HU211988A9

HU211988A9 - New sulfated polysaccharide, pharmaceutically acceptable salts thereof, process for preparation thereof, and drug containing the same

Info

Publication number: HU211988A9
Application number: HU95P/P00729P
Authority: HU
Inventors: Hui-Zeng Fan; Etsuji Yamanaka; Yoshiyuki Muranaka; Song Yu; Kazuhiro Numata; Toshinori Oka; Norihiko Suzuki
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd; Taiho Fine Chemical Co Ltd
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 1996-01-29
Also published as: ATE138938T1; KR970000528B1; CA2026992A1; KR910700269A; AU634521B2; AU5032590A; ES2087907T3; EP0408770A4; EP0408770B1; DD297165A5; DE69027256D1; WO1990008784A1; EP0408770A1; CA2026992C; DE69027256T2; JP2714718B2; DK0408770T3

Description

A találmány tárgya egy új szulfatált poliszacharid, gyógyászatilag elfogadható sói, az előállításukra szolgáló eljárás, valamint a fentieket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények.

Tengeri uborka testfalából lúgos extrakcióval egy szulfatált poliszacharidot nyertünk ki, amely antikoaguláns hatású, és a heparinra jellemző lipid-derítő hatást mutat. A feltalálók az ilyen poliszacharidot az alábbi szakirodalmi helyeken: [Yao Hsueh, (1980), 15(5), 263-270; Zhongyao Tongbao, (1982), 7(4), 2729; Hsueh Pao, (1983), 18(3), 203-208; és a 63128 001 számú japán nyilvánosságrahozatali irat] FGAG-nek nevezték el. A63-10 601 számú japán nyilvánosságrahozatali iratban más kutatók egy másik példát írnak le szulfatált poliszacharid elválasztására. Bár a fent említett korábbi irodalmi helyeken leírt szulfatált pliszacharidokat különböző neveken említik, ezek mind azonosak, és az alábbi fizikai-kémiai állandókkal jellemezhetó'k:

megjelenés:

fehér, amorf, erősen higroszkópos por, molekulatömeg:

körülbelül 15 000 és köriilbelü 80 000 közötti (gélszúréssel mérve), az összetétel elemzési eredményei: galaktózamin 13-17 tömeg% glükuronsav 16-19 tömeg% fukóz 13-27 tömeg% szulfát 27-38,5 tömeg% mólarányok:

galaktózamin:glükuronsav:fukóz: szulfát = 1:1 ± 0,2:1,35 ±0,35:3,6 ±0,6.

A fenti analitikai eredmények alapján az FGAG egy nagy molekulatömegü szulfatált poliszacharid, amely galaktózamint, gliikuronsavat, fukózt és hasonló komponenseket tartalmaz, és az ismert szulfatált poliszacharidoknál nagyobb szulfáttartalommal jellemezhető.

Erős antikoaguláns hatása miatt az FGAG-t már javasolták a disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC, éren belüli szórt vérrögképződés) gyógyítására, de később azt találták, hogy embereknél alkalmazva a trombocitákra (vérlemezkék) erős aggregáló hatást fejt ki, és ezen mellékhatás következtében az emberi DIC kezelésére nem használható.

A fenti helyzet alapján kiterjedt kutatómunkát végeztünk olyan vegyületekkel kapcsolatban, amelyek gyógyszerként jól használhatók a DIC kezelésére, és a heparinokhoz hasonló hatásúak. Ennek során azt találtuk, hogy az FGAG-nek vagy valamilyen sójának depolimerizálásával előállított szulfatált poliszacharid lényegében nem fejt ki aggregáló hatást a trombocitákra, ugyanakkor megtartja antikoaguláns hatását és más, a heparinokhoz hasonló hatásait. Továbbá felismertük, hogy a heparintól eltérően a szulfatált poliszacharid inhibiálja a trombinképződést anélkül, hogy anti-Xa vagy antitrombin hatást mutatna, így a trombózis kezelésében hatásos lehet. Az új szulfatált poliszacharidot D-HG-nek neveztük el.

Ezek az új felismerések képezik a találmány alapját.

Tehát a találmány tárgya egy új szulfatált poliszacharid (D-HG), gyógyászatilag elfogadható sói, az előállításukra szolgáló eljárás, valamint a fentieket hatóanyagként tartalmazó, a DIC és trombózis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmények.

A találmány szerinti D-HG fizikai-kémiai tulajdonságai a következők:

[1] molekulatömege:

000 és körülbelül 42 000 közötti (nagy sebességű

GPC-vel mérve);

[2] megjelenése:

fehér, amorf, erősen higroszkópos por;

[3] oldhatósága:

vízben oldódik, etanolban, acetonban és hasonló szerves oldószerekben nem oldódik;

[4] fajlagos forgatóképessége:

[oc]n = -55 és -73° közötti (C = 1%);

[5] színreakciók:

Elson-Morgan reakció +

Karbazol-kénsav reakció +

Cisztein-kénsav reakció +

Orcin-sósav reakció +

Azúré A metakromáziás reakció + [6] az összetétel elemzési eredményei:

A D-HG-ben a szacharid-komponensek - vagyis a galaktózamin (GalN), glükuronsav (GA), fukóz (Fuc) - és a szulfát mólarányai a következők: GalN:GA:Fuc:szulfát = 1:0,8 ± 0,2:0,85 ± 0,15:3,4 ± 0,9.

