置している追加的なrev/rexトランス優性な変異
体は第３の機能的ドメインの一部であるか、さもなけれ
ば導入されたアミノ酸変化がタンパク質の３次構造を妨
害して、その結果、観察されるトランス優性な表現型を
生じたのかもしれない。

［6.2］ ［実施例４］ Revで集中発生した点変異および欠失変異 Revタンパク質は生体内でセリンの位置でリン酸化さ
れ、主として細胞核へ局在化し、その核小体で濃縮され
る。下記の突然変異分析は、Rev機能のこの特性関連
を、他のどの因子よりHIV−１構造遺伝子発現のトラン
ス−活性化因子として指摘する。

テーラーらが報告したオリゴヌクレオチド指令による
突然変異誘発を再び使用して、集中発生する点変異（p
M）をHIV−1 RevのHXB−３株へ導入した（テーラーら、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、13巻、［1985
年］、8765〜8785頁）。具体的にはバクテリオファージ
M13突然変異誘発系（アマーシャム社、アーリントンハ
イツ、IL、米国）を使用して、発現ベクターpcREV（マ
リムら、ネーチャー、335巻、［1988年］、181〜183
頁）によって暗号化された完全鎖長のcDNAコピーrexへ
標的指向ヌクレオチド置換を導入した。pcREVのDNAおよ
び対応するアミノ酸配列を第６図に示す。

集中発生する一連の点変異をRevへ導入し（第５図、M
1〜M14）、クローン化し、ジデオキシヌクレオチド配列
決定システム（ストラタジーン、ラ・ジョラ、CA、米
国）を使用してその配列を確定した。突然変異は、Rev
全体にわたってほぼ均等に配置され、その中にある11個
のセリン残基へそれぞれ標的指向することができた。変
化したヌクレオチドに下線を付して、各突然変異（pM1
〜pM14）およびそれを囲むDNA配列を第７図に示す。

注目した大部分の突然変異は、第５図で四角で囲んだ
残基を置き換えて、アスパラギン酸（Asp）およびロイ
シン（Leu）のコドンを生じた。各突然変異は、Rev内の
その位置にしたがい、例えばＮ−末端に最も近い突然変
異をpM1、Ｃ−末端に最も近い突然変異をpM14と命名し
た。

種々のpM突然変異体の正確な構造を第７図に示した。
突然変異の大半は２つのコドンだけに影響したが、この
一般法則の例外として、M2、M4、M23、M24およびM25は
３個のコドンに影響を与え、またM6は５個のコドンに影
響を与えた。多くの場合、アミノ酸置換はアミノ酸２個
のミスセンス変異から起こったが、pM6の場合は、Aspお
よびLeuがアルギニン残基４個を置換し、それによって
アミノ酸２個の欠失を生じた。pM4は元のREVで観察され
なかった近接したアミノ酸１個の置換を追加的に含んで
おり、これは23位におけるチロシンのアスパラギン酸置
換を含むものである。これらの追加的な変化は、突然変
異誘発プロトコールに使用した１本鎖DNAオリゴヌクレ
オチドプライマー内の１塩基エラーから起こったもので
ある。

多くの点変異は独特なBgl II部位の形成を結果した;p
M7は２つの隣接したセリン残基の簡単な欠失によって構
成された（第５図参照）。Bgl II部位はすべて同一の読
み取り枠へ挿入され、それによってそれに伴うRevのＮ
−末端およびＣ−末端の欠失変異（ｐΔ）の組み立てを
促進した。ｐΔ変異体は欠失の位置によって命名され、
例えばｐΔ11/14は導入したpM11およびpM14突然変異の
間に欠失を有する。

［実施例５］ Rev突然変異体の発現 親シトメガロウイルスの即時早期プロモーターに基づ
くベクターpBC12/CMV（B.R.カレン、セル、46巻、［198
6年］、973〜982頁）を陰性対照として使用した。また
この実験では、ゲノムtat遺伝子発現ベクターpgTATおよ
び分泌されたアルカリ性ホスファターゼ遺伝子発現ベク
ターpBC12/RSV/SEAPを使用した（マリムら、前掲、およ
びバージャーら、ジーン、66巻、［1988年］、１〜10
頁）。

発現ベクターpcREVを修飾して、pMおよびｐΔrev変異
体を発現した。修飾したpcREVをpgTATとともにCOS細胞
へ同時トランスフェクトすることからなる定性的検定を
再び使用し、変異体におけるHIV−1 revおよびtatの発
現を検定した（マリムら、前掲、およびマリムら、ネー
チャー、338巻、［1989年］、254〜57頁）。具体的に
は、カレンが報告したように（メソッズ・イン・エンジ
モロジー、152巻、［1987年］、684〜703頁）、pgTAT
0.25μｇと、野生型、またはDEAE−デキストランおよび
クロロキンで修飾したpcREV発現ベクター0.25μｇを使
用するDNA依存性トランスフェクションによって、COS細
胞培養（35mm）を同時トランスフェクトした。

60時間のトランスフェクション後、培養を［³⁵S］−
システインおよび［³²P］−無機リン酸塩（［³²−Ｐ］
−Pi）で同時標識した（マリムら、［1988年］、前掲、
およびハウバーら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、62
巻、［1988年］、4801〜04頁）。ついで細胞をRIPA緩衝
液で溶解し、家兎ポリクローナル抗ペプチド抗血清を使
用する免疫沈降分析により、培養中のrevおよびtat発現
の相対水準を検定した（マリムら、［1988年］、前掲、
およびカレンら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、62
巻、［1988年］、2498〜2501頁）。より具体的には、Re
vアミノ酸残基１〜20（REV1/20）に対する抗血清をpM5
およびpM6によって暗号化された変異体タンパク質の免
疫沈降に使用し、またRevアミノ酸残基27〜51（REV27/5
1）に対する抗血清を残りすべての変異体タンパク質の
免疫沈降に使用した。tat発現の免疫沈降分析は、Tatア
ミノ酸残基１〜61（TAT1/61）に対する家兎ポリクロー
ナル抗体ペプチド抗血清を使用して実施した。

免疫沈降したタンパク質を、14％不連続SDS−アクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分解し、オートラジオグ
ラフィーにより可視化した。これらの実験の結果を第８
図に示す。既知タンパク質分子量マーカーの相対移動度
を図の右側に示す。

［³⁵S］−システインおよび［³²P］−Pi標識した培養
の抗−Rev抗血清による免疫沈降をそれぞれ第8Aおよび8
C図に示す。［³⁵S］−システイン標識培養の免疫沈降で
は、大半のミスセンス（pM）変異体で野生型に匹敵する
強度および移動度を示すバンドを生じた（第8A図、レー
ン１〜14）。この一般法則の例外として、変異体pM6で
は僅かに早い移動度を示す強いバンドを生じ（M_r〜18k
D）、pM1では著しく遅い移動度を示す微弱なバンドを生
じた。

抗Tat抗血清を使用するtat発現の免疫沈降分析は、モ
デル指示薬としてpgTATを使用するrev機能の定性的検定
を提供した。前述のようにrevが存在しないと、86アミ
ノ酸（aa）のエキソン２個形tatタンパク質をもっぱら
暗号化している完全にスプライスされた細胞質性tat mR
NAが発現する。然しrevが存在すると、pgTATは、先端を
切り取られたエキソン１個形の72aa鎖長のタンパク質を
暗号化しているスプライスされないtat mRNAの細胞質発
現を誘導する。

第８図で、野生型revは19キロダルトン（kD）の相対
分子質量（M_r）で移動し、容易に検出されるが（レーン
０）、tatの86aa形および72aa形はそれぞれ15.5kDおよ
び14kDで移動する。模擬トランスフェクト培養は、これ
らの検定条件下で何ら特異的な信号を生じないが（マリ
ムら、前掲）、第8B図を精査した結果、突然変異体発現
ベクターでトランスフェクトした培養でも、組立て体指
示薬pgTATで同時トランスフェクトした培養でも、どち
らもtatタンパク質合計に匹敵する量を合成することが
判明した。この成績から、どの変異体Revタンパク質も
トランスフェクト細胞に対して有毒でないことが示唆さ
れる。

