HU210834B

HU210834B - Method for the preparation pharmaceutical composition for the treatment of dermatitis

Info

Publication number: HU210834B
Application number: HU91511A
Authority: HU
Inventors: Jean-Claude Farine; Courten Alfred De
Original assignee: Om Lab Sa
Priority date: 1990-02-16
Filing date: 1991-02-15
Publication date: 1995-08-28
Also published as: KR0169982B1; BE1005589A3; HUT61201A; JP3002552B2; EG19540A; ITMI910381A1; GB2240922A; CH680045A5; PT96789B; IT1244743B; PT96789A; ITMI910381A0; HU910511D0; GB9103278D0; PL289084A1; AT402152B; KR910015306A; FR2658419A1; ATA32291A; DE4104728A1

Description

A találmány tárgya eljárás bőrgyulladás (dermatitisz), közelebbről atópiás bőrgyulladás kezelésére alkalmazható gyógyászati készítmény előállítására, konkrétan egy ismert baktérium-lizátum új alkalmazására a fentebb említett betegség kezelésére használható gyógyászati készítmény előállítása céljából.

A 633 188 számú svájci szabadalmi leírásból (amelynek tulajdonosa e bejelentés tulajdonosával azonos) ismert egy immun-bioterápiás gyógyászati készítmény légúti fertózéses betegségek kezelésére. E készítmény hatóanyagként olyan baktérium-lizátumot tartalmaz, amely a

- Staphylococcus aureus 1-050,1-051,1-052,1-053, 1-054;

- Streptococcus viridans 1-046,1-047,1-048;

- Neisseria catarrhalis 1-045 baktériumtörzseknek legalább az egyikéből, valamint

- Haemophilus influenzáé b szerotípus NCTC 8467;

- Diplococcus pneumoniae 1„ 2„ 3. és 47. szerotípusok; NCTC 7465,7466, 7978,10319;

- Klebsiella pneumoniae NCTC 204,5056 ;

- Klebsiella ozaenae NCTC 5050;

- Streptococcus pyogenes „A” csoport NCTC 8191;

- Neisseria catarrhalis NCTC 3622, 3625 baktériumtörzsek közül legalább az egyikből ered. Az NCTC törzsek a National Collection of Type

Cultures (London, Colindale Avenue 175, NW95HT, Nagy-Britannia) intézményben katalogizáltak, és a nyilvánosság számára hozzáférhetők; míg az I törzseket az idézett szabadalom tulajdonosa 1978. március 14-én a Collection nationale de cultures de micro-organismes, (Institut Pasteur, 28 Rue du Dr Roux, 75724 Paris, Franciaország) intézményben deponálta.

Valamennyi fenti törzs olyan kórokozókból származik, amelyek a légutak fertőző betegségeiért felelősek.

A fentebb idézett svájci szabadalom tárgyát képező baktérium-lizátum figyelemreméltó hatást mutatott az atópiás bőrgyulladás ellen, ami mindenképpen váratlan, mert ez a betegség krónikus, és örökletesen determinált.

Újabb vizsgálatok során kimutatták, hogy az atópiás bőrgyulladás összetett immunhiánnyal kapcsolatos, és főként a gyenge túlérzékenységi reakciók jellemzik; a túlérzékenységet késlelteti a sejtes közvetítés, további jellemzője az E immunglobulinok (rövidítve: IgE) szintézisének a fokozódása. Ezenfelül a gyomor-bélcsatorna lehet a betegségért felelős allergének behatolási útja.

