JP4520441B2

JP4520441B2 - インテグラーゼｎ−末端領域を標的としたウイルス感染阻害剤

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Publication number: JP4520441B2
Application number: JP2006239627A
Authority: JP
Inventors: 貴夫増田; 真理神奈木
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-05-13
Filing date: 2006-09-04
Publication date: 2010-08-04
Anticipated expiration: 2020-04-25
Also published as: JP2007016044A

Description

本発明は、エイズウイルス等のレトロウイルスのインテグラーゼのＮ−末端領域を標的とすることにより得られる、エイズウイルス等のレトロウイルスの感染阻害剤や、かかるウイルス阻害剤のスクリーニング方法や、かかるウイルス阻害剤を含む治療用組成物やエイズワクチンに関する。

レトロウイルスの１種であるレンチウイルスに属するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）には、ヒト免疫不全ウイルス１型（以下「ＨＩＶ−１」という）とヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）とがあり、それらは遺伝子レベルで４０％の相同性を示すことが知られている。レンチウイルスは宿主細胞を殺す病原性ウイルスであり、ＨＩＶは、多くのレンチウイルスと同様に、持続感染し、感染経路の大半を通じて、低い活性を示し、この経過の間、感染者はほとんど無症状であって感染していることに気づかず、この潜伏期間は１０年以上続いて、最終的にこのＨＩＶ感染者の殆ど全てが後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を発症し、死に至る。

ＨＩＶ−１をはじめとするレトロウイルスは、感染標的細胞に吸着し、脱殻して侵入した後、逆転写酵素によりウイルス粒子内にパッケージされている一本鎖ＲＮＡ遺伝子を二本鎖ＤＮＡに変換し、核内に移行した後、宿主染色体に組み込む（インテグレーション反応）ことで感染を樹立させることが知られている。こうしたＨＩＶ−１の増殖に必須なウイルス感染の初期過程における逆転写反応及びインテグレーション反応はウイルス特異的反応過程であり、これらの反応はウイルスのポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子産物である逆転写酵素（ＲＴ）及びインテグラーゼ（ＩＮ）により触媒されることも知られている。

レトロウイルスのインテグレーション反応過程は、図１に示すように、（１）逆転写酵素によりＤＮＡに変換されたウイルスＤＮＡの両末端に存在するＬＴＲ領域の各末端に作用し、両３′末端の２のヌクレオチド（ＨＩＶ−１の場合はＧＴ）を切除除去する３′−プロセッシング反応、（２）３′−プロセッシング反応を終えたウイルスＤＮＡが核内に移行し宿主染色体ＤＮＡと会合し、ウイルスＤＮＡ両３′末端−ＯＨ基の求核反応により切れ目が入れられると同時に切断された宿主染色体ＤＮＡの各５′末端リン酸基とウイルスＤＮＡ３′末端−ＯＨ基が各々エステル結合するジョイニング反応、（３）ウイルスＤＮＡの各５′末端と宿主染色体ＤＮＡの各３′末端が結合する修復の３つの過程からなり（非特許文献１）、インテグラーゼが直接触媒する反応は、３′−プロセッシング反応とジョイニング反応であり、修復は宿主細胞のＤＮＡ修復酵素系により行われるものと考えられている。

ＨＩＶ−１のインテグラーゼ蛋白は全長２８８個のアミノ酸からなり、図２に示すように、Ｎ−末端ドメイン（Ｎ−末端側から数えて１〜５０位までのアミノ酸を含むペプチド）、中央酵素活性ドメイン（５１〜２１２位までのアミノ酸を含むペプチド）及びＣ−末端ドメイン（２１３〜２８８位までのアミノ酸を含むペプチド）の機能的相補可能な３つのドメインから構成されている（図２にはすべてのレトロウイルスインテグラーゼに保存されているアミノ酸とその位置が示されており、また、図２中、Ｈはヒスチジンを、Ｃはシステインを、Ｄはアスパラギン酸を、Ｅはグルタミン酸をそれぞれ表している。）。

そして、インテグレーション反応には、インテグラーゼの中央に位置する酵素活性ドメインが重要であるとされ、特に、酵素活性ドメインに存在する６４位及び１１６位のアスパラギン酸、及び１５２位のグルタミン酸の３つのアミノ酸残基は、Ｍｇ^２＋又はＭｎ^２＋との結合に関与するインテグレーション反応に必須なアミノ酸残基であり、これらアミノ酸がインテグラーゼの酵素活性中心であることが報告されている（非特許文献２、３、４）。また、この酵素活性ドメインに存在し、レトロウイルス間で強く保存されている１３６位、１５６及び１５９位のリジン残基が、ウイルスＤＮＡ末端部位との特異的結合に重要であることも報告されている。