またこの分析は、Revの５種のミスセンス変異体およ
び２種の欠失変異体が不活性であることを示したが（レ
ーン４〜７、10、16、20）、その他のRev突然変異体は
すべて完全に72aaTat発現を誘導できることが判った。
４種の不活性なミスセンス変異体はアミノ酸残基23と56
の間（M4〜M7）で集中発生したが、第５の不活性変異体
（pM10）は２つの完全に機能的な突然変異体によって分
離され、残基78および79に影響を与える。RevのＮ−末
端に近い４残基（ｐΔ1/2）またはＣ−末端に近い21残
基（ｐΔ11/14）の欠失は、rev機能に対して殆どまたは
全く効果がなかった。これとは対照的に残基９と17の間
の追加的な配列の欠失（ｐΔ1/3）はrev機能の喪失を生
じた。

［実施例６］ rev突然変異体のトランス−活性化能 rev突然変異体のトランス−活性化能を一層厳密に評
価するため、HIV−１の複製欠損型rev変異体をトランス
で救援するrev突然変異体の救援能を試験した。この分
析の目的のため、ベクターpHIV−１ΔrevのrevHIV−１
プロウイルス［ファインバーグらによってpHXB2Bam−p3
と命名された（セル、46巻、［1986年］、807〜17頁］
を使用した。このプロウイルスは、revの第２暗号エキ
ソンのアミノ酸位置59に該プロウイルスの複製を不可能
にするフレーム・シフト変異を含んでおり、即ち、COS
細胞へトランスフェクトしたとき、HIV−1 rev発現がト
ランスで可能なベクターとの同時トランスフェクトがな
いと、機能的なRevタンパク質を産生できない（リムス
キーら、ネーチャー、335巻、［1989年］、738〜40
頁）。第９図に示したように、可溶性p24 Gag発現のELI
SA検定法（デュポン−NEN社、ビレリカ、MA、米国）を
製造業者の標準的な供給によって使用して、培養上清へ
放出されたHIV−1 p24 Gagタンパク質濃度（pg/ml）を
定量的に検定することにより、ウイルスの複製を測定
し、突然変異体のrevプロウイルス救援能を分析した。

対照の目的のため、Rev非応答性ベクターpBC12/RSV/S
EAP（１培養当たり12.5ng）［分泌されたアルカリ性ホ
スファターゼ（SEAP）遺伝子発現ベクター］で培養を同
時トランスフェクトすることによって監視した。上清p2
4 Gag濃度と並行してSEAP濃度を便宜的に測定した。ま
た幾つかの培養では、陰性対照ベクターpBC12/CMV（NE
G）か、または野生型rev遺伝子発現ベクター（pcRev）
の何れか125ngで同時トランスフェクトした。

COS細胞培養（35mm）をpHIV−１Δrev250ngと、対照
ベクターまたは修飾した１突然変異体含有ベクター125n
gで同時トランスフェクトした。65時間トランスフェク
ション後、上清培地を採取し、P24 Gagタンパク質の発
現水準を検定した。同時にSEAP濃度を測定した。上清SE
AP濃度で認められた僅かな変動を補正し、得られた値を
第９図に再掲した（SEAPの平均活性を1.00単位とし、観
察された標準偏差は±0.14、範囲は1.30〜0.73であ
る）。

この実験で、SEAP活性の上清濃度にはほとんど変動が
見られなかったので、トランスフェクション効率が等価
であることが証明され、また細胞毒性を誘発する突然変
異体がないことが確かめられた。pHIV−１Δrev単独の
トランスフェクションでは、培養上清に検出可能なp24
Gagタンパク質を生じなかったが（レーンNEG）、野生型
rev遺伝子発現ベクターとの同時トランスフェクション
では、pHIV−１ΔRevのp24 Gag分泌誘導能を有効に補足
していた（レーンpcREV）。

またpgTATに基づく検定で試験し、陽性であったすべ
てのRev突然変異体を可視化して第8B図に示したが、野
生型rev組立て体で認められた活性の50〜100％の活性水
準が救援検定で達成された。例外としてM1では−30％の
活性を示したが、この減少はM1変異体の生体内安定性の
低下を反映したものであろう。第8B図でマイナスと採点
したすべての突然変異体は、救援検定で完全に陰性であ
り（即ち、p24 Gagの10pg/mlまたはそれ以下）、例外と
してM7では辛うじて検出し得た上清のp24 Gagタンパク
質濃度を生じた。

［実施例７］ 生物学的活性に必要でないRevリン酸化 HIV−1 Revタンパク質は生体内で発現すると１または
それ以上のセリン残基の位置でリン酸化される。第５図
に概略を示した突然変異は、rev暗号配列内の11個の各
セリン残基に影響を与える。そこでHIV−1 revの生体内
リン酸化部位を確かめるため、トランスフェクトしたCO
S細胞培養で一過性に発現する［³²P］−Pi標識Revタン
パク質を免疫沈降により監視した（第8C図）。［³²P］
−Piのrevへの挿入濃度と、これと並行してトランスフ
ェクトした培養で挿入された［³⁵S］−システイン濃度
との比較（第8A図）を用いて、個々の突然変異体のリン
酸挿入水準に対する効果を評価した。この比較の結果を
第１表に示す。

第１表にまとめた分析で、リン酸化の減少を生じる４
種のミスセンス変異体を確認した。これらのうち、M2お
よびM12はリン酸取り込みに対して中等度の効果を示す
が（それぞれ−30％および−60％の抑制）、M5およびM6
はリン酸取り込み水準が劇的に低下した。revのリン酸
化に対するM5およびM6変異体の劇的な効果（これらはど
のセリン残基にも影響しない）に関して考え得る理由
を、以下さらに詳細に考察する。

Revにおけるリン酸受容体セリン残基の位置をさらに
よくつきとめるため、欠失変異体（ｐΔ）のリン酸化水
準の研究を実施した（第8C図、レーン15〜20）。この分
析の結果、ｐΔ13/14変異体は正常にリン酸化される
が、ｐΔ12/14欠失およびそれより一層大きいＣ−末端
の欠失は、低水準のリン酸化しか示さない（−90％抑
制）。同様にｐΔ1/2Rev変異体も［³⁵S］−システイン
では効果的に標識され得るが、［³²P］−Piの取り込み
は低水準を示す（−90％抑制）。

M2およびM12変異体の部位へ広がる欠失が、何故、ミ
スセンス変異体そのものより、リン酸化水準に一層激し
い効果を示すのかは明らかでない。然しこれらの結果
は、Revタンパク質がセリンリン酸化の２ケ所の１次部
位を含んでおり、その１つは残基８（M2）にあり、第２
は残基99（M12）にあるという仮説と一致している。何
れにしても、これらの残基を欠いている変異体（即ち、
pM2、ｐΔ1/2、pM12、ｐΔ12/14）は、ほぼ野生型Revの
活性水準を示す（第8B図、第９図）。したがってRevの
リン酸化は、トランスフェクトされた細胞におけるHIV
−１調節タンパク質のトランス−活性化機能に不可欠な
ものではないと結論される。

［実施例８］ Revの核局在化 Revタンパク質が、発現細胞の核、特に核小体へ顕著
に局在化されることは、間接免疫蛍光法を用いた変異体
分析によって確認された。固定されたトランスフェクト
COS細胞培養から得られた位相差写真およびそれに対応
する免疫蛍光写真を第10図に示す。

トランスフェクトされたCOS細胞内のRevタンパク質を
局在化するのに使用した間接免疫蛍光法の手技は、カレ
ンの報告（B.R.カレン、メソッズ・イン・エンジモロジ
ー、152巻、［1987年］、684頁、およびB.R.カレン、ジ
ャーナル・オブ・ビロロジー、62巻、［1988年］、2498
頁）にしたがい、ただし修飾されたパラホルムアルデヒ
ド法に基づく細胞固定法を使用して行った（ルーベン
ら、ジャーナル・オブ・ビロロジー、53巻、［1989
年］、１〜８頁）。具体的には、細胞を家兎ポリクロー
ナル抗体Revペプチド抗血清で処理し、ついでローダミ
ン結合ヤギ抗家兎IgGで処理した。

第１の家兎抗Rev抗体は1:800倍希釈で使用した。pM
1、pM2、pM3、ｐΔ1/2、ｐΔ1/3ベクターでトランスフ
ェクトした培養を除いて、Rev突然変異体の大半の分析
にはREV1/20抗体を使用した。上記の例外の変異体にはR
EV27/51抗体を使用した。第２抗体であるローダミン結
合ヤギ抗家兎IgG（ベーリンガー・マンハイム・バイオ
ケミカルズ、インジアナポリス、IN、米国）は1:50倍希
釈で使用した。

