HU208636B - Process for producing pharmaceutical compositions neutralizing procoagulant activity caused by tumour cells - Google Patents

Process for producing pharmaceutical compositions neutralizing procoagulant activity caused by tumour cells Download PDF

Info

Publication number
HU208636B
HU208636B HU9201552A HU155292A HU208636B HU 208636 B HU208636 B HU 208636B HU 9201552 A HU9201552 A HU 9201552A HU 155292 A HU155292 A HU 155292A HU 208636 B HU208636 B HU 208636B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
leu
glu
asp
lys
thr
Prior art date
Application number
HU9201552A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT61202A (en
HU9201552D0 (en
Inventor
Christiaan Reutelingsperger
Original Assignee
Boehringer Ingelheim Int
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Boehringer Ingelheim Int filed Critical Boehringer Ingelheim Int
Publication of HU9201552D0 publication Critical patent/HU9201552D0/hu
Publication of HUT61202A publication Critical patent/HUT61202A/hu
Publication of HU208636B publication Critical patent/HU208636B/hu

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

A találmány tárgyát tumorok metasztázisának elkerülésére szolgáló, hatóanyagként a VÁC proteinek csoportjába tartozó valamilyen antikoaguláns proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítása képezi.
Daganatos betegségek esetében különleges problémaként jelentkezik a metasztázisok (áttételek) kialakulása. Ennek a metasztázisként elnevezett jelenségnek a mechanizmusát a következőképpen magyarázzák:
Tumorsejtek elárasztják a szervezet keringési rendszerét (intravaszkuláció), és a véráramban szállítódnak. Ezek a rosszindulatú sejtek kölcsönhatásba lépnek a vérlemezkékkel és a plazma véralvadási faktorokkal, és aktiválják a hemosztatikus rendszert. A tumorsejtekből ismert felületfüggő prokoaguláns aktivitás trombin és végül fibrinpolimer képződéséhez vezet. Ezenkívül ezek a sejtek más gazdasejtekkel is kölcsönhatásba lépnek. Végül a vérlemezke aggregátumokkal és fibrin szálakkal körülvett tumorsejtek a hajszálerekben rögzítődnek, A fibrinfonadéknak a tumorsejtek felülete körül való kialakulása által rejtve maradnak az olyan specifikus tumor antigének, amelyek különben olyan immunológiai reakciót váltanának ki, amelynek következménye a tumorsejt szétesése lenne. A tumorsejtnek pontosan ez a képessége, hogy egy fibrinhálóval veszi körül magát, tehető felelőssé ezen sejtek metasztázisos aktivitásáért. A tumorenzimek ezt követően proteolitikusan megtámadják a véredényfalat, miáltal a tumorsejtek el tudják hagyni a keringési rendszert (extravaszkuláció), és szekunder tumorok keletkeznek.
Ennél a mechanizmusnál döntő nyilvánvalóan a keringő tumorsejteknek az a képessége, hogy egy fibrinszövedék képződését idézzék elő, amely arra szolgál, hogy a sejtet a hajszálérben rögzítse, és/vagy a szervezet immunvédelmét elhárítsa. Falanga és munkatársai izoláltak és jellemeztek egy speciális rák-prokoagulánst [Biochemistry 24, 5558-5567 (1985)], amely képes volt arra, hogy az X faktor aktiválásával koagulációt váltson ki. Izoláltak más rák-prokoagulánsokat is, amelyek közvetlenül az X faktort aktiválják. A keringési rendszer tumorsejtek által való aktiválásának területére vonatkozó kutatások összefoglalása a Cancer Metastasis Reviews 3, 99-116 (1984) közleményben található.
A találmány feladatául azt tűztük ki, hogy olyan hatóanyagot állítsunk elő, amely a tumorsejtek prokoaguláns aktivitása ellen hatásos.
A fibrin képződése egy olyan enzimes reakciósorozat utolsó lépése, amelynek során trombin keletkezik, amely végül a fibrinogént fibrinné alakítja át. Különböző prokoaguláns reakciókat, például a protrombin Xa és Va faktorok által való aktiválását katalizálnak foszfolipid-felületek, amelyekhez a koagulációs faktorok kötődnek. A foszfolipidek nem minden fajtája képes arra, hogy az alvadást stimulálja. A foszfolipid-felület töltése tűnik a befolyást meghatározó tényezőnek. Negatívan töltött foszfolipidek, mint például a foszfatidil-szerin, magas prokoaguláns hatással rendelkeznek.