インテグラーゼのＣ−末端ドメインは、ＤＮＡ結合能をもち、この領域のアミノ酸配列は多様性に富み、現在までにインテグラーゼ多量体形成及び核移行等の機能が知られているが、詳細はまだよくわかっていない。近年、ＮＭＲによる構造解析から、このＣ末端ドメインにＳＨ３（Ｓｒｃ−ｈｏｍｏｌｏｇｙ３）様構造が存在し、このＳＨ３の２量体形成あるいは非特異的ＤＮＡ結合能に関与していると考えられており（非特許文献５，６）非特異的ＤＮＡ結合能に関しては、２６４位のリジン残基を含むいくつかの塩基性アミノ酸残基の重要性が示唆されている（非特許文献７、８）。

また、インテグラーゼのＮ−末端ドメインには、全てのレトロウイルスのインテグラーゼに保存されている２つのヒスチジン残基（Ｈ）と２つのシステイン残基（Ｃ）から構成されるＨＨＣＣモチーフが存在し、このアミノ酸モチーフはいくつかの転写調節因子のＤＮＡ結合ドメインに認められるＺｎフィンガーモチーフに似ていることから、その機能として、インテグラーゼの特異的ＤＮＡ結合領域と考えられていたが、現在ではインテグラーゼの二量体あるいは多量体形成に関与しているものと考えられている（非特許文献９）。

そして、上記インテグラーゼのＮ−末端ドメインのＮＭＲによる構造解析から、このＮ−末端ドメインは、図３のα１〜α４に示される４つのαヘリックス構造からなるヘリックス・ターン・ヘリックス（ＨＴＨ）構造を有し、ＨＨＣＣモチーフの各２つのヒスチジン残基とシステイン残基は亜鉛イオンを取り囲むように配位することによりこの構造の安定化、すなわち骨格形成に重要な役割を果たし、また、このＮ−末端ドメインは液体中で二量体を形成することも報告されている（非特許文献１０）。このＮ−末端ドメインはインテグラーゼ分子の二量体形成の安定化に重要で、間接的にインテグレーション反応に関与していることが知られているが、その真の機能に関しては不明である。

また、Ｎ−末端領域のＨＴＨ構造は、トリプトファンリプレッサー蛋白質のＤＮＡ結合部位に代表されるＨＴＨ構造に酷似している。インテグラーゼのＮ−末端ドメインのＨＴＨ構造とトリプトファンリプレッサー蛋白質のＤＮＡ結合部位に代表されるＨＴＨ構造との違いとして、トリプトファンリプレッサー蛋白質のＤＮＡ結合部位として考えられている第２番目のヘリックスに相当する領域が、ＨＩＶ−１インテグラーゼでは二量体形成におけるインテグラーゼ分子間のインターフェイス領域となっている。

また、本発明者らによって、インテグラーゼのＮ−末端ドメインに存在するＨＨＣＣモチーフの骨格となるヒスチジン残基又はシステイン残基のアミノ酸置換変異を導入したＨＩＶ−１変異株を解析し、ウイルスの感染性がほぼ完全に失われることを見い出し、また、この点変異による感染価欠失機序として、ウイルス吸着・侵入以降、逆転写反応以前のステップ（脱殻過程）が阻害されることを世界で初めて報告した（非特許文献１１）。また、これらの研究により、インテグラーゼ蛋白のＨＨＣＣモチーフを骨格とするＮ−末端ドメインの構造がウイルスの感染性維持に非常に重要な役割を担っているものと考えられるようになった。

その他、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する治療方法等に関する報告も既に多くなされており、例えば、特許文献１には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染した患者に対し、ＨＩＶのコア蛋白質（Ｇａｇポリ蛋白質）であるＨＩＶ基質（ＭＡ）ポリペプチドの変異を受けたポリペプチドを投与する治療方法が、特許文献２には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＮｅｆ蛋白質の生物学的に活性なペプチドフラグメント、これらのペプチド又はその生物学的に活性な類似体を含む薬学組成物、ペプチドのアンタゴニスト及びアンタゴニストを含む薬学的組成物、並びに上記化合物及び組成物を利用する治療及びスクリーニング方法が、特許文献３には、少なくとも一つの細胞をレトロウイルス感染に抵抗性にするために、レトロウイルスの複製を阻害することができるトランスドミナント・ネガティブ・インテグラーゼ遺伝子を使用する治療方法がそれぞれ記載されている。

