HU210767B

HU210767B - Process for preparing pharmaceutical compositions containing l-alpha-glycerophosphoryl-d-myo-inositol for the treatment of peripheral neuropathies and cerebropathies

Info

Publication number: HU210767B
Application number: HU9201267A
Authority: HU
Inventors: Carlo Scolastico; Camillo Maria Francesc Palazzi; Carla Procida
Original assignee: Apotekna Sa
Priority date: 1989-10-27
Filing date: 1990-10-17
Publication date: 1995-07-28
Also published as: ATE100713T1; IT8922173A0; IT1239474B; AU6884891A; DE69006360T2; JP3037749B2; EP0497906A1; KR920703067A; NO179009B; DE69006360D1; CA2067755A1; NO179009C; KR0176978B1; WO1991006301A1; IT8922173A1; HUT61667A; AU645533B2; HU9201267D0; DK0497906T3; NO921525L

Description

Jelen találmány olyan gyógyászati készítmények előállításával foglalkozik, amelyek anyagcserezavar vagy toxikus eredetű perifériás neuropátiák és organikus és funkcionális eredetű cerebropátiák kezelésére valók, és aktív hatóanyagként az (1) általános képlet szerinti L-a-glicerofoszforil-D-mio-inozit (a továbbiakban GFI) vagy ennek alkáli- vagy alkáli-földfémmel alkotott sóját tartalmazzák.

Jelen találmány elsősorban továbbá a GFI alkáli- és alkáliföldfémmel képzett sóival, különösen a GFI kalciumsójával foglalkozik.

Kémiai szempontból a GFI szerkezetileg hasonló a foszfatidil-inozithoz (továbbiakban FI). Az FI a glicero-foszforil-inozit glicerin része hidroxilcsoportjának zsírsavakkal, főként telítetlen savakkal kétszeresen acilezett terméke.

Az FI természetes eredetű vízben csaknem oldhatatlan molekula, amit általában szarvasmarhaagyból és/vagy szójababból foszfatidil-etanolamin hozzákeverésével végzett extrakcióval (agyi frakció), és ezt követő tisztítással nyerünk.

Az FI elég labilis molekulának mutatkozott, minthogy a glicerin rész hidroxilcsoportjához kötődő telítetlen zsírsav láncok könnyen lépnek peroxidációs reakcióba és így számos bomlási terméket eredményeznek.

Ezzel szemben a GFI egy deacilezett analóg, ezért önmagában és sóformában vízoldékony és stabil, és alkáli- és alkáliföldfém sói, különösen nátriummal, káliummal, kalciummal és magnéziummal képzett sói kristályosak és különösen alkalmasak gyógyászati készítményekben való felhasználásra.

Az említett sók használatának előnyei, különösen a kalcium sóé, a szabad GFI savval összehasonlítva: kevésbé higroszkóposak, nagyobb a stabilitásuk, jobban adaptálhatók gyógyászati készítmények felhasználási területéhez, minthogy a sók önmagukban kevésbé higroszkóposak lévén sokáig tárolhatók észlelhető bomlás nélkül.

A GFI-t vagy alkáli- és/vagy alkáli-földfémmel képzett sóit, különösen kalciumsóját úgy állíthatjuk elő, hogy a szójababban lévő acilezett foszfolipid keveréket kontrollált elszappanosításnak vetjük alá, majd tisztítással elválasztjuk a nyert szabad GFI savat és tetszőleges alkáli- vagy alkáli-földfémmel sóját képezzük.

A GFI preparálására ismert eljárást közölnek a 0 217 765 számú európai közrebocsátási iratban.

Biokémiai szempontból az FI katabolizmusa ismereteink szerint nagyon fontos szerepet játszik a fiziológiás aktivitással összefüggő biokémiai folyamatokban, ami a foszfor anyagcserét illeti [Ansell G. B. és Dohmen H.; J. Neurochem. 2, 1, (1957); Sheltaway A. és Dawson R. M. C.; Bíochem. J. 111,157, (1969)].