図に示したように、Rev突然変異体は４つの型に分け
られる亜細胞性局在化を示した。即ち、N:細胞質発現が
検出不可能な核／核小体局在化、Ｎ＞C:僅かな細胞質発
現、Ｎ≧C:若干の核濃縮を伴った明白な細胞質発現、Ｃ
＞N:細胞内の無秩序な分布、からなる４種類の型であ
る。これらの分布の代表的な例を図に示した。図でRev
タンパク質は下段の図の右上隅に表示した。この検定に
よって検出された各Revタンパク質の局在化を第１表に
示す。

図に示したように、変異体の大半は、トランス−活性
化陰性のクローンpM10（第10D図）を含め、完全に野生
型の亜細胞性局在化（Ｎ）を示した。然しながら数種の
変異体では、pM4（第10F図）によって代表されるよう
に、極めて微弱ながら検出可能な水準の細胞質蛍光を生
じた。この表現型は、活性変異体（pM3、pM8）でも不活
性変異体（pM4pM7）でも、ともにこの特性を示すので、
生物学的活性と明らかに相関しなかった。しかもかなり
幅広い範囲の１欠失変異体（ｐΔ1/3）が、野生型パタ
ーンとRevの塩基性ドメインで突然変異によって誘導さ
れたパターン（Ｎ≧Ｃ、第10H図）との中間型の亜細胞
性局在化を示している。然しこの欠失は、塩基性ドメイ
ンに近接した位置ではない。この異常な局在化の理由は
明らかではないが、ｐΔ1/3で認められた生物学的活性
の欠如とよく相関している。

既知の核局在化シグナルと相同性を示すRevのアルギ
ニン・リッチな突然変異（pM5、pM6）は、細胞質Revタ
ンパク質を高水準で生じる（Ｃ＞Ｎ）。ただしこれらの
タンパク質は、細胞核から排除されたものではなく（第
10J図）、実際はRevの塩基性ドメインが核局在化のシグ
ナルであることを示唆している。

pM5およびpM6が、リン酸化受容体として先に提案した
部位を保有しているにもかかわらず、生体内で必ずしも
有意にリン酸化されないことを思い起こせば興味深い。
これはRevのリン酸化に関与しているキナーゼが細胞核
に限定されているためかも知れない。したがってpM5お
よびpM6 Rev変異体の不適当な亜細胞性局在化は、その
低いリン酸化水準に起因している可能性も考えられる。

［実施例９］ Rev機能のトランス優性な抑制 トランス−活性化HIV−１構造遺伝子発現能を喪失し
たRev突然変異体について、野生型Revタンパク質の機能
をトランスで抑制するその抑制能を検討した。

COS細胞（35mm）を、組立て体指示薬pgTAT250ngと、p
BC12/CMV 290ng（陰性対照）（第11A図、レーン１）:pc
REV 40ng（低水準）、pBC12/CMV250ng（レーン２）;pcR
EV 290ng（高水準）（レーン３）;pcREV 40ng、pM4 250
ng（レーン４）;pcREV 40ng、pM7 250ng（レーン５）;p
cREV 40ng、pM10 250ng（レーン６）で同時トランスフ
ェクトした。60時間トランスフェクション後、培養を［
³⁵S］−システインで標識し、家兎抗Tat抗血清を使用す
る免疫沈降分析に掛けた。

第11A図に示したように、pM4（レーン４）およびpM7
（レーン５）では、72aa Tatの発現誘導によって測定し
た野生型Revタンパク質活性に対して殆ど効果を示さな
かったが、pM10（レーン６）ではRev機能を完全に抑制
するようであった。この成績は、pM10がHIV−1 rev遺伝
子機能の特異的な抑制因子を暗号化していることを示唆
する。

pM10が、実際にスプライスされていないHIV−1 mRNA
（tatの72aa形を暗号化している）の細胞質発現を特異
的に防止することによって作用するということを証明す
るため、マリムら［（1988年）、前掲］のS1ヌクレアー
ゼ防御検定法を使用した。この検定法（第11B図）は、p
BC12/CMV 2.75μｇ＋pcREV 2.5μｇ（レーン１）;pgTAT
2.5μｇ＋pBC12/CMV 2.75μｇ（レーン２）;pgTAT 2.5
μｇ＋pcREV 0.25μｇ＋pBC12/CMV 2.5μｇ（レーン
３）;pgTAT 2.5μｇ＋pcREV 2.75μｇ（レーン４）;pgT
AT 2.5μｇ＋pcREV 0.25μｇ＋pM10 2.5μｇ（レーン
５）;pgTAT 2.5μｇ＋pcREV 0.25μｇ＋ｐΔ10/14 2.5
μｇ（レーン６）でトランスフェクトされたCOS細胞（1
00mm）の細胞質において発現されるスプライスされた
（Ｓ）およびスプライスされない（Ｕ）tat mRNA濃度を
定量する。添加したDNA合計は、陰性対照とした親発現
ベクターpBC12/CMVを含めて、合計5.25μｇに保った。

60時間トランスフェクション後、細胞質RNAを分析用
に回収し、５μｇアリコートをS1ヌクレアーゼ防御検定
に使用した。使用したDNAプローブは、tatの第１の暗号
エキソン内にあるXhuo II部位で、クレノーDNAポリメラ
ーゼを使用して末端標識した798塩基対のプローブであ
る（マリムら、［1988年］、前掲）。トランスフェクト
したCOS培養で、スプライスされない（Ｕ）およびスプ
ライスされた（Ｓ）細胞質tat m RNA濃度をともに定量
し得るよう、プローブ（Ｉ）を設計した。このプローブ
を使用して、スプライスされた（Ｓ）tat mRNAは202nt
プローブ断片を救援すると予想し、スプライスされない
（Ｕ）tat mRNAは506nt断片を救援すると予想した。ス
プライスされないRNAの相対濃度を、各レーン毎にLKBソ
フトレーザースキャナーを使用するデンシトメトリーに
よって定量した。これを可視化して、第11B図に示した
結果から、レーン２では14％がスプライスされず、レー
ン３では63％がスプライスされず、レーン４では82％が
スプライスされず、レーン５では22％がスプライスされ
ず、レーン６では24％がスプライスされなかった。

予想されたように、スプライスされたtat mRNAは、pg
TAT単独でトランスフェクトした細胞の細胞質で顕著で
あったが（第11B図、レーン２）、スプライスされないt
at mRNAは、HIV−1 Revタンパク質を同時発現した細胞
の細胞質で優性な細胞質種であった（第11B図、レーン
３および４）。然しpgTATをpcREVおよびpM10の双方と同
時発現させると、tat mRNAのスプライスされた形の細胞
質優位性を回復している（第11B図、レーン５）。

レーン５および６で負荷したRNAの合計量は若干低い
ようであるが、それにもかかわらずpM10（レーン５）が
pgTATベクターからのRev誘導のスプライスされないtat
mRNAの細胞質発現を選択的に抑制できることは明らかで
ある。事実、pcREVおよびpM10の双方の存在で検出した
スプライスされないtat mRNAの相対濃度は、Revの存在
なしで観察した濃度に匹敵する。

これと同じパターンがｐΔ10/14でも明らかである
（第11B図、レーン６）。これらの結果は、さらに３′
からM10突然変異へまたがるRev遺伝子の欠失（ｐΔ10/1
4）もRev機能のトランス−抑制因子を暗号化しているこ
とを示している。M10突然変異の部位から広がるｐΔ9/1
4と呼ばれる一層幅広い欠失も優性な負の表現型を示す
（第１表）。然しM8突然変異の部位へ広がる欠失はもは
やトランス優性ではなかった（成績は示さず）。

［実施例10］ pM10 Rev変異体はrev機能の競合的抑制因子である 第11Aおよび11B図に示した実験結果から、pM10はトラ
ンスで存在すると、野生型Rev機能を抑制できることが
判る。然しこれらの実験はpM10の大過剰の存在で実施さ
れた。Rev機能のトランス−抑制の効果を一層正確に定
量化するため、pcREVの単一濃度によるpHIV−１Δrevプ
ロウイルス突然変異体の救援を抑制するpM10の濃度増大
による抑制能を分析した。またこの実験では、pM4およ
びｐΔ10/14Rev変異体の濃度を増大する効果、および野
生型Revそのものの発現水準を単に増大する効果を試験
した。