Azon proteinek között, amelyek foszfolipidekhez kötődnek és foszfolipid-felületektól függő folyamatokkal kapcsolódnak, van egy család, amelynek tagjai foszfolipidekhoz való kötődésükben Ca2+-függők.
Ehhez a családhoz, amelynek tagjait annexineknek is nevezik, a lipokortin I, kalpaktin I, protein II, lipokortin III, p67-kalelektrin mellett a vaszkuláris antikoaguláns protein (VÁC) és IBC, PAP, PAP I, PP4, endonexin II és lipokortin V is tartozik. Ezeknek a proteineknek a származékai is rendelkeznek ilyen tulajdonságokkal.
Az annexinek közös strukturális jellemvonásain alapul valószínűleg hasonló Ca2+- és foszfolipid-kötő képességük. Bár ez a közös tulajdonság az összes annexinre jellemző, világos különbség áll fenn Ca2+-höz és a különböző foszfolipid-fajtákhoz való affinitásuk tekintetében.
Az annexinek fiziológiai funkciói membránasszociált folyamatok. A VÁC alvadásgátló hatásának alapvető mechanizmusa a foszfolipidek katalitikus kapacitásának a VAC-nak felületükhöz való kötődése által való csökkentéseként ismert, miáltal a foszfolipidek felületén az alvadást elősegítő komplex képződése gátlódik.
Más annexinek is gátolhatják a véralvadást, de a VÁC tűnik a leghatásosabb inhibitornak.
Meglepő módon azt állapítottuk meg, hogy annexinek, különösen a VÁC, gátolják a tumorsejtek prokoaguláns aktivitását.
A VÁC proteinek prokoaguláns aktivitást semlegesítő hatását különböző vastagbél-tumorsejteken bizonyítottuk. Egy bizonyos mennyiségű vastagbél-tumorsejt prokoaguláns aktivitását VACa dózistól függően gátolja (lásd a 2. ábrát). A sejtmennyiség és az alvadási idő közötti összefüggésből (1. ábra) kiszámítottuk, hogy 210 nM VACa 6xl06 sejt/ml prokoaguláns aktivitásának 99%-át semlegesíti. Ha VACa-val semlegesített vastagbélsejteket Ca2+ jelenlétében centrifugálunk és utána TBSA-val mosunk, utána semmilyen prokoaguláns aktivitást nem mutatnak koagulációs vizsgálatban. Ha viszont a folyadék Ca2+ helyett EDTA-t tartalmaz, akkor a sejtek normális prokoaguláns aktivitást mutatnak.
Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a VACa a tumorsejtekkel asszociált prokoaguláns aktivitást semlegesíti, amennyiben az Ca2+-függően olyan felületi helyekre kötődik, amelyek ezen prokoaguláns aktivitás szempontjából döntő szerepet játszanak. Nagy valószínűség szerint a foszfolipidek is szerepet játszanak a tumorsejteken asszociált prokoaguláns aktivitásban, mivel eddig VACa-ra semmilyen más felületi receptort nem mutattak ki.
A VACa tehát gátolja a tumorsejtek prokoaguláns aktivitását, amennyiben a tumorsejtek felületének olyan helyeihez kötődik, amelyek azon reakciók iniciálásában és/vagy továbbvitelében részesek, amelyek trombin és legvégül fibrin képződéséhez vezetnek. Mivel VACa mellett más annexinek is kötődnek Ca2+függően foszfolipidekhez, a VACa-val kapott eredmények ezekre is valószínűsíthetők.
HU 208 636 Β
Azáltal, hogy az annexinek a tumorsejtek saját prokoaguláns aktivitását csökkentik, meggátolják a tumorsejteknek egy fibrinhálóba való beburkolózását, ami elengedhetetlenül szükséges a tumorsejtek metasztázisos aktivitásához. A semlegesítő hatás alapján az annexinek ezért abban a helyzetben vannak, hogy meggátolják a tumorsejtek metasztázisát, és ezért potenciális antimetasztázisos aktivitású hatóanyagoknak tekinthetők. Az annexinek, különösen a VÁC proteinek jól definiált szerkezetű molekulák, amelyek az emberi szervezetben rákos megbetegedéstől függetlenül jelen vannak. Ezért meglepő, hogy ezek a tulajdonképpen endogén anyagok a szervezetbe bejuttatva tumorsejtek metasztázisát gátló hatást, konkrétan tumorsejt-asszociált prokoaguláns aktivitást semlegesítő hatást fejtenek ki.