A galaktózamin, glükuronsav, fukóz és a szulfát meghatározását a következő módszerekkel végeztük: GalN: White módszer (Carbohydrate Research, 114:

586, 201);

GA: Bitter-Muir módszer (Anal. Biochem., 330,

1962);

Fuc: Dische módszer (J. Bioi. Chem., 175: 595 (1948));

szulfát: Dodgson és Price módszere (Biochem. J., 84:

106 1962).

A fenti analitikai eredmények azt mutatják, hogy a D-HG a molekulában szulfát- és karboxilcsoportot tartalmaz, amelyek bázisokkal reagálva sót képeznek. A D-HG só formájában stabil, rendszerint ilyen alakban izoláljuk és tisztítjuk. Sóként alkalmazhatók a gyógyászatilag elfogadható sók, így a kálium, nátrium vagy más alkálifémek, a kalcium, magnézium, bárium vagy más alkáliföldfémek sói, a piridiniumsók vagy hasonló szerves bázisok sói. Az alábbiakban megadjuk a szacharid-komponensek %-os arányait szabad (sóképzés nélküli) formában:

GalN 18-24 tömeg%

Ga 14-21 tömeg%

Fuc 13-20 tömeg% szulfát 31—44 tómeg%

A D-HG-nek és sóinak molekulatömege (nagy sebességű GPC-vel mérve) előnyösen körülbelül 4000 és körülbelül 15 000 közötti.

A találmány szerinti D-HG előállításához kiindulási anyagként FGAG-t használunk. A D-HG előállítására az FGAG-t vagy sóját depolimerizáljuk, majd elvá2

HU 211 988 A9 lasztjuk, és tisztítjuk. Az FGAG-t úgy állítjuk elő, hogy tengeri uborka (egy óceáni élőlény) testfalát lúggal elbontjuk, a kapott terméket az extraháláshoz pankreatinnal vagy valamilyen hasonló fehérjebontó enzimmel tovább bontjuk, azután elválasztjuk és tisztítjuk.

A D-HG előállításához használt FGAG-t vagy sóját könnyen előállíthatjuk az előzőekben felsorolt irodalmakban vagy még inkább például a későbbi referenciapéldában ismertetett módon. Erre a célra a tengeri uborkának például az alábbi fajai használhatók:

Stichopus japonicus Selenka,

Stichopus chloronoyus Brandt,

Stichopus variegatus Semper,

Holothuria pervicax Selenka,

Holothuria atra,

Holothuria árgus,

Holothuria edulis,

Holothuria scabra,

Parastichopus nigripunctatus,

Thelenota ananas,

Holothuria monacaria Lesson,

Holothuria leucospilaota Brandt,

Cucumaria chronhjelmi,

Cucumaria echinata,

Cucumaria frondosa Japonica,

Pentacta australis,

Paracaudina chilensis ransonneti,

Molpadia musculus,

Leptosynapta inhaerens,

Polycheira rufescens,

Synapta maculata,

Halodeima cinerascens (Brandt),

Actinopyga lacanora (Jaeger),

Actinopyga echinites (laeger),

Microthele nobilis (Selenka), stb.

A kiindulási anyagként használt tengeri uborka lehet friss vagy szárított. A fent felsoroltak közül kiindulási anyagként a legelőnyösebben a Stichopus japonicus Selenka használható.

A D-HG előállításához az FGAG-t vagy sóját vízben oldjuk, és az oldatot depolimerizáljuk. Ezen reakció során egy nagy molekulatömegű szulfátéit poliszacharidot, például heparint vagy hasonlót egy kis molekulatömegű szulfátéit poliszachariddá alakítunk át. A reakcióhoz általában depolimerizáló szert is alkalmazunk. Ez lehet például hidrogén-peroxid, hipoklórossav, hipobrómossav, nátrium-hipoklorát vagy valamilyen hasonló hipohalogénsav vagy sói; továbbá perjódsav, nátrium-perjodát és perjódsav hasonló sói stb. A reakció gyorsítására használható például aszkorbinsav vagy vas(II)-ion. A depolimerizációs reakciót adott esetben elősegíthetjük különböző sugárzásokkal, például ultrahanghullámokkal, ultraibolya- vagy gammasugárzással. Ezeket vagy önmagukban, a depolimerizáló szer helyett, vagy a fenti depolimerizáló szerekkel együtt alkalmazzuk. A találmány szerinti depolimerizációs módszerek közül a legelőnyösebb az, amelyben depolimerizáló szerként hidrogén-peroxidot használunk. A hidrogén-peroxidból 1-31 tömeg%-ot, előnyösen 1-16 tömeg%-ot alkalmazunk, a hidrogén-peroxid koncentrációjában kifejezve. A reakcióidő általában 160 óra, előnyösen 3—40 óra, a reakcióhőmérséklet pedig a szobahőmérséklet és körülbelül 80 °C, előnyösen körülbelül 40 és körülbelül 60 °C között változik. A hidrogén-peroxidos reakcióban a közeg savas vagy semleges, pH-ja 1 és 8, előnyösen 3 és 7 közötti. Az állandó pH érték fenntartására a reakciót végezhetjük valamilyen pufferben, például acetát, foszfát, Tris vagy hasonló pufferben, vagy használhatunk például egy híg nátrium-hidroxid vagy hasonló oldattal működő pHszabályozót. A reakció befejeztével a pH-t semlegesre állítjuk, azután elvégezzük az izolálást és tisztítást. Erre használhatunk például frakcionált kicsapást valamilyen szerves oldószer - mint etanol, aceton, stb. -; valamilyen acetát - mint kálium-, bárium-, kalcium-, ammónium-acetát, stb. -; vagy egy kvaterner ammóniumsó, például ceril-trimetil-ammóniumsó, stb. alkalmazásával. Az izolálás és tisztítás ezenkívül megoldható ioncserés kromatográfiával, amelyhez olyan gyantákat használunk, mint például DEAE-cellulóz (a Sigma Chemical Co. gyártmánya), DEAE-Toyopearl (a Tosoh Corporation gyártmánya), DEAE-Cellulofine (a Chisso Corporation gyártmánya), Dowex-1 (a Dow Chemical Co. gyártmánya); továbbá például Sephadex G-50 vagy Sephadex G-220 (mindkettő a Pharmacia-LKB Biotechnology gyártmánya) gyantán végzett gélkromatográfiával, Spectra/Por-ral (a Spectrum Medical Industries gyártmánya) végzett dialízissel vagy ultraszűréssel is. Ezeket a módszereket használhatjuk különkülön vagy egymással kombinálva. A trombocita-aggregáló hatást nem mutató D-HG előállításához előnyösen ioncserés kromatográfiát, gélkromatográfiát vagy ultraszűrést alkalmazunk.