第12図に示したように、COS細胞培養（35mm）を、pHI
V−１Δrev 25ngおよびpcREV 50ngで同時トランスフェ
クトし、pcREV（▼）、pM4（△）、ｐΔ10/14（○）、
またはpM10（■）の倍数モルの過剰を増大した（即ち、
10倍とは示したプラスミド組立て体500ngの同時トラン
スフェクションを表す）。DNAの添加量合計は、陰性対
照とした親発現ベクターpBC12/CMVを含めて合計587.5ng
に保った。SEAP遺伝子発現ベクターを内部対照として同
時トランスフェクトした（１培養当たり12.5ng）。65時
間目に上清培地を採取し、上清のp24 Gag発現水準を測
定することによって検定した。

この検定の結果を、競合するrevベクターが全く存在
しない場合に得られたp24の発現水準（水準を1.00と規
定）と比較して第12図に示す。すべての値はpHIV−１Δ
rev 25ng、pcREV 50ng、pBC12/RSV/SEAP 12.5ngおよびp
BC12/CMV 500ngでトランスフェクトした培養で観察され
たp24 Gagの発現水準との相対値で表す。この対照培養
（●）は、添加したRev変異体の競合的効果の測定に対
する基準値となるが、p24 Gag発現を1.00単位水準と便
宜的に規定した。ここに提示した値を上清SEAP濃度で観
察された僅かな変動について補正する（平均SEAP活性は
1.00±0.27（範囲1.28〜0.72））。

図に示したように、野生型rev発現ベクターpcREVのト
ランスフェクション水準が増大すると、ウイルス複製に
対して緩和なプラスの効果が働き、培地へのp24 Gagの
放出に最高で−70％の増大をもたらすことが判明した。
これに反してpM10ベクターを同時トランスフェクトする
と、HIV−１構造遺伝子の発現に劇的な抑制効果を示し
た。得られた抑制パターンは、生物学的標的に対して野
生型Revと同一の親和性を示すRev機能に対する競合的な
抑制因子として期待させるものである。即ち、等モル量
のpM10ではp24 Gagの発現を−２倍数減少し、２倍過剰
のpM10では発現を−３倍数減少し、５倍過剰では−６倍
数減少したが、10倍過剰ではp24 Gag発現を−93％減少
した。

pM10以外にも、ｐΔ10/14の同時トランスフェクショ
ンでp24 Gagの発現を減少するが、Revのこの大きな欠失
変異体はpM10ほど有効な抑制因子ではなかった。ｐΔ10
/14によって発現される厳しく先端を切り取ったタンパ
ク質は、生物学的標的へのRevの結合を促進する配列を
欠いているため、効果が低い競合因子である。

最後にpM4の同時トランスフェクションも僅かである
が同様に抑制効果を示す（最高用量を使用しても２倍以
下（32％））。この効果は、RRE結合と無関係な活性
（鎮圧）から生じるように考えられる。

［実施例11］ HIV−1 Revトランス−活性化因子のドメイン構造 上述のように、トランスフェクトした細胞における一
過性の遺伝子発現分析を用いて、HIV−１のトランス−
作用性遺伝子生産物Revの一連のミスセンスおよび欠失
変異体の生物学的活性を調べた。これらの結果は、第12
A図（図でＳはスプライス部位を構成する）に模式的に
示したように、Rev内に２つの機能的ドメインが存在す
る可能性を明らかに示している。しかもこれらの２つの
ドメインはトランス−活性化に不可欠であり得る（ハッ
チング部分）。

これらのドメインのうち、４種のミスセンス変異体、
pM4、pM5、pM6およびpM7で限定されている第１ドメイン
（RNA結合ドメイン）は、野生型Revのおよそのアミノ酸
位置10〜およそのアミノ酸位置68の間の約35アミノ酸領
域にまたがっており、Revの核局在化に不可欠である高
塩基性配列要素を含んでいる。このドメインはまた、核
局在化（NL）シグナルを含んでいる（黒枠）。このドメ
イン内で変化した突然変異体は劣性の負の表現型を示
す。

これに対して第２ドメイン（活性化ドメイン）内の突
然変異は、ほぼアミノ酸残基79を中心にして、一般にミ
スセンス変異体pM10および欠失変異体ｐΔ9/14およびｐ
Δ10/14によって限定されており、Rev機能の喪失を生じ
るが、注目すべきことは、これらの変異体によって示さ
れる負の表現型はトランス優性なことである。Revの２
つの領域（第12A図、ハッチング部分）はタンパク質機
能にとってさほど必要でないようである。図で示したよ
うに、Rev活性化ドメインの突然変異はRevを欠損させ、
野生型Rev機能を競合的に抑制するタンパク質の生産を
生じる。このトランス抑制は、トランスフェクトした細
胞内でのHIV−１複製を著しく減少または抑制するに十
分である。pM10および関連する欠失変異体によって示さ
れる優性な負の表現型に関する分子的原理はまだ判って
いない。然しミスセンス（M10）および欠失（Δ9/14、
Δ10/14）変異体が、何れもRev機能をトランスで抑制で
きる観察結果から、属性の獲得より、むしろその喪失が
関与していることが示唆される。一つの可能性は、欠損
型Revタンパク質分子が野生型Revタンパク質のサブユニ
ットと混合多量体を作ることができ、そのため野生型タ
ンパク質の機能をトランス優性な態様で抑制するのかも
知れない。然しながら生体内でRev機能が単量体である
か、多量体であるのかは現在のところ判っていない。多
数の原核性および真核性転写因子の詳細な機能分析を含
む以前の研究に基づいた別の仮説では、転写トランス−
活性化因子が、タンパク質をその好適な標的物質へ向か
わせる特異的な「結合ドメイン」と、結合反応の機能的
結果を発揮させる「活性化ドメイン」（この場合は転写
活性化）の２つの異なった機能的ドメインを保有してい
るというものである。幾つかの系で、結合ドメインが配
列特異的なDNA結合要素からなることが判明した。然し
少なくとも１つの例では、単純ヘルペス１型ウイルス
（HSV−１）トランス−活性化因子VP16の場合、結合ド
メインは細胞性転写因子との特異的な相互作用を仲介す
る代わりに、HSV−１ゲノム内の標的配列へ結合するよ
うである。重要なことは、結合ドメインの突然変異は緩
和な発現水準で劣性である負の表現型を生じる傾向があ
ることである。これとは対照的に、転写因子の活性化ド
メインの突然変異または欠失は、優性な負の表現型を備
えた変異体を生じ得る。これらの変異体はインタクトな
結合ドメインを保有しており、好適な細胞標的へ結合す
る野生型トランス−活性化因子と競合するが、いったん
結合が起こると転写を活性化できないと信じられる。HS
V−1 VP16タンパク質の場合、そのようなトランス優性
な変異体の過剰発現は野生型VP16機能を効果的に抑制
し、そのために正常な許容細胞でHSV−１の複製を妨害
することが判明した。

rev遺伝子生産物は遺伝子発現の転写後トランス−調
節因子であるが、この場合に２つの異なった機能的ドメ
インの概念が適用し得ると考えるのが合理的なようであ
る。特にRevは、そのRNA標的配列（RRE）との直接的な
相互作用を介して、極めて配列特異的な態様で機能する
ので（M.H.マリムら、セル、60巻、［1990年］、675〜6
83頁）、したがってこの特異性を付与する配列を含んで
いるはずである。いったん結合が起これば、その結果は
活性化反応（この場合、HIV−１構造タンパク質を暗号
化している不完全にスライスされたRNAの核放出）へ翻
訳されるはずである。したがってこの活性化ドメインに
おける突然変異は、野生型Rev機能の競合的な抑制因子
を生じ得る。これがRevのpM10およびｐΔ10/14変異体で
観察された表現型であり、これらの変異体は分離した活
性化ドメインの存在を示しているのかも知れない。逆に
この突然変異分析によって規定されたRevタンパク質の
第２の一層Ｎ−末端に不可欠な領域は、数個の転写因子
であると定義された「結合ドメイン」と同一機能を果た
し得る。事実、このドメインで変化した突然変異体（例
えばpM4、pM7）は、低いけれども有意な抑制を高い発現
水準で観察されるが、一般に劣性の負の表現型を示す。
Rev活性化ドメインの局在化を、野生型Revのおよそのア
ミノ酸位置68〜およそのアミノ酸位置90、特におよその
位置78〜およその位置86、ことにおよその位置78〜およ
その位置83または84まで伸長するように高めるトランス
優性な突然変異体がそれ以外にも発見された（第5A図、
および実施例11Aおよび11B参照）。

［実施例11a］ それ以外のトランス優性なHIV−1 Rev突然変異体 6.2項で報告した方法と同様に、それ以外のHIV−1 re
v変異体を作成した。これらを第5A図および第２表に示
したように命名し、特性を調べた。生体内における表現
型をマリムらの方法（M.H.マリムら、セル、58巻、［19
89年］、205〜214頁）にしたがい測定した（すべての検
定はトランスフェクション効率のため内部的に調節し
た）。