A találmány célkitűzésének tekintett feladatot tehát egy, az annexinek családjához tartozó antikoaguláns protein, előnyösen a VACa alkalmazásával oldottuk meg.
A találmány szerint alkalmazható VÁC proteinek nemcsak szabad formában, hanem sóik, különösen gyógyászatilag elfogadható sóik formájában is létezhetnek. Mivel több, szabad aminocsoporttal rendelkező aminosav-maradékot is tartalmaznak, a találmány szerinti vegyületek például savaddíciós sók formájában is létezhetnek. Savaddíciós sókként különösen a szokásos, gyógyászatilag alkalmazható savakkal képzett, fiziológiásán elviselhető sók jönnek számításba; szervetlen savakként hidrogén-halogenidek, például a hidrogén-klorid, de kénsav és foszforsav, illetve pirofoszforsav is említhető; szerves savakként elsősorban szulfonsavak, például a benzolszulfonsav vagy a p-toluolszulfonsav, vagy rövid szénláncú alkánszulfonsavak, például metánszulfonsav, valamint karbonsavak, például ecetsav, tejsav, palmitinsav és sztearinsav, almasav, borkősav, aszkorbinsav és citromsav megfelelők. Mivel a vegyületek szabad karboxilcsoportokkal rendelkező aminosavmaradékokat is tartalmaznak, fémsóként, különösen alkálifémsóként vagy alkáliföldfémsóként, például nátrium-, kalcium- vagy magnéziumsóként, vagy ammóniából vagy valamilyen fiziológiailag elviselhető, nitrogéntartalmú szerves bázisból levezethető ammóniumsóként is létezhetnek. Mivel azonban egyidejűleg mind szabad karboxilcsoportokat, mind szabad aminocsoportokat tartalmaznak, belső sóként is létezhetnek.
A találmány szerinti készítmények beadhatók parenterálisan, például intravénásán, intrakután, szubkután vagy intramuszkuláris úton, vagy helyileg is alkalmazhatók.
Az egyedi dózisok nagysága, valamint a beadási séma legjobban az illető kóreset egyedi megítélése alapján határozható meg: az illető faktorok meghatározására szolgáló szükséges módszerek a szakember által ismertek. Normál esetben egy injekcióban a találmány szerinti hatóanyag gyógyászatilag hatásos mennyisége a körülbelül 0,005-0,5 mg/testtömegkilogramm dózistartományon belül esik. Előnyös a körülbelül 0,01-0,1, különösen előnyös a körülbelül 0,01-0,05 mg/testttömegkilogramm tartományba eső adag. A beadás intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután injekcióval történik. Ennek megfelelően a parenterális beadásra szánt, egységdózis formában levő gyógyszerkészítmények az alkalmazás fajtájától függően dózisonként körülbelül 0,4-7,5 mg hatóanyagot tartalmaznak. A találmány. szerinti gyógyszerkészítmények a hatóanyagok mellett adott esetben még valamilyen puffért, például egy foszfátpuffert is tartalmaznak, amely a pH-t körülbelül 3,5 és 8 között tartja, továbbá nátrium-kloridot, mannitot vagy szorbitot az izotónia beállítására. A készítmények lehetnek fagyasztva szárított vagy oldott formában, amikor az oldatok egy antibakteriális hatású tartósítószert, például 0,2-0,3% 4-hidroxi-benzoesavmetil-észtert vagy -etil-észtert tartalmazhatnak. Egy helyi alkalmazásra szolgáló készítmény vizes oldatként, lemosószerként vagy zseléként, olajos oldatként vagy szuszpenzióként, vagy zsírtartalmú vagy különösen emulziós kenőcsként formázható. Egy vizes oldat formájában levő készítményt például úgy állítunk elő, hogy a találmány szerinti hatóanyagokat egy 4 és 6,5 közötti pH-jú vizes pufferoldatban oldjuk, és kívánt esetben egy további hatóanyagot, például valamilyen gyulladásgátlót, és/vagy egy polimert, például polivinilpirrolidont, és/vagy egy tartósítószert adunk hozzá. A hatóanyag koncentrációja körülbelül 0,1-1,5, előnyösen 0,25-1,0 mg 10 ml oldatban vagy 10 g zselében.