本発明者らは、インテグラーゼのＮ−末端ドメインについての研究をさらに進めるため、インテグラーゼのＮ−末端領域のアミノ酸配列をＨＩＶ−１間、あるいは近縁のＨＩＶ−２、ＳＩＶ、異種のレトロウイルス間でその相同性を調べたところ、図４に示すように、インテグラーゼの二量体形成におけるインターフェース領域に相当する領域に疎水性アミノ酸により構成され、種間で強く保存されている疎水性アミノ酸モチーフα−ｈｅｌｉｘ−３が存在することを見い出した（図４中、「ＮＬ４３」はＨＩＶ−１の遺伝子に含まれているインテグラーゼ遺伝子領域の、「ＨＩＶ−２_ＲＯＤ」はＨＩＶ−２のＲＯＤ株のインテグラーゼ遺伝子領域の、「ＳＩＶ_ＡＧＭ」はアフリカグリーンモンキー由来のＳＩＶのインテグラーゼ遺伝子領域の、「ＦＩＶ」はネコ免疫不全ウイルスのインテグラーゼ遺伝子領域の、「ＭｏＭｕＬＶ」はマウス白血症ウイルスのインテグラーゼ領域の、それぞれＮ−末端を示している）。これら疎水性アミノ酸モチーフにアミノ酸置換を導入したいくつかの変異ＨＩＶ−１を作製し解析したところ、ＨＨＣＣ各アミノ酸残基に置換変異を導入した前記ＨＩＶ−１変異株と同様に、逆転写反応以前のステップでウイルスの感染性がほぼ完全に失われることが新たに判明した。

また、インテグラーゼのＮ−末端領域のＨＨＣＣの４つのアミノ酸を亜鉛イオンと結合しうる配列である、ＨＨＣＨ，ＨＨＨＣ，ＨＨＨＨ，ＣＣＨＨ，ＣＣＣＣのそれぞれに置換したＨＩＶ−１変異株や、リン酸化反応が予想される１５位のタイロシン残基の置換変異を導入したＨＩＶ−１変異株も、逆転写反応以前のステップでウイルスの感染性が完全に失活することが確かめられた。

これら一連のアミノ酸置換変異ＨＩＶ−１の解析から、ＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ−末端ドメインの構造は、一つのアミノ酸の置換によっても影響され、機能的に不安定になりやすく、その結果、ウイルスの感染性に致命的な影響を与えることを確認した。本発明者らは、また、ＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ−末端ドメインに限らず、他の酵素活性ドメインやＣ−末端ドメインについても種間で保存されているアミノ酸の置換変異体を作製し解析を行ったが、逆転写反応以前のステップでウイルスの感染性がほぼ完全に失われる変異体はインテグラーゼのＮ−末端領域内の置換に限定されていることも確認した。

これら本発明者らにより新たに見出された知見は、新規なインテグラーゼ阻害剤を開発する上で、すなわちヒト免疫不全ウイルスの感染を逆転写過程以前で阻止するという新規なエイズ治療薬や治療方法を開発する上できわめて有力な示唆を与えるものである。従来行なわれているインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング方法が酵素活性阻害に専ら焦点を当て、インテグラーゼ蛋白のコアともいえる中央酵素活性ドメインを標的としていたのに対し、インテグラーゼ蛋白のＮ−末端領域を標的とすることにより、薬剤作用点が全く異なる新規なＨＩＶ−１阻害剤を得ることが可能となる。

特表平８−５０３４８８号公報特表平９−５０１１４３号公報特表平１０−５０３６５４号公報Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３，１３３−１７３，１９９４Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６，６３６１−６３６９，１９９２Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２，２３３１−２３３８，１９９２Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，５６２４−５６３０，１９９１ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ２，８０７−８１０，１９９５Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４，９８２６−９８３３，１９９５ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ２２，４１２５−４１３１，１９９４Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４，９８２６−９８３３，１９９５Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３，１３６５９−１３６６４，１９９６ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕｃｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙ４，５６７−５７７，１９９７Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９，６６８７−６６９６，１９９５

本発明の課題は、従来のインテグラーゼ阻害剤とは薬剤の作用点を全く異にする、ＨＩＶ感染を逆転写過程以前で阻止することができる新規なインテグラーゼ阻害剤のスクリーニング方法を提供することや、またかかるスクリーニング方法を用いて得られる新規なインテグラーゼ阻害剤を提供することや、新規なエイズ治療薬として期待が大きいこれらインテグラーゼ阻害剤やそれをコードするＤＮＡを含む薬剤組成物を提供することにある。

本発明者らは、インテグラーゼ蛋白の本来の酵素活性の場であるウイルス遺伝子の組み込み過程ではなく、ウイルス感染性維持に非常に重要な役割を担っているＮ末端領域に着目し、独自にデザインし、ウイルスの感染性を完全に失わせることを確認したインテグラーゼ変異クローンを用いて、インテグラーゼ変異蛋白の構造解析により、あるいは変異の認められた領域のアミノ酸配列をもつ合成ペプチドがこれまで報告されているインテグラーゼ阻害剤とは異なった作用で、ＨＩＶ−１の複製阻害を行うことを見い出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２６番目から３９番目のアミノ酸配列からなるペプチドを含むことを特徴とするＨＩＶ−１感染阻害剤に関する。