Az így kapott D-HG-t általában nátrium- és/vagy kálium- vagy hasonló sója alakjában izoláljuk. A só formájú D-HG kationcserélő - például Dowex 50W gyantával átalakítható szabad D-HG-vé. A só formájú D-HG-t adott esetben egy e célra szokásosan alkalmazott módszerrel átalakíthatjuk a kívánt gyógyászatilag elfogadható sóvá. A szulfátéit poliszacharidok gyógyászatilag elfogadható sói közé tartoznak például a káliummal, nátriummal vagy más alkálifémekkel, a kalciummal, magnéziummal, báriummal vagy más alkáliföldfémekkel képzett sók, a piridiniumsók vagy hasonló szerves bázisok sói.

A DIC és a trombózis kezelése során a találmány szerinti D-HG antikoaguláns hatását hasznosítjuk, amelynek révén megakadályozza a végeredményekben végbemenő koaguláció felgyorsulását. A D-HG antikoaguláns hatása azt jelenti, hogy gátolja a trombocitáknak a trombin által okozott aggregációját, továbbá tipikusan olyan antikoaguláns enzimhatást fejt ki, amely az aktivált parciális trombolasztin-időt meghosszabbítja. A D-HG antikoaguláns hatása teljes mértékben különöbzik a heparinétól, amennyiben e hatás kifejtéséhez a D-HG nem igényel plazmafaktort - amilyen például az antitrombin III -, és nem befolyásolják az antiheparin faktorok, például a trombocita 4 faktor. További különbség, hogy a D-HG a trombin képződését anélkül gátolja, hogy anti-Xa vagy antitrombin ha3

HU 211 988 A9 tást fejtenek ki, így nyilvánvalóan hatásos a trombózissal szemben. A D-HG fontos jellemzője, hogy a heparinnal és a FGAG-val szemben gyakorlatilag nem okoz trombocita-koagulálást, amely káros hatás a DIC és a trombózis kezelésére szolgáló gyógyszereknél felléphet. Az a kifejezés, hogy „gyakorlatilag nem okoz trombocita-koagulálást” azt jelenti, hogy élőlényeknek, különösen embereknek beadva nem lép fel a trombociták koagulálása, ami az élőlényt megmérgezi vagy a trombózist súlyosbítja.

A D-HG-ből a DIC és a trombózis kezelésére különböző gyógyszerkészítmények állíthatók elő. Pontosabban: a készítmények, amelyek a D-HG-ból és/vagy egy gyógyászatilag elfogadható sójából hatásos menynyiséget és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaznak, különböző beadási formákban állíthatók elő. Orális formák például a tabletták, kapszulák, porok, granulátumok, szemcsés készítmények és hasonlók; parenterális formák például az injekciók, kúpok, kenőcsök, tapaszok stb. Ezeket a készítményeket a szakember számára ismert, hagyományos módszerekkel állítjuk elő. Orális beadásra szolgáló szilárd készítményeket úgy állíthatunk elő, hogy a találmány szerinti hatóanyagot kötőanyagok, dezintegránsok (a szétesést elősegítő szerek), csúsztatószerek, színező, ízesítő, illatosító és hasonló anyagok hozzáadásával vagy anélkül egy hordozóanyaggal összekeverjük, és a keverékből a hagyományos módon tablettákat, kapszulákat, porokat, granulátumokat, szemcsés vagy hasonló készítményeket állítunk elő. Injektálható készítményeket úgy állítunk elő, hogy a hatóanyaghoz pH-beállító szert, puffért, stabilizátort, izotonizáló szert, helyi érzéstelenítő és hasonló szereket adunk, és a keverékből hagyományos módon intravénás, intramuszkuláris, szubkután, intrakután vagy intraperitoneális injekciókat készítünk. Kúpokat úgy állítunk elő, hogy a hatóanyagból, egy kúpalapanyagból és adott esetben egy felületaktív vagy hasonló anyagból keveréket készítünk, és azt hagyományos módon kúpokká dolgozzuk fel.