Ennek alapján a jelen találmány tárgya eljárás gyógyászati készítmény előállítására, amely hatóanyagként Haemophilus influenzáé, b szerotípus NCTC 8467, Diplococcus pneumoniae, 1., 2., 3. és 47. szerotípusok, NCTC 7465,7466,7978,10319; Klebsiella pneumoniae NCTC 204,5056;

Klebsiella ozaenae NCTC 5050;

Staphylococcus aureus 1-049,1-050,1-051,1-052,

1-053,1-054,1-046, 1-047,1-048,

Streptococcus viridans

Streptococcus pyogenes A csoport NCTC 8191 és

Branhamella catarrhalis (anc. Neisseria catarrhalis) 1-045, NCTC 3622,3625 törzsek lizátumát tartalmazza, oly módon, hogy az ismert módon előállított lizátumot gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal összekeverve atópiás bőrgyulladás kezelésére alkalmazható gyógyászati készítménnyé alakítjuk.

A baktérium-lizátum valamennyi fent felsorolt törzset tartalmazza és koncentrált, liofilizált formában van jelen. A gyógyászati készítményt előnyösen orális adagolásra alkalmas, egyenként 7 mg liofilizált baktériumlizátumot tartalmazó kapszulák formájában alakítjuk ki, a lizátum minden egyes baktériumtípusból (Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophilus, Diplococcus és Klebsiella) 6 milliárd csírát tartalmaz.

Az alábbiakban példaképpen leírjuk a baktériumlizátumok előállítását, valamint a gyógyászati készítmény galenikus formáját, továbbá klinikai vizsgálataink eredményeit.

A baktérium-lizátumok előállítása

Standard, steril tenyésztő alapközeget állíthatunk elő, amely valamennyi törzs számára megfelelő, és az alábbi komponenseket tartalmazza, amelyek feltüntetett mennyisége 1 liter végtérfogatra vonatkozik:

Komponensek:

Nátrium-klorid	2,5 g
Dinátrium-hidrogén-foszfát	2g
Nátrium-acetát	0,5 g
Aneurin	0,003 g
Nikotinsav	0,003 g
Nátrium-laktát (70 tömeg%-os oldat)	2 ml
Ammónium-laktát (50 tömeg%-os oldat)	2 ml
Húskivonat	22,5 g
Élesztőkivonat	7,5 g
Glükóz	3g

A különböző törzseket elkülönítetten, optimalizált körülmények között, folyékony közegben tenyésztjük.

A tenyésztő alapközeget előnyösen 2 tömeg%-osra dúsítjuk élesztőkivonattal és 0,5 tömeg%-osra Fildes-kivonattal a Haemophilus influenzáé törzs tenyésztése során.

Ugyanígy előnyösen úgy járunk el, hogy a Diplococcus pneumoniae törzs tenyésztése során a tenyésztő alapközeget lószérummal 0,5 tomeg%-osra és glükózzal 0,3 tömeg%-osra dúsítjuk.

Végül a többi törzs - Streptococcus viridans és pyogenes, Klebsiella ozaenae és pneumoniae, valamint Staphylococcus aureus és Branhamella catarrhalis tenyésztése során előnyösen a tenyésztő alapközeget glükózzal 0,3%-osra dúsítjuk.

A fenti tenyészeteket fermentorokban külön-külön 37 °C hőmérsékleten 7,0 p H értéken állítjuk elő.

Összegyűjtés és sejtszámlálás után a baktériumokat centrifugáljuk, és konyhasóoldatban szuszpendáljuk; minden esetben elkülönítetten kezelünk minden egyes törzset

Ezt követően a különböző baktériumszuszpenziókat standardizált körülmények között, azaz körülbelül 9-10 pH értéken és körülbelül 20-40 °C hőmérséklettartományban alkalikus lízisnek vetjük alá, amelynek lefolyását mikroszkóp alatt figyeljük.

HU 210 834 Β

Ezután az egyes baktériumtörzsekből származó lizátumok térfogatát a csírák száma és a koncentrátum végtérfogata szerint állítjuk be, majd az egyes lizátumokat a megfelelő arányokban elegyítjük, és centrifugáljuk. A felülúszót konyhasóoldattal a minden egyes gyártási tételre számított végtérfogatra hígítjuk. Ezután a koncentrátumot nagy mélységű szűrőn szüljük, végül 0,2 μ pórusméretű membránon sterilizáljuk. Az így kapott terméket kémiai és mikrobiológiai szempontból vizsgáljuk. A termék 4 °C hőmérsékleten tárolható.