本発明によると、従来のインテグラーゼ阻害剤とは薬剤の作用点を全く異にする、ＨＩＶ感染を逆転写過程以前で阻止することができる新規なインテグラーゼ阻害剤をスクリーニングすることができる。また、かかるスクリーニングによりレトロウイルスの感染・増殖を完全に阻止することができる新規なインテグラーゼ阻害剤を得ることができる。これら新規なインテグラーゼ阻害剤を含む薬剤組成物は、エイズ治療薬として期待できる。

本発明において、レトロウイルスとは、ＲＮＡを遺伝子としてもち、逆転写酵素によりゲノムＲＮＡをＤＮＡに変換するものであればどのようなものでもよく、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１型（特にＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、マウス白血病ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎ウイルス、ヒツジのビスナウイルス、ウシ免疫不全ウイルス、メーソン・ファイザーサルウイルス、マウス乳癌ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒト泡沫レトロウイルスを具体的に挙げることができる。また、本発明においてインテグラーゼとは、前記レトロウイルスが感染した細胞内で生産する蛋白質であり、宿主内で逆転写酵素により複製されたウイルスゲノムが、宿主の染色体に組み込まれる反応を触媒するものであればどのようなものでもよい。

本発明において、レトロウイルスのインテグラーゼＮ−末端領域とは、レトロウイルスのインテグラーゼ蛋白のアミノ酸配列において、亜鉛イオンと結合する領域及びその隣接するＣ−末端側の一部を意味し、例えば、配列番号２に記載するＨＩＶ−１のインテグラーゼのアミノ酸配列においては、通常Ｚｎフィンガー様ドメインと呼ばれているＮ−末端ドメイン（１から５０個のアミノ酸配列の領域）に加えて、その隣接するＣ−末端側１０残基程度が含まれる。また、本発明において、レトロウイルス感染阻害剤とは、逆転写反応以前にウイルス感染を阻害する物質をいい、本発明のレトロウイルス感染阻害剤によるとレトロウイルスの複製・増殖を阻害することができる。

本発明におけるレトロウイルス感染阻害剤のスクリーニング方法としては、レトロウイルスのインテグラーゼのＮ−末端領域の全部若しくは一部からなる領域又は該Ｎ−末端領域を含む領域を標的とする方法であればどのようなものでもよく、例えば、リコンビナントＤＮＡ技術により得られる、レトロウイルスのインテグラーゼのＮ−末端領域の全部若しくは一部からなるペプチド又は該Ｎ−末端領域を含むペプチドに対して結合するペプチド又は蛋白質等の被検物質をファージディスプレイ法、免疫沈降法、ツー・ハイブリッド法（ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄａｓｓａｙ）、ファー・ウエスタン（ＦａｒＷｅｓｔｅｒｎ）法等の蛋白質の分子間相互作用を利用して検出する方法を例示することができる。また、ペプチド又は蛋白質の候補被検物質としては、ＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ−末端領域（１番目から５５番目）のアミノ酸配列の一部又は該アミノ酸配列若しくはその一部を有するペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含むペプチド又は蛋白質を挙げることができる。

ファージ・ディスプレイ法におけるランダムオリゴペプチドとしては、ｐＳＫＡＮシステム（ＭｏＢｉＴｅｃ社製）を、ｃＤＮＡライブラリー作成用としてはＳｕｒｆＺＡＰＣｌｏｎｉｎｇｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を、ランダムペプチドをファージに挿入したファージライブラリー（ＮＥＢ社製）を利用することができる。ツー・ハイブリッド分析には、市販のＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）や、ＨｙｂｒｉｄＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のシステムを利用することができる。また、ファー・ウエスタン法は、結合蛋白質をメンブレン上のバンドとして直接検出でき、λｇｔ１１等の発現ライブラリーを用いればそれらを直接クローニングすることも可能な方法である。これらの方法によると、従来の酵素活性阻害をみるスクリーニング方法に比べて簡単に、かつ、薬剤作用点も異なる新規な阻害剤を見出すことが可能となる。

本発明における被検物質としては、上記の他にレトロウイルスのインテグラーゼのＮ−末端領域の全部若しくは一部からなるペプチド又は該Ｎ−末端領域を含むペプチドをコードするＲＮＡに対して結合する物質も例示することができる。ウイルスＲＮＡに結合する物質としては、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はペプチド若しくは蛋白質を挙げることができ、そして、ウイルスＲＮＡの塩基配列上のどの部位に蛋白質が特異的に結合しているかは、例えば、リボヌクレアーゼを用いるフットプリンティング法によって確認することができる。

本発明におけるスクリーニング方法としては、被検物質の存在下及び被検物質がペプチドの場合は該ペプチドをコードするＤＮＡが発現可能な状態下で、野生型レトロウイルスを宿主細胞にインフェクションし、インフェクション後の宿主細胞中のウイルス遺伝子発現量を非感染コントロール（Ｍｏｃｋ）と比較する方法や、被検物質の存在下及び被検物質がペプチドの場合は該ペプチドをコードするＤＮＡが発現可能な状態下で、野生型レトロウイルスのインテグラーゼ遺伝子を用いるツー・ハイブリッド法を行い、インテグラーゼの２量体形成の阻害を検出する方法を挙げることができる。