Ha van elegendő kalcium a foszfatidil-inozitol foszfodiészteráz (foszfolipáz C) aktivitásának elősegítésére, valószínűleg főként ez az enzim felelős az FI bomlásáért, melynek fő metabolitjai a diacilglicerin és inozitfoszfát [Friedel R. 0., Brown J. D. és Durrell J.; Biochim. biophys. Acat., 144, 684 (1967); Keough K. M. W. és TTiompson W.; Biochim. biophys. Acta., 270,324,1972; Thompson W.; Can. J. Biochem., 45, 853 (1967); Dawson R. M. C. és mtsai; Biochem. J. 122,605 (1971); Irvine R. F.; Biochem. 1,176,475, (1978)].

Az egész metabolikus ciklust az 1. reakcióvázlat mutatja be.

Noha az FI gyenge acilezésére létrejöhet fiziológiás körülmények között (alacsony Ca^ koncentráció), amely acilezést a foszfolipáz A] enzim katalizál és a lizofoszfatidil inozit megnövekedéséhez vezet [Hong

S. L. és Deykin D.; J. Bioi. Chem., 256, 5215 (1981)], a foszfatidilinozit-foszfodiészteráz általános előfordulása az állati sejtekben és extrém magas aktivitása, ami in vitro is megmutatkozik [Friedel R. 0., Brown J. D. és Durrell J.; Biochim. biophys. Acta., 144, 684, (1967); Keough K. M. W. és Thompson W.; Biochim. biophys. Acta., 270, 324, (1972); Thompson W.; Can. J. Biochem., 45, 853, (1967); Dawson R. M. C. és mtsai.; Biochem. J., 122, 605 (1971); Irvine R. F.; Biochem. J., 176, 475, (1978)], ezt az enzimet teszik a legfőbb felelőssé a foszfoinozit metabolizmusáért.

A fentiekből kitűnik, hogy a GFI-ről ez idáig csak az volt ismert, hogy a foszforanyagcsere folyamatokban játszik szerepet. Meglepő módon azt találtuk, hogy a GFI jelentős aktivitást mutat anyagcserezavar vagy toxikus eredetű perifériás neuropátiákban és organikus és funkcionális eredetű cerebropátiákban.

A találmány tárgya tehát eljárás alfa-glicerofoszforilD-mio-inozitot vagy annak alkáli- vagy alkáli-földfémmel alkotott sóját tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, melyre jellemző, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot anyagcserezavar vagy toxikus eredetű perifériás neuropátiák és organikus és funkcionális eredetű cerebropátiák kezelésére alkalmas készítménnyé alakítjuk.

A találmány szerinti készítmények előállítása során a gyógyászati készítmények előállítása során a gyakorlatban mindennaposán alkalmazott, szakirodalomból ismert, szakember számára kézenfekvő megoldásokat alkalmazzuk.

Orális adagolásra alkalmas készítmények például a kapszulák, lágy kapszulák, tabletták, granulátumok, porok, oldatok, tasakok, hosszú hatású készítmények, amelyek 10-500 mg GFI-t tartalmaznak (vagy annak alkálivagy alkáliföldfémmel alkotott sóját, előnyösen Ca sóját) egységdózisként, amit naponta 2-3-szor kell alkalmazni a diagnózistól és a beteg állapotától függően.

Parenterális alkalmazásra, intravénás vagy intramuszkuláris alkalmazásra a megfelelő formák liofilizált ampullák vagy steril oldatok, amelyek 2-250 mg GFI-t tartalmaznak (vagy annak alkáli- vagy alkáliföldfémmel alkotott sóját, előnyösen Ca sóját) egységdózisként, amit naponta 1-3-szor kell alkalmazni.

A találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak más kiegészítő vagy egyébként hasznos hatású komponenseket.

A farmakológiai kísérletek eredményeit példákon keresztül ismertetjük az alábbiakban.