Egy helyileg alkalmazható olajos készítményt például a találmány szerinti hatóanyagok valamilyen olajban, adott esetben sűrítőszerek, például alumíniumsztearát, és/vagy olyan felületaktív szerek (tenzidek), például többértékű alkoholok zsirsav-monoészterei, így glicerin-monosztearát, szorbit-monolaurát, szorbitmonosztearát vagy szorbit-monooleát (amelyek HLB „hydrophilic-lipophilic-balance” - értéke 10 alatt van) hozzáadása mellett végzett szuszpendálásával kapunk. Zsírtartalmú kenőcsöt például a találmány szerinti hatóanyagok valamilyen kenhető zsíralapban, adott esetben egy 10 alatti HLB-értékű tenzid hozzáadása mellett végzett szuszpendálásával kapunk. Emulziós kenőcsöt a találmány szerinti hatóanyag vizes oldatának egy lágy, kenhető zsíralappal egy 10 alatti HLB-értékű tenzid hozzáadása mellett végzett eldörzsölésével kapunk. A helyileg alkalmazható készítmények tartósítószereket is tartalmazhatnak. A hatóanyag koncentrációja 0,1-1,5 mg, előnyösen 0,25-1,0 mg körülbelül 10 g alapmasszában.
A találmány tárgya tehát eljárás: egy tumorsejt-asszociált prokoaguláns aktivitást semlegesítő olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely egy, az annexinek csoportjába tartozó VÁC proteint tartalmaz adott esetben segédanyagokkal és/vagy hordozókkal és/vagy stabilizátorokkal együtt; előnyösen egy tumorsejt-asszociált prokoaguláns aktivitást semlegesítő olyan gyógyszerkészítmény előállítására, amely a
HU 208 636 Β
1 5 10 15
Met Alá Gin Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe
20 25 30
Asp Glu Arg Alá Asp Alá XX Thr Leu Arg Lys Alá Met Lys Gly
35 40 45
Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg
50 55 60
Ser Asn Alá Gin Arg Gin Glu Ile Ser Alá Alá Phe Lys Thr Leu
65 70 75
Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly
80 85 90
Lys Phe Glu Lys Leu Ile Val Alá Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu
95 100 105
Tyr Asp Alá Tyr Glu Leu Lys His Alá Leu Lys Gly Alá Gly Thr
110 115 120
Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu Ile Ile Alá Ser Arg Thr Pro Glu
125 130 135
Glu Leu Arg Alá Ile Lys Gin Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser
140 145 150
Ser Leu Glu Asp Asp Val Val dy Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gin
155 160 165
Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gin Alá Asn Arg Asp Pro Asp Alá
170 175 180
Gly Ile Asp Glu Alá Gin Val Glu Gin Asp Alá Gin Alá Leu Phe
185 190 195
Gin Alá Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe Ile
200 205 210
Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Val Phe
215 220 225
Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gin Ile Glu Glu Thr Ile
230 235 240
Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gin Leu Leu Leu Alá Val
245 250 255
Val Lys Ser Ile Arg Ser Ile Pro Alá Tyr Leu Alá Glu Thr Leu
260 265 270
Tyr Tyr Alá Met Lys Gly Alá Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile
275 280 285
Arg Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg
290 295 300
Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Alá Thr Ser Leu Tyr Ser Met Ile
305 310 315
Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Alá Leu Leu Leu Leu
320
Cys Gly Glu Asp Asp -OH
HU 208 636 Β általános képlettel - a képletben
XX jelentése Asp vagy Glu; és adott esetben az 1 helyzetben levő metionin lehasadt, és adott esetben a 2 helyzetben levő alanin védve van, és/vagy adott esetben aggregációk, például a 316 helyzetben levő ciszteinek között intermolekuláris diszulfidhidak vannak ábrázolható VACa-t vagy biológiailag aktív változatait vagy származékait tartalmazza adott esetben segédanyagokkal és/vagy hordozókkal és/vagy stabilizátorokkal együtt.
A következő példa a találmány szemléltetésére szolgál anélkül, hogy annak oltalmi körét bármiképp korlátozná.
Anyagok és módszerek