本発明のレトロウイルス感染阻害剤には、上記のレトロウイルス感染阻害剤のスクリーニング方法により得られる、例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はペプチド若しくは蛋白質等の物質や、インテグラーゼＮ−末端領域のリコンビナント精製蛋白質を標的として、ファージ・ディスプレイ法によってそこに結合することが見出された配列番号３〜１１に示された９種のペプチド又は該ペプチドを含むペプチド若しくは蛋白質や、ＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ−末端領域におけるα３近傍のペプチドである配列番号２記載に示されるアミノ酸配列のうち２６番目から３９番目のアミノ酸配列を有するペプチド又は該ペプチドを含むペプチド若しくは蛋白質等を挙げることができる。また、レトロウイルスのインテグラーゼのＮ−末端領域を特異的に認識するモノクローナル抗体をレトロウイルス感染阻害剤として例示することができる。

そしてまた、本発明のレトロウイルス感染阻害剤には、上記のレトロウイルス感染阻害作用を有するペプチド又は蛋白質に、他のペプチド若しくは蛋白質又は糖蛋白質を含む非蛋白質が結合した複合体を挙げることができ、これら複合体としては、Ｔ細胞抗原であるＣＤ４糖蛋白質やレトロウイルスのコート蛋白質が結合した複合体を具体的に例示することができ、これら複合体としては、化学修飾等により、プロテアーゼに抵抗性を有する性質が付加されたものや細胞内への透過性が改善されたものが好ましい。

さらに、上記のレトロウイルス感染阻害剤を構成するタンパク質等は、細胞内で発現させることにより細胞内に存在させることもできる。すなわち、ペプチド若しくは蛋白質又は蛋白質部分をコードするＤＮＡをその発現が可能なＤＮＡ構築物、例えば、ウイルスベクター等に該ＤＮＡを発現可能に組み込んだＤＮＡ構築物としたものを用いることもできる。

本発明におけるレトロウイルス感染阻害剤としては、上記の阻害物質の他、レトロウイルスの複製を阻害しうる、その活性を失ったトランスドミナント・ネガティブ・インテグラーゼ遺伝子、例えば、レトロウイルスのインテグラーゼのＮ−末端領域の全部若しくは一部からなるペプチド又は該Ｎ−末端領域を含むペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異インテグラーゼをコードするＤＮＡ又はこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、これらＤＮＡを有するレトロウイルス変異株が逆転写反応以前にレトロウイルスの複製を阻害する当該ＤＮＡからなる遺伝子を挙げることができる。

上記不活化された変異インテグラーゼ遺伝子としては、配列番号２に示される野生型ＨＩＶ−１インテグラーゼのアミノ酸配列のうち、４３番目のシステインがヒスチジンに置換された（Ｃ４３Ｈ）や、４０番目のシステインがヒスチジンに置換された（Ｃ４０Ｈ）や、４０番目及び４３番目のシステインがヒスチジンに置換された（Ｃ４０Ｈ，Ｃ４３Ｈ）や、１２番目及び１６番目のヒスチジンがシステインに置換された（Ｈ１２Ｃ，Ｈ１６Ｃ）や、１２番目及び１６番目のヒスチジンがシステインに置換され、かつ、４０番目及び４３番目のシステインがヒスチジンに置換された（Ｈ１２Ｃ，Ｈ１６Ｃ，Ｃ４０Ｈ，Ｃ４３Ｈ）や、２９番目のプロリンがフェニルアラニンに置換された（Ｐ２９Ｆ）や、３２番目のバリンがグルタミン酸に置換された（Ｖ３２Ｅ）や、３６番目のイソロイシンがグルタミン酸に置換された（Ｉ３６Ｅ）や、１５番目のタイロシンがアラニンに置換された（Ｙ１５Ａ）や、１５番目のタイロシンがスレオニンに置換された（Ｙ１５Ｔ）等から選ばれた変異インテグラーゼ遺伝子を具体的に挙げることができる。

本発明の治療用組成物としては、上記のレトロウイルス感染阻害剤を含む組成物を挙げることができ、また、これら組成物には、ｔａｔ阻害剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤、及びアジドチミジン、ジデオキシイノシン、ジデオキシシトシン及びｄ４Ｔ等からなるヌクレオシド又は非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤等の抗ウイルス薬を含めることができる。本発明の治療用組成物はエイズ治療用薬剤として有用である。