Kapszulák előállítása

A kiválasztott galenikus forma előállítása előtt a baktérium-lizátum koncentrátumát önmagában ismert módon (például hidrogén-kloriddal) közömbösítjük, majd a koncentrátumot liofílizáljuk, az így kapott liofilizáttnot aszeptikus körülmények között összegyűjtjük, szitáljuk, és megfelelő tartóedényben vákuumban tároljuk. Az így kapott termék - amelyet standardizált liofilizátumnak nevezünk - 40 mg tömegében a gyógyászati készítmény hatóanyagát képező 7 mg liofilizált baktérium-lizátumot tartalmaz, amely lizátumban az egyes baktériumtípusok (Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophilus, Diplococcus és Klebsiella) csíraszáma 6 milliárd.

Ezt követően önmagában ismert módon orális adagolás céljára alkalmas kapszulákat készítünk, amelyek mindegyike 40 mg standardizált liofilizátumot tartalmaz; úgy járunk el hogy a - például Capsugel-típusú kapszulákba (gyártja a Capsugel AG, Bázel, Svájc) a fenti liofilizátum és a tapasztalt szakember számára könnyen kiválasztható, megfelelő vivőanyagok keverékét töltjük. Vivőanyagként például propil-3,4,5-trihidroxi-glutamátot, nátrium-L-hidrogén-glutamátot, magnézium-triszilikátot, magnézium-sztearátot, mannitot, színezőanyagokat (E132 és El71) alkalmazhatunk.

Példa

Gyógyászati készítményt állítunk elő, amelynek összetétele megegyezik a 633 188 számú svájci szabadalommal védett, kereskedelmi forgalomban BronchoVaxom ^R márkanéven kapható termékével.

Toxicitási vizsgálatok

Akut toxicitási vizsgálatainkat egereken végeztük 5,000 mg/testtömeg-kg-ig teijedő dózisokkal az LD_S0(50%-os halálos dózis) meghatározása céljából. E vizsgálatok alapján a példa szerinti gyógyászati készítmény nem fejtett ki toxikus hatást; a makro- és mikroszkópos vizsgálatok során a szerveken nem észleltünk elváltozást.

Klinikai vizsgálatok

A fenti példa szerinti gyógyászati készítménnyel klinikai vizsgálatokat végeztünk, hogy atopiás bőrgyulladásra kifejtett hatásait megállapítsuk. 26 hoszszantartó atopiás bőrgyulladásban szenvedő felnőtt beteget 5 hónapon át kezeltünk a gyógyászati készítménnyel. A gyógyászati készítményt 7 mg baktérium5 lizátumot tartalmazó kapszulában, napi 1 kapszula adagolásával adtuk a betegeknek 1 hónapig, majd a vizsgálat 3., 4. és 5. hónapjában 10 egymást kővető napon át adagoltuk. E betegek közül 15 már előzőleg kapta a gyógyászati készítményt ugyanilyen adagolási rend szerint 5 hónapig; és 1 beteg már régebben kapta a készítményt.

Különös figyelmet szenteltünk a viszketegség és a bőrgyulladás súlyossági fokának, közelebbről a sömörképződés „lichenifikálódás”) jelenségének, amelyet havonta értékeltünk az alábbi skála szerint: 0 = nincsen, 1 = enyhe, 2 = mérsékelt, 3 = súlyos és 4 = igen súlyos.

Klinikai javulást állapítottunk meg, amennyiben a tünetek (viszketegség és bőrgyulladás) súlyossága, va20 lamint a szokásos gyógyszerek alkalmazásának szükséglete több mint 50%-kal csökkent.

Az A, G és M immunglobulinok szérumszintjét (amelyet radiális immundiffuzió útján mértünk), valamint az IgE-k összes szérumszintjét (amelyet radioim25 munológiai eljárással mértünk) a vizsgálat előtt, majd a kezelés első, majd a kezelés öt hónapjának letelte után határoztuk meg.