Orális készítményekhez hordozóanyagként használható például a laktóz, szacharóz, keményítő, talkum, magnézium-sztearát, kristályos cellulóz, metilcellulóz, karboxi-metil-cellulóz, glicerin, nátrium-alginát, arabgumi és hasonlók. Orális készítményekhez kötőanyagként használható például a poli(vinil-alkohol), poli(vinil-éter), etil-cellulóz, arabgumi, sellak, szacharóz és hasonlók. Színezőanyagként, dezintegránsként és egyéb adalékanyagként a szakmában szokásosan alkalmazott anyagokat használjuk.

Kúpalapanyagként használhatunk például lanolint, kakaóolajat, valamilyen zsírsav-trigliceridet, Witepsolt (a Dynamite Nobel lajstromozott védjegye) és hasonlókat.

Az egységdózisokat hatóanyagtartalma a kezelendő paciens tüneteitől, a készítmény formájától és hasonló tényezőktől függ. Előnyösen egy orális egységdózis 10-200 mg, egy injekciós egységdózis 1-100 mg, egy végbélkúp pedig 10-100 mg hatóanyagot tartalmaz. A találmány szerinti készítmény napi klinikai dózisa függ a paciens életkorától, nemétől, állapotától és más tényezőktől is, általában körülbelül 10 - körülbelül 1000 mg, előnyösen körülbelül 50 - körülbelül 200 mg hatóanyagot tartalmaz, és naponta 1—4 adagra osztva adjuk be.

Tehát a találmány tárgya egy új szulfatált poliszacharid, a D-HG, amely a trombocitákat gyakorlatilag nem koagulálja, kitűnő antikoaguláns, és gyógyszerkészítményként figyelemre méltó tulajdonságokat mutat a DIC és a trombózis kezelésében.

Az alábbi referenciapélda, a példák és farmakológiai vizsgálatok a találmány részletesebb ismertetésére szolgálnak.

/. Referenciapélda

Az FGAG előállítása

Egy kg Stichopus japonicust 10 liter meleg vízbe merítünk, és egy éjszakán át duzzadni hagyjuk. A testszövetet eltávolítjuk és homogenizáljuk, majd annyi kálium-hidroxidot adunk hozzá, hogy a keverék koncentrációja 1M legyen. A keveréket 100 percig 60 °C-on kezeljük, majd a pH-ját 8,5-re állítjuk, és 50 g pankreatin hozzáadása után 50 °C-on 3 órán át keverjük.

A szennyezéseket centrifugálással eltávolítjuk, a maradékhoz 4,3 liter etanolt adtunk. A keveréket 4 °C-on állni hagyjuk, és a kapott csapadékot összegyűjtjük. A csapadékot 80 tömeg%-os etanollal, vízmentes etanollal, majd acetonnal mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így 50 g nyers terméket kapunk. A nyers termékből 50 g-ot 3,5 liter vízben oldunk, és az oldatot az oldatlanul maradt rész eltávolítására lecentrifugáljuk. A felülúszóhoz 5 tömeg% nátrium-kloridot és 40 tömeg% etanolt adunk, majd az így kapott csapadékot lecentrifugáljuk. A csapadékot 2,5 liter vízben oldjuk, és az oldat pH-ját 10,5-re állítjuk. Az oldathoz cseppenként hozzáadunk 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxid-oldatot, majd a keveréket vízfürdőn 50 °C-on 3 órán át melegítve elszíntelenítjük. Lehűlés után az oldatlan részt centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszóhoz körülbelül 490 g kálium-acetátot adunk, és a keveréket egy éjszakán át 4 °C-on tartjuk. A kapott csapadékot másnap 2 liter vízben oldjuk, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és pH-ját 2,8-ra állítjuk. Az oldatlan részt centrifugálással eltávolítjuk, a felülúszót semlegesítjük, és 196 g kálium-acetátot adunk hozzá. A keveréket 4 °C-on állni hagyjuk, a kivált csapadékot lecentrifugáljuk. A csapadékot annyi vízben oldjuk, hogy a kálium-acetát koncentrációja 0,5M legyen, és az oldatot egy éjszakán át 4 °C-on állni hagyjuk. A csapadékot lecentrifugáljuk, 40 tömeg%-os metanollal mossuk, és 1 liter vízben oldjuk. Az oldathoz 5 tömeg% nátrium-kloridot és 40 tömeg% etanolt adunk. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 80 tömeg%-os metanollal, vízmentes etanollal, majd acetonnal mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így 17 g-ot kapunk az FGAG nátrium-/kálium-sójából. A só fizikai-kémiai jellemzői a következők:

Molekulatömeg

HU 211 988 A9 (nagy sebességű GPC-vel mérve): 55 000

Az összetétel elemzési eredményei a következeik:

GalN 20,0 tömeg%

Ga 18,6 tömeg%

Fuc 17,2 tömeg% szulfát 36,6 tömeg% nátrium 6,2 tömeg% kálium 7,4 tömeg%

1. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 10 g-ot 75 ml vízben oldunk, és 25 ml 30 tömeg%-os hidrogén-peroxid-oldatot adunk hozzá. Az oldatot 12 órán át 60 °C-on melegítjük, miközben a ρΗ-ját egy pH-szabályozó és híg nátrium-hidroxid-oldat alkalmazásával körülbelül 7-es értéken tartjuk. Lehűlés után az oldathoz 2 tömeg% nátrium-kloridot és 40 tömeg% etanolt adunk. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 80 tömeg%-os etanollal, vízmentes etanollal, majd acetonnal mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így 7,15 g-ot kapunk a D-HG nátrium-/kálium-sójából.