実施例４〜11に報告した変異体に追加して、それ以外
の突然変異体、pM21、pM22、pM27、pM28、pM29およびpM
32が、野生型HIV−1 Rev機能をトランス優性に抑制する
ことが判明した。

［実施例11b］ HIV−２およびSIV Rev機能に対する効果 実施例４〜11のトランス優性なHIV−1 rev遺伝子突然
変異体の多価可能性を、6.2項およびM.H.マリムら（プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・USA、86巻、［1989
年］、8222〜8226頁）が既に報告した手法を使用して分
析した。得られた結果から、少なくとも変異体pM10はHI
V−1 rev遺伝子の表現型発現ばかりでなく、HIV−2 rev
遺伝子およびSIV_macrev遺伝子機能をもトランス優性に
抑制する抑制能を有することが判った。例えばHIV−2 r
evの場合、pM10の過剰を野生型HIV−2 rev遺伝子ととも
に発現させると、細胞質におけるスプライスされないmR
NAおよびエキソン１個形のtatの発現の抑制によってHIV
−2 Rev機能を強力に抑制する。

［6.3］ ［実施例12］ Rex機能の分析 Rex機能に対してrex突然変異体を試験するため（第14
図）、DEAE−デキストランを使用して、各変異体DNAをp
gTAX−LTRとともにCOS細胞へ同時トランスフェクトした
（B.P.カレン、メソッズ・イン・エンジモロジー、152
巻、［1987年］、692〜693頁）。プラスミドはすべて1.
25μg/mlの濃度で添加した。48時間トランスフェクショ
ン後、細胞を³⁵S−システインで代謝的に２時間標識
し、細胞抽出物を調製し、試料を、HTLV−Ｉエンベロー
プタンパク質と特異的に反応する0.5αヒトモノクロー
ナル抗体で免疫沈降させた。免疫沈降物をSDS−10％ポ
リアクリルアミドゲルで分析した。

HTLV−I Env、TaxおよびRexタンパク質生産物を同時
分析するため（第15図）、COS細胞をpgTAX−LTR（0.1μ
g/ml）および突然変異体Rexタンパク質を暗号化してい
るベクター（１μg/ml）または野生型pREX、pRevおよび
pCMV−IL−２ベクター（１μg/ml）で同時トランスフェ
クトした。HTLV−Ｉタンパク質の免疫沈降分析のため、
下記の抗体を使用した。Env:0.5α抗体、Tax:Tax特異的
な抗ペプチド家兎抗血清［発明者の１人が調製、またW.
ワックスマンらの方法（サイエンス、235巻、［1987
年］、674〜677頁）によっても調製できる］、Rex:Rex
特異的な抗ペプチド家兎抗血清［発明者の１人が調製、
またH.シーミらの方法（セル、55巻、［1988年］、197
〜209頁）によっても調製できる］。各例毎に、放射能
標識した細胞抽出物をそれぞれ３回ずつ免疫沈降および
電気泳動分析に使用した。得られたオートラジオグラム
を、それぞれの関連領域だけ第15図のパネルに示す。

免疫沈降によるHTLV−I Rex変異体の亜細胞性局在化
のため（第16図）、表記の発現プラスミドでCOS細胞を
トランスフェクトし、48時間後にパラホルムアルデヒド
で固定した。ついで細胞を、前に述べたように家兎抗Re
xペプチド抗血清（1:100倍希釈）およびローダミン結合
ヤギ抗家兎IgGで逐次染色した（B.R.カレン、［1987
年］、前掲）。

［実施例13］ RexおよびRev機能の抑制 野生型Rexタンパク質の機能を抑制するrex突然変異体
の抑制能を分析するため（第17A図）、COS培養をpgTAX
−LTR（1.25μg/ml）、pREX（0.1μg/ml）と、Rex変異
体（レーン１〜６）、pREX（レーン７）、pRev（レーン
８）またはpCMV−IL−２（レーン９）１μg/mlを含むそ
れぞれ３種のプラスミドで同時トランスフェクトした。
Env生産物を0.5αモノクローナル抗体との免疫沈降およ
びSDS−10％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に
より分析した。HIV−1 revタンパク質機能の抑制を分析
するため、COS細胞をpgTAT、pReV、および10倍モル過剰
のpBC/CMV−IL−２またはM6、M7およびM13トランス優性
変異体で同時トランスフェクトした。48時間の培養およ
び³⁵S−システインによる生合成的な標識ののち、細胞
抽出物を、Rev誘導した先端を切り取った72アミノ酸形
のTatタンパク質生産物の免疫沈降によって検定した
（レーン２）。完全鎖長のTatタンパク質の86アミノ酸
形だけが検出されたように、10:1のモル比で、M6、M7お
よびM13（レーン３〜５）変異体は、HIV−1 Revタンパ
ク質の作用を完全に抑制した。HIV−１複製の抑制を分
析するため、rev欠損型HIV−１プロウイルスプラスミド
pHXB2−Bam−p3（M.R.ファインバーグら、セル、46巻、
［1986年］、807〜817頁）およびpREXで、M1、M6、M7お
よびM13変異体のそれぞれ表記した過剰倍数量の存在
で、COS細胞を同時トランスフェクトした。トランスフ
ェクション混合物中のDNA濃度の合計は、pBC/CMV−IL−
２親ベクターの添加量を変えることによって一定濃度に
保った。トランスフェクション３日後、HIV−1 p24Gag
タンパク質の上清濃度をELISA（コールター・イムノロ
ジー・キット）によって測定した。M6、M7およびM13変
異体は用量に比例したHIV−1 p24生産の抑制を生じた
が、劣性の負のM1変異体は抑制を示さなかった。

［７］薬理学的考察 HIV−１はエイズの主な病因学的な作図である。HTLV
−Ｉは一般にATLの原因となる。HTLV−IIは異型Ｔ細胞
毛状細胞性白血病のある種の例に病因学的に関係する。
HIV−1 RevおよびHTLV−I Rexトランス−活性化因子
は、培養で複製に不可欠であることが判明し、Revおよ
びRexはしたがって罹患患者における化学療法介入の可
能性のある目標である。

ここで報告するのは、野生型RevまたはRexでトランス
フェクトされた細胞で野生型Revおよび／またはRex機能
の有効な競合的抑制因子として作用し、したがってHIV
−１および／またはHTLV−Ｉおよび／またはHTLV−II複
製の有効な抑制因子として作用するRevおよび／またはR
exの変異体形態である。したがってこれらの変異体は、
感染にさらされた患者のリンパ細胞を保護するのに使用
し得る。この研究の実用化が期待できる適応は、HSV−
１の本質的なVP16トランス−活性化因子に類似したトラ
ンス優性な誘導体の発現が、HSV−１感染に対する耐性
を正常な感受性細胞集団へ有効に付与できた観察結果で
ある（A.D.フリードマンら、ネーチャー、335巻、［198
8年］、452〜454頁）。また対応するトランスジェニッ
クマウスがHSV−１感染に対して免疫されるようであ
る。

即ち、RexまたはRevのトランス優性な抑制因子を暗号
化した突然変異体rexおよびrev遺伝子は、HTLV−Ｉまた
はHTLV−IIによって起こる疾患の処置、またはエイズお
よびARS（ARC）を含むHIV−１で誘発される疾患の処置
に、それぞれ「細胞内免疫原」として使用するのに薦め
られる。さらにこの発明の少なくとも幾つかのトランス
優性なRex突然変異体タンパク質は、特にHTLV−I Rexお
よびHIV−1 Revタンパク質作用を両者とも抑制できる特
性を有するから、この２種類のウイルス型による感染の
処置への使用が薦められる。この特性は、１種類以上の
これらのウイルス性病原に同時感染した患者、またはそ
の感染がこれら２つのウイルス間で鑑別できない患者の
場合、特に有用であり得る。

１種類以上のウイルス種に対して有効な治療剤の存在
は、この発明以前には全く開示されていないと思われ
る。広範な適用性の観点から、上記の概念は、Revおよ
びRexを暗号化しているウイルス種によって起こされた
疾患の治療に適用されるだけでなく、同様に調節される
遺伝子を有する微生物によって起こされたそれ以外のウ
イルス疾患にも適用され得るであろう。