/. Kísérlet

A GFI aktivitása diabéteszes eredetű enterális (bél) vegetatív neuropátiában

A diabétesz neurológiai összefüggései közismertek, mint mind a motoros, mind a szenzoros perifériás idegek funkcionális és morfológiai elváltozásai.

HU 210 767 B

Ezeket az elváltozásokat támasztják alá az axonális transzport szignifikáns változásai a vele járó axonális atrófiával és következményes degenerációval.

A diabéteszes vegetatív neuropátia gyomor-bél panaszokkal függ össze, úgy mint diabéteszes hasmenés, székrekedés, csökkent vékonybél tranzit és megakolon, és összefügg a bélrendszer megváltozott beidegzésével.

Az alloxánnal indukált kísérletes diabétesz figyelemre méltó összefüggést mutatott a neuronális és gasztrointesztinális (gyomor-bél) elváltozások között.

Az enterális neuronokbán P-anyag, met-enkefalin és VIP található különböző irányultsággal és aktivitásokkal.

A P-anyag és VIP tartalmú axonok a száj felé irányulnak, míg az enkefalint tartalmazó neuronok a végbélnyílás felé. A P-anyag az enterális neuronok és simaizom direkt excitációját okozza, míg az enkefalin direkt módon gátolja az enterális neuronokat és a simaizom összehúzódást, bár egy indirekt hatása acetilkolin stimuláció révén sem zárható ki. A VIP simaizom elernyesztő hatású. A gasztrointesztinális funkciókat valószínűleg ezen neuronális komponensek finom összjátéka szabályozza. A bélrendszer diabéteszes vegetatív neuropátiája esetén ez a koordinált aktivitás változik meg, és ez veszélyezteti a gasztrointesztinális működéseket. A vizsgálatot 3 csoportra osztott hím Sprague Dawley patkányokon végeztük (tömegük körülbelül 250 g): kontroll csoport (c), diabéteszes csoport (D) és kezelt diabéteszes csoport (DDTRp).

A diabéteszt 100 mg/kg alloxan egyszeri szubkután injektálásával idéztük elő (glikémia >400 mg/dl), és a diabétesz előidézése utáni hetedik napon kezdtük a kezelést (GFI)₂Ca 10 mg/kg dózisú szubkután injekciójával három hónapon keresztül.

A következő paramétereket mértük: testtömeg, vércukor, metenkefalin, P-anyag és VIP.

Mindezek a paraméterek, amelyek a diabéteszes csoportban a normálistól jelentősen eltérőek voltak, helyreálltak a kezelt diabéteszes csoportnál és a kontroll csoportnál mért értékekhez hasonlókká váltak statisztikailag szignifikánsan.

Az 1. és 2. táblázat a vizsgálat alatt nyert met-enkefalin és P-anyag értékeket mutatja.

Emellett a D diabéteszes csoporthoz tartozó valamennyi patkánynál tipikus hályog jelentkezett: a szemlencsék nagyon törékenyek voltak, és a boncolás során szétestek.

Ezzel szemben a DDTRp diabéteszes csoport szemlencséje tiszta volt és a boncolásnál normális rezisztenciát mutatott.

/. táblázat

MET-Enkefalin (pg/mg prot.)

Kis
Duodenum	pg/mg prot.
C	141,5±16,7 (n = 6)
D	58,6±3,9 (n = 7)***
DDTRp	103,9±14,7 (n = 8) n. s.

Kis
Jejunum	pg/mg prot.
C	45,9±4,8 (n = 6)
D	15,l±l,9(n = 8)***
DDTRp	34,9±l,8(n = 8)*
Ileum	pg/mg prot.
C	27,9±1,5 (n = 6)
D	10,6±l,3 (n = 6)***
DDTRp	24,9±l,7(n = 7)n. s.

