JPH10236956A

JPH10236956A - 免疫賦活剤

Info

Publication number: JPH10236956A
Application number: JP6016397A
Authority: JP
Inventors: Kyuichi Kamoi; 久一鴨井; Koichi Kiyonobu; 浩一清信; Koji Sayama; 晃司佐山
Original assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Nippon Beet Sugar Manufacturing Co Ltd
Priority date: 1997-02-28
Filing date: 1997-02-28
Publication date: 1998-09-08
Anticipated expiration: 2017-02-28
Also published as: JP3665850B2

Abstract

(57)【要約】【解決手段】ラフィノースを有効成分とする免疫賦活
剤。【効果】ラフィノース１日当り４〜２０ｇ（好適には
５〜１５ｇ）を経口投与することによりすぐれた免疫賦
活作用が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫賦活剤に関
し、更に詳細には、ラフィノース（オリゴ糖）を有効成
分とする免疫賦活剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】腸の中には約百種類、百兆個の細菌が生
息している。このような腸内細菌と宿主との関係が、近
年、注目を浴びるようになり、腸内細菌の研究が盛んに
なってきた。

【０００３】一方、オリゴ糖は、２〜１０個の単糖類が
結合した糖であり、ビフィズス菌を増殖させ、腸の働き
を助ける性質がある。最近は乳酸菌飲料、清涼飲料水、
缶コーヒーなどに使用されている。ラフィノースは、ビ
フィズス菌・乳酸桿菌に資化されるオリゴ糖の一つで、
植物界に広く分布する三糖類である。白色で針状の結晶
構造をしており、ビートからは１８８５年に見つかっ
た。ラフィノースは、ビフィズス菌の増殖を誘導し、大
腸菌やウェルシュ菌などの増殖を抑制すると考えられ
る。

【０００４】また、ビフィズス菌は宿主の免疫機構に影
響を及ぼす事が最近の報告から明らかになってきている
が、ラフィノースの投与によって免疫機能が高められた
という報告は未だなされていない。ましてや本発明のよ
うに、ラフィノースの投与によって実際にヒトの末梢血
における免疫細胞の増殖を確認したという報告、ラフィ
ノースの投与によるin vivoでの免疫賦活作用を確認し
たという報告については、いずれも従来全くなされてい
ない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】免疫賦活、免疫力の増
強が、癌をはじめとする各種疾病の予防、治療にきわめ
て重要である点に鑑み、本発明者らは、すぐれた免疫賦
活剤、特に安全性の高い有用な免疫賦活剤を新たに開発
することを目的として設定した。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために各方面から検討の結果、免疫賦活性の
ほかに安全性の面にも注目し、経口投与も可能な免疫賦
活剤を開発することとし、副作用の少ない天然物に着目
した。

【０００７】そして数多くの天然物の内、オリゴ糖、特
にラフィノースがすぐれた免疫賦活作用を有することを
見出し、本発明者らは、更に、ラフィノースの投与によ
る腸内ミクロフローラにおけるビフィズス菌の増加、免
疫細胞増殖作用、好中球の機能について、実際にヒト糞
便及び血液で確認し、また更に、ヒトボランティアによ
るラフィノース経口投与の安全性ないし健康チェックも
行い、機能及び安全性の両面から、しかもin vitroでは
なくin vivoレベルでラフィノースの有用性を確認し、
本発明を完成した。

【０００８】すなわち、本発明は、ラフィノース（オリ
ゴ糖）を有効成分とする免疫賦活剤に関するものであ
り、本発明によれば、安全性が高く、経口投与も可能な
卓越した免疫賦活剤が提供される。以下、本発明につい
て詳述する。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明に係る免疫賦活剤は、ラフ
ィノースを有効成分としてこれに常用される無機又は有
機の担体ないし医療用賦形剤を加えて、常法にしたが
い、固体、半固体又は液体の形で、経口投与剤のほか、
外用剤等の非経口投与剤に製剤化する。経口投与剤の場
合、その投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、
顆粒剤、散剤、シロップ剤、うがい薬等が挙げられる。
これらの各種製剤は、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、
滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティン
グ剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる
既知の補助剤を用いて製剤化することができる。

【００１０】その使用量は、症状、年令、体重、投与方
法および剤形等によって異なるが、通常、成人１日当り
４〜２０ｇ、好ましくは５〜１５ｇを経口投与すること
ができる。本発明に係る有効成分は、天然起源でありし
かも食品として使用されているものを起源とするため、
毒性については格別の問題はなく、ラットに対して１日
当り５００ｍｇ経口投与しても急性毒性は全く認められ
なかった。したがって、必要あれば上記範囲よりも多量
に使用してもさしつかえない。