このようにこの発明は、ウイルス疾患の予防および治
療、特にATL（成人Ｔ細胞白血病）、エイズ（後天性免
疫不全症候群）、ARSまたはARC（エイズ関連症候群また
は複合体）、SIV_macのようなSIV（サル免疫不全ウイル
ス）、FIV（ネコ免疫不全ウイルス）、EIAV（ウマ感染
性貧血ウイルス）、ビスナウイルスおよびウシ免疫不全
ウイルス感染症のようなレトロウイルス、具体的にはヒ
トレトロウイルス疾患、より具体的にはrexまたはrev遺
伝子によって調節される病原体、またはそれと同等な病
原体によって起こるATL、エイズ、およびARS（ARC）の
ようなヒトレトロウイルス疾患の予防および治療への使
用に適用される。

特に好都合なことは、そのリプレッサー効果の多価性
であって、HIV−１およびHTLV−Ｉに同時感染した静注
薬使用者でしばしば見られるようなウイルスによる多重
感染、特に二重感染の処置、またはそれ以外の感染（例
えばHIV感染）の危険が増大している単純感染状態の処
置、異なったウイルス種スペクトルによる感染を防御す
ることが望ましい状態の予防に有用である。

この多価性は、ある特定型のウイルスの関連ウイル
ス、例えばレトロウイルスの抑制に最も有効であると通
常期待されるが、DNAウイルスないしRNA（レトロ−）ウ
イルスの何れかのように、必ずしも極めて近縁のウイル
スに制限される必要はなく、例えばHIV−１とJCウイル
ス（ヒトパポーバウイルス）間のようなDNAウイルスと
レトロウイルスの間の感染レベルで相互作用が存在し
（H.ゲンダーマンら、プロシーディングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・
ザ・USA、83巻、［1986年］、9759〜9763頁、H.タダ
ら、同誌、87巻、［1990年］、3479〜3483頁）、したが
って上記の多価トランス優性の原理が適用できる系統的
に一層離れたウイルス種で共通の調節メカニズムがよく
作動し得ることが知られている。

この発明の治療上の可能性は、例えばHTLV−ＩのRex
機能およびHIV−１のRev機能の抑制がウイルスの複製を
阻止し、感染性ウイルス粒子の生成を防止することによ
って、感染の潜伏段階を持続させることが期待されるか
ら直ちに明白である。したがって既にHIV−１ウイルス
に感染した対象の細胞は、トランス優性なリプレッサー
の遺伝子をそのゲノムに組み込んで保有しており、細胞
は機能的なまま温存され、対象は長期治療の必要なく、
疾患の症状をいつまでも発現しない。

この観点に立てば、この発明の遺伝子は、それ自体医
薬品であって、生体内へ直接、または生体外で間接に、
１回または多回投与により、好ましくは例えばレトロウ
イルスベクターまたはプラスミドベクターのようなベク
ターを要素として、標的哺乳動物細胞へ機能的な形態で
送達を達成し得るのに好適な形態で投与される。例えば
そのようなウイルス複製のトランス優性な抑制因子を暗
号化している遺伝子を、感染患者自身に由来するリンパ
細胞のゲノムへ直接埋め込むことにより、患者の細胞へ
生体外で挿入を行い、挿入を実施した後、それらの細胞
を保菌患者へ投与し得る。HTLV−ＩおよびHTLV−II、お
よびHIV−１はさまざまな型のＴ細胞で複製するので、
それらが原因となった疾患は特に好適であると思われ
る。

したがってこの発明の１適用は、例えばフリードマン
が報告した遺伝子治療の概念に相当する（T.フリードマ
ン、サイエンス、244巻、［1989年６月16日号］、1275
頁、またはP.M.レーン．ボーン・マロー・トランスプラ
ント、１巻、［1987年］、243頁）。造血幹細胞を例え
ばエイズ/ATL患者から採取し、生体外で培養し、この発
明により突然変異して、Rex/Rev機能のような抑制すべ
き機能に対するトランス優性リプレッサーを暗号化して
いる遺伝子を、レトロウイルスベクターを利用してこれ
らの細胞へ埋め込み、このようにしてウイルス耐性とな
った子孫生産能を備えた幹細胞を、もとの患者の免疫系
へ戻してやると、細胞は、獲得した未処置幹細胞より選
択的な優位性により増殖することが期待される。やがて
造血細胞の集団は完全にトランス優性な因子を生産する
細胞から構成され、ウイルス耐性である。

これを実施する方法は技術上既知である（例えば米国
特許第4868116号）。この発明によって突然変異した遺
伝子を、骨髄細胞のような標的哺乳動物細胞へ送達する
ためのベクター、例えばレトロウイルスベクターまたは
プラスミドベクターは報告されており、ここに引用する
（サイエンス、244巻、［1989年６月16日号］、1275
頁）。したがって、例えば種々のRevおよび／またはRex
トランス優性遺伝子をレトロウイルスベクター系へクロ
ーン化する。レトロウイルス依存性遺伝子を、例えばHI
V感染したヒトの細胞系へ送達したのち、トランス優性
な突然変異体の抑制効果をウイルス生産物の抑制によっ
て容易に確かめられる。

上記の治療概念は、バルチモアが着想した細胞内免疫
の例である（D.バルチモア、ネーチャー、335巻、［198
8年］、395頁）。簡単に説明すると、この概念は、選ば
れたウイルスのある生活機能のリプレッサーを暗号化し
ている遺伝子を、そのウイルスが感染した特定の標的細
胞へ挿入することからなる（例えばエイズを起こすウイ
ルスの場合、特定のＴ細胞）。この研究方法を任意のウ
イルスのトランス優性リプレッサーで治療に適用するに
は、そのような突然変異体タンパク質を暗号化している
遺伝子のための可能性あるベクターおよびこれらのベク
ターを適当な細胞へ挿入する、モデル系で確かめられた
可能性ある方法を、ヒトまたは動物へ適用するのに有効
で安全な細胞内送達システムの構成が確立されることが
前提条件である。この概念を実験的に立証するための試
験を実行に移すには、現在のところ遺伝子治療を防止し
ようとする倫理的な障壁のために必ず困難が伴う。然し
そのような遺伝学的な最初の実験は、非治療的な目的で
既に開始された。その方法の無害性が証明されれば、極
めて短期間にこれらの先駆的な実験に引き続き、まずエ
イズ疾患のような救命的な条件で、治療目的に向かって
類似の研究が行われるであろう。この発明はそのような
研究で初期の利用によく適合すると思われる（T.フリー
ドマン、サイエンス、244巻、［1989年６月16日号］、1
279頁、第２欄、「インフェクシアス・ディシージ
ズ」、参照）。

この発明を利用するもう一つの態様は、遺伝子ではな
くてこの発明のリプレッサータンパク質を標的細胞へ挿
入することを含む。投与は、例えば経口または非経口
で、例えばリポソームを介する送達によって細胞内へ透
過できる形で通常の態様で実施する。

言うまでもなく、これらの用途のための正確な投与量
は、使用する化合物、投与方法および所望する処置によ
って変わる。個々の状態に応じて最も好適な投与量を確
定することは、当業者の熟知するところである。

この発明はさらに、トランス優性に基づいた抗ウイル
ス薬の設計および技術に使用することができる。この発
明によって、ウイルスの種類によりその構造的原理は幅
広く変わるけれども、数種のウイルス種に全般に適用可
能であると思われるウイルス遺伝子機能を操作する手段
を発見した。この予期しなかった発見は、さらに特異的
な、多分低分子量で、多分非ペプチド性のトランス優性
なウイルス複製の抑制剤、特にトランス優性な、即ち、
低分子量の抑制剤または中和モノクローナル抗体のよう
な、変異体RevまたはRexタンパク質におけるRNA−結合
ドメインを一次的に真似ることができる抑制剤を設計す
ることを目的とした研究を行う道を開いた。

以上説明した発明に関して、この発明の範囲から逸脱
することなく、その態様または詳細の点でさまざまな組
み合わせまたは変更を行うことができることは明らかで
ある。

本明細書で報告した変異体以外にも、既に組み立てら
れた特異的な突然変異体の中で、まだ特性が明らかにな
っていないが、一層詳細な実験によってトランス優性に
抑制的であり、または多価であることが確かめられる変
異体、および前記の原理に基づき、ただし本明細書では
具体的に説明を加えなかったそれ以外の突然変異体もま
た、この発明の範囲に包含されることは明らかである。

この発明によって下記の各事項が可能となる。

（１） １種以上のウイルス種の機能的に等価な遺伝子
の表現型発現をトランス優性に抑制し、したがって１種
以上のウイルス種の複製を阻止するタンパク質を暗号化
している遺伝子、またはその機能的な断片または誘導
体。