また本発明のエイズワクチン等のレトロウイルス用ワクチンとしては、レトロウイルスのインテグラーゼのＮ−末端領域の全部若しくは一部からなるペプチド又は該Ｎ−末端領域を含むペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された変異インテグラーゼをコードするＤＮＡ又はこのＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを有するレトロウイルス変異株であって、該変異株が逆転写反応以前にレトロウイルスの複製を阻害する当該変異株からなるものを挙げることができ、具体的には、前記Ｃ４３Ｈや、Ｃ４０Ｈや、Ｃ４０Ｈ，Ｃ４３Ｈや、Ｈ１２Ｃ，Ｈ１６Ｃや、Ｈ１２Ｃ，Ｈ１６Ｃ，Ｃ４０Ｈ，Ｃ４３Ｈや、Ｐ２９Ｆや、Ｖ３２Ｅや、Ｉ３６Ｅや、Ｙ１５Ａや、Ｙ１５Ｔ等から選ばれた変異インテグラーゼ遺伝子を有する変異株からなるワクチンを挙げることができる。

本発明の治療方法においては、前記レトロウイルス感染阻害剤や、治療用組成物や、レトロウイルス用ワクチンを用いることができる。

以下本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１（ＨＩＶ−１インテグラーゼの変異クローンの作製）
文献（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，５９，２８４−２９１，１９８６）記載の方法により、ＨＩＶ−１インテグラーゼの突然変異誘発性ＤＮＡフラグメントを感染性クローンであるｐＮＬ４−３から得た。このｐＮＬ４−３のＳＰｅＩサイトからＳａｌＩサイトにわたる４．３ｋｂフラグメントをＨＩＶ−１インテグラーゼの突然変異誘発性ＤＮＡフラグメントとして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（ストラタジーン社製）にサブクローンした。このベクターＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに調製し、Ｔ７−ＧＥＮｉｎｖｉｔｒｏｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓｋｉｔ（米国のＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社製）のプロトコルの指示に基づき、この一本鎖ＤＮＡにヘルパーファージＭ１３Ｋ０７を用いて位置特異的突然変異誘発を行い、前記Ｃ４３Ｈや、Ｃ４０Ｈや、Ｃ４０Ｈ，Ｃ４３Ｈや、Ｈ１２Ｃ，Ｈ１６Ｃや、Ｈ１２Ｃ，Ｈ１６Ｃ，Ｃ４０Ｈ，Ｃ４３Ｈや、Ｐ２９Ｆや、Ｖ３２Ｅや、Ｉ３６Ｅや、Ｙ１５Ａや、Ｙ１５Ｔ等のＨＩＶ−１インテグラーゼの変異クローンを得た（図４参照）。

実施例２（各ＨＨＣＣモチーフ変異クローンとマウス白血病ウイルスのアンホトロピックエンベロープとからのシュードタイプウイルスの作製）
実施例１記載の方法によって得られた、１μｇのＨＩＶ−１インテグラーゼの変異クローン（ｐＮＬｌｕｃ△ＢｇＩＩＩ）と、１μｇのマウス白血病ウイルスのアンホトロピックエンベロープ発現ベクター（ｐＤＪ−１）とを、１０μｌのリポフェクトアミン（ＢＲＬ社製）に混合し、３０度で３０分間反応させた。この反応物をＣＯＳ細胞に加えてトランスフェクションした。トランスフェクションから６時間後、１０％の子牛血清を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）を４ｍｌ加え培養した。また、２４時間後にこの培養液を同様の新しい培養液４ｍｌと交換させ、さらに培養してＣＯＳ細胞から培養液に放出されたシュードタイプウイルスを作製し、このウイルスをｐ２４固相酵素免疫検定法によりウイルス粒子放出量を定量した（図５）。得られた培養液をウイルス溶液として、また、コントロールとして、プラスミドをトランスフェクションしていないＣＯＳ細胞培養液を非ウイルス溶液（Ｍｏｃｋ）を以下の実験に使用した。

また、上記シュードタイプウイルス作製に、各ウイルスの変異クローンが影響するかどうかをプロウイルス遺伝子発現量を調べた。前記トランスフェクションから６時間後、全てのＣＯＳ細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝溶液）で３回洗浄し、このＣＯＳ細胞に２００μｌの１×ルシフェラーゼ溶解液（プロメガ社製）を加えて溶解し、この溶解液１０μｌをｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒＭｏｎｏｌｉｇｈｔ２０１０（カリフォルニア州のサンディエゴのアナリティカル・ルミネッセンス・ラボレトリー社製）を用いてルシフェラーゼアッセイ法によりプロウイルス遺伝子発現量を測定した（図６）。これらのことから、各ウイルスの変異クローンはプロウイルス遺伝子発現及びウイルス粒子放出に影響しないことがわかった。