C = kontroll csoport

D = diabéteszes csoport DDTRp = (GFl)₂Ca-val utókezelt D * p<0,05; *** p<0,001 n. s. = nem szignifikáns

1. táblázat (folytatás) MET-Enkefalin (pg/mg prot.)

Nagy
Rektum		pg/mg prot.
C		102,4+11,8 (n = 5)
D		78,7±5,1 (n = 7)*
DDTRp		120,0+1,6 (n = 8) n. s.
Colon		pg/mg prot.
C		101,0±10,2 (n = 7)
D		46,2+3,8 (n = 8)***
DDTRp		90,5±5,6 (n = 8)n. s.

C = kontroll csoport

D = diabéteszes csoport

DDTRp = (GFJ)₂Ca-val utókezelt D * p<0,0l; *** p<0,001 n. s. = nem szignifikáns

2. táblázat

P-anyag (ng/mg prot.)

Kis
Duodenum	ng/mg prot.
C	1,17+0,091 (n = 8)
D	0,44+0,025 (n = 7)***
DDTRp	1,00+0,081 (n = 8) n. s.
Jejunum	ng/mg prot.
C	1,43+0,1
D	0,78+0,05***
DDTRp	1,31+0,04 n. s.
Ileum	ng/mg prot.
C	1,22+0,06
D	0,39±0,03***
DDTRp	1,13+0,09 n. s.

C = kontroll csoport

D = diabéteszes csoport DDTRp = (GFI)₂Ca-val utókezelt D * p<0,001; *** p<0,001 n. s. = nem szignifikáns

HU 210 767 Β

2. táblázat (folyt:) P-ányag (ng/mg prot.)

Nagy
Coecum	ng/mg prot.
C	0,76+0,05
D	0,37+0,02***
DDTRp	0,50+0,02***
Colon	ng/mg prot.
C	0,58±0,02
D	0,35±0,02***
DDTRp	O,56±O,O3 n. s.
Rectum	ng/mg prot.
C	0,54±0,03
D	0,34±0,02***
DDTRp	0,55+0,02 n. s.

C = kontroll csoport

D = diabéteszes csoport; DDTRp = (GFI)₂Ca-val utókezelt D * p<0,01 *** p<0,001

n. s. = nem szignifikáns

2. példa

A GF1 hatása diabéteszes eredetű korai enterális neuropátiában

Kísérletesen indukált diabéteszes patkányokat kezeltünk a fent leírt módon (lásd 1. példa), hogy érzékeljük a gasztrointesztinális védőhatást ugyanabban a pillanatban, amikor a neuropátiás károsodást megállapítottuk.

A kezelést intraperitoneálisan végeztük 10 mg/kg (GFI)₂Ca-mal 35 napon keresztül, a diabétesz előidézését követő 7. naptól kezdve.

A vizsgált paraméterek (testtömeg, vércukor, és metenkefalin) normalizálódtak a DDTRp kezelt diabéteszes csoportnál hasonlóan az 1. példában leírtakhoz.

3. példa

Hatás receptorokra és szekunder messengerre perifériás szervekben kísérletes diabéteszes neuropátiában

Az állatok, a kezelés, a csoportok és az adagolás megfelel az 1. példában leírtaknak, míg a kezelési idő 35 nap, mint a 2. példában.

A vizsgált paraméter a máj inzulin receptora volt ¹²⁵J-inzulin kötés révén, amit Scatchard módszere szerint analizáltunk [G. Scarchard; Ann. N. Y. Acad. Sci.; 51, 660 (1970)] tisztított máj plazma-membránok felhasználásával, amit Ray eljárása szerint preparáltunk [T. K. Ray; Biochem. Biophys. Acta; 196, 1 (1970)].

A nagy affinitású J¹²⁵-inzulin (B_maxl) kötőreceptor helyek száma a májban megnövekszik diabéteszes patkányoknál. A (GFI)₂Ca-mal való kezelés részben kivédi ezt a növekedést a diabéteszes patkányoknál.

4. példa

A GF1 feledékenység elleni hatása egypróbás passzív elkerülési vizsgálattal - elektrosokk, mint memóriát törlő tényező segítségével Ezt a passzív elkerülési tesztet a szokásos felszerelés felhasználásával végeztük, ami egy ketrecből áll, melynek aljába elektromosságot vezettünk, és az elülső falából egy megemelt kifutópálya nyúlik ki. A kifutópályát megvilágítottuk, miközben a ketrec sötét volt. Ha egy patkányt helyeztünk a kifutópályára, a sötét ketrecbe egy nyíláson átjuthatott be.

A megzavaró áramütést a lábra a sötét terület aljába vezetett árammal értük el. A vizsgálatot 3 nap alatt végeztük: az első napon minden patkányt alávetettünk a szokásos tanulási tréningnek, a második napon a kezelt csoportnak orálisan (GFI)₂Ca-t adagoltunk háromféle dózisban: 3-30-100 mg/kg és 60 perc múlva a tréninget elvégeztük mind a lábra ható áramütés mint tanulást segítő tényező, mind elektrosokk mint felejtést okozó tényező segítségével. A harmadik napon a tréninget megismételtük a patkány ketrecbe való belépéséhez szükséges látenciáidé mérésével. A vizsgálatot Piracetammal összehasonlítva végeztük el, amit 300-1000 mg/kg dózisban per os alkalmaztunk, és az eredmények szignifikánsan a GFI mellett szóltak, a GFI 30-100 mg/kg-os dózisait a Piracetam 300-1000 mg/kg-os dózisaihoz viszonyítva.

5. példa

A GFI hatása az idegvezetési sebességre

271 g kezdő tömegű Fisher F-344 patkányokat használtunk. A diabéteszt 70 mg/kg streptozocinnal hoztuk létre, és hogy a diabéteszes állatok általános fiziológiai állapotának ellenőrizhetetlen rosszabbodását megelőzzük, minden nap 0,75 U inzulint adagoltunk szubkután. Az állatokat három csoportra osztottuk: C, D és DDTRp (lásd 1., 2., 3. példa).

A kezelést (GFI)₂Ca 10 mg/kg-os dózisának intraperitoneális adagolásával végeztük 8 héten keresztül, a diabéteszes állapot első napjától kezdődőleg. A mért paraméter a farok-ideg vezetési sebessége (CV) volt Spüler és mtsai leírása alapján [M. Spüler, W. Dimpfel, H.-U. Tüllner; Arc. Int. Pharmacodyn., 287, 211 (1987)].

Különösen az alábbi részeken értékeltünk:

1. a motoros ideg proximális részének CV-je

2. a szenzoros ideg proximális részének CV-je

3. a szenzoros ideg disztális részének CV-je.

A vezetési sebességet a diabétesz előidézése előtt (3 hónapos patkányok) és a kezelés után 8 héttel mértük. A CV a D diabéteszes csoportnál csökkent, ami megerősítette a diabéteszes perifériás neuropátia kifejlődésének diagnózisát, míg - amint a 3. táblázatban látható - a DDTRp csoportnál statisztikailag növekedett, ami a (GFI)₂Ca terápiás hatására utal diabéteszes neuropátia esetén.

HU 210 767 B

3. táblázat

	A motoros ideg proximális részének CV±SEM értéke (m/s)	A szenzoros ideg proximális részének CV±SEM értéke (m/s)	A szenzoros ideg disztális részének CV±SEM értéke (m/s)
	bazelin	8 hét	bazelin	8 hét	bazelin	8 hét
c	32,2±0,2	33,2±0,7	41,2±0,2	43,l±0,6	35,7+0,4	36,2±0,8
D	32,1+0,4	28,1+0,8*	40,8±0,3	35,9+0,7*	35,2+0,6	30,5+0,4*
DDTRp	31,8±0,5	32,1 ±0,4*	4O,6±O,8	42,6±0,8*	35,1+0,7	35,9+0,9*