Továbbá sejtesen közvetített bőrteszteket (Multitest CMI J. Immunother. VH(2) 105-108 (1991)] is alkal30 máztunk. A 26 kezelt betegünk 57,7%-án a vizsgálat 5 hónapja során klinikai javulást figyeltünk meg. Ha figyelembe vesszük, hogy 15 betegünket két öt hónapos időszakban előzőleg már kezelték, akkor ez az esetek 73,3%-ában javulást jelent.

A 26 betegen elvégzett immunglobulinszintmeghatározás (A, G, M és E) a kezelés 1. és 5. hónapja után statisztikailag szignifikáns csökkenést mutatott (lásd az I. táblázatot).

Azon a 15 betegen, akiket két periódusban kezeltünk a gyógyászati készítménnyel, megállapítottuk az IgE szintjének statisztikailag jelentős csökkenését az első kezelési időszak végén, s ez még hangsúlyosabbá vált a kezelés második periódusában (lásd a Π. táblázatot).

A bőrtesztek (Multitest CMI) azt mutatták, hogy a

26 beteg a kezelés előtt gyenge választ adott (ami tükrözi a sejtes immunitás hiányát), ennek értéke 7,21±1,5, és ez az érték a kezelés 5 hónapja után normálissá válik, mivel 22,25±2,7 mm értéket ér el (a bőr megkeményedésének normális átlagértéke 18 és 28 mm között van).

A fentiek szerint elért klinikai eredmények nyilvánvalóan mutatják, hogy a találmány szerinti gyógyászati készítmény az atopiás bőrgyulladásra jelentős hatást fejt ki.

/. Táblázat

26, őt hónapon át kezelt, atópiás bőgyulladásban szenvedő beteg átlagos A, G, M és E immunglobulinszintje

Paraméter	Kezdeti értéke	1 hó után	P =	5 hó után	P =
IgA (NE/ml)	332,62±17,29	313,23+18,42	0,077	306,15±16,36	0,012

HU 210 834 B

IgA (NE/ml)	1844,23168,18	1687,31159,62	0,001	1672,69160,72	0,004
IgM (NE/ml)	228,84112,74	182,3118,22	0,0001	195,73111,86	0,002
IgE (NE/ml)	1935,541468,65	1553,081368,49	0,007	1286,461281,38	0,012

11. táblázat

15, két öthónapos periódusban kezelt, atópiás bórgyulladásban szenvedő beteg átlagos IgE-szintje

Vizsgálati periódus	Átlagos IgE-értékek (NE/ml)
Kezdeti értékek	1 hó után	5 hó után
1.	4593,611089,6	4315,411014,8*	3304,11819,5**
2.	2961,71681,6	2329,71530,9***	1888,61384,33****

* p = 0,038

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, amely hatóanyagként

Haemophilus influenzáé, b szerotípus NCTC 8467, Diplococcus pneumoniae, 1., 2., 3. és 47. szerotípusok, NCTC 7465,7466,7978,10319;

Klebsiella pneumoniae Klebsiella ozaenae Staphylococcus aureus

NCTC 204,5056; NCTC 5050;

1-049,1-050,1-051,1-052,

1-053,1-054,1-046, 1-047,1-048,

Streptococcus viridans

Streptococcus pyogenes A csoport NCTC 8191 és

20 Branhamella catarrhalis (anc. Neisseria catarrhalis) 1-045, NCTC 3622,3625 törzsek lizátumát tartalmazza, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított lizátumot gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal összekeverve

25 atópiás bőrgyulladás kezelésére alkalmazható gyógyászati készítménnyé alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktérium-lizátumot koncentrált és liofilizált alakban alkalmazzuk.

30 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gyógyászati készítményt kapszulánként a napi 7 mg dózisnak megfelel baktérium-lizátumot tartalmazó, orális adagolásra alkalmas kapszulák formájában állítjuk elő.