（２） １種以上のウイルス種の機能的に等価な遺伝子
の表現型発現をトランス優性に抑制し、したがって１種
以上のウイルス種の複製を阻止するタンパク質、または
その機能的な断片または誘導体。

（３） それによって抑制される遺伝子が、HTLV−I re
x、HTLV−II rex、HIV−1 rev、HIV−II rev、SIVrev、
EIAV rev、ビスナウイルス rev、およびウシ免疫不全
ウイルス revの２種またはそれ以上から選ばれたもの
である１記載の遺伝子、または２記載のタンパク質、ま
たは抑制される遺伝子が、HTLV−I rexおよびHIV−1 re
vである１記載の遺伝子、または２記載のタンパク質、
または抑制される遺伝子が、HIV−1 revおよびHIV−2 r
evである１記載の遺伝子、または２記載のタンパク質、
または、野生型Rexタンパク質の約22〜101の間、好まし
くは約82〜約97の間、ことに約87〜約94の間のアミノ酸
位置に突然変異体を有するHTLV−I Rexタンパク質を暗
号化している１記載の遺伝子、またはHTLV−I Rexタン
パク質である２記載のタンパク質、または野生型Rexタ
ンパク質の約59〜121の間、好ましくは約59、60、64、6
5、119、120、または121のアミノ酸位置に突然変異体を
有するHTLV−I Rexタンパク質を暗号化している１記載
の遺伝子、またはHTLV−I Rexタンパク質である２記載
のタンパク質、または野生型Revタンパク質の約68〜90
の間、好ましくは約78〜約86の間、ことに約78〜約83ま
たは84の間のアミノ酸位置に突然変異体を有するHIV−1
Revタンパク質を暗号化している１記載の遺伝子、また
はHIV−1 Revタンパク質である２記載のタンパク質、ま
たはpcRexM2、pcRexM7、およびpcRexM8、M6、M7およびM
13、およびpM10の遺伝子またはタンパク質、またはそれ
らから誘導された遺伝子またはタンパク質から選ばれた
１記載の遺伝子、または２記載のタンパク質、または機
能的なその断片または誘導体。

（４）HTLV−I rex遺伝子の表現型発現をトランス優性
に抑制するタンパク質を暗号化している遺伝子、または
タンパク質、または機能的なその断片または誘導体。

（５）それによってHTLV−I rex遺伝子の表現型発現が
抑制される４記載の遺伝子またはタンパク質、または野
生型Rexタンパク質の約22〜101の間、好ましくは約82〜
約97の間、ことに約87〜約94の間のアミノ酸位置に突然
変異体を有するHTLV−I Rexタンパク質を暗号化してい
る４記載の遺伝子、またはHTLV−I Rexタンパク質であ
る４記載のタンパク質、または野生型Rexタンパク質の
約59〜121の間、好ましくは約59、60、64、65、119、12
0、または121のアミノ酸位置に突然変異体を有するHTLV
−I Rexタンパク質を暗号化している４記載の遺伝子、
またはHTLV−I Rexタンパク質である４記載のタンパク
質、またはpcRexM2、pcRexM7、pcRexM8、pcRexM17、お
よびpcRex13Δ15、およびM6、M7およびM13の遺伝子また
はタンパク質、またはそれらから誘導された遺伝子また
はタンパク質から選ばれた４記載の遺伝子またはタンパ
ク質、または機能的なその断片または誘導体。

（６）HIV−１、HIV−２、SIV、EIAV、ビスナウイル
ス、またはウシ免疫不全ウイルスのrev遺伝子の表現型
発現をトランス優性に抑制するタンパク質を暗号化して
いる遺伝子またはタンパク質、または機能的なその断片
または誘導体。

（７）それによってHIV rev遺伝子の表現型発現が抑制
される６記載の遺伝子またはタンパク質、またはそれに
よってHIV rev遺伝子の表現型発現が抑制される６記載
の遺伝子またはタンパク質、または野生型Revタンパク
質の約68〜90の間、好ましくは約78〜約86の間、ことに
約78〜約83または84の間のアミノ酸位置に突然変異体を
有するHIV−1 Revタンパク質を暗号化している６記載の
遺伝子、またはHIV−1 Revタンパク質である６記載のタ
ンパク質、またはpM10、ｐΔ9/14、およびｐΔ10/14、
およびpM21、pM22、pM27、pM28、pM29、およびpM32の遺
伝子またはタンパク質、またはそれらから誘導された遺
伝子またはタンパク質から選ばれた６記載の遺伝子また
はタンパク質、またはpM10、pM21、およびpM32の遺伝子
またはタンパク質、またはそれらから誘導された遺伝子
またはタンパク質から選ばれた６記載の遺伝子、または
機能的なその断片または誘導体。

（８）少なくとも１個のトランス優性な負の突然変異体
によってRexタンパク質の野生型の形から、Rexタンパク
質のエフェクター活性を示す野生型Rexタンパク質のペ
プチドドメインに修飾を受け、実質上、Rexタンパク質
の野生型の形の核小体局在化活性を有するリプレッサー
であるHTLV−I Rexタンパク質のトランス優性なリプレ
ッサーを暗号化しているDNAセグメント。

（９）少なくとも１個のトランス優性な負の突然変異体
によってRexタンパク質の野生型の形から、Rexタンパク
質のエフェクター活性を示す野生型Rexタンパク質のペ
プチドドメインに修飾を受け、実質上、Rexタンパク質
の野生型の形の核小体局在化活性を有するリプレッサー
であるHTLV−I Rexタンパク質機能のトランス優性なリ
プレッサー。

（10）第１ドメインは実質上、野生型HIV−1 Revの特異
的結合機能を有し、第２ドメインは野生型HIV−1 Revの
活性化機能を有せず、第２ドメインは１またはそれ以上
の突然変異体によって野生型HTLV−I Revから修飾され
たものである第１ドメインおよび第２ドメインを含んで
いるHTLV−I Rev機能のトランス優性なリプレッサー。

（11）実質上、野生型Revの特異的結合機能を有する第
１ドメインを含んでおり、野生型HIV−1 Revの活性化機
能を有していないHIV−1 Rev機能のトランス優性なリプ
レッサー。

（12）好適な発現系から対応する野生型遺伝子を単離
し、この遺伝子を好適なクローニング系へ加えて、所望
の突然変異を遺伝子へ導入し、所望の突然変異を有する
クローンから得られた突然変異遺伝子を回収することを
含んでなる１、４および６の何れか１項記載の遺伝子の
生産方法。

（13）好適な発現系および増幅系で１、４および６の何
れか１項記載の遺伝子を発現ならびに増幅し、得られた
生産物を回収することを含んでなる２、４および６の何
れか１項記載のタンパク質の生産方法。

（14）１、４および６の何れか１項記載の遺伝子、また
は２、４および６の何れか１項記載のタンパク質、また
は機能的なその断片または誘導体を所望の予防または治
療効果を達成し得る好適な形で製薬上許容し得る担体ま
たは希釈剤とともに含有している医薬組成物。

（15）１、４および６の何れか１項記載の遺伝子、また
は２、４および６の何れか１項記載のタンパク質、また
は機能的なその断片または誘導体を所望の予防または治
療効果を達成し得る好適な形でそのような処置を必要と
する対象へ投与することを含んでなるウイルス感染の処
置方法。

（16）HIV−１、HTLV−Ｉ、またはHTLV−IIウイルスの
何れか１つを複製し、HTLV−I Rex機能トランス優性リ
プレッサーを産生する該DNAセグメントを発現する能力
を有する細胞へ８記載のDNAセグメントを導入すること
を含んでなるHIV−１、HTLV−Ｉ、またはHTLV−II複製
の抑制方法。

（17）HIV−１で感染させた細胞へHIV−1 Rev機能を導
入することを含んでなるHIV−１複製の抑制方法。

（18）医薬として使用する１、４および６の何れか１項
記載の遺伝子、または２、４および６の何れか１項記載
のタンパク質、または機能的なその断片または誘導体。

（19）１、４および６の何れか１項記載の遺伝子、また
は機能的なその断片または誘導体を、標的哺乳動物細胞
へ機能的な形で送達し得る好適な形態で含有するベクタ
ー。