【００１１】本発明に係る免疫賦活剤は、ヒトのほか、
ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、スイギュウといった各種の
哺乳動物に対して適用することができ、また、ウサギ、
ラット、マウスといった実験動物に対しても適用するこ
とができる。そして有効成分についても、精製されたラ
フィノースを使用するのが最適ではあるが、例えば一部
の経口投与剤の場合においては、甜菜糖の製造工程で副
生するシロップの加工品といった精製度は多少低下した
ものを使用することも可能である。

【００１２】ラフィノースによる免疫賦活作用の詳細な
メカニズムについては、今後の研究にまたねばならない
が、ラフィノースの投与により腸内細菌そう（腸内ミク
ロフローラ）のビフィズス菌の占める割合が増加して、
二次的に免疫反応が高めることが考えられている。そし
て、ラフィノースを投与することによって、免疫賦活作
用が高まり、各種疾病の予防、治療が有効に行われるこ
ととなり、例えば経口投与、うがい薬、局所投与等によ
る歯周病の予防、治療にも有効であることが大いに期待
される。

【００１３】以下、本発明の実施例について述べる。

【００１４】

【実施例１】ラフィノースのボランティアへの投与によ
る腸内細菌そう、免疫細胞増殖作用、好中球の貪食機能
に対する影響

【００１５】（１）被験者被験者は本研究の主旨を理解し、同意が得られたボラン
ティア１０名（男性２名、女性８名）、平均年齢は２
４．４歳（２１歳〜２７歳）を対象とした。被験者は全
身疾患を有さず、過去３ヶ月以内に抗生剤などの薬物投
与を受けていない者とした。

【００１６】（２）実験スケジュールラフィノース投与開始より一週間前（−１Ｗ）、投与開
始日（０Ｗ）、投与開始後１週目（１Ｗ）、２週目（２
Ｗ）、３週目（３Ｗ）、４週目（４Ｗ）に各検査項目を
検索した。

【００１７】（３）投与方法被験者を無作為に５名ずつに分け、盲検法にてラフィノ
ース投与群（テスト群）とプラセーボ投与群（コントロ
ール群）の２群に分けた。各群とも一回量３ｇとし、一
日三回の服用で、一日投与量は９ｇ／Ｄａｙとした。な
お、プラセーボとしてグルコースを投与した。

【００１８】（４）観察項目及び結果（１）（ｉ）腸内細菌そうの検索週一回糞便を採取し、腸内細菌そうの検索を行なった。
糞便は滅菌済みのビニール袋に排便し、よくもみほぐし
た後、滅菌済みの舌圧子にて糞便中央部より親指第一関
節程度の大きさの試料を採取した。採取した糞便の１ｇ
を希釈液（９ｍｌ）に加えて十分に混和した後、この液
の１０倍希釈系列を作製し、検液とした。これを平板培
地上ヘ０．０５ｍｌずつ正確に滴下し、コンラージ棒で
十分に塗沫した。嫌気性菌用の各平板培地は、作製後２
４〜２８時間嫌気的条件下に保存して還元処理した後に
使用した。好気性菌は３５℃、４８時間、嫌気性菌は嫌
気性培養装置（Anaerobic system model 1024, Forma S
cientific）内で３５℃、７２時間培養後、同定および
菌数計算を行った。細菌の同定は、平板培地上の集落形
態、グラム染色標本の鏡検、好気的条件下における発育
試験および各種生化学的性状試験により行った。菌数計
算は、平板培地上の集落数をコロニーカウンターで測定
し、下記式により、糞便１ｇ中の菌数を算出した。糞便１ｇ中の生菌数＝コロニー数×糞便希釈倍率×２０

【００１９】（ii）腸内細菌そうの検索結果イ）総菌数に対するビフィズス菌の割合テスト群の総菌数に対するビフィズス菌の割合は、投与
１週間前で２２．６８％、投与開始日で３８．０７％、
投与１週目で３７．０２％、投与２週目で５５．８１
％、投与３週目で６１．３１％、投与４週目で４０．４
９％であった。コントロール群の総菌数に対するビフィ
ズス菌の割合は、投与１週間前で２３．７３％、投与開
始日で２２．７５％、投与１週目で３０．１２％、投与
２週目で４９．９８％、投与３週目で４４．６４％、投
与４週目で３４．８８％であった。

【００２０】以上のように、テスト群・コントロール群
共、総菌数に対するビフィズス菌の割合は、投与３週目
まで経週的に増加し、投与４週目で減少した（図１）。
統計学的検索では投与１週間前と比較してテスト群では
投与２週目（ｐ＜０．０５）、投与３週目（ｐ＜０．０
５）で有意な増加が、コントロール群では投与２週目
（ｐ＜０．０５）、投与３週目（ｐ＜０．０５）、投与
４週目（ｐ＜０．０５）に有意な増加が認められた。群
間比較においては、試験期間を通じて統計学的有意差は
認められなかった。

【００２１】ロ）嫌気性菌数に対するビフィズス菌の割
合テスト群の嫌気性菌数に対するビフィズス菌の割合は、
投与１週間前で２２．７６％、投与開始日で３８．１０
％、投与１週目で３７．７２％、投与２週目で５５．９
８％、投与３週目で６２．９３％、投与４週目で４０．
８２％であった。コントロール群の総菌数に対するビフ
ィズス菌の割合は、投与１週間前で２４．４１％、投与
開始日で２３．９４％、投与１週目で３０．３７％、投
与２週目で５０．００％、投与３週目で４４．７５％、
投与４週目で３５．０３％であった。

【００２２】以上のように、テスト群・コントロール群
共、総菌数に対するビフィズス菌の割合は、投与３週目
まで経週的に増加し、投与４週目で減少した（図２）。
統計学的検索では投与１週間前と比較してテスト群では
投与２週目（ｐ＜０．０５）、投与３週目（ｐ＜０．０
５）で有意な増加が、コントロール群では投与２週目
（ｐ＜０．０５）、投与３週目（ｐ＜０．０５)、投与
４週目（ｐ＜０．０５）に有意な増加が認められた。群
間比較においては、試験期間を通じて統計学的有意差は
認められなかった。

【００２３】（５）観察項目及び結果（２）（ｉ）免疫学的検索週一回採血を行い、免疫学的検索を行なった。

【００２４】イ）リンパ球増殖反応末梢血から、リンパ球を比重遠心法にて分離し、ＰＢＳ
にて洗浄後、１０％ＦＣＳ加ＰＲＭＩ１６４０にて５
×１０⁵ｃｅｌｌ／ｍｌの細胞数となるよう調整した。
使用したマイトジェンは、Ｔ−ｃｅｌｌｍｉｔｏｇｅ
ｎとしてＰＨＡ（phytohemagglutinin : DIFCO）、Ｔ，
Ｂ−ｃｅｌｌｍｉｔｏｇｅｎとしてＰＷＭ（pokeweed
mitogen : GIBCO）を用いた。マイクロプレートにマイ
トジェンを最終濃度でＰＨＡ１５μｇ／ｍｌ、ＰＷＭ
１５０μｇ／ｍｌになるように添加しておき、各ウェ
ルに５×１０⁵ｃｅｌｌ／ｍｌのリンパ球を２００μｌ
ずつ分注した。その後ＣＯ₂インキュベーターにてＰＨ
Ａは６５時間、ＰＷＭは８９時間インキュベーションし
た。インキュベーション後、³Ｈ−Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ
を０．５μｃｉ／ｗｅｌｌ加え、さらにＣＯ₂インキュ
ベーターで７時間インキュベーションした。セルハーベ
スターにて細胞を回収し、液体シンチレーションカウン
ターにて測定を行なった。

【００２５】ロ）多形核白血球（ＰＭＮ）の貪食能末梢血からのＰＭＮの分離は以下のように行なった。被
験者の前腕の皮静脈より、末梢血１０ｍｌをヘパリン加
チューブ（Vacutainer with sodium Heparin, Becton D
ickinson Vacutainer Systems, U.S.A.）を用いて採取
し、サンプルチューブ（Falcon 2096, U.S.A.）にＭｏ
ｎｏ−Ｐｏｌｙｒｅｓｏｌｖｉｎｇｍｅｄｉｕｍ
（Flow Laboratories Inc., U.S.A.）を３ｍｌ入れ、そ
の上に静かに血液を３．５ｍｌを重層した。その後、３
００×Ｇで３０分間、室温で遠心分離し、ＰＭＮを含む
バフィーコートを取り出した。それを別のサンプルチュ
ーブ（Corning 25319, JAPAN）に移しリン酸緩衝液（Ｐ
ＢＳ，ｐＨ７．４）で２回洗浄後、１ｍｌ中に１×１０
⁶個の細胞数となるように調整した。細胞生存率（Viabi
lity）の測定は、０．４％ＴｒｙｐａｎＢｌｕｅ（SI
GMAChemical Co, U.S.A.）を用いて、ＴｒｙｐａｎＢ
ｌｕｅＥｘｃｌｕｓｉｏｎ法により決し、９９％以上
がＰＭＮであることを確認した。

【００２６】貪食能の解析は以下のように行なった。Ｐ
ＭＮの浮遊液１００μｌにＰＲＭＩ１６４０ｍｅｄ
ｉｕｍ（SIGMA Chemical co., U.S.A.）３００μｌ（ｐ
Ｈ７．４）、同一被験者の新鮮血清１００μｌ、そして
貪食マーカーとして直径１μｍのＦＩＴＣ標識ビーズ
（PolyscienceInc., U.S.A）添加ＰＢＳ溶液５μｌを超
音波処理後加えた。その後、３７℃の恒温槽中にて、４
５分間インキュベート後、貪食作用を４℃の５ｍＭＥ
ＤＴＡ加ＰＢＳ溶液を加え停止させた。さらに、同液に
より２回洗浄し、余剰のビーズを除去後、２％パラホル
ムアルデヒド加ＰＢＳ／ＥＤＴＡ溶液で固定した。

【００２７】ＰＭＮの貪食能の測定は、落射型蛍光顕微
鏡（BH-2, OLYMPUSK.K., JAPAN）を使用し、細胞形態の
確認とビーズの摂取状態を確認後、フローサイトメータ
ー（FACScan, Becton Dickinson Immunocytometry Syst
ems, U.S.A.）で計測した。フローセル中を通過する細
胞浮遊液に４８８ｎｍのアルゴンレーザーを照射し、前
方散乱光（ＦＷ−ＳＣ）および側方散乱光（ＲＴ−Ｓ
Ｃ）で得られたサイトグラム上でＰＭＮを識別、ゲーテ
ィングし、各サンプルごとに５０００個の細胞について
解析を行った。そして得られた蛍光強度のヒストグラム
から、ビーズの蛍光を有している群と有していない群の
値を得、陽性率（ビーズを摂取した細胞数の割合）を求
め、貪食率として算出するとともに、Mean Channelとビ
ーズ１個の蛍光強度より細胞内に取り込まれているビー
ズの数、すなわち貪食度を算出した。

【００２８】（ii）免疫学的検索結果イ）リンパ球増殖反応テスト群のＰＨＡによる増殖反応は、投与開始日を１と
すると、投与１週目で２．１９、投与２週目で１．７
３、投与４週目で２．１３であった。コントロール群の
ＰＨＡによる増殖反応は、投与開始日を１とすると、投
与１週目で１．０９、投与２週目で０．９５、投与４週
目で１．３７であった（図３）。また、テスト群のＰＷ
Ｍによる増殖反応は、投与開始日を１とすると、投与１
週目で１．９７、投与２週目で１．７９、投与４週目で
１．３１であった。コントロール群のＰＷＭによる増殖
反応は、投与開始日を１とすると、投与１週目で１．９
７、投与２週目で１．０８、投与４週目で１．７４であ
った。（図４）。

【００２９】以上のように、ＰＨＡによる増殖反応は試
験期間を通して、テスト群で高い値を示した。一方ＰＷ
Ｍによる増殖反応は２週目でテスト群の方が高い値を示
したが、４週目ではコントロール群の方が高い値を示し
ていた。

【００３０】ロ）多形核白血球（ＰＭＮ）の貪食能テスト群のＰＭＮの貪食率は、投与開始日で８９．６５
％、投与１週目で８８．７６％、投与２週目で９５．７
４％、投与４週目で９５．２９％であった。投与開始日
と比較して投与２週目で有意な増加が認められた。コン
トロール群のＰＭＮの貪食率は、投与開始日で９０．１
３％、投与１週目で８９．９８％、投与２週目で９５．
３８％、投与４週目で９４．５３％であった。投与開始
日と比較して各測定時に、統計学的有意差は認められな
かった。（図５）

【００３１】テスト群のＰＭＮの貪食度は、投与開始日
で８．０９個、投与１週目で１０．８７個、投与２週目
で１２．０７個、投与４週目で１０．０８個であった。
投与開始日と比較して投与２週目で有意な増加が認めら
れた。コントロール群のＰＭＮの貪食度は、投与開始日
で６．９３個、投与１週目で９．４８個、投与２週目で
１０．８９個、投与４週目で７．５３個であった。投与
開始日と比較して各測定時に、統計学的有意差は認めら
れなかった。（図６）

【００３２】以上のように貪食率、貪食度とも投与開始
より２週目までやや上昇し、４週目で減少する傾向がテ
スト群、コントロール群ともに認められた。テスト群と
コントロール群の間には貪食率は差はなく、貪食度にお
いてはテスト群でやや高い値を示したものの統計学的有
意差は認められなかった。