A VÁC proteinek ismert szerkezetű polipeptidek. Izolálásukat a következő közleményekben írják le: Eur. J. Biochem. 151, 625-629 (1985); Eur. J. Biochem. 173, 171-178 (1988). A VACa előállítását az EPA 0181465 és az EPA 0293 567 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentések vagy például a 2496/88 alapszámú magyar szabadalmi bejelentés, természetes fonásokból való kinyerését a 199883 számú magyar szabadalmi leírás közli. A VACP és a VACa különböző változatainak előállítását szintén leírja a 2496/88 alapszámú magyar szabadalmi bejelentés. A ν^β előállítását és szerkezetének különböző annexinek szerkezetével való összehasonlítását a Eur. J. Biochem., 185, 63-71 (1989) irodalmi közlemény tárgyalja. Humán VÁC proteinek biotechnológiai módszerek alkalmazásával való előállítását a Eur. J. Biochem., 174, 585-592 (1988) irodalmi közlemény tartalmazza. A következőkben leírt vizsgálatokat VACa-val végeztük. Az eredmények azonban más annexinekre, különösen VACβ-ra is vonatkoztathatók.
Vastagbél tumorsejteket szövettenyésztő lombikban 10% borjú magzatszérummal kiegészített RPMI 1640 táptalajban tenyésztünk. A sejteket úgy szüreteljük, hogy a lombik fenekét egy gumitörlővel letöröljük. Az összegyűjtött sejteket TBSA-pufferral (50 mM triszxHCl, 100 mM nátrium-klorid, 4,5 mg/ml glükóz, 0,5 mg/ml borjúszérumalbumin, 2 mM kalcium-klorid, pH 7,9) mossuk, és utána a vizsgálatokhoz ugyanebben a pufferban szuszpendáljuk. A sejtek életképességét triptánkék kizárással vizsgáljuk. A sejtek több mint 95%-a életképes volt ezen eljárás után.
Koagulációs vizsgálat:
A vastagbélsejtek prokoaguláns aktivitását úgy mértük, hogy meghatározott mennyiségű mosott sejtet adtunk 50 μΐ citrátozott, vérlemezkementes plazmához (PFP). Az elegyet 2 percig kevertük 37 °C-on. A koagulációt kalcium-klorid hozzáadásával (végkoncentráció: 10 mM) váltottuk ki. Az elegy végtérfogata 500 μΐ volt. A koagulációt turbidimetriásan egy Payton Dual Wave Aggregometerrel figyeltük.
Eredmények:
Vastagbélsejt-asszociált prokoaguláns aktivitás:
Amennyiben a mosott vastagbélsejteket citrátozott PFP-hez adtuk, és a plazma kalciumtartalmát helyreállítottuk, akkor olyan alvadási időt észlelhettünk, amely a jelen lévő sejtek számától függött (1. ábra). A sejtek távollétében az alvadási idő több mint 15 perc volt, míg 8xl06 sejt ezt az alvadási időt körülbelül 2 percre csökkentette. Ezt a prokoaguláns aktivitást a kezeletlen sejtekkel kaptuk; a sejtek centrifugálása a prokoaguláns aktivitás koprecipitációját eredményezte.
A vastagbélsejt-asszociált prokoaguláns aktivitás semlegesítése VACa-val:
Egy meghatározott mennyiségű vastagbélsejt prokoaguláns aktivitását VACa dózistól függően gátolta (2. ábra). A sejtmennyiség és az alvadási idő összefüggéséből (1. ábra) kiszámítottuk, hogy 210 nM VACa 6xl06 sejt/ml prokoaguláns aktivitásának 99%-át semlegesíti. Ha VACa-val semlegesített vastagbélsejteket Ca2+-ionok jelenlétében centrifugáltuk és utána TBSAval mostuk, koagulációs vizsgálatban semmilyen prokoaguláns aktivitást nem mutattak. Amennyiben viszont a folyadék Ca2+-ionok helyett EDTA-t tartalmazott, akkor a sejtek normális prokoaguláns aktivitást mutattak.
Az ábrák magyarázata:
1. ábra:
Vastagbélsejt-asszociált prokoaguláns aktivitás.
Citrátozott vérlemezkementes plazmát (PFP) adott számú vastagbélsejtet tartalmazó TBSA-val hígítottunk. 37 °C-on végzett 3 perces inkubálás után kalcium-kloridot adtunk hozzá (végkoncentráció 10 mM), és regisztráltuk az alvadási időt.
2. ábra:
VACa hatása vastagbélsejtek prokoaguláns aktivitására.
Citrátozott vérlemezkementes plazmát (PFP) adott mennyiségű VACa-t és meghatározott számú vastagbélsejtet tartalmazó TBSA-val hígítottunk (6xl06 sejt/ml végkoncentrációig). 37 °C-on végzett 3 perces inkubálás után kalcium-klorid hozzáadásával (végkoncentráció 10 mM) koagulációt váltottunk ki. A mért alvadási időt az 1. ábrára vonatkoztattuk, és a prokoaguláns-aktív vastagbélsejtekre extrapoláltuk.