実施例３（各変異ウイルスにおける感染性）
１０ｍＭの塩化マグネシウム存在下で、実施例２のｐ２４固相酵素免疫検定法により定量された約５０ｎｇの各ウイルス溶液に、デオキシリボヌクレアーゼＩを加えて３０分間処理し、得られた各変異ウイルスのＤＮＡをＲＤ細胞（ヒトラブドミオザルコーマ細胞）に接種することでウイルス感染させた。ウイルス感染２日後及び６日後、感染細胞中に発現したウイルス遺伝子を前記記載のルシフェラーゼアッセイ法により測定した（図７）。この結果から、１例（Ｐ３０Ｎの変異ウイルス）を除いて全ての変異ウイルスがＭｏｃｋ以下であり、ウイルス感染性がウイルスの変異により強く阻害することがわかった。

実施例４（各変異ウイルスにより逆転写反応以前で感染性が強く阻害されていることの確認）
これらの各変異ウイルスにおいて、逆転写反応以前でウイルスの感染性が完全に失われているかどうかを以下に記載する方法で確認した。実施例３に記載するウイルス感染２日後のＲＤ細胞から、尿素溶解法により全ＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを含む抽出液をフェノール及びクロロホルムにより処理し、エタノール沈殿させることでＤＮＡを精製し、１００μｌの超純水に加え再溶解した。ＨＩＶ−１に特異的なプライマー（Ｒ／Ｕ５，Ｒ／ｇａｇ）を用いて、このＤＮＡ溶液に含まれるウイルス遺伝子をＰＣＲ法により増幅させた（９４℃で１分間熱変性させ、５５℃で２分間アニーリングし、７２℃で２分間合成反応させるサイクルを３０サイクル行い増幅させた）。このＰＣＲ産物を２％のアガロースゲル電気泳動法により分画し、サイバーグリーンにより染色し視覚化した（図８）。この結果から、１例（Ｐ３０Ｎの変異ウイルス）を除く全ての変異ウイルスにおいて、Ｒ／Ｕ５及びＲ／ｇａｇのプライマーを用いてもウイルスＤＮＡを検出されなかったことから、ウイルスの感染性が逆転写反応以前で強く阻害されていることがわかった。

実施例５（Ｙｅａｓｔｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ分析）
図９に、Ｇａｌ−４ｙｅａｓｔｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄｓｙｓｔｅｍ法を用いて、ＨＩＶ−１インテグラーゼの野生型及びその変異体にかかる２量体形成能及び他のウイルス構造蛋白質との会合における蛋白間相互作用を調べた結果を示す。図９のＤＢに示されているＷＴＩＮ、Ｄ６４ＥＩＮ及びＣ４３ＬＩＮとは、ｐＰＣ９７（ＧＡＬ４_ＤＢベクター）のＭＣＳ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｃｌｏｎｉｎｇｓｉｔｅｓ）に野生型インテグラーゼの遺伝子、インテグラーゼのＤ６４Ｅ変異体の遺伝子、又はインテグラーゼのＣ４３Ｌ変異体の遺伝子をそれぞれＧＡＬ４_ＤＢベクターのフレームに合わせて挿入し、構築されたＧＡＬ４_ＤＢベクターとの複合体を意味する。また、図９のＡＤに示されているＷＴＩＮ（野生型インテグラーゼの遺伝子）、Ｄ６４ＥＩＮ（インテグラーゼのＤ６４Ｅ変異体の遺伝子）、Ｃ４３ＬＩＮ（インテグラーゼのＣ４３Ｌ変異体の遺伝子）、ＭＡ（ｇａｇ領域に含まれるｐ１７遺伝子）、ＣＡ（ｇａｇ領域に含まれるｐ２４遺伝子）、ＮＣ（ｇａｇ領域に含まれるｐ７又はｐ９遺伝子）、ＲＴ（逆転写酵素遺伝子）、Ｖｉｆ（ウイルス感染性遺伝子）及びＶｐｒ（ウイルス蛋白質Ｒ遺伝子）とは、ｐＰＣ８６（ＧＡＬ４_ＡＤベクター）のＭＣＳにそれぞれの相補的なＤＮＡを挿入し、構築されたｐＰＣ８６−ｃＤＮＡを意味する。これらの結果から、Ｃ４３Ｌ変異体によりインテグラーゼ分子間の二量体形成能が阻害されることがわかった。

実施例６（ＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ末端ドメインの部分ペプチドの阻害活性）
化学合成より作製した、図３に示されるＮＺ−１、ＮＺ−２、Ｎ−ＩＴＦｃｃ及びＮＺ−４のペプチドを最終濃度で２０μＭになるように生理的食塩水で希釈し、ＲＤ細胞に加え２時間処理した。その後、ｐ２４固相酵素免疫検定法により定量された５０ｎｇのＨＩＶ−１を、この処理されたＲＤ細胞に接種しウイルス感染させた。ウイルス感染３日後、感染細胞中に発現したウイルス遺伝子を上記記載のルシフェラーゼアッセイ法により測定したところ、ＮＺ−１、ＮＺ−２及びＮＺ−４のペプチドにて処理されたＲＤ細胞は、１０〜３０％しか抑制されなかったが、Ｎ−ＩＴＦｃｃのペプチドにて処理されたＲＤ細胞では、８０％近く抑制されており、抗ウイルス剤として応用可能なことがわかった。