【００３３】

【実施例２】試験期間中の体調および副作用について、
以下の項目について、被験者にアンケート調査を行なう
ことにより、本発明に係る免疫賦活剤の安全性確認のた
めのパネルテストを行なった。（１）普段の体調（２）試験期間中の体調の変化（３）投与による効果の有無（４）投与による副作用の有無（５）投与薬剤の味

【００３４】上記アンケート調査の結果は次のとおりで
あった。

【００３５】（１）普段の体調「便秘気味」が４人、「軟便気味」が１人、「便秘でも
軟便でもない」が４人、「肌荒れ」が３人、「吹き出物
がよくできる」が３人であった。各群別にみると、テス
ト群では「便秘気味」が４人、「軟便気味」が０人、
「便秘でも軟便でもない」が１人、「肌荒れ」が１人、
「吹き出物がよくできる」が２人で、コントロール群で
は「便秘気味」が０人、「軟便気味」が１人、「便秘で
も軟便でもない」が３人、「肌荒れ」が２人、「吹き出
物がよくできる」が１人であった。

【００３６】（２）試験期間中の体調の変化テスト群とコントロール群に分けて体調の変化をみてみ
ると、テスト群では、一週目に、「特になし」が５人、
二週目に、「特になし」が４人、「お腹が痛い日があっ
た」が１人、三週目に、「特になし」が２人、「お腹が
痛い日があった」が２人、「排便の間隔が短くなった」
が１人、四週目に、「特になし」が３人、「排便の間隔
が短くなった」が１人、「便通が良くなった」が１人で
あった。コントロール群では、一週目に、「特になし」
が３人、「軟便になった」が１人、「お腹が張る感じ」
が１人、二週目に、「特になし」が３人、「軟便になっ
た」が１人、「お腹が張る感じ」が１人、三週目に、
「特になし」が３人、「やや軟便になった」が１人、
「お腹が張る感じ」が１人、四週目に、「特になし」が
３人、「やや軟便になった」が１人、「お腹が張る感
じ」が１人であった。

【００３７】（３）投与による効果の有無テスト群とコントロール群に分けて効果の有無をみてみ
ると、テスト群では、「効果があった」が１人、「若干
の効果があった」が２人、「どちらでもない」が２人、
「悪くなった」が０人で、コントロール群では、「効果
があった」が０人、「若干の効果があった」が１人、
「どちらでもない」が４人、「悪くなった」が０人であ
った。

【００３８】（４）投与による副作用の有無投与期間を通じ、テスト群とコントロール群共に副作用
等は認められなかった。

【００３９】（５）投与薬剤の味投与薬剤の味については、テスト群では「多少甘かっ
た」が１人、「のみやすい」が４人で、コントロール群
では、「甘かった」が３人、「甘味が強い」が２人であ
った。

【００４０】

【発明の効果】テスト群の総菌数に対するビフィズス菌
の割合は、投与３週目まで経週的に増加し、４週目で減
少した。このことは、これまでの研究結果と一致し、ラ
フィノースの投与によりビフィズス菌が増加し、腸内細
菌そうに変化を与えることが確認された。また、テスト
群においてＰＭＮの貪食率、貪食度が、ともに投与開始
より２週目で有意な増加を示し、リンパ球増殖反応（Ｐ
ＨＡ）が高い値を示したことから、ビフィズス菌がラフ
ィノースの影響により、増加し、同時にビフィズス菌の
免疫賦活作用が増強されたと考えられた。これらのこと
から、ラフィノースにはビフィズス菌を増加させ、免疫
細胞の機能を高める作用があることが確認され、また、
パネル試験の結果から、ラフィノースの長期間経口投与
によっても格別の副作用は認められなかった。

【００４１】したがって、本発明によれば、安全性が高
くすぐれた免疫賦活剤を提供することが可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】総菌数に対するビフィズス菌の割合を示す。

【図２】嫌気性菌に対するビフィズス菌の割合を示す。

【図３】リンパ球増殖反応（ＰＨＡ）の変化を示す。

【図４】リンパ球増殖反応（ＰＷＭ）の変化を示す。

【図５】多形核白血球（ＰＭＮ）の貪食率の変化を示
す。

【図６】多形核白血球（ＰＭＮ）の貪食度の変化を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者清信浩一東京都葛飾区お花茶屋１−17−14 (72)発明者佐山晃司北海道帯広市稲田町南９線西13番地日本甜菜製糖株式会社総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ラフィノースを有効成分とすることを特
徴とする免疫賦活剤。
【請求項２】ラフィノースの経口投与量が１日当り４
〜２０ｇ、好適には５〜１５ｇであること、を特徴とす
る請求項１に記載の免疫賦活剤。