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás hatóanyagként az annexinek csoportjába tartozó VÁC proteint tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy az ismert módon előállított VÁC proteint a gyógyszertechnológiában szokásosan használt hordozókkal és/vagy hígítókkal és/vagy stabilizátorokkal és/vagy egyéb segédanyagokkal keverjük, és a keveréket tumorsejtek által kiváltott prokoaguláns aktivitást semlegesítő hatású gyógyszerkészítménnyé formázzuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként egy
    HU 208 636 Β
    1 5 10 15 Met Alá Gin Val Leu Arg Gly Thr Val Thr Asp Phe Pro Gly Phe 20 25 30 Asp Glu Arg Alá Asp Alá q Thr Leu Arg Lys Alá Met Lys Gly 35 40 45 Leu Gly Thr Asp Glu Glu Ser Ile Leu Thr Leu Leu Thr Ser Arg 50 55 60 Ser Asn Alá Gin Arg Gin Glu He Ser Alá Alá Phe Lys Thr Leu 65 70 75 Phe Gly Arg Asp Leu Leu Asp Asp Leu Lys Ser Glu Leu Thr Gly 80 85 90 Lys Phe Glu Lys Leu Ile Val Alá Leu Met Lys Pro Ser Arg Leu 95 100 105 Tyr Asp Alá Tyr Glu Leu Lys His Alá Leu Lys Gly Alá Gly Thr 110 115 120 Asn Glu Lys Val Leu Thr Glu Ile He Alq Ser Arg Thr Pro Glu 125 130 135 Glu Leu Arg Alá He Lys Gin Val Tyr Glu Glu Glu Tyr Gly Ser 140 145 150 Ser Leu Glu Asp Asp Val Val Gly Asp Thr Ser Gly Tyr Tyr Gin 155 160 165 Arg Met Leu Val Val Leu Leu Gin Alá Asn Arg Asp Pro Asp Alá 170 175 180 Gly He Asp Glu Alá Gin Val Glu Gin Asp Alá Gin Alá Leu Phe 185 190 195 Gin Alá Gly Glu Leu Lys Trp Gly Thr Asp Glu Glu Lys Phe Ile 200 205 210 Thr Ile Phe Gly Thr Arg Ser Val Ser His Leu Arg Lys Val Phe 215 220 225 Asp Lys Tyr Met Thr Ile Ser Gly Phe Gin He Glu Glu Thr He 230 235 240 Asp Arg Glu Thr Ser Gly Asn Leu Glu Gin Leu Leu Leu Alá Val 245 250 255 Val Lys Ser He Arg Ser Ile Pro Alá Tyr Leu Alá Glu Thr Leu 260 265 270 Tyr Tyr Alá Met Lys Gly Alá Gly Thr Asp Asp His Thr Leu Ile 275 280 285 Arg Val Met Val Ser Arg Ser Glu Ile Asp Leu Phe Asn Ile Arg 290 295 300 Lys Glu Phe Arg Lys Asn Phe Alá Thr Ser Leu Tyr Ser Met He 305 310 315 Lys Gly Asp Thr Ser Gly Asp Tyr Lys Lys Alá Leu Leu Leu Leu 320 Cys Gly Glu Asp Asp -OH
    HU 208 636 Β általános képlettel - a képletben
    XX jelentése Glu vagy Asp; és adott esetben az 1 helyzetben levő metionin lehasadt, és adott esetben a 2 helyzetben levő alanin védve van, és/vagy adott esetben aggregációk, például a 316 helyzetben levő ciszteinek között intermolekuláris diszulfidhidak vannak ábrázolt szerkezetű VACa-t alkalmazunk.
HU9201552A 1989-11-11 1990-11-08 Process for producing pharmaceutical compositions neutralizing procoagulant activity caused by tumour cells HU208636B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3937607A DE3937607A1 (de) 1989-11-11 1989-11-11 Verwendung eines antikoagulanz zur behandlung von tumorerkrankungen