2. Példa

6,95 g D-HG nátrium-/kábum-sót állítunk elő az 1. példában leírt módon, azzal a különbséggel, hogy a hidrogén-peroxidos kezelést 24 órán át végezzük.

3. Példa

D-HG nátrium-/kálium-sót ábítunk elő az 1. példában leírt módon, azzal a különbséggel, hogy a reakció lefolyása közben a pH értéket egy híg lúgos oldattal körülbelül 4-en tartjuk.

Kitermelés: 6,4 g.

4. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 10 g-ot 83,3 ml 0,2M foszfát pufferben (pH = 7) oldunk, és 16,7 ml 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxid-oldatot adunk hozzá. A keveréket 12 órán át 60 °C-on melegítjük. Lehűlés után az oldathoz 2 tömeg% nátrium-kloridot és 40 tömeg% etanolt adunk. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 80 tömeg%-os etanollal, vízmentes etanollal, majd acetonnal mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így 7,18 g D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk.

5. Példa

D-HG nátrium-/kálium-sót állítunk elő a 4. példában leírt módon, azzal a különbséggel, hogy a reakcióhoz 0,2M acetát puffért (pH = 3,5) használunk. Kitermelés: 7,05 g.

6. és 7. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 2 g-ot 15 ml vízben oldunk, és 5 ml 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxid-oldatot adunk hozzá. A keveréket 60 °C-on 14 órán át (6. példa) illetve 40 órán át (7. példa) melegítjük. Lehűlés után a keverék pH-ját 7 és 8 közötti értékre állítjuk, és vízzel, Spectra/por 3 alkalmazásával alaposan átdializáljuk. Ezután a keveréket liofilizáljuk, és csökkentett nyomáson megszárítjuk. Ily módon 1,62 g, illetve 1,76 g D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk.

8. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 2 g-ot 16,7 ml vízben oldunk. Az oldathoz 3,3 ml 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxidoldatot adunk, és a keveréket 24 órán át 45 °C-on tartjuk. Lehűlés után a keverék ρΗ-ját visszaállítjuk körülbelül 7-re, azután 2 tömeg% nátrium-kloridot és 40 tömeg% etanolt adunk hozzá. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 80 tömeg%-os etanollal, vízmentes etanollal, majd acetonnal mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így 1,41 g D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk.

9-12. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 2 g-ot 15 ml vízben oldunk, és 5 ml 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxid-oldatot adunk hozzá. A keveréket 60 °C-on 4, 8, 12, ibetve 24 órán át melegítjük. Lehűlés után a keverék pH-ját 7 és 8 közötti értékre állítjuk, és vízzel, Spectra/por 3 alkalmazásával alaposan átdiabzáljuk. Ezután elvégezzük a 8. példában leírt kezelést. Ily módon 1,42 g, 1,35 g, 1,35 g, illetve 1,2 g D-HG nátrium-/kábum-sót kapunk.

13. és 14. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 2 g-ot 14,7 ml vízben oldunk, és 5,3 ml 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxid-oldatot adunk hozzá. A keveréket 45 °C-on 14 órán át, illetve 40 órán át melegítjük. Lehűlés után a keverék pH-ját visszaállítjuk körülbelül 7-re, majd 2 tömeg% nátriumklorid és 40 tömeg% etanol hozzáadásával csapadékot választunk ki. Ezután elvégezzük a 6. és 7. példában leírt kezelést. Ily módon 1,64 g, illetve 1,62 g D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk.

15. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kábum-sóból 2 g-ot 30 ml vízben oldunk, és 12 órán át a 8. példa szerinti módon kezeljük. Ezután az oldatot nátrium-klorid-oldattal Spehadex G-50T (a Pharmacia-LKB Biotechnology gyártmánya) oszlopon frakcionáljuk. Az uronsavas detektálással kapott csúcsfrakciókat három részre osztjuk. Az utolsóként kapott eluátumot összegyűjtjük, vízzel teljes mértékben átdializáljuk, liofilizáljuk és csökkentett nyomáson megszárítjuk. Ily módon 0,2 g D-HG nátriumsót kapunk.

16. Példa

A 8. példában kapott D-HG nátrium-/kálium-sóból 0,5 g-ot a 15. példában leírt módon frakcionálunk, így 0,18 g D-HG nátriumsót kapunk.

Az 1. ábra a D-HG nátriumsót infravörös abszorpciós

HU 211 988 A9 spektrumát mutatja (kálium-bromid tablettával mérve), a

2. ábrán pedig ugyanezen só proton-NMR spektruma látható (D₂O-ban, 90 MHz-en, 70 °C-on mérve).

17. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 2 g-ot 16,7 ml vízben oldunk, és 3,3 ml 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxid-oldatot adunk hozzá. A keveréket 5 órán át 45 °C-on tartjuk. Lehűlés után a keverék pH-ját visszaállítjuk körülbelül 7-re, azután 2 tömeg% nátrium-kloridot és 40 tömeg% etanolt adunk hozzá. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 80 tömeg%-os etanollal, vízmentes etanollal, majd acetonnal mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így D-HG nátrium/kálium-sót kapunk.

Kitermelés: 1,60 g.

18. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 2 g-ot 9 órán át a 17. példában leírt módon kezelünk, így 1,54 g D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk.

19. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 2 g-ot 12 órán át a 17. példában leírt módon kezelünk, így 1,52 g D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk.

20. Példa

Az 1. referenciapélda szerint előállított FGAG nátrium-/kálium-sóból 1 g-ot 8,7 ml 0,2M foszfát pufferben (pH = 7) oldunk, és 1,3 ml 30 tömeg%-os vizes hidrogén-peroxid-oldatot adunk hozzá. A keveréket 3 órán át 60 °C-on melegítjük. Lehűlés után az oldathoz 5 tömeg% nátrium-kloridot és 66 tömeg% etanolt adunk. A kivált csapadékot lecentrifugáljuk, 80 tömeg%-os etanollal, vízmentes etanollal, majd dietiléterrel mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk. Ezt 10 ml 10 mM pH = 7,0-es és Tris-HCl pufferben oldjuk, összekeverjük DEAEToyoperl-lel (a Tosoh Corporation gyártmánya), és a pufferrel pontosan kiegyenlítjük. A lineáris gradienselúciót a pufferben 0 és 1M közötti nátrium-klorid-oldattal hajtjuk végre. Az uronsavas detektálással kapott csúcs-frakciókat összegyűjtjük és kétszeres mennyiségű etanolt adunk hozzá, ennek hatására csapadék válik ki. A csapadékot lecentrifugáljuk, 80 tömeg%-os etanollal, vízmentes etanollal, majd dietil-éterrel mossuk (ebben a sorrendben), azután csökkentett nyomáson megszárítjuk, így D-HG nátrium-/kálium-sót kapunk. Kitermelés: 0,39 g.

Az 1. táblázatban a fenti példák szerint előállított D-HG-k fizikai-kémiai tulajdonságai láthatók.

1. Táblázat

Példa	MWX10³	[«]§	Összetétel	Mólarány
			GalN	Puc	GA	Sül*	Na	K	GalN:GA: Fue:Sul*
1	10.2	-71,2	21,7	16,7	16,5	29,7	7,1	6,4	1:0,70:0,84: 2,5
2	9,7	-67,1	19,8	15,8	15,1	30,2	7,2	7,9	1:0,70:0,87: 2,8
3	14,1	-71,5	20,2	17,6	15,6	33,1	6,2	6,7	1:0,71:0,95: 3,0
4	4,7	-55,4	19,8	15,1	13,3	31,4	8,2	4,8	1:0,62:0,83: 2,9
5	6,5	-61,2	20,6	15,6	15,8	32,8	7,8	4,4	1:0,71:0,83: 2,9
6	12,0	-70,8	18,6	16,5	17,1	38,6	4,7	6,1	1:0,85:0,97: 3,8
7	7,8	-68,0	17,5	13,1	16,1	37,1	5,4	6,4	1:0,85:0,82: 3,9
8	13,4	-70,1	17,1	14,6	14,6	32,7	8,1	5,5	1:0,79:0,93: 3,5
9	14,1	-69,6	19,9	14,3	14,8	34,0	7,6	5,2	1:0,69:0,79: 3,1
10	8,6	-66,3	20,8	15,1	14,3	34,8	8,5	5,5	1:0,64:0,79: 3,1
11	7,5	-66,0	17,8	13,2	13,2	32,9	6,4	5,1	1:0,68:0,81: 3,4

HU 211 988 A9

Példa	MWX10³	[0C]§	Összetétel	Mólarány
			GalN	Puc	GA	Sül*	Na	K	GalN:GA: Fue:Sul*
12	5,6	-64,8	20,1	14,7	13,0	33,4	4,1	5,1	1:0,60:0,80: 3,0
13	10,0	-72,2	18,1	14,0	16,7	37,1	5,0	6,5	1:0,85:0,89: 3,8
14	6,6	-68,4	17,3	12,8	15,9	35,3	5,6	6,7	1:0,85:0,81: 3,7
15	10,2	-68,2	19,1	15,8	14,4	32,9	8,6	0	1:0,69:0,90: 3,1
16	7,7	-67,5	17,6	13,9	14,1	32,1	4,4	0	1:0,74:0,86: 3,3
17	41,4	-70,7	19,8	14,7	15,8	29,9	5,9	5,5	1:0,73:0,81: 2,7
18	24,3	-72,6	18,0	15,9	16,6	33,4	6,2	5,2	1:0,85:0,96: 3,4
19	20,1	-71,1	18,3	14,4	14,8	33,0	7,5	5,0	1:0,75:0,86: 3,3
20	12,8	-62,4	19,3	14,5	16,2	34,3	10,7	0	1:0,78:0,81: 3,3

Megjegyzés: az 1. táblázatban az MW, vagyis a molekulatömeg értékét nagy sebességű GPC-vel mértük. Sül* jelentése szulfát.

Az elektroforézisben [Dietrich. C. P., J. Chromatogr., 130, 299 (1977)] az 1-19. példákban kapott D-HG-k mindegyike egyetlen foltot mutatott.

1. Készítmény-példa

Injektálható készítmény

A 16. példában kapott D-HG nátriumsót injekció céljára szolgáló desztillált vízben oldva 5 tömeg%-os vizes oldatot készítünk. Az oldatból 50 mg-os mennyiséget (DHG-ben kifejezve) a liofilizálás elvégzésére fiolába töltünk, majd oldószerként 2 ml fiziológiás nátrium-kloridoldatot adunk hozzá.