* p<0,001 D C-vel, illetve DDTRp D-vel szemben

Ismert [D. A. Green, P. V. de Jesus és A. I. Winegrad;

J. Clin. Invest., 55, 1326 (1975)], hogy ezt a fajta vizsgálatot pozitív eredménnyel elvégezték a múltban streptozotocinnal indukált diabéteszes patkányok 650 mg/kg 15 myo-inozitol kezelésével, de ezt az eredményt később más vizsgálatok nem erősítették meg, noha a myo-inozitol adagja mindig nagyon nagy volt [J. G. Salway, J. A. Finnegan, D. Bamett, L. Whitehead, A. Karunanayaka és R. B. Payne; 2,1282 (1978)]. Emiatt a myo-inozitol terá- 20 piás felhasználásra alkalmatlan.

Amint a fenti eredményekből kitűnik, a GFI alkalmas farmakológiai készítmények aktív hatóanyagaként való felhasználása perifériás neuropátiák és organikus vagy funkcionális eredetű cerebropátiák, mint például 25 vasculopátiák, Alzheimer-kór, időskori leépülési szindróma és hasonló kórképek kezelésében.

A fentiekben ismertetett farmakológiai vizsgálatoknál felhasznált és a fentiekben leírt szokásos eljárásokkal előállított GFI és annak Ca-sója fiziko-kémiai jellemzőit az alábbiakban ismertetjük példák segítségével.

GFI szabad sav (MW = 334 g/mol)

Op. = 140 °C

Elemanalízis:

C (számított: 32,33%) = 32,25%

H (számított: 5,69%) = 5,73%

GFI kalcium-só (GFI)₂Ca; MW = 706 g/mol [a]_D = -15,5°±l (c = 2,07;H₂O) ’H-NMR (300 MHZ, D₂O):

ppm 3,37 (dd; CH-5; J₅_6 = J<m = 9,27 Hz) ppm 3,58 (dd; CH-3; J₃_₂ = 2,78 Hz; J₃^,=

9,27 Hz) ppm 3,65-3,75 (m; CH-4+CH₂-9) ppm 3,79 (dd; CH-6; = J^, = 9,27 Hz) ppm 3,90-4,10 (m; CH-l+CH-8+CH₂-7) ppm 4,31 (dd; CH-2; J₂_₃ = J₂_, = 2,78 Hz) ppm 4,80 (s; DHO) ¹³C-NMR (D₂O) teljesen ppm 69,03 (s; C-9) ppm 73,34 (d; C-7; Jc_o-p = 5,6 Hz)

77,60 (d; C-8) ppm 77,71 (s; C-3) ppm 78,25 (m; C-2+C-6) ppm 79,16 (s; C-4) ppm 80-99 (s; C-5) ppm 83,13 (d; C-l; J_C-o~p = 5,9 Hz)

Elemanalízis:

C (számított: 30,59%) = 3,48%

H (számított: 5,10%) = 5,15%

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás L-alfa-glicerofoszforil-D-mio-inozitot vagy annak alkáli- vagy alkáli-földfémmel alkotott sóját tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított hatóanyagot anyagcserezavar vagy toxikus eredetű perifériás neuropátiák és organikus és funkcionális eredetű cerebropátiák kezelésére alkalmas készítménnyé alakítjuk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aktív hatóanyagként az L-alfa-glicerofoszforil-D-mio-inozit kalcium-sóját alkalmazzuk.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szájon át alkalmazható gyógyászati készítményt alakítunk ki.
4. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy parenterálisan alkalmazható gyógyászati készítményt alakítunk ki.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egységdózisonként 5-500 mg L-alfa-glicerofoszforil-D-mio-inozitot vagy annak alkáli- vagy alkáli-földfémmel alkotott sóját tartalmazó gyógyászati készítményt alakítunk ki.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az L-alfa-glicerofoszforil-D-mio-inozit kalcium-sóját alkalmazzuk.