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9201552D0 HU9201552D0 (en) 1992-08-28
HUT61202A HUT61202A (en) 1992-12-28
HU208636B true HU208636B (en) 1993-12-28

Family

ID=6393365

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201552A HU208636B (en) 1989-11-11 1990-11-08 Process for producing pharmaceutical compositions neutralizing procoagulant activity caused by tumour cells

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0500602B1 (hu)
JP (1) JPH05501876A (hu)
AT (1) ATE120371T1 (hu)
CA (1) CA2068312A1 (hu)
DE (2) DE3937607A1 (hu)
DK (1) DK0500602T3 (hu)
ES (1) ES2071833T3 (hu)
HU (1) HU208636B (hu)
WO (1) WO1991007187A1 (hu)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5968477A (en) 1994-01-24 1999-10-19 Neorx Corporation Radiolabeled annexin conjugates with hexose and a chelator
CA2180555C (en) * 1994-01-24 2004-12-14 Sudhakar Kasina Radiolabeled annexins
US20030220233A1 (en) 1994-01-24 2003-11-27 Neorx Corporation Radiolabeled annexins
WO1995034315A1 (en) * 1994-06-16 1995-12-21 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose conjugates
EP0799050B1 (en) * 1994-12-07 2004-08-11 Neorx Corporation Radiolabeled annexin-galactose cluster conjugates
JPH10512852A (ja) * 1994-12-07 1998-12-08 ネオルクス コーポレイション 放射性標識化アネキシン−ガラクトースクラスター複合体
US6509316B2 (en) 1995-03-07 2003-01-21 George Washington University Pharmaceutical compositions, methods, and kits for treatment and diagnosis of lung cancer
US6288039B1 (en) 1995-03-07 2001-09-11 George Washington University Pharmaceutical compositions methods and kits for treatment and diagnosis of breast cancer
US5935860A (en) 1995-03-07 1999-08-10 The George Washington University Use of uteroglobin expression as a molecular marker for prostatic intraepithelial neoplasia
US5696092A (en) * 1995-03-07 1997-12-09 George Washington University Methods and compositions for inhibiting metastasis of epithelial cell-derived cancers
ATE230614T1 (de) 1998-07-13 2003-01-15 Univ Texas Krebsbehandlung mit aminophospholipide bindenden, therapeutischen konjugaten
AU2004202605B2 (en) 1998-07-13 2007-10-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
US6406693B1 (en) 1998-07-13 2002-06-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
EP1520588B1 (en) 1998-07-13 2014-12-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Uses of antibodies to aminophospholipids for cancer treatment
US6818213B1 (en) 1998-07-13 2004-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment compositions comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US7645739B2 (en) 2001-02-21 2010-01-12 Alavita Pharmaceuticals, Inc. Modified annexin compositions and methods of using same
US7635676B2 (en) 2001-02-21 2009-12-22 Alavita Pharmaccuticals, Inc. Modified annexin proteins and methods for their use in organ transplantation
EP1839670A3 (en) 2001-02-21 2009-11-11 Alavita Pharmaceuticals, Inc. Modified Annexin Proteins and their use against thrombosis
US7635680B2 (en) 2001-02-21 2009-12-22 Alavita Pharmaceuticals, Inc. Attenuation of reperfusion injury