（20）トランス優性なドメインを３、５、または７に記
載の突然変異体RexまたはRexタンパク質に似せることが
できる抑制剤。

（21）（ｉ）−Rexタンパク質によって認識される調節
応答要素、および少なくとも１個の未使用のスプライス
部位を含んでいるmRNAを暗号化しているDNAセグメン
ト、 −発現されると、核小体からのmRNAの放出を誘発するタ
ンパク質生産物を生産することが可能なrex遺伝子を暗
号化しているDNAセグメント、 −rex遺伝子を暗号化しているDNAセグメントおよびmRNA
を暗号化しているDNAによって形質転換され、rex遺伝子
のタンパク質生産物の発現能およびmRNAの発現能を保有
する宿主を含んでなる遺伝子系を提供し、 （ii）この遺伝子系の細胞を含有する培養を、Rexタン
パク質の特異的抑制因子であることが疑われる因子が細
胞へ侵入するような条件下で該因子と接触させ、 （iii）未使用のスプライス部位を含んでいるmRNAの核
からの放出に対するこの因子の効果を測定し、 （iv）スプライス部位を使用したmRNAのスプライス形態
の核からの放出に対する該因子の効果を測定し、 それによって未使用のスプライス部位を含んでいるmRNA
の放出を低下し、それと同時にmRNAのスプライス形態が
低下しなければ、該因子がHTLV−I rex遺伝子の活性ま
たはrex遺伝子生産物の活性の特異的な抑制因子である
ことを示す 段階を含んでなるRexタンパク質の遺伝子活性化機能の
特異的抑制因子の同定方法。

（22）−Rexタンパク質によって認識される調節応答要
素を含んでいるmRNA、および少なくとも１個の未使用の
スプライス部位を暗号化しているDNAセグメント、 −発現されると、核小体からmRNAの放出を誘発するタン
パク質生産物を生産することが可能なRex遺伝子を暗号
化しているDNAセグメント、 −rex遺伝子を暗号化しているDNAセグメント、およびmR
NAを暗号化しているDNAセグメントによって形質転換さ
れた細胞であって、rex遺伝子のタンパク質生産物発現
能およびmRNA発現能を有する宿主細胞を含有する容器 を含んでなる21記載の同定方法によってRexタンパク質
の遺伝子活性化機能の特異的抑制因子を同定する、因子
のスクリーニング試薬用キット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ８９２４３９６．８ (32)優先日 平成１年10月30日(1989．10．30) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ４４２，６７０ (32)優先日 平成１年11月29日(1989．11．29) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (73)特許権者 999999999 デューク・ユニバーシティー アメリカ合衆国27706 ノース・カロラ イナ、ダーラム、アレン・ビルディング 07番、オフィス・オブ・テクノロジ ー・トランスファー (72)発明者 バッハマイエル、ヘルムート オーストリア国アー―2344 マリア・エ ンツェルスドルフ、ホーヘ・バンド・シ ュトラーセ 34／４番 (72)発明者 ベーンライン、エルンスト オーストリア国アー―2531 ガーデン、 ハウプトシュトラーセ 91／６番 (72)発明者 カレン、ブライアン・アール アメリカ合衆国27707 ノース・カロラ イナ、ダーラム、トレイル23、3636番 (72)発明者 グリーン、ワーナー・シー アメリカ合衆国27514 ノース・カロラ イナ、チャペル・ヒル、アルダー・プレ イス 101番 (72)発明者 ハウベル、ヨアヒム オーストリア国アー―2344 マリア・エ ンツェルスドルフ、エルラウフシュトラ ーセ 32／７番 (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｃｑｖｉｒ ｅｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃｉｅｎ ｃｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ，Ｖｏｌ. ２，ｐｐ．256−263（1989) Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），Ｖｏ ｌ．335，ｐｐ．452−454（1988)

Claims (27)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】HIV−１の野生型Revタンパク質のアミノ酸
   68位からアミノ酸90位の間に１個またはそれ以上の突然
   変異を含む、HIV−１の野性型rev遺伝子の表現型発現を
   トランス優性に抑制する変異rev遺伝子。
2. 【請求項２】変異がミスセンスまたは欠失変異である、
   請求項１記載の変異rev遺伝子。
3. 【請求項３】変異がミスセンス変異である、請求項２記
   載の変異rev遺伝子。
4. 【請求項４】HIV−１の野性型Revタンパク質のアミノ酸
   78位および79位に変異を有するタンパク質をコードす
   る、請求項１記載の変異rev遺伝子。
5. 【請求項５】変異がミスセンス変異である、請求項４記
   載の変異rev遺伝子。
6. 【請求項６】HIV−１の野生型Revタンパク質のアミノ酸
   78位にAspおよび79位にLeuを有するタンパク質をコード
   する、請求項４記載の変異rev遺伝子。
7. 【請求項７】変異HIV−1Revタンパク質が第１ドメイン
   および第２ドメインを含み、当該第１ドメインは野生型
   HIV−1Revタンパク質のアミノ酸約10位からアミノ酸約6
   8位を含み、当該第２ドメインは野生型HIV−1Revタンパ
   ク質のアミノ酸約68位からアミノ酸約90位を含み、当該
   第２ドメインは１個またはそれ以上の変異を含むことに
   より修飾されているものである、HIV−１の野生型rev遺
   伝子の表現型発現をトランス優勢に抑制する変異HIV−1
   Revタンパク質をコードする変異rev遺伝子。
8. 【請求項８】変異がミスセンスまたは欠失変異である、
   請求項７記載の変異rev遺伝子。
9. 【請求項９】変異タンパク質M10、Δ9/14およびΔ10/14
   をコードする遺伝子からなる群から選択される、請求項
   ７記載の変異rev遺伝子。
10. 【請求項１０】変異タンパク質M10をコードする、変異r
    ev遺伝子。
11. 【請求項１１】野生型Revタンパク質のアミノ酸78位がA
    spおよび79位がLeuをコードするように修飾した、図６
    の野生型遺伝子である、請求項10記載の変異タンパク質
    M10をコードする変異rev遺伝子。
12. 【請求項１２】野生型Revタンパク質のアミノ酸78位でA
    spおよび79位でLeuをコードするヌクレオチドGATCTGを
    有する、請求項11記載の変異rev遺伝子。
13. 【請求項１３】変異体HIV−1Revタンパク質が実質的に
    野生型HIV−1Revの特異的結合機能を有する第１ドメイ
    ンおよび野生型HIV−1Revの活性化機能を有しない第２
    ドメインを含み、当該第２ドメインは野生型HIV−1Rev
    タンパク質のアミノ酸約68位から約90位を含み、該第２
    ドメインは１個またはそれ以上の変異を含むことにより
    修飾されているものである、HIV−１の野生型rev遺伝子
    の表現型発現をトランス優勢に抑制する変異HIV−1Rev
    タンパク質をコードする変異rev遺伝子。
14. 【請求項１４】適当な発現系から対応する野生型遺伝子
    を分離し、この分離遺伝子を適当なクローニング系に挿
    入し、所望の突然変異を当該遺伝子へ導入し、所望の突
    然変異を有するクローンから変異rev遺伝子を回収する
    ことを含む、請求項１記載の変異rev遺伝子の製造方
    法。
15. 【請求項１５】変異タンパク質M10をコードする遺伝子
    を調製するための、請求項14記載の方法。
16. 【請求項１６】請求項１記載の変異rev遺伝子を適当な
    発現および増幅系で発現および増幅させ、そこから得ら
    れた生産物を回収することを含む、請求項１記載の変異
    rev遺伝子によりコードされたタンパク質の製造方法。
17. 【請求項１７】変異タンパク質M10の製造のための、請
    求項16記載の方法。
18. 【請求項１８】請求項１記載の変異rev遺伝子および担
    体または希釈剤を含む、組成物。
19. 【請求項１９】請求項７記載の変異rev遺伝子および担
    体または希釈剤を含む、組成物。
20. 【請求項２０】請求項10記載の変異rev遺伝子および担
    体または希釈剤を含む、組成物。
21. 【請求項２１】請求項１記載の変異rev遺伝子を含む、
    ベクター。
22. 【請求項２２】請求項７記載の変異rev遺伝子を含む、
    ベクター。
23. 【請求項２３】レトロウイルスベクターである、請求項
    21記載のベクター。
24. 【請求項２４】プラスミドベクターである、請求項21記
    載のベクター。
25. 【請求項２５】請求項10記載の変異rev遺伝子を含む、
    ベクター。
26. 【請求項２６】請求項11記載の変異rev遺伝子を含む、
    ベクター。
27. 【請求項２７】変異タンパク質M10をコードする変異rev
    遺伝子を含む、レトロウイルスベクター。