2. Készítmény-példa Injektálható készítmény

Elkészítjük az alábbi összetételű injektálható készítményt:

D-HG nátrium-/kálium-só (12. példa) 40 mg fiziológiás nátrium-klorid-oldat szükség szerint az össztérfogathoz ampullánként 2 ml

3. Készítmény-példa Tabletta

Elkészítjük az alábbi összetételű tablettákat: ⁴

D-HG nátrium-/kálium-só (14. példa) 10 mg kukoricakeményító' 65 mg karboxi-metil-cellulóz 3 mg magnézium-sztearát 2 mg tablettánként 100 mg

4. Készítmény-példa

Kúp

Elkészítjük az alábbi összetételű kúpokat:

D-HG nátrium-/kálium-só (4. példa) 50 mg Witepsol W-35 (a Dynamite Nobel Ag gyártmánya) 950 mg kúponként 1 000 mg

Farmakológiai vizsgálatok <DIC modell>

A D-HG-nak, az FGAG-nak és a heparinnak a DIC-re gyakorolt hatását az alábbi irodalomban: [Ja35 pan J. Pharmacol, 35, 203-227 (1984)] leírt módon vizsgáltuk.

D-HG-ként a 16. példában kapott nátriumsót, FGAG-ként az 1. referenciapéldában kapott nátrium/kálium-sót, heparinként pedig egy 185,6 NE/mg akti40 vitású nátriumsót használtunk.

10-15 ICR egérből álló csoportnak 800 NE/kg trombint injektáltunk be intravénásán. 24 óra elteltével a túlélési arány kiszámítására megfigyeltük, hogy hány egér hullott el a DIC következtében. A D-HG nátriumsót, az FGAG nátrium-/kálium-sót, illetve a heparin-nátriumsót egy perccel a trombin beadása eló'tt injektáltuk be intravénásán. Az eredmények a 2. táblázaton láthatók.

5Q 2. Táblázat

Gyógyszer	Dózis (mg/kg)	Túlélési arány (%)
Kontroll	0	13
	3	90
D-HG nátriumsó	1	60
	0,3	40
FGAG nátrium/kálium-só	1	60
Heparin-nátriumsó	1	80

HU 211 988 A9 mg/kg-os mennyiségben a D-HG a DIC-cel szemben ugyanolyan hatást fejtett ki, mint a heparin és az FGAG. Ennek a modellnek az alkalmazásával a vegyiileteknek a trombózis ellenes hatása is vizsgálható.

<Antikoaguláns hatás>

Nyálból kinyert, citromsavat tartalmazó plazmához 10 ptg/ml D-HG nátriumsót (16. példa) illetve D-HG nátrium-/kálium-sót (11. példa) adtunk. Egy fiziológiás sóoldatot tartalmazó kontrollmintával szemben mértük az aktivált parciális tromboplasztinidő (APTT) meghosszabbodást. Az eredmények a 3. táblázatban láthatók.

3. Táblázat

Gyógyszer	APTT (Asec)
16. példa	24,7
11. példa	16,2
Kontroll	0,0

A D-HG lényegesen nagyobb antikoaguláns hatást mutatott.

<Antikoaguláns hatás embereknél>

egészséges személybóT kinyert, citromsavat tartalmazó plazma alkalmazásával mértük a D-HG nátriumsó (16. példa), egy FGAG nátrium-/kálium-só és egy heparin-nátriumsó hatását a koagulálásgátló szempontjából. A paramétereket pg/m 1-lien fejeztük ki. Az eredmények a 4. táblázatban láthatók.

Az x2APTT az a koncentráció (pg/ml), amely az aktivált parciális tromboplasztin-időt (gyógyszer hozzáadása nélkül) a kétszeresére növeli.

A I laICc,) az a koncentráció (pg/ml), amely ahhoz szükséges, hogy a trombin aktivitást 90%-ban inhibiálja, amit a trombin-idő meghosszabbodása alapján számítottunk.

Az XaIC₅₀ az a gyógyszerkoncentráció (pg/ml), amely 50%-ban inhibiálja egy faktor X-szel ellátott szintetikus szubsztrát, az S2222 lebomlását.

A VIII IC₈₀ az a gyógyszerkoncentráció (pg/ml), amely 80%-ban inhibiálja a faktor VlII-at. Ezt úgy számítottuk ki, hogy egy kis mennyiségű faktor VIII jelenlétében mértük azt az aktivitást, amely egy faktor VlII-ban hiányos plazma kontakt-aktivált koagulációs idejének meghosszabbításához szükséges.

A IlaGI az a koncentráció (pg/ml), amely a kont5 rollminta esetén a kontakt-aktivált plazmában kétszeresére növeli a pro trombin teljes inaktiváláshoz szükséges időt. Ez egy trombinképződést inhibiáló hatást jelent.

Ί q 4. Táblázat

Gyógy- szer	X2APTT	IIaIC₉₀	XaIC₅₀	VIII IC₈₀	IlaGI
Heparin- nátrium- só	1,2	0,3	3,4	0,79	1,2
FGAG nátrium- /kálium- só	2,4	2	5200	1,68	2,4
16. példa	12,0	30	5100	4,77	12,0

Amint a 4. táblázatból látható, a D-HG nátriumsók meghosszabbítják az APTT-t, tehát antikoaguláns hatá25 súak, de a heparin-nátriumsóktól eltérően gyakorlatilag sem antitrombin, sem pedig a faktor Xa-val szembeni (anti-Xa) hatást nem fejtenek ki. Másrészt a D-HG nátriumsók a trombinképződést inhibiáló hatást mutatnak, ami megerősíti azt a tényt, hogy ezek a sók tromθθ bózis ellen hatásosak. Ezt a hatást feltehetően a faktor VIII aktivitásának inhibíciója és a koagulációs kaszkád pozitív visszacsatolási mechanizmusának gátlása okozza. A fentiek azt mutatják, hogy a D-HG kiválóan alkalmas szer a DIC és a trombózis kezelésére.

Azt vizsgáltuk, hogy egy nyűiből kinyert, plazmamentes, mosott trombocita-szuszpenzióban 0,1 NE/ml trombin hozzáadására bekövetkező trombocita-aggregá42 cióra (amit a fényátbocsátás növekedésével fejeztünk ki), milyen hatást fejt ki a 16. példában kapott D-HG nátriumsó, illetve 185,6 NE/mg aktivitású heparin-nátriumsó hozzáadása. Az eredmények az 5. táblázatban láthatók.

5. Táblázat

Gyógyszer	Koncentráció (pg/ml)	Fényátbocsátás (%)
Kontroll	0	86,6
D-HG nátriumsó	3	46,4
	10	5,2
Heparin-nátriumsó	3	80,2

A D-HG a heparintól eltérően jelentős mértékben inhibiálta a trombin által előidézett aggregációt a plazmamentes rendszerben. Ily módon bebizonyítottuk, hogy a D-HG hatása független a plazmafaktoroktól, mint például az ATIII stb.

cTrombocita-aggregációt előidéző hatás embereknél egészséges személybóT (B, E, G, Η, I) trombocitában dús plazmát nyertünk ki, és azt citráttal kezeltük. A plazmához hozzáadtuk a 16. példában kapott D-HG nátriumsót, illetve az 1. referenciapéldában kapott FGAG nátrium-/kálium-sót, és mértük ezek trombocita-aggregációt előidéző hatását (a fényátbocsátás növekedésében kifejezve). Az eredmények a 6. táblázatban láthatók.

HU 211 988 A9

6. Táblázat

Gyógyszer	Koncentráció (mg/ml	Fényátbocsátás (%)
B	E	G	H	J
D-HG nátriumsó	1	1,2	2,5	3,8	3,0	1,3
FGAG nátrium/kálium-só	0,3	20,9	83,8	48,2	65,4	77,4
Kontrollminta	-	2,4	1,3	2,3	1,8	2,4

A D-HG 1 mg/ml koncentrációban nem okozott trombocita-aggregációt, viszont az FGAG már kisebb, 300 pg/inl koncentrációban is trombocita-aggregáló hatást mutatott.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. FGAG-nak vagy valamilyen sójának depolimerizálásával előállított szulfatált poliszacharid (D-HG) amelynek fizikai-kémiai tulajdonságai a következők:

[1] molekulatömege:

3000 és körülbelül 42 000 közötti (nagy sebességű

GPC-vel mérve);
[2] megjelenése:

fehér, amorf, erősen higroszkópos por;
[3] oldhatósága:

vízben oldódik, etanolban, acetonban és hasonló szerves oldószerekben nem oldódik;
[4] fajlagos forgatóképessége:

[oc]q = -55 és -73° közötti (C = 1%);
[5] színreakciók:

Elson-Morgan reakció +

Karbazol-kénsav reakció +

Cisztein-kénsav reakció +

Orcin-sósav reakció +

Azúré A metakromáziás reakció + [6] az összetétel elemzési eredményei:

galaktózamin:glükuronsav:fukóz:szulfát = 1:0,8 ± 0,2:0,85 ±0,15:3,4 ±0,9

- és gyógyászatilag elfogadható sói.

2. Egy az 1. igénypont szerinti szulfatált polisza10 charid (D-HG) és sója, amelynek molekulatömege 4000 és 15 000 közötti (nagy sebességű GPC-vel mérve).

3. Eljárás az 1. igénypont szerinti szulfatált poliszacharid (D-HG) és sójának előállítására, azzal jellemez15 ve, hogy az FGAG-t vagy egy sóját depolimerizáljuk, majd az így kapott terméket elválasztjuk és tisztítjuk.

4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztást és tisztítást kálium-acetát alkalmazásával végzett frakcionált kicsapással és/vagy etanol

20 alkalmazásával végzett kicsapással hajtjuk végre.

5. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztást és tisztítást gélszűréssel végezzük.

6. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az elválasztást és tisztítást ioncserével végezzük.

25 7. Disszemniált intravaszkuláris koaguláció kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, amely az 1. igénypont szerinti szulfatált poliszacahridból (D-HG) és/vagy sójából hatásos mennyiséget és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.

30 8. Trombózis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény, amely az 1. igénypont szerinti szulfatált poliszacharidból (D-HG) és/vagy sójából hatásos mennyiséget és egy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagot tartalmaz.

35 9. Az 1. igénypont szerinti szulfatált poliszacharid (D-HG) és/vagy sójának felhasználása a disszemniált intravaszkuláris koaguláció tünetcsoport kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.

10. Az 1. igénypont szerinti szulfatált poliszacharid

40 (D-HG) és/vagy sójának felhasználása a trombózis kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.