実施例７（ファージディスプレイ法によるＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ末端ドメインに結合するペプチドを用いた抗ウイルス剤のスクリーニング）
ＨＩＶ−１のクローン（ｐＮＬ４−３）を鋳型としてＰＣＲ法により増幅した（９４℃で１分間熱変性させ、６０℃で１分間アニーリングし、７２℃で２分間合成反応させるサイクルを３０サイクル行い増幅させた）。このＰＣＲ産物から、ＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ末端ドメイン（Ｎ末端側から５５個のアミノ酸配列をコードする領域）のＤＮＡ断片を取り出し、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシア社製）のＢａｍＨＩやＥｃｏＲＩ等の部位にこのＤＮＡ断片を挿入し、ＨＩＶ−１インテグラーゼ発現ベクター（ｐＧＥＸ２Ｔ−ｚｉｎｃ）を構築した。構築されたベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。このトランスフォームされた大腸菌を培養液に加え、最終濃度で１００ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を添加し、３７℃で５時間発現誘導を行い、５時間後、この大腸菌を３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離させ集菌し、次に１Ｌ当たりの培地から集菌された大腸菌を１００ｍｌの１ＭのＮａＣｌと３ｍＭのＤＴＴとを含む生理食塩水（Ａ液）に再溶解し、超音波処理（５００Ｗで１０分間）によりこの大腸菌を粉砕した。得られた大腸菌粉砕液を１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することにより、蛋白粗分画を回収し、この蛋白粗分画に含まれるＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）が融合したインテグラーゼＮ−末端蛋白をグルタチオンセファロースビーズ（ファルマシア社製）により精製した。

次に、種々の長さのランダムペプチドをファージに挿入したファージライブラリー（ＮＥＢ社製）の中から、パニング操作（各ファージライブラリーの中でＧＳＴ蛋白質に結合しないファージ粒子を回収する操作、選択されたファージの中から上記記載の作製されたＧＳＴ融合インテグラーゼＮ−末端蛋白に結合するファージ粒子を回収する操作）を３〜７回繰り返し、ＨＩＶ−１インテグラーゼＮ末端ドメインと特異的に結合するペプチドを含むファージをスクリーニングした。この得られたファージをクローニングし、遺伝子配列を決定した。これらのファージディスプレー法によって得られたペプチドが、ＨＩＶ−１インテグラーゼＮ末端ドメインを標的とし、インビトロで結合するかどうかを固相酵素免疫検定法により確認した（図１０）。より詳しくは、９６穴プレートを１００μｇ／ｍｌのＧＳＴ融合インテグラーゼＮ−末端蛋白、ＧＳＴ蛋白質又は無蛋白質でコーティングし、ブロッキング後、１０^１１ｐＦＵの各ペプチドをもつクローン化ファージを加えて反応させ、次に、抗Ｍ１３−ＨＲＰ抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Ｍ１３）により２次反応させた。反応の終了した９６穴プレートに２，２′−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリンスルホニックアシッド）（ＡＢＴＳ；シグマ社製）を基質として発色させ、吸光度４０５ｎｍで定量した。これらの結果から、ＧＳＴ融合インテグラーゼＮ−末端蛋白に各ペプチドが特異的に結合することが確認できた。

第１図は、レトロウイルスのインテグレーション反応過程を示す図である。第２図は、レトロウイルスインテグラーゼ間に保存されているアミノ酸とその位置を示す図である。第３図は、ＨＩＶ−１インテグラーゼのＮ−末端ドメインのα１〜α４のαヘリックスの領域を示す図である。第４図は、標的とされたレトロウイルスのインテグラーゼＮ−末端領域において保存されるアミノ酸残基を示す図である。第５図は、ＨＩＶ−１インテグラーゼ変異クローンにおける細胞感染後のウイルス粒子の放出を示す図である。第６図は、ＨＩＶ−１インテグラーゼ変異クローンにおけるＣＯＳ細胞感染後のウイルス遺伝子の発現量を示す図である。第７図は、ＨＩＶ−１インテグラーゼ変異クローンにおけるＲＤ細胞感染後のウイルス遺伝子の発現量を示す図である。第８図は、ＨＩＶ−１インテグラーゼ変異クローンが逆転写反応以前に感染が阻害されたことを示す図である。第９図は、ＨＩＶ−１変異クローンのツー・ハイブリッド法による蛋白相互間作用を示す図である。第１０図は、ファージディスプレー法によるウイルス感染阻害剤の特異的結合を示す図である。

Claims

配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち、２６番目から３９番目のアミノ酸配列からなるペプチドを含むことを特徴とするＨＩＶ−１感染阻害剤。