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT87083B (pt) * 1987-03-28 1992-07-31 Boehringer Ingelheim Int Processo para a preparacao de uma proteina anticoagulante vascular, de adn que codifica para esta proteina e de composicoes farmaceuticas que a contem

Also Published As

Publication number Publication date
DE59008813D1 (de) 1995-05-04
WO1991007187A1 (de) 1991-05-30
HUT61202A (en) 1992-12-28
DE3937607A1 (de) 1991-05-16
JPH05501876A (ja) 1993-04-08
ATE120371T1 (de) 1995-04-15
EP0500602A1 (de) 1992-09-02
ES2071833T3 (es) 1995-07-01
CA2068312A1 (en) 1991-05-12
HU9201552D0 (en) 1992-08-28
EP0500602B1 (de) 1995-03-29
DK0500602T3 (da) 1995-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU208636B (en) Process for producing pharmaceutical compositions neutralizing procoagulant activity caused by tumour cells
JP7003183B2 (ja) 凍結乾燥した組換え型ｖｗｆ製剤
Landowski et al. Studies of the structure of the metastasis-associated 67 kDa laminin binding protein: fatty acid acylation and evidence supporting dimerization of the 32 kDa gene product to form the mature protein
US4656161A (en) Increasing the enteral absorbability of heparin or heparinoids
US8440628B2 (en) Medical compositions containing ghrelin
EP0706398B1 (en) Pharmaceutical composition containing heparin, heparin fragments or their derivatives in combination with glycerol esters
US5260224A (en) Therapeutic uses of actin-binding compounds
JPH01502434A (ja) 新規インシュリン誘導体
AU738413B2 (en) Human growth hormone-containing aqueous pharmaceutical composition
PT89534B (pt) Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas anticoagulantes contendo como ingrediente activo proteina c ou proteina c activada combinada com heparina
JPH08245418A (ja) 安定なトランスグルタミナーゼ製剤およびそれらを製造する方法
KR101024511B1 (ko) 올리고펩티드 및 에테르화된 시클로덱스트린을 포함하는액상 제제
IE60649B1 (en) Mixed crystals of insulin and insulin derivatives, a process for the preparation of these mixed crystals, and pharmaceutical agents containing these mixed crystals
JPH04503070A (ja) プラスミノーゲン活性化因子蛋白の薬学的組成物
US4510135A (en) Orally administered heparin
KR100442758B1 (ko) 조직인자응고계억제제함유혈관신생저해제
KR20140083035A (ko) 인자 ｖｉｉｉ의 생체이용률을 증가시키기 위한 황산화 글리코사미노글리칸과 하이알루로니다제의 병용 사용
JPH0273022A (ja) 組織プラスミノーゲン活性化因子を用いた薬学的製剤
PT1750733E (pt) Método de administração de factor viii suíno sem domínio b
KR102017973B1 (ko) 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제
CA2161682A1 (en) Liquid globulin composition for intravenous injection, process for producing the same, and method of inhibiting globulin dimer increase in said composition
PT1372700E (pt) Soluções aquosas estáveis do factor de estimulação de colónias de macrofagos granulócitos.
JP2001064199A (ja) レシチン化スーパーオキシドジスムターゼ含有医薬組成物
Verma et al. Kinetic analysis, isolation, and characterization of hydrophilic folate-binding proteins released from chorionic villi cultured under serum-free conditions
JPH01308235A (ja) ヒト成長ホルモン経鼻剤

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee