HU208159B - Process for producing 1h-rh analogs and pharmaceutical compositions comprising same - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új, citotoxikus csoportokat tartalmazó peptidek előállítására, melyek befolyásolják emlősöknél a gonadotróp (ivarszervekre ható) hormonok a hipofízisből történő felszabadulását, továbbá daganat-ellenes hatást is kifejtenek. Pontosabban a jelen találmány a luteinizáló hormont felszabadító hormon (angolul: luteinizing hormonreleasing hormoné (LHRH), szerkezet:

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ analógjainak és gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóinak előállítására, továbbá ezeket a vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására vonatkozik.

A hipotalamusz LHRH-ja kontrollálja a gonadotropinok (LH és FSH) felszabadulását a hipofízisből, amelyek az ivarszervekben a szexuál szteroidok szintézisét stimulálják.

A hormonérzékeny tumorok kezelésében új megközelítést fejlesztettek ki, ami az LHRH agonistáinak és antagonistáinak felhasználására irányul (A. V. Schally és A. M. Comaru-Schally, Sem. Endocrinol., 5 389— 398, 1987). Néhány LHRH agonista a 6. és 10., vagy mindkét helyén szubsztituálva sokkal nagyobb aktivitást mutat, mint az LHRH, és jelentkezik elhúzódó hatás is. A következő szuperagonistákat használják a klinikai gyakorlatban:

[D-Leu⁶, NH-Et‘°]LHRH (Leuprolide; J. A. Vilchey-Martiney és tsai, Biochem. Biophys. Rés. Commun., 59 1226-1232, 1974), [D-Trp⁶]LHRH (Decapeptyl, D. H. Coy és tsai, J. Med. Chem., 19 423-425, 1976). [D-Ser(tBu)⁶, NH-Et¹⁰]LHRH (Buserelin, W. Koenig és tsai, In: R. Walter and J. Meienhofer (eds.); peptidek: Chemistry, Structure and Biology. Proceedings of the Fourth American Peptide Symposium. Ann Arbor Science, Ann Arbor, MI, 1975, 883-888. oldalak; [D-Ser(tBu)⁶,NH-NH-CO-NH₂'°]LHRH (Zoladex, A. S. Dutta és tsai, J. Med. Chem., 27 1018-1024, 1978), [D-Nal(2)⁶]LHRH (Nafarelin, J. J. Nestor és tsai, J. Med. Chem., 25 795-801, 1982).

Az LHRH molekula 1., 2., 3., 6. és adott esetben 5. és 10. helyén való változtatások hatékony antagon istákhoz vezettek (M. J. Karién és J. E. Rivier Endocrine Review, 7 44-66, 1986; S. Bajusz és tsai, Int. J. Pept. Prot. Rés., 32 425-435, 1988), amelyek gátolják a hipofízisből az LH és FSH felszabadulását és így jelentőséggel bírnak, mint terápiás szerek, a hormon dependens daganatok (prosztata, mellrák és hasnyálmirigyrák) kezelésében (A. V. Schally, in General Gynecology, 6. kötet, Parthenon Press, Camforth, England, 1989, 1-20. oldalak).

Az ideális rákellenes szerek elméletileg azok lennének, amelyek elpusztítják a rákos sejteket a normális sejtek károsítása nélkül. Az antineoplasztikus szereket hordozó hormonok a feladatot a receptort tartalmazó tumorok célzott kemoterápiájának hatékonyabb véghezvitelével szolgálnák. Egy ideális mechanizmusa a hormon gyógyszer konjugátum hatásának a sejtmembrán receptorhoz való kötődésük, amelyet a hibrid molekula sejtbe kerülése követ és a gyógyszer vagy biológiailag aktív származéka a vivő hormonról az endoszómákban vagy a szekunder dizoszómákban felszabadul. A felszabadult anyagok azután átjutnak a lizoszómák membránján a sejtplazmába és elérik a végső céljukat. Ahhoz, hogy a konjugátum a fenti mechanizmusra hatékony legyen, stabil kötődés szükséges a gyógyszer és a hormon között, mielőtt a konjugátum a célzott tumorsejtbe jut, de ketté kell hasadjon a bejutást követően.

Sok humán tumor hormon dependens vagy hormonra reagáló, és hormon receptorokat tartalmaznak. Bizonyos tumorok ezek közül függenek a szexuál hormonoktól vagy a növekedési faktoroktól, vagy reagálnak rájuk, illetve vannak olyan komponenseik, amelyek függenek tőlük vagy reagálnak rájuk. A többi tumor vagy tumor komponens nem annyira függ ezektől. Az emlötumoroknak ösztrogén, progeszteron, glukokortikoid, LHRH, EGF, IGF-I és szomatosztatin receptorai vannak. Peptid hormon receptorokat találtak továbbá akut leukémia-, prosztata-, emlő-, hasnyálmirigy-, ováriumdaganatoknál, vastagbél- és agytumoroknál (Μ. N. Pollak, és tsai, Cancer Lett. 38 223-230, 1987; F. Pekonen, és tsai, Cancer Rés., 48 1343-1347,1988; M. Fekete és tsai, J. Clin. Láb, Anal. 3 137-147, 1989; G. Emons és tsai, Eur. J. Cancer Oncol., 25 215-221,1989). Azt találták, hogy az LHRHnak mind az agonista, mind az antagonista analógjai kötődnek a humán emlő tumor sejtmembránjához, továbbá a hasnyálmirigy tumor sejtmembránjához is, noha az utóbbi daganatot hormon independensnek tartották (M. Fekete és tsai, Endocrinology, 124 946-955, 1989; M, Fekete és tsai, Pancreas 4 521-528, 1989). Demonstrálták, hogy biológiailag aktív peptidek, úgy mint a melanotropin (MSH), epidermális növekedési faktor, inzulin és az LHRH agonista és antagonista analógjai a célsejtjükbe endocitózis révén jutnak be (L. Jennes és tsai, Peptides 5 215-220, 1984)

A tumorok kezelésében használt alkilező szerek alapvetően nem szelektív hatásmechanizmusúak. Fitotoxikus hatásuk kifejtése az alkilcsoportjuk különböző sejtalkotókba való bejuttatása révén valósul meg. A DNA alkilezése a sejtmagban feltehetően reprezentálja a fő interakciót, ami a sejt elpusztulásához vezet.

Fiziológiás körülmények között alkilálhatunk minden sejtmaghoz kötődő anyagot, mint például ionizált karboxil- és foszforsavcsoportokat, hidroxilcsoportot, tiolokat és töltéssel nem rendelkező nitrogéncsoportokat. A mustár-nitrogének (klórambucil, ciklofoszfamid és melfalán) a legrégibb daganatellenes szerek a klinikai gyakorlatban. Ezek spontán képeznek ciklikus aziridínium (etilénimónium) kationszármazékokat intramolekuláris ciklizáció révén, amelyek direkt vagy karbóniumionon keresztül transzferálnak egy alkilcsoportot egy sejtmaghoz kötődő vegyületre. Az aziridincsoport tartalmú szerek, mint a tio-TEPA ezen mechanizmus alapján hatnak.

A ciklopropán egy másik alkilező szer. A nagymértékben feszülő gyűrűt a nukleofilek hasítják. A ciklopropán hasadása kettős gyökű vagy ikerion átmeneti állapotot eredményezhet epimerizációs reakciókban és így alkiláló szerként viselkedhet a DNS nukleofil bázisaival való kölcsönhatás során.

HU 208 159 B

Ciklopropilcsoport építése disztamicinbe (természetes antivirális tumorellenes szer) a citosztatikus aktivitás megnégyszerezödését eredményezte (K. Krowicki és tsai, J. Med. Chem. 3 341-345, 1988).

Majdnem minden klinikailag alkalmazott alkilezőszer kétféleképpen működhet. Képes keresztkötést kialakítani két különálló molekula között, vagy egy molekulának két különböző nukleofil csoportját alkilálhatja. Keresztkötések a DNS-sel létrejöhetnek egyszálú formában, két komplementer szálú között, vagy DNS és más molekulák, úgy mint proteinek között. Feltételezett, hogy az alkiláló szerek citotoxicitása összefüggésben van a keresztkötéseket kialakító képességükkel (J. J. Roberts és tsai, Adv. Radiat. Bioi. 7 211-435, 1978)

Ciszplantin (cisz-diamin-diklór-platinum) régóta alkalmazzák a daganat-terápiában. Ciszplantinhoz hasonló struktúrájú oldalláncot tartalmazó LHRH analógok nagy affinitást mutatnak a patkány hipofízis membrán receptoraihoz és humán emlőrák sejtjeihez. (S. Bajusz és tsai., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 6313-6317, 1989). Citotoxikus réz és nikkel komplexek beépítése megfelelően módosított LHRH analógokban a vegyületekben nagy hormonális aktivitást és affinitást eredményezett az LHRH receptorokhoz humán emlő karcinóma semtmembránon. Néhány ezen metallopeptidek közül citotoxikus aktivitást fejtett ki humán emlő és prosztata sejtvonalakra in vitro. Például pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[Ahx-A₂bu(SAL)₂(Cu)]Leu-Arg-Pro-Gly-NH gátolja a [³H]-timidin beépülését az MDA-MB-231 humán emlő sejtvonal DNS-ébe 87% koncentrációnál 10 pg koncentrációban.

Számos daganat-kemoterápiában használt szer tartalmaz kinoncsoportot. Antraciklin tumorellenes antibiotikumok, mint például az adriamicin, daunorubicin, mitomicin C és mitoxantron a DNS-hez specifikus bázisok közé ékelődés révén kötődnek és blokkolják új RNS vagy DNS vagy mindkettő szintézisét, ezzel a DNS szál ketté válását okozzák és akadályozzák a sejtreplikációt. A kinoncsoport bioreduktív redukciói szabad gyökök keletkezéséhez vezethetnek (szuperoxid és hidroxilgyökök), amelyek DNS szál töréseit indukálhatják (Bachur és tsai., Cancer Rés. 38 1745— 1750, 1978). Egy másik út a kinonnak hidrokinonná való redukciója, amelyet alkiláló intermedierré, kinonmetiddé alakítunk át (Moore és tsai, Drug Exp. Clin. Rés. 12 475-494, 1986). Daunorubicint melanotropin (MSH) peptid vivőanyaghoz kötöttünk és a konjugátum toxikusabbnak mutatkozott patkány melanomasejtekre, mint a szabad szer. (J. M. Varga, Meth. Enzymol. 7/2 259-269, 1985). A metil-antrakinonszármazékoknak citotoxikus aktivitásuk van hipoxiás daganatos sejtekre. (T. S. Lin. és tsai J. Med. Chem. 23 1237-1242, 1980).

Néhány antimetabolit kemoterápiás szerként számíthat érdeklődésre, minthogy fontosak a sejt folát metabolizmusában (I. D. Goldman és tsai., Eds. Folyl and Antifolyl Polyglutamates, Plenum Kiadó, New York, 1983). Ametotrexát/N-[p[[(2,4-diamino-6-pteridinil)-metil]-metil-amino]-benzoil]-glutaminsav/ egy folsav antagonista, amelyik gátolja a dihidrofolát reduktáz funkcióját és ezáltal megakadályozza a timidilát és purin nukleotidok szintézisét, valamint a szerin és metionin aminosavakét, ezáltal gátolja a DNS, az RNS és a proteinek képződését.

Kezdetben a klorambucil (/4-[4-(bisz)-2-klór-etilJamino)-fenil/-vajsav) alkilezőszer LHRH agonistába és antagonistákba való beépítése olyan vegyületekhez vezetett, amelyek vagy nem mutattak aktivitást, vagy alacsony aktivitásúak voltak [K. Channabasavaiah és J. M. Stewart, Biochem, Biophys. Rés. Commun., 86, 1266-1273 (1979), C. J. Bowers és tsai, Biochem. Biophys, Rés. Commun., 67 698-703 (1974), K. Channabasavaiah és tsai, In: E. Gross és J. Meienhofer (eds.), Peptides, Proceedings of the Sixth American Peptide Symposium, Pierce Chem. Co. Rockford, IL, 1979, 803-807. oldalak],

A D-melfalánt (mustár-nitrogén típusú alkilálószer, 4-[bisz-/2-klór-etil/-amino]-D-fenil-alanin) tartalmazó LHRH analógok nagy agonista és antagonista aktivitással rendelkeznek és nagy affinitással kötődnek a patkány hipofízis, humán emlő és prosztata karcinóma sejtmembránjaihoz (S. Bajusz és tsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 6318-6322, 1989). A kötődés reverzibilis és az LHRH receptorok alkilálása nem következik be. Szignifikáns citotoxikus aktivitás (a [³H]-timidin beépülésének meggátlása) a T-47D humán emlő karcinóma sejtvonal és az MT-4 patkány emlő karcinóma sejtvonal kultúrákon volt demonstrálható.

A szexuálhormon és növekedési faktor dependens tumor komponensek visszaszoríthatók ezen faktorok csökkentésével a beteg szervezetében. Ez azonban nem oldja meg a fennmaradó nem dependens tumorok vagy tumorkomponensek problémáját. Amint Fekete és mások rámutatnak (lásd fent), LHRH receptorok jelen lehetnek vagy hiányozhatnak is tumorokból és tumorkomponensekből, amelyek nem függenek szexuál hormontól vagy növekedési faktortól.

így citotoxikus csoportot tartalmazó LHRH analógok szolgálhatnak a kemoterápiás szerek hordozóiként. Az ilyen peptidek kötődni tudnak az LHRH receptorokhoz és nem károsítják a receptor részt, és ez bizonyos célszelektivitást biztosíthat az így megváltoztatott citotoxikus LHRH analógoknak, és így sejtspecifikussá teszi őket. A sejtbe kerülés után ezen hibrid vegyület citotoxikus komponense meg tudja gátolni a sejtfolyamatokat és így okozza a sejt halálát.

Létezik néhány vegyület a klinikumban használt tumorellenes szerek között, amelyek vivő peptidmolekulákhoz köthetők. A kötődés létrehozható a citotoxikus rész funkcionális csoportjának és a peptid szabad amino vagy karboxilcsoportjának módosításával.

A jelen találmány olyan LHRH analógokkal foglalkozik, amelyek jelentős agonista vagy antagonista aktivitásúak és citotoxikus oldallánccal rendelkeznek, mint például kínon szerkezetű csoportok (előnyösen kis szénatom számú alkilcsoportokkal szubsztituált naftokinonok és antrakinonok), alkiláló szerek, mint például mustár-nitrogének, három tagú gyűrűs csoportok, mint például ciklopropil-, aziridinil- és epoxicsoport, tumor3

HU 208 159 Β ellenes antitestek és antimetabolitok, mint például metotrexoil. A vegyületek többsége szignifikánsan gátolja különböző humán emlő sejtvonalak növekedését sejtkultúrákban.

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű peptidek - ahol

R¹ jelentése pGlu vagy D-Nal (2),

R² jelentése His vagy D-Phe (4C1),

R³ jelentése Trp, D-Trp vagy D-Pal (3),

R⁵ jelentése Tyr vagy Arg,

R⁶ jelentése D-Lys vagy D-Orn,

R¹⁰ jelentése Gly vagy D-Ala,

X¹ jelentése rövid szénláncú 2-5 szénatomos alkanoilcsoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu,

Q jelentése -Q⁴ vagy -A(Q³) vagy -B(Q')2 vagy —B(AQ²)2 általános képletű csoport, ahol A jelentése -CO-(CH₂)_n-NH- vagy

-CO-(CH₂)_n-CO- csoport, ahol n jelentése 2-6, B jelentése -CO-(CH₂)_n-CH(NH)-(CH₂)_m-NHI csoport, ahol m jelentése 0 vagy 1 és n jelentése 0 vagy 1, az A és B jelentésében szereplő CO-csoportok az

R⁶ csoporton található aminocsoporthoz kötődnek, és a B(AQ²)₂ csoport esetében az A csoport CO-csoportja a B csoport aminocsoportjához kötődik,

Q¹ jelentése D- vagy L-Mel vagy ciklopropán-karbonil-csoport,

Q² jelentése felöleli Q¹ jelentését és jelenthet továbbá antrakinon-2-metoxi- vagy doxorubicinil-csoportot,

Q³ jelentése felöleli Q² jelentését és jelenthet továbbá metotrexoil-csoportot,

Q⁴ jelentése felöleli Q¹ jelentését, továbbá jelenthet metotrexoil-csoportot és gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sói előállítására oly módon, hogy

a) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése Q⁴ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (Via) általános képletű pepiidet

- a képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-Q⁴ általános képletű vegyülettel - a képletben Q⁴ jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk,

b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése AQ³ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VI) általános képletű pepiidet

- a képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-AQ³ általános képletű vegyülettel - a képletben A és Q³ jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk,

c) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése AQ³ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VII) általános képletű pepiidet

- a képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és A, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R'° jelentése a fentiekben megadott, egy Y-Q³ általános képletű vegyülettel - a képletben Q³ jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk,

d) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése B(Q’)₂ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VIII) általános képletű pepiidet - a képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoil-csoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és B, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-Q¹ általános képletű vegyülettel - a képletben Q¹ jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport reagáltatunk,

e) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése B(AQ²)₂ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VIII) általános képletű pepiidet - a képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoil-csoport vagy hidrogénatom, amennyiben R^l jelentése pGlu csoport és B, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-AQ² általános képletű vegyülettel - a képletben A és Q² jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport

- reagáltatunk, kívánt esetben a kapott pepiidet tisztítjuk és kívánt esetben a kapott pepiidet gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sójává alakítjuk.

Az (I) általános képletű vegyületeket előállíthatjuk szilárd fázisú technikák és klasszikus (oldószeres) szintézisek kombinációjával.

Az (I) általános képletű vegyületeket előnyösen az alábbi (VI) általános képletű intermedier peptidekből állíthatjuk elő:

X-R¹-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶-Leu-Arg-Pro-R¹⁰-NH₂ (VI)

A (VI) általános képletű peptideket az alábbi (VIA) általános képletű peptidek védőcsoportmentesítésével kapjuk meg:

X¹ -R¹ -R²(X²)-R³-Ser(X⁴)-R⁵-R⁶-(X⁶)-Leu-Arg(X⁸)Pro-R'-NH-X¹⁰ (VIA) ahol

R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott

X¹ jelentése egy 2-5 szénatomos acilcsoport vagy amennyiben R¹ jelentése pGlu, akkor X¹ jelentése hidrogénatom,

X₂ jelentése hidrogénatom vagy a His imidazol nitrogénjének egy védőcsoportját jelenti,

X⁴ jelentése hidrogénatom vagy a Ser hidroxilcsoportjának egy védőcsoportját jelenti,

X⁵ jelentése hidrogénatom vagy a Tyr fenolos hidroxilcsoportjának egy védőcsoportját vagy az Arg guanidinocsoportjának egy védőcsoportját jelenti,

X⁶ jelentése hidrogénatom vagy a Lys vagy Om védőcsoportját jelenti,

X⁸ jelentése hidrogénatom vagy az Arg guanidinocsoportjának egy védőcsoportját jelenti,

X¹⁰ jelentése hidrogénatom vagy egy gyantába beépített benzhidrilcsoport.

HU 208 159 Β

A (VIA) általános képletű peptideket előnyösen szilárd fázisú eljárással állítjuk elő.

Az alábbi (VII) általános képletű peptideket a (VI) általános képletű peptideknek A-val történő acilezésével kapjuk

X¹ -R¹ -R²-R³-Ser-R⁵-R⁶(A)-Leu-Arg-ProR'°-NH₂ (VII)

- ahol X¹, R¹, R², R³, R⁵, R⁶, R^!0, X¹⁰ és A jelentése a fentiekben megadott jelentés.

A (VI) általános képletű vegyületeknek egy megfelelően védett B-vel végzett acilezésével, majd ezt követő védőcsoport mentesítésével kapjuk az alábbi (VIII) általános képletű peptideket:

X¹-R’-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶(B)-Leu-Arg-ProR‘°-NH2 (VIII)

- ahol X¹, R¹, R², R³, R⁵, R⁶, R¹⁰ és B jelentése a fentiekben megadott.

Egy másik megfelelő eljárás szerint a (VIII) általános képletű intermedier peptideket megkaphatjuk az alábbi (VIIIA) általános képletű intermedier peptidek védőcsoport mentesítésével:

X¹-R’-R²(X²)-R³-Ser(X⁴)R⁵(X⁵)[B(X⁶)₂]-Leu-Aig(X⁸)-Pro-R¹⁰NH-X¹⁰ (VIIIA)

-ahol X⁶ jelentése hidrogénatom vagy a diaminosav oldallánc védőcsoportja, R¹, R², R³, R⁵, R⁶, R¹⁰, A, X¹, X², X⁴, X⁵, X⁶, X⁸ és X¹⁰ jelentése a fentiekben megadott -, melyet a (VIA) általános képletű intermedier peptidek előállítására alkalmazott szilárd fázisú eljárással állítunk elő, azzal az eltéréssel, hogy egy megfelelően védett R⁶[B(X⁶)₂] van beépítve a 6-os pozícióban védett R⁶(X⁶) csoport helyére.

Olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, ahol Q jelentése B(Q *)₂ egy (VIII) általános képletű pepiidet reagáltatunk például egy N-védett aminosavval, egy alkil- vagy alkanoil-halogeniddel, például Boc-D- vagy Boc-L-Mel vagy ciklopropán-karbonil-klorid. Másképp eljárva a (VI) általános képletű vegyületeket előállíthatjuk az (I) általános képletű peptideknek egy előre kialakított B(Q’)₂ csoporttal való kapcsolással - a képletben B és Q jelentése a fentiekben megadott.

Olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, amelyeknél Q jelentése B(AQ²)2·, egy (VIII) általános képletű pepiidet egy előre kialakított (AQ²) csoporttal kapcsoljuk - a képletben A és Q² jelentése a fentiekben megadott. Más úton eljárva azon (I) általános képletű vegyületeket, ahol Q jelentése B(AQ²)2, előállíthatjuk egy (VIII) általános képletű peptidnek először egy A csoportot tartalmazó acilezőszerrel, majd ezt követően például Boc-D-vagy Boc-L-Mel; 2-hidroxi-metil-antrakinon vagy doxorubicinnal végzett reagáltatásával.

Olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, ahol Q jelentése A(Q³), egy (VI) általános képletű peptid D-Lys oldalláncát meghosszabbítjuk egy omegaamino-alkánsav vagy egy ct,omega-dikarbonsavval, majd ezt követően végezzük a kapcsolást, melyet végrehajthatunk például 2-hidroxi-metil-antrakinon, doxorubicin, vagy metotrexát reagenssel. Más úton eljárva az olyan (I) általános képletű vegyületeket, ahol Q jelentése A(Q³), előállíthatjuk a (VI) általános képletű peptidnek egy előre kialakított A(Q³) csoporttal való reagáltatásával - a képletben A és Q jelentése a fentiekben megadott.

Olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, ahol Q jelentése Q⁴ csoport, egy (VI) általános képletű pepiidet reagáltathatunk például D-Mel, BocD- vagy Boc-L-Mel, ciklopropán-karbonil-klorid vagy metotrexát reagenssel. Előnyösen a reakciót úgy hajtjuk végre, hogy X¹ jelentése hidrogéncsoport vagy egy 2-5 szénatomos alkanoilcsoport, míg az összes többi X csoport hidrogénatomot jelent.

Egy találmány szerinti gyógyászati készítményt állíthatunk elő az (I) általános képletű vegyületnek gyógyászatilag elfogadható hordozóval való összekeverésével, amely hordozó magába foglalja a mikrokapszulákat (mikrogömböket) vagy mikrogranulátumokat (mikrorészecskéket) is, melyek poli-(DL-laktidco-glikolid)-ból készülnek elnyújtott hatástartamú készítmények előállítása esetén.

A találmány leírásának megkönnyítése végett az aminosavak, peptidek és származékaik szokásosan alkalmazott rövidítéseit alkalmazzuk, ahogy azok a peptid kémiában használatosak és az IUPAC-IUB biokémiai nómenklatúrával foglalkozó bizottság által meghatározott [European J. Biochem., 138,9-37 (1984)].

Az egyes aminosavcsoportoknak a rövidítései a megfelelő aminosav triviális nevén alapszik, lásd pl. pGlu piroglutaminsavat, His hisztidint, Trp triptofánt, Ser szerint, Tyr tirozint, Lys lizint, Om ornitint, Leu leucint, Arg arginint, Pro prolint, Gly glicint, Alá alanint és Phe fenil-alanint jelent. Ahol az aminosav-csoportok izomer formákkal rendelkeznek, az aminosav L-formájú, hacsak másképpen nincs jelölve.

A jelen találmányban alkalmazott nem szokásos aminosavaknak a rövidítése a következő:

D-Mel: 4-[bisz-(2-klór-etil)-amino-D-fenilalanint,

A₂pr: 2,3-diamino-propionsavat,

D-Nal(2): 3-(2-naftil)-D-alanint,

D-Pal(3): 3-(3-piridil)-D-alanint és D-Phe(4Cl): 4-klór-D-fenil-alanint jelent.

A peptid szekvenciákat aszerint a megállapodás szerint jelöljük, hogy az N-terminális aminosav a bal oldalon, és a C-terminális a jobb oldalon helyezkedik el. További rövidítések:

AcOH ecetsav

Ac₂0 ecetsavanhidrid

Ahx 6-amino-hexanoil-csoport

Boc terc-butoxi-karbonil-csoport

Bzl benzil-csoport

CPC ciklopropán-karbonil-csoport

DCB 2,6-diklór-benzil-csoport

DCC N,N’-diciklohexil-karbodiimid

DCM diklór-metán

DIC N,N’-diizopropil-karbodiimid

DMF dimetil-formamid

DOX doxorubicin (adriamicin)

Glt glutaroil-csoport

HMAQG 2-hidroxilmetil-antrakinolin-csoport

HOBt 1-hidroxi-benzotriazol

HOPCP pentaklór-fenol

HPLC nagynyomású folyadékkromatográfia

HU 208 159 Β

MeCN	acetonitril
MTX	metotrexoil-csoport (ametopterin-csoport)
TEA	trietil-amin
TFA	trifluor-ecetsav
THF	tetrahidrofurán
Tos	4-toluol-szulfonil-csoport
Z(2-C1)	2-klór-benziloxi-karbonil-csoport
z	benziloxi-karbonil-csoport.

Különösen előnyösek az alábbi (I) általános képletű LHRH-analógok:

X-R¹-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶(Q)-Leu-Arg-Pro-R¹⁰-NH₂ ahol

R¹ jelentése D-Nal (2),

R² D-Phe (4C1),

R³ jelentése D-Trp D-Pal (3),

R⁵ jelentése Tyr vagy Arg,

R⁶ jelentése D-Lys,

R¹⁰ jelentése D-Ala,

X jelentése acetilcsoport, továbbá peptid széria, ahol R¹ jelentése pGlu,

R² jelentése His,

R³ jelentése Trp,

R⁵ jelentése Tyr,

R⁶ jelentése D-Lys vagy D-Orn,

R¹⁰ jelentése Gly és X jelentése hidrogénatom,

Q jelentése Q⁴ vagy A(Q³) vagy B(Q*)2 vagy B (AQ²)2 képletű citotoxikus csoport, ahol

A jelentése 6-amino-hexánsav vagy glutársav-csoport, B jelentése A₂pr,

Q² jelentése Q¹, antrakinon-2-metoxi- vagy doxorubicinil-csoport,

Q³ jelentése Q² vagy metotrexoil-csoport,

Q⁴ jelentése Q¹ metotrexoil-csoport.

A legelőnyösebb peptidek a következők:

1. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-ArgPro-Gly-NH₂

2. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-ProGly-NH₂

3. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(HMAQG)-LeuArg-Pro-Gly-NH₂

4. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(MTX)-Leu-ArgPro-Gly-NH₂

5. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(D-Mel)₂]Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

6. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(CPC)₂]-LeuArg-Pro-Gly-NH₂

7. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(HMAQG)₂]Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂NH₂

8. Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(D-Mel)-Leu-ArgPro-Gly-NH₂

9. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(CPC)-Leu-ArgPro-Gly-NH₂

10. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(HMAQG)-LeuArg-Pro-Gly-NH₂

11. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(MTX)-Leu-ArgPro-Gly-NH₂

12. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[A₂pr(D-Mel)₂]Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

13. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[A₂pr(CPC)₂]-LeuArg-Pro-Gly-NH₂

14. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[A₂pr(HMAQG)₂]Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂

15. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl-D-Tr-Ser-Tyr-D-Lys(DMel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

16. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-DLys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

17. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-DLys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

18. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-DLys(MTX)-Leu-Arg19. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

20. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

21. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-O-Ala-NH₂

22. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

23. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys[A₂pr(D-Mel)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

24. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys[A₂pr(CPC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

25. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys[A₂pr(HMAQG)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

26. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

27. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala28. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-Ala29. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala30. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys[A₂pr(D-Mel)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

31. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys[A₂pr(CPC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

32. Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys[A₂pr(HMAQG)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂

33. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Glt-DOX)-LeuArg-Pro-Gly-NH₂

34. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Ahx-MTX)-LeuArg-Pro-Gly-NH₂

A találmány szerinti peptideket alkalmazhatjuk gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sóik formájában. Ezekre a savaddíciós sókra példaként említjük a hidrogén-klorid-, hidrogén-bromid-, szulfát-, foszfát-, fumarát-, glukonát-, tannál·, maleát-, acetát-, citrát-, benzoát-, szukcinát-, alginát-, pamoát-, maleát-, aszkorbát-, tartarát- és hasonló sóikat.

A fenti sókat önmagában ismert módon állíthatjuk elő, előnyösen úgy, hogy a pepiidet savas pH-értéken érintkezésbe hozzuk a fenti anionok valamelyikét tartalmazó, jól disszociáló sóval (általában alkáli- vagy alkáliföldfém sót alkalmazunk), és a képződő savaddíciós sót önmagában ismert módon elválasztjuk.

A találmány szerinti peptideknek poli-(DL-laktidco-glicolid)-ből készített mikrokapszulái és mikrorészecskéi előnyösek, amennyiben lassú hatóanyagkibo6

HU 208 159 B csátású rendszereket készítünk. Izotóniás só, foszfát puffer oldatoknak intravénás adagolása, illetve hasonló megoldás is alkalmazható.

A gyógyászati készítmények a peptideket általában egy szokásosan alkalmazott gyógyászatilag megfelelő hordozóval kapcsolva tartalmazzák. A dozírozás általában 1-100 mikrogramm peptid/testsúlykg, amennyiben intravénás adagolást alkalmazunk. Általában a találmány szerinti peptidekkel végzett kezelést hasonlóan végezzük, mint ahogy azt más LHRH antagonisták és agonisták esetében a klinikumban teszik.

A találmány szerinti peptideket adagolhatjuk emlősöknek intravénásán, szubkután, intramuszkulárisan, intranazálisan vagy intravaginálisan, hogy elérjük a megfelelő tumorellenes hatást. A hatásos mennyiség változik az adagolás formájától és a kezelt emlős érzékenységétől függően. Egy tipikus dózisforma az, amelynél a pepiidet egy fiziológiai sóoldat tartalmazza és az adagolás 0,1-2,5 mg/testsúlykg dózist eredményez.

Megjegyezzük, hogy habár a találmány az előnyös megjelenési formákon keresztül kerül leírásra, tudni való, hogy a szakterületen járatos szakember számára változtatások és módosítások hajthatók végre anélkül, hogy a találmány oltalmi körét elhagynánk.

A találmány szerinti vegyületek hatékonyan befolyásolják a hipofízis gonadotropin kibocsátó képességét, tumoros sejtek membránjaihoz kötődnek és gátolják a [(³H)]-timidinnek a DNS sejtkultúrákba való beépülését.

A találmány szerinti vegyületek hatásosságát az alábbi módszerekkel vizsgáltuk.

(a) LH-kibocsátás és LHRH-inhibitáló aktivitás

Az LH kibocsátó képesség in vitro vizsgálatánál erősen fuzionált hipofízis sejtrendszert alkalmazunk [S. Vigh és A. V. Schally, Peptides 5. Suppl. 7, 241-247 (1984); V. Csernus és A. V. Schally, Neuroendocrine Research Methods, B. Greenstein kiadó, Harwood Academic Publishers, London, 1990)].

A vegyületek LH-kibocsátó hatását az alábbiak szerint határoztuk meg:

Minden egyes pepiidet sejteken át perfuzáltatunk 3 percen át (1 ml perfuzátum) 20-100 pM-n. Az összegyűjtött 1 ml-es frakciók LH-tartalmát radioimmunvizsgálattal [radioimmunoassay (RIA)] határoztuk meg. A peptidek hatékonyságát hasonló módon perfuzált 3 nM LHRH-hoz hasonlítottuk.

A peptidek LHRH inhibitáló hatását az alábbiak szerint vizsgáltuk. Minden egyes pepiidet sejteken át perfuzáltatunk 9 percen át (3 ml perfuzátum) 1 nM-en. Közvetlenül ezt követően egy, a peptidet és 3 nM LHRH-t tartalmazó keveréket adagolunk 3 percen át. Ezt követően 3 nM LHRH-t tartalmazó 3 perces infúziót (1 ml perfuzátum) alkalmazunk 30 perces intervallumokban (30, 60, 90, 120 perc). Az 1 ml-es frakciók LH-tartalmát RIA módszerrel határozzuk meg.

(b) In vivő antiovuláns aktivitás

A peptidek ilyen jellegű aktivitását 4 napos ciklusidejű patkányokon határoztuk meg [A. Corbin és C. W. Beattie, Endocr. Rés. Commun., 2, 1-23 (1975)].

(c) Receptorhoz való kötődés

A peptideknek humán tüdőrák sejtmembránokhoz való affinitását címképezett LHRH és [D-Trp⁶]LHRH alkalmazásával határoztuk meg. A vizsgálatot az alábbi műben leírtakhoz hasonló módon hajtottuk végre: T. Kadar és tsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 890-894 (1984) és M. Fekete és tsai, Endocrinology, 124, 946955 (1989).

(d) Citotoxicitási teszt

Az (I) általános képletű peptideknek a [³H]-timidinnek MCF-7 humán emlőrák sejtvonal egyrétegű kultúrájának DNS-ébe való beépítődését az alábbi műben leírtak szerint hajtottuk végre: V. K. Sondak és tsai, Cancer Research, 44, 1725-1728 (1984); E Holzel és tsai, J. Cancer Rés. Clin. Oncol. 709, 217-226 (1985); M. Albert és tsai, J. Cancer Rés. Clin. Oncol. 709, 210-216(1985).

A találmány szerinti peptideket előállíthatjuk bármely, a peptid kémiában ismert módszer alkalmazásával. Ezen módszerek összefoglalása található a következő műben: M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Heidelberg, 1984. A klaszszikus oldatos szintézist részletezi a következő mű: „Methoden dér Organische Chemie” (Houben-Weyl), 15. kötet, Synthese von Pepiiden, I. és II. rész, Georg Thieme kiadó, Stuttgart, 1974. A kifejezetten szilárd fázisú szintézis módszereket a következő könyv ismerteti: J. M. Stewart és J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (2. kiadás) és G. Bárány és tsai, Int. J. Peptide Protein Rés. 30,705-739, 1987.

A találmány szerinti alap peptidek szilárd fázisos eljárással lettek szintetizálva és csak a citotoxikus oldalláncok beépítése történt klasszikus eljárások szerint. A szilád fázisú szintézis során egy megfelelően védett aminosavakat (néha védett peptideket) adunk lépésenként C—> N irányban, miközben az aminosav C-terminálisa megfelelően rögzítve van egy inért szilárd hordozóhoz (gyantához). A kapcsolódási lépés teljessé válása után az N-terminális védőcsoportot az újonnan hozzáadott aminosav csoportról eltávolítjuk, majd a következő aminosavat (megfelelően védett) adagoljuk, és ezt folytatjuk tovább. Miután az összes kivált aminosavat a megfelelő sorrendben összekapcsoltuk, a peptidet lehasítjuk a hordozóról és a jelen lévő egy vagy több csoportot olyan körülmények között távolítjuk el, mely a legkevésbé roncsoló a szekvenciára nézve. Ezt követően az előállított terméket körültekintően tisztítjuk és gondosan ellemezzük, hogy megbizonyosodjunk hogy a kívánt szerkezetet valóban előállítottuk.

A találmány szerinti vegyületek előállításának egy különösen előnyös megoldása a szilárd fázisú szintézis és az azt követő oldatban végrehajtott citotoxikus oldallánc beépítés. Azokat az (I) általános képletű peptideket, ahol R⁶ jelentése szubsztituált D-Lys vagy D-Orn, előnyösen az alábbi (VIA) általános képletű intermedier peptidek felhasználásával állítjuk elő:

HU 208 159 Β

X¹ -R¹ -R²(X²)-R³-Ser(X⁴)-R⁵(X⁵)-R⁶(X⁶)-Leu-Arg(X⁸)Pro-R¹⁰-NH-X‘°

- ahol

R¹, R², R³, R⁵, R⁶, R¹⁰ és X¹ jelentése a fentiekben megadott,

X² jelentése p-toluol-szulfonil- vagy 2,4-dinitro-fenil védőcsoport, ha R² jelentése His és jelentés nélküli, ha R² jelentése D-Phe(4Cl),

X⁴ jelentése a szerin hidroxilcsoportjának egy védőcsoportja, mint például benzil (Bzl) vagy 2,6-diklór-benzil (DCB). Előnyös védőcsoport a Bzl,

X⁵ jelentése benzil, 2-Br-benziloxi-karbonil vagy DCB (előnyös) a fenolos hidroxilcsoport védelmére, amikor R⁵ jelentése Tyr, vagy a Tos (előnyös), nitro vagy metil-(t-butil-benzol)-szulfonil a guanidinocsoport védelmére, amennyiben R⁵ jelentése Arg,

X⁶ jelentése a Lys vagy Om oldallánci aminocsoportjának egy védőcsoportja, mint például Z, Z(2-klór) (előnyös),

X⁸ jelentése egy az Arg védelmére megfelelő csoport, mint például metil-(t-butil-benzol)-szulfonil vagy Tos (előnyös),

X¹⁰ jelentése egy amidvédő benzhidril- vagy metilbenzhidril-csoport, amely a hordozó gyantába van beépítve; peptid amidok szintézise esetén a kereskedelemből beszerezhető bezhidril-aminopolisztirén-2% divinil-benzol kopolimer alkalmazható előnyösen.

A (VIA) általános képletű peptidek szilárd fázisú szintézisét Boc védett Gly-nek vagy D-Ala-nak benzhidril-amin gyantával való kapcsolódásával indítjuk el CH₂C1₂ közegben. A kapcsolódást DIC vagy DIC/HOBt alkalmazásával a környezet hőmérsékletén hajtjuk végre. A Boc csoport eltávolítása után az egymást követő védett aminosavak kapcsolását (mindegyiket háromszoros moláris feleslegben alkalmazzuk) CH₂C1₂ vagy DMF/CH₂C1₂ keverékben hajtjuk végre a Boc-aminosav oldékonyságától függően. Minden .fázisban a kapcsolódási reakció sikerességét előnyösen a ninhidrin teszttel követhetjük [lásd Kaiser és tsai Anal. Biochem. 34, 595 (1970)]. Amennyiben nem teljes a kapcsolódás a kapcsolási eljárást megismételjük azelőtt, hogy az alfa-amino védőcsoportot eltávolítanánk a következő aminosav reakciójához.

Miután a (VIA) általános képletű intermedier peptidek megfelelő szekvenciáját felépítettük, kívánt esetben az N-terminálist acetilezhetjük Ac₂-O/imidazol alkalmazásával és a peptid gyantát ezt követően folyékony HF-fel kezeljük anizol jelenlétében és így kapjuk a (VI) általános képletű peptideket.

Az előzőekben ismertetetteken kívül alábbi (VII) általános képletű peptideket megkaphatjuk a (VI) általános képletű peptideknek vagy glutársav-anhidriddel való acilezésével vagy Boc-6-amino-hexánsavval végzett kapcsolással, majd ezt követő védőcsoport-eltávolítással is: X¹ -R¹ -R²-R³-Ser-R⁵-R⁶A)-Leu-Arg-ProR‘°-NH₂ (VII) ahol

X¹, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, és A jelentése glutaril- vagy amino-hexanoilcsoport.

Az előzőekben ismertetetteken kívül (VI) általános képletű peptideknek Boc védett diamino-alkánsavval, előnyösen 2,3-diamino-propánsavval végzett acilezésével, majd ezt követő védőcsoport eltávolításával kaphatjuk az alábbi (VIII) általános képletű peptideket: X'-R¹-R²-R³-Ser-R⁵-R⁶(B)-Leu-Arg-Pro-R¹⁰-NH₂ (VIII) ahol X¹, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, és B jelentése diamino-alkanoil-, előnyösen 2,3-diaminopropionil-csoport.

Egy alternatív szintézisút szerint a (VIII) általános képletű peptideket megkaphatjuk a (VI) általános képletű peptideknél alkalmazott szilárd fázisú eljárással, de egy megfelelően védett R⁶(B) csoportot, előnyösen Boc-R⁶[B(Z2)] csoportot építünk be a 6-os pozícióba a Boc-R⁶X⁶ csoport helyett.

Azon (I) általános képletű vegyületeket, ahol a Q csoport jelentése B(Q’)₂ a (VIII) általános képletű intermedier peptidekből állítjuk elő Boc-D vagy Boc-LMel-OPCP vagy Trt-Azy-nal végzett acilezéssel. Ciklopropán-alkanoil-halogenideket előnyösen ciklopropán-karbonil-kloridot alkalmazva kapjuk a (CPC)₂-t tartalmazó analógokat.

Azokat az (I) általános képletű vegyületeket ahol Q jelentése B(Q')₂ csoport, alternatív úton állíthatjuk a (VI) általános képletű peptideknek egy előre kialakított B (Q¹ )₂ résszel való kapcsolásával - a képletben B és Q jelentése a fentiekben megadott -, például a karbodiimid reakció alkalmazásával.

Azokat az (I) általános képletű vegyületeket ahol Q jelentése B(AQ²)₂, előnyösen előállíthatjuk a (VIII) általános képletű intermedier peptidek és 2-hemiglutaroil-oxi-metil-antrakinon-karbodiimiddel végzett öszszekapcsolásával.

Olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, ahol Q jelentése A(Q³) csoport mitomicin C, MTX vagy doxorubicin vegyületeket kötünk a (VII) általános képletű intermedier peptidekhez karbodiimid reakció segítségével. Az (I) általános képletű vegyületeknek egy másik csoportját, ahol Q jelentése A(Q³) előállíthatunk egy előre kialakított A(Q²) rész (2-hemiglutaroil-oxi-metil-antrakinon vagy hemiglutaroileszperamicin) (VI) általános képletű peptidekkel végrehajtott karbodiimid reakciójával.

A (VI) általános képletű peptideket átalakíthatjuk Q helyén Q⁴ csoportot hordozó (I) általános képletű peptidekké karbodiimid kapcsolásos reakcióval 1,1 mól ekvivalens Trt-Azy, MTX alkalmazásával, vagy BocD- vagy Boc-L-Mel-OPCP vegyületekkel való reagáltatással. A (VI) általános képletű peptideket ciklopropán-karbonil-kloriddal acilezve kapjuk a CPC csoporttal rendelkező analógokat.

A nyers szintézis terméket (>500 mg) BECKMAN Prep-350 preparatív HPLC rendszerrel tisztítottuk, amely gömb alakú Cl8 szilikagéllel (pórusméret 300 A, részecskeméret 12 μτη) (RAININ Inc., Co., Wobum, MA) töltött DYNAMAX MACRO oszloppal (41,4x250 mm) (A oszlop). Kisebb mennyiségű pepiidet (>250 mg) BECKMAN HPLC rendszeren (Model

HU 208 159 B

142) tisztítunk az előzőekben megegyező töltettel rendelkező DYANAMAX MACRO 921,2x250 mm) oszlopot alkalmazva (B eljárás). 50 mg-nál kisebb tömegű terméket reverz fázisos tisztításnak vetünk alá 10x250 mm VYDAC Protein & Peptide C₁₈ oszlopon (pórusméret 300 A, részecskeméret 5 pm) (ALTECH, Deerfield, IL) (C oszlop), vagy 10x250 mm-es W-POREX C₁₈ oszlopot (pórusméret 300 A, részecskeméret pm) (Phenomenex, Rancho Pálos Verdes, CA) (D oszlop) alkalmazva. Az oszlopok eluálására vagy az i) jelű oldószert alkalmaztuk, amely (A) 0,1% vizes TFA-t tartalmaz és (B) 70%-os vizes acetonitrilben készült 0,1 %-os TFA-t tartalmaz, vagy az ii) jelű oldószerrendszert alkalmaztunk, amely (A) 0,2%-os vizes ecetsavat és (B) 70%-os acetonitrilben készült 0,2%-os ecetsavat tartalmaz. Az eluálás alatt általában gradiens módszert alkalmaztunk. Az eluenst 230 vagy 280 mnen működő UV detektorral vizsgáltuk. A kromatografálást a környezet hőmérsékletén hajtottuk végre.

A nyers és tisztított peptidek analitikus HPLC analízisét egy Hewlett-Packard 1090 jelű folyadékkromatográffal vizsgáltuk, amely 220 és 280 nm-en működő dióda detektorral és 4,6x250 mm-es W-POREX C₁₈ reverz fázisú oszloppal (pórusméret 300 A, részecskeméret 5 pm) (E oszlop) volt ellátva. 1,2 ml/perces átáramlást és az i) oldószer rendszert alkalmaztuk. Az elválasztást szobahőmérsékleten hajtottuk végre. Aminosav-analízis céljából a peptidmintákat 110 °C-on 20 órán át vákuum alatt lepecsételt tubusokban hidrolizáltuk, mely tubusok 4 mól/liter metán-szulfonsavat tartalmaznak. Az analízist Beckman 6300 aminosav-analizátorral hajtuttuk végre.

/. előállítás

Boc-D-Mel-OPCP

D-4-[bisz-(2-klór-etil)-amino]-fenil-alanint (D-Mel, 5 mmól) Boc származékává alakítva át az L izomernél leírt módon [H. Kun-hwaés G, R. Marshall, J. Med. Chem. 24, 1304-1310 (1981)], azzal az eltérései, hogy acilezőszerként di-t-butil-dikarbonátot alkalmazunk Boc-azid helyett. Az olajos terméket, a Boc-D-Mel-t THF-ben (10 ml) oldjuk és 0 °C-ra hűtjük. A kevert oldathoz pentaklórfenolt (5,25 mmól) és DIC-t (6,5 mmól) adagolunk. 10 perces keverést követően a reakciókeveréket szűrjük, a kapott szűrőpogácsát THF-fel (2x5 ml) mossuk, majd a szűrletet kis térfogatra (5 ml) pároljuk be. 10 ml etanolt adagolunk, majd a kristályokat 2 órás hűtést (0 °C) követően elválasztjuk. Az így kapott Boc-D-Mel-OPCP (kb. 3,4 mmól) 138-140 °C-on olvad.

II. előállítás pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-GlyNH2 (IIA) és pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-GlyNH₂ (IIB) [D-Lys]⁶LHRH-t [N, C. Nicholas és tsai, J. Med. Chem., 19 937-941 (1976)] és [D-Orn]⁶LHRH-t építünk fel lépésenként benzhidril-HCl gyantán, amely 1 millimól ekvivalens (mekv.) NH₂/g benzhidril-HCl gyantán, amely 1 millimól ekvivalens (mekv.) NH₂/g tartalmaz (Advanced ChemTech, Louisville, KY). A reakciót egy Boc-Gly-val indított, manuálisan végzett szilárd fázisú szintézisre alkalmas reakcióedényben hajtjuk végre az alábbi eljárás szerint.

A benzhidril-amin-HCl gyanta (1 g, kb. 1 mmól) CH₂Cl₂-ben készült 10%-os TEA oldattal végzett semlegesítését követően a következő táblázatban felsorolt védett aminosavakat kapcsoljuk egymást követően 3 mólnyi felesleget alkalmazva a reagensekből.

Lépés	Reagensek és műveletek	keverési idők (perc)
1.	Kapcsolás: Boc-amino-sav DCM-ben vagy DMF-ben, a különféle védett aminosavak oldékonyságától függően, TDIC	60-90
2.	MeOH (vagy DMF majd MeOH) mosás	2
3.	DCM mosás	2
4.	MeOH mosás	2
5.	DCM mosás (háromszor)	2
6.	Védőcsoport eltávolítás: 50%-os TFA DCM-ben (kétszer)	5 és 25
7.	DCM mosás	2
8.	2-propanol mosás	1
9.	Semlegesítés: 10%-os TEA, DCM-ben	2
10.	MeOH mosás	1
11.	Semlegesítés: 10%-os TEA, DCM-ben	2
12.	MeOH mosás	1
13.	DCM mosás (háromszor)	2

A fentiek szerint eljárva a gyantát a következő vegyületekkel kezeljük egymást követő kapcsolási lépésekben: Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-D-Lys[Z(2-Cl)], Boc-Tyr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Trp, Boc-His(Tos) és pGlu.

így kapjuk a következő peptid-gyantát: pGlu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(DCB)-D-Lys[Z(2Cl)]Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH-GYANTA.

Amennyiben Boc-D-Om(Z)-t alkalmazunk Boc-DLys[Z(2-Cl)] helyett a következő szerkezetű peptidgyantát kapjuk:

pGlu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(DCB)-D-Om-(Z)Leu-Arg(Tos)-Pro-Gly-NH-GYANTA.

Az így kapott peptid-gyantát 2 ml anizollal és 20 ml HF-fel kezeljük 0 °C-on 45 percen át. A HF-nek vákuum alatt történő eliminálását követően a peptid-gyanta maradékot száraz dietil-éterrel mossuk. Ezt követően a pepiidet 50%-os vizes ecetsavval extraháljuk, majd a gyantát szűréssel eltávolítjuk és a pepiidet liofilizáljuk.

A nyers pepiidet (860 mg, 725 mg) A jelű oszlopon tisztítjuk az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva, amelynél a B komponens 10-40% között mozog.

HU 208 159 B

A tisztítást 60 percen át 30 ml/perc áramlással végezzük. Alkalmazott hullámhossz 230 nm.

A tisztított peptidek gyakorlatilag tisztának (>96% tisztaság) mutatkoztak analitikai HPLC módszerrel vizsgálva, melynél i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmaztunk (B: 15-35%, 20 perc).

11,3 perc és 10,4 perc volt a két retenciós idő. Aminosav analízis a várt eredményt adta.

III. előállítás pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(A₂pr)-Leu-Arg-ProGly-NH₂ (IIIA) és pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-OrníAiprj-Leu-Arg-ProGly-NH₂ (IIIB)

Boc₂A₂pr (60,6 mg) DMF-ben (1 ml) készült oldatát 0 °C-ra hűtjük, majd pentaklór-fenolt (60 mg) és 35 pliter DIC-t adunk az elegyhez, majd a keveréket 1 órán át keverjük. [D-Lys]⁶LHRH (319 mg TFA-só) DMF-ben (0,5 ml) készült oldatát TEA-val (81 μΐ) semlegesítjük, majd az elegyet az előzőekben előállított aktív észter oldathoz öntjük. A reakciókeveréket 2 órán át 0 ’C-on keverjük. Vákuumban végzett töményítést követően az olajos maradékot 0,1 %-os TFA-ban és dietil-éterben oldjuk, majd a fázist a B jelű oszlopon HPLC tisztításnak vetjük alá az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva (B: 20-60%, 60 perc). A nyers Boc-védett peptidet DCMben készült 30%-os TFA-val kezeljük és így kapjuk a [DLys(A₂pr)(⁶]LHRH (IIIA) TFA sóját (251 mg).

A fentiekhez hasonló módon eljárva, de [DOm]⁶LHRH TFA sóját alkalmazva kiindulási anyagként kapjuk a IIIB jelű anyagot (202 mg).

A IIIA és IIIB peptid HPLC retenciós ideje 12,2 perc, illetve 11,2 perc volt az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva (B: 15-35%, 20 perc).

IV. előállítás

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-LysLeu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂(IV)

A IV peptid előállítását a II. előállításnál megadott táblázatban leírt eljárások alkalmazásával végrehajtott szilárd fázisú eljárással állítjuk elő. A szintézist Boc-DAla-nak 1,0 mekv. NH₂-t tartalmazó 1 grammnyi benzhidril-amin gyantával való kapcsolásával kezdjük. A dekapeptidet 9 egymást követő kapcsolási lépésben építjük fel a következő vegyületeket alkalmazva: Boc-Pro, BocLeu, Boc-Arg(Tos), Boc-Lys[Z(2-Cl)], Boc-Tyr(DCB), Boc-Ser(Bzl), Boc-Trp, Boc-D-Phe(4Cl), Boc-D-Nal(2) Az N terminális acetilezést 50-szeres feleslegben alkalmazott CH₂C1₂ oldatban készült ecetsavanhidriddel hajtjuk végre 30 perc leforgása alatt. A peptidet 1,5 ml m-krezol jelenlétében 15 ml HF-fel hasítjuk le a gyantáról, mely hasítást 30 percen át 0 ’C-on és 30 percen át szobahőmérsékleten végzünk. A HF eliminálását követően a peptid és gyanta keverékét dietil-éterrel mossuk, majd a peptidet DMF-fel extraháljuk. A DMF oldatot kis térfogatra töményítjük erős vákuumban, majd dietil-éterrel dörzsöljük el. Az így kapott nyers terméket a II. eljárásban leírt preparatív HPLC módszerrel tisztítjuk B-re nézve 40-70%-os lineáris gradienst alkalmazva (60 perc). A nyers peptid (837 mg) retenciós ideje

25,5 perc volt, az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva (B: 30-60%, 30 perc).

V. előállítás

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-LysLeu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (VA) és

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-LysLeu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (VB)

A VA és VB peptideket benzhidril-amin-HCl gyantán végzett szilárd fázisú technikával állítjuk elő a II. előállításnál megadott táblázatnak megfelelően.

így ^a gyantát (0,5 g, amely 0,5 mmól NH₂-t tartalmaz) 10 egymást követő kapcsolási lépésben kezeljük a következő vegyületekkel:

Boc-D-Ala, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), BocLys[Y(2-Cl)j, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzy), Boc-DPal(3), Boc-D-Phe(4Cl), Boc-D-Nal(2), végezetül Ac₁₂O/imidazollal végzett kezelést hajtunk végre, majd a peptid-gyantát HF-fel és anizollal kezeljük és így kapjuk a szabad D-Lys-t tartalmazó VA dekapeptidet (540 mg). A fentiekhez hasonló módon eljárva, de a

3. pozícióban Boc-D-Pal(3)-t építve be a Boc-D-Trp helyére, kapjuk a szabad D-Lys-t tartalmazó VB dekapeptidet (500 mg). A peptideket az A jelű oszlopon alkalmazzuk i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva (B: 20-60%, 80 perc).

A HPLC retenciós idők: 11,4, illetve 18,8 perc az VA, illetve VB vegyületre nézve, mikor az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazzuk (B: 30-50% 40 perc).

VI. előállítás

Boc-D-Lys(Z₂-A2pr)

Z₂-A-2-pr-ből (0,72 g) és etil-klór-formiátból (0,2 ml) TEA (0,28 ml) jelenlétében készült kevert anhidridnek DMF-ben készült oldatához Boc-D-Lys (0,5 g) és TEA (0,3 ml) 50%-os vizes DMF-ben (4 ml) készült oldatát adagoljuk keverés közben, 0 ’C-on 2 órán át végzett keverést követően a reakciókeveréket olajjá töményítjük csökkentett nyomás alatt, majd vízben és etil-acetátban oldjuk, miközben a közeget 1 mól/literes KHSO₄ oldattal savanyítjuk. A szerves fázist vízzel mossuk Na₂SO₄ fölött szárítjuk, majd vákuumban szárazra pároljuk. 1,1 g Boc-D-Lys(Z2-A₂pr)-t kapunk.

VII. előállítás

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLysíAtfij-Leu-Arg-Pro-D-Ala-Nl·^ (VIIA) és

Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLysíArfó-Leu-Arg-Pro-D-Ala-Nlf (VllB)

A VIIA és VIIB vegyületeket 1 mekv. NH₂/g tartalmú benzhidrid-amin-HCl gyantán (Advanced ChemTech, Louisville, KY) állítjuk elő lépésenként egy olyan reakcióedényben, amelyben az alábbiakban részletezett Boc-D-Al-val indított, manuálisan végrehajtott szilárd fázisú szintézist végrehajthatjuk.

A benzhidril-amin-HCl gyantát (1 g, kb. 1 mmól)

HU 208 159 Β

CH₂Cl₂-ben készített 10%-os TEA oldattal végzett semlegesítést követően 3 mólnyi feleslegben alkalmazott aminosavakkal kapcsoljuk a II. előállításban megadott táblázattal összhangban.

így ^a gyantát a következő vegyületekkel kezeljük: Boc-D-Ala, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-DLys(Z₂-A₂pr) (VI. előállítás), Boc-Arg(Tos), BocSer(Bzl), Boc-D-Pal(3), Boc-D-Phe(4Cl), és Boc-DNal(2). Miután a dekapeptid aminosav szekvenciája felépült, a terminális Boc csoportot eltávolítjuk és az N-terminálist tízszeres feleslegben alkalmazott Ac₂O-val és imidazollal acelezzük és így kapjuk a következő szerkezetű peptid-gyantát: Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-DPal(3)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys(Z₂A₂pr)-Leu-Arg(Tos)Pro-D-Ala-NH-GYANTA. A fentiekhez hasonló módon eljárva, de a Boc-D-Pal(3) helyére Boc-D-Trp-t beépítve a következő szerkezetű peptid-gyantát kapjuk: Ac-DNal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Ly-s(Z₂A₂pr)-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-GYANTA.

Az így kapott peptid-gyantát anizollal és HF-fel kezeljük, majd a nyers peptidet a IV. előállításnál megadott módon izoláljuk. Ezt követően a nyers peptidet (1,3 g) HPLC tisztításnak vetjük alá, melyet A jelű oszlopon, i) jelű lineáris gardiensű oldószer rendszert alkalmazva hajtunk végre (30-50% B, 60 perc).

Az így kapott VIIA és VIIB peptidek (705 mg és 780 mg) gyakorlatilag (>95%) tisztának mutatkoznak az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazása esetén (30-50% B, 20 perc). A két retenciós idő: 10,1 perc, illetve 17,5 perc.

Alternatív módon a VIIA és VIIB peptideket előállíthatjuk az VAés VB előállítás szerinti peptideknek a III. előállításáéi leírt módon Boc₂-A₂pr-rel végrehajtott acilezésével is. Tisztítást követően a Boc-védett peptideket 50%os DCM-ben készült TEA oldattal kezeljük, majd újra a fentiek szerint végrehajtott HPLC tisztításnak vetjük alá.

Vili. előállítás pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Ahx)-Leu-Arg-Pro-.

Gly-NPfl

160 mg [D-Lys]⁶LHRH-t DMF-ben (OÁ ml) oldunk, majd 3 mekv. TEA-val (42 μΐ) semlegesítjük, majd ezt követően Boc-Ahx-t (28 mg), DIC-t (20 μΐ) és HOBt-t (19 mg) adagolunk, majd a keveréket 0 °C-on 2 órán át keverjük. A Boc-védett peptidet dietil-éterrel végzett kicsapással izoláljuk, majd HPLC módszerrel tisztítjuk B jelű oszlopot és i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva (20-50% B, 60 perc). A védett peptideket tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és DCM-ben készült 30%-os TFA oldattal mossuk. B jelű oszlopon i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszerrel (10-30% B, 40 perc) végzett tisztítást követően 79 mg [D-Lys-Ahx]⁶LHRH-t kapunk. A VIII. előállítás szerinti peptid HPLC retenciós ideje 9 perc mikor az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazzuk (20-40% B, 20 perc).

IX. előállítás pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Glt)-Leu-Arg-ProGly-Nkf

A IX. peptidet a [D-Lys]⁶LHRH-nak (IIIA előállítás, 160 mg) TEA (42 μΐ) jelenlétében, 500 μΐ DMFben, glutársavanhidriddel (57 mg) végzett acilezésével állítjuk elő, mely reakciót szobahőmérsékleten 2 órán át vezetünk le. A nyers [D-Lys]⁶LHRH-t HPLC módszerrel tisztítjuk B jelű oszlopot és i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva (20-40% B, 40 perc). A nyers IX. peptid (120 mg) 12,4 perces HPLC retenciós idővel rendelkezik, amikor az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazzuk (2040% B, 20 perc).

X. előállítás

Antraklnon-2-metU-hemiglutarát

576 mg (2 mmól) 2-(hidroxi-metil)-antrakinont 6 ml vízmentes piridinben refluxáltatunk 24 órán át 456 mg (4 mmól) glutársavanhidriddel. A piridint vákuumban eltávolítjuk, majd a maradékot savanyítjuk és etil-acetáttal extraháljuk. A sárga terméket etil-acetát/hexán elegyből átkristályosítjuk (580 mg), olvadáspont 150-151 °C. A VIII. peptid HPLC retenciós ideje

19.7 perc az i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva (30-60% B, 30 perc)

1. példa pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-ProGly-NH₂(1)

A pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-ArgPro-Gly-NH₂ (1) peptidet [D-Lys]⁶LHRH (HA előállítás, 31,9 mg/20 pmól/TFA só) 0,5 ml DMF-ben készült oldatának Boc-D-Mel-OPCP (I. előállítás, 26 mg) 200 μΐ MeCN-ben készült oldatával történő reakcióval állítjuk elő 4 mekv. TEA jelenlétében. A keveréket szobahőmérsékleten 10 órán át folyamatosan keverjük. A reakciókeveréket dietil-éterrel kicsapatjuk, majd szűrjük és ugyanezzel az oldószerrel háromszor mossuk. Az így kapott Boc-védett peptidet 5 ml 50%-os CH₂C1₂ oldattal kezeljük 10 percen át szobahőmérsékleten, majd bepároljuk és HPLC tisztításnak vetjük alá a C oszlopot és az ii) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazva. A nyers peptidet tartalmazó liofilizált frakciók 14,3 mg 1 peptidet tartalmaznak.

Hasonló módon állítjuk elő a következő peptideket: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(D-Mel)-Leu-Arg-ProGly-NH₂ (8) (15,1 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-DTrp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (15) (16 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-SerArg-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (19) (13,6 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-SerArg-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (26) (12,1 mg).

Ezeket a peptideket a fentiekhez hasonló módon eljárva állítjuk elő, de a következő anyagokat alkalmazzuk:

[D-Orn]⁶LHRH-t (IIB előállítás, 31,6 mg), Ac-DNal(2)¹,D-Phe(4Cl)²,D-Trp³,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰]-LHRH (IV. előállítás, 33,4 mg), Ac-D-Nal(2)*,DPhe(4Cl)²D,Trp³,Arg⁵,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰]-LHRH (VA előállítás, 35,6 mg) és [Ac-D-Nal(2)¹,D-Phe(4Cl)²,DPal(3),Arg⁵,D-Lys⁶,D-AIa^l0]-LHRH (VB előállítás,

34.8 mg).

HU 208 159 B

HPLC adatok Gradiens (%B/perc)

Sorszám	Tisztításnál	Analízisnél	Retenciós idő (perc)
1.	20-50/60	35-55/20	8,8
8.	20-50/60	35-55/20	7,8
15.	40-70/60	65-85/20	11,5
19.	35-55/40	50-70/20	11,2
26.	30-50/40	40-60/20	13,5

2. példa pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-ProGly-NH₂(2)

A fenti (2) képletű peptidek a [D-Lys]⁶LHRH (IIA előállítás 31,9 mg TFA só) ciklopropán-karbonil-kloriddal végrehajtott acilezési reakciójával állítjuk elő. A pepiidet 0,2 ml DMF-ben oldjuk, majd TEA-val semlegesítjük és az elegyet -30 °C-ra hűtjük. 10 μΐ 20%-os MeCN-ben készült ciklopropán-karbonil-oldatot adagolunk az elegyhez. Ezt az eljárást kétszer megismételjük, majd a reakciókeveréket 0 °C-on egész éjen át keverjük. A reakciókeveréket kis mennyiségű vízzel hígítjuk, majd a C jelű oszlopra injektáljuk és i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszerrel tisztítjuk. A liofilizált frakciók 8,3 mg (2) képletű nyers pepiidet tartalmaznak.

A fentiekhez hasonló módon eljárva, de [DOm]⁶LHRH-t (IIB előállítás 31,6 mg), [Ac-D-Nal(2)’, D-Phe(4Cl)², D-Trp³,D-Lys⁶,D-Ala'°]-LHRH-t (IV. előállítás, 33,4 mg), [Ac-Nal(2)',D-Phe(4Cl)²,DTrp³,Arg⁵,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰]-LHRH-t (VA előállítás,

35,6 mg) és [Ac-D-Nal(2)¹,D-Phe(4Cl),DPal(3)^{3 *},Arg⁵,D-Lys⁵,D-Ala¹⁰]-LHRH-t (VB előállítás,

34,8 mg) alkalmazva a következő peptideket állítjuk elő: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Om(CPC)-Leu-Arg-ProGly-NH₂ (9) (12,1 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-DTrp-Ser-Tyr-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂. (16) (24,4 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-SerArt-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (20) (10,6 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-DLys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (27) (8,4 mg).

HPLC adat Gradiens (%B/perc)

Sorszám	Tisztításnál	Analízisnél	Retenciós idő
2.	15-35/50	20-40/20	12,6
9.	10-30/40	25-45/20	9,8
16.	40-60/40	50-79/20	10,3
20.	25-50/50	45-65/20	12,3
27.	25-45/40	35-55/20	13,0

3. példa pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(HMAQG)-Leu-ArgPro-Gly-NH₂ (3)

A fenti (3) képletű peptid szintézisét [DLys]⁶LHRH (IIA előállítás, 31,9 mg TFA só) és antrakinon-2-metil-hemiglutarát (X) karbodiimiddel végzett kapcsolásával hajtjuk végre. 10,6 mg antrakinon-2-metíl-hemiglutarát oldatát (200 μΐ DMF-ben készült) és

4,6 mg HOBt-t 0 °C-ra hűtünk, majd 3,5 μΐ DIC-vel reagáltatjuk. 15 perc elteltével az oldatot összekeverjük 31,9 mg [D-Lys]⁶LHRH (IIA előállítás, TEA-val semlegesítve) oldatával (200 ml) keverjük össze, majd 24 órán át 0 °C-on tartjuk az elegyet. Ha a reakció nem teljes, a kapcsolást fele mennyiségű DIC-vel megismételjük. A reakciókeveréket vízzel hígítjuk, majd az 1. példában leírt tisztításnak vetjük alá. 21,6 mg (3) képletű pepiidet kapunk.

A pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Om(HMAQG)-LeuArg-Pro-Gly-NH₂ (10) (15,4 mg), Ac-D-Nal(2)-DPhe(4Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-(HMAQG)-Leu-ArgPro-D-Ala-NH₂ (17) (18,2 mg), Ac-D-Nal(2)-DPhe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(HMAQG)-Leu-ArgPro-D-Ala-NH₂ (21) (20,6 mg), Ac-D-Nal(2)-DPhe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(HMAQG)-Leu-ArgPro-D-Ala-NH₂ (28) (14,7 mg) peptideket hasonló eljárásokkal állítjuk elő azzal az eltértéssel, hogy az alábbi vegyületeket alkalmazzuk kiindulási anyagként: [D-Orn]⁶LHRH (IIB előállítás, 31,6 mg), [Ac-DNal(2)¹,D-Phe(4Cl)²,D-Trp³,D-Lys⁶,D-Ala¹⁽⁾]LHRH (IV. előállítás, 33,4 mg), [Ac-D-Nal(2)',DPhe(4Cl)²,D-Trp³,Arg⁵,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰-LHRH (VA előállítás, 35,6 mg) és [Ac-D-Nal(2)‘.D-Phe^Cl)²,DPal(3)³,Arg⁵,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰]-LHRH (VB előállítás,

34,8 mg).

HPLC adat Gradiens (%B/perc)

Sorszám	Tisztításnál	Analízisnél	Retenciós idő
3.	30-50/40	45-65/20	8,6
10.	25-45/40	45-65/20	8,7
17.	50-70/40	65-85/20	6,3
21.	35-65/60	65-85/20	7,4
28.	35-55/40	45-65/20	7,8

4, példa pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-ProGly-NH₂ (4)

A fenti (4) képletű pepiidet [D-Lys]⁶LHRH-nak metotrexáttal (ametopterin) végzett acilezésével állítjuk elő.. 12,0 mg metotrexátnak 100 μΐ DMF-ben készült oldatához mólekvivalens mennyiségű DIC-t adunk 0 °C-on. 15 perc elteltével az elegyét összekeverjük 31,9 mg [D-Lys]⁶LHRH (IIA előállítás szerinti vegyület, TEA-val semlegesítve) oldatával, majd egész éjszakán át 0 °C-on tartjuk a kapott elegyet. Ezután a reakciókeveréket vízzel hígítjuk és a 2. példában leírt módon tisztításnak vetjük alá. A két fó terméket kévéssé eltérő retenciós időkkel izoláljuk (a: 5,2 mg, b: 5,5 mg).

A fentiekhez hasonlóképpen eljárva, de [DOrn]⁶LHRH-t (IIB előállítás, 31,6 mg) [Ac-DNal(2)‘,D-Phe(4Cl)²,D-Trp³,D-Lys⁶,D-Ala¹⁰]-LHRH-t (IV. előállítás, 33,4 mg), [Ac-Nal(2)',D-Phe(4Cl)²,D12

HU 208 159 Β

Trp³,Arg⁵,D-Lys⁶,D-Ala^l0]-LHRH-t (VA előállítás,

35,6 mg), [Ac-D-Nal(2)²,D-Phe(4Cl)²,DPal(3)³,Arg⁵,D-Lys⁶,D-Ala^l0]-LHRH-t (VB előállítás,

34,8 mg) és [D-Lys(Ahx)]⁶LHRH-t (VIII. előállítás, 35 mg) alkalmazva a következő peptideket állíthatjuk elő: pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(MTX)-Leu-Arg-Pro-GlyNH₂ (11) (4,3 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-TrpSer-Tyr-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (18) (8,4 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-DLys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (22) (11,8 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-_b2 (29) (11,6 mg) és pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Om[Ahx(MTX)]-Leu-ArgPro-Gly-NH₂ (34) (24 mg).

HPLC-adat Gradiens (%B/perc)

Sorszám	Tisztításnál	Analízisnél	Retenciós idő
4.	20-40/40	20-40/20	12,3/12,8
11.	15-45/60	25-45/20	10,1
18.	40-60/40	45-65/20	10,3/10,7
22.	25-45/40	45-65/20	7,1/7,4
29.	25-45/40	30-50/20	11,8
34.	20-40/40	25-45/20	10,9

5. példa

További peptidek pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(D-Mel)₂]-LeuArg-Pro-Gly-NH₂ (5) (12,4 mg), pGlu-His-Trp-SerTyr-D-Om-[A₂pr(D-Mel)₂]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (12) (11,1 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-SerArg-D-Lys[A₂pr(D-Mel)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (23) (5,8 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe-(4C1)-D-Pal(3)-SerArg-D-Lys[A₂pr(D-Mel)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (30) (10,0 mg) peptideket az 1. példában leírtak szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy [D-LysA₂pr]⁶LHRH-t, (IIIA előállítás, 35,9 mg), [DOm(A2PR)]⁶LHRH (IIIB előállítás, 35,6 mg), [Ac-DNal(2)^l-D-Phe(4Cl)²,D-Trp³,Arg⁵,D-Lys(A2pr)⁶,DAla¹⁰]LHRH (VILA előállítás, 39,6 mg) és [Ac-DNal(2)¹-D-Phe(4Cl)²,D-Pal(3)³,Arg⁵,D-Lys(A₂pr)⁶,DAla¹⁰]LHRH (VIIB előállítás, 38,8 mg) alkalmazunk amino komponensként és a Boc-D-Mel-OPCP acilezőszer mennyiségét metkétszerezzük.

6. példa

További peptidek pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(CPC)₂-Leu-ArgPro-Gly-NH₂ (6) (8,4 mg), pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-DOm[A₂pr(CPC₂]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (13) (9,6 mg), Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(CPC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (24) (7,6 mg), [AcD-N'al(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(CPC)₂]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ (31) (6,8 mg), peptideket a 2. példában leírtak szerint állítjuk elő, azzal az eltéréssel, hogy a [D-Lys(A₂pr)⁶]LHRH-t (IIIA előállítás, 35,9 mg), [D-Om(A₂pr)⁶]-LHRH-t (IIIB előállítás,

35,6 mg) [Ac-D-Nal(2)']-D-Phe(4Cl)²,D-Trp³,Arg⁵,DLys(A2pr)⁶,D-Ala'°]-LHRH-t (VII. előállítás, 39,6 mg) és [Ac-D-Nal(2)‘,D-Phe(4Cl)²,D-Pal(3)³,Arg⁵,DLys(A2pr)⁶,D-Ala^,0]-LHRH-t (VIIB előállítás, 38,8 mg) acilezünk kétszeres mólekvivalens mennyiségű ciklopropán-karbonil-kloriddal.

HPLC adat Gradiens (%B/perc)

Sorszám	Tisztításnál	Analízisnél	Retenciós idő
6.	15-35/40	25-45/20	10,6
13.	15-35/40	25-45/20	9,3
24.	20-50/60	45-65/20	11,6
31.	20-50/60	40-60/20	8,7

7. példa

További peptidek pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A₂pr(HMAQG)₂-LeuArg-Pro-Gly-NH₂-t (7) (4,3 mg), pGlu-His-Trp-SerTyr-D-Om[A₂pr(HMAQG)₂]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂-t (14) (8,9 mg), (Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-SerArg-D-Lys[A₂pr(HMAQG)₂-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂-t (25) (10,7 mg), [Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)Ser-Arg-D-Lys[A₂pr(HMAQG)₂]-Leu-Arg-Pro-D-AlaNH₂-t (32) (9,1 mg) állítunk elő a 3. példában leírt módon azzal az eltéréssel, hogy [D-Lys(A₂pr)]⁶LHRH-t (IIIA előállítás, 35,9 mg), [D-Om(A2pr)]⁶,LHRH-t (ΠIB előállítás, 35,6 mg), [Ac-D-Nal(2)',D-Phe(4Cl)²,DTrp³,Arg⁵,D-Lys(A2pr)⁶,D-Ala^l0]-LHRH-t (VIIA előállítás, 39,6 mg) és [Ac-D-Nal(2)',D-Phe(4Cl)²,DPal(3)³,Arg⁵-,D-Lys(A₂pr)⁶,D-Ala¹⁰-LHRH-t (VIIB előállítás, 38,8 mg) alkalmazunk egy karbodiimid kapcsolási reakcióban és kétszeres mennyiségű antrakinon-2-metil-hemiglutarátot, DIC-t és HOBt-t alkalmazunk.

HPLC adat Gradiens (%B/perc)

Sorszám	Tisztításnál	Analízisnél	Retenciós idő
5.	30-50/40	50-70/20	9,8
12.	25-45/40	50-70/20	7,8
23.	25-45/40	55-70/20	9,8
30.	40-70/60	65-85/20	12,3
28.	35-55/40	45-65/20	7,8

HPLC adat Gradiens (%B/perc)

Sorszám	Tisztításnál	Analízisnél	Retenciós idő
7.	35—65/60	50-70/20	12,6
14.	40-60/40	50-70/20	10,4
25.	40-80/80	65-85/20	13,9
32.	40-70/40	60-80/20	15,2

HU 208 159 Β

8. példa pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Lys(Glt-DOX)-Leu-Arg-ProGly-NH₂ (33)

A fenti (33) képletű peptid szintézisét a doxorubicin aminocukor csoportjának a [D-Lys(Glt)]⁶LHRH gluta- 5 roil oldalláncához való kapcsolással hajtjuk végre.

29,6 mg IX. előállítási példában előállított vegyületet 200 μΐ DMF-ben oldunk és 14 mg doxorubicinnel és 4 μΐ DIC-vel reagáltatjuk 6,2 μΐ TEA és 3,3 mg HOBt jelenlétében 0 °C-on. A reakciókeveréket D jelű 10 oszlopon végzett tisztításnak vetjük alá, melynek során i) jelű lineáris gradiensű oldószer rendszert alkalmazunk (20-50% B, 60 perc). A [D-Lys(GltDOX)⁶LHRH (20 mg) HPLC retenciós ideje 10,5 perc, amikor az alábbi i) jelű lineáris gradiensű oldószer 15 rendszert alkalmazzuk (20-50% B, 20 perc).

9. példa

Biológiai hatások, receptor kötődési képesség és citotoxikus aktivitás 20

A találmány szerinti vegyületek biológiai hatásossága, receptor kötődési képessége és citotoxikus aktivitása az 1-4. táblázatokban kerül ismertetésre. A találmány szerinti LHRH agonista tulajdonsággal rendelkező vegyületeknek az 1. táblázatban bemutatott hormonális ak- 25 tivitásait az LHRH hasonló tulajdonságához viszonyítva határoztuk meg patkány hipofízis sejt szuperfuzionált rendszerében in vitro körülmények között (S. Vigh és A. V. Schally, Peptides 5,241-247 (1984)). Apeptidet 3 percen át különböző koncentrációban vittük be infúzióval, majd a kibocsátott LH mennyiségét viszonyítottuk 3 nM LHRH által kiváltott mennyiséghez. Az 1. táblázat szintén tartalmaz adatokat ezeknek a vegyületeknek humán mellrák semtmembránokhoz való receptor kötődési affinitásáról.

A 2. táblázat tartalmazza a találmány szerinti LHRH inhibitáló tulajdonságokkal rendelkező vegyületek antiovuláns aktivitásait és humán mellrák sejtmembrán receptor kötődési affinitásait. A gátló hatást in vivő határozzuk meg 4 napos ciklusú patkányokon (A. Corbin és C. W, Beattie, Endocr. Rés. Commun., 2 1-23 (1975).

A 3. és 4. táblázat adatai mutatják a ³H-timidinnek DNS-be való beépülésének gátlását, mely adatokat citotoxikus LHRH analógoknak MCF-7, T47D, MDA-MB-231 és SKBr-3 humán emlőrák sejtvonalakra kifejtett hatásával határoztuk meg. 200000 sejtnek 200 μΐ RPMI-160-ban, amely 2% CFBS-t is tartalmaz, készült oldatát inkubáljuk 1,5 vagy 10 gg citotoxikus analóggal 3 órán át, vagy 23 órán át ΙμΟ ³H-timidinnel, majd az inkubálást 60 percen át folytatjuk. A DNS-t 1 N perklórsavval extraháljuk és a radioaktivitást mérjük.

1. táblázat

LH kibocsátó aktivitása és receptor kötődési affinitása a pGlu-His-Trp-Ser-Trp-R⁶(YX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ peptideknek, amelyek citotoxikus gyököket tartalmaznak humán mellrák sejtmembránokra nézve

Példa száma	R6	Y	X	Relatív affinitás	Kal nM_1	KajgM-1
1.	D-Lys	-	(D-Mel)		66,74	1,07
2.	D-Lys	-	CPC	52	1,65	-
3.	D-Lys	-	HMAQG	35	1,52	-
4A	D-Lys	-	MTX		5,42	1,59
4B	D-Lys	-	MTX		0,63	-
5.	D-Lys	L-A2pr	(D-Mel)2		30,48	3,45
6.	D-Lys	L-A2pr	(CPC)2	25	0,14	-
7.	D-Lys	L-A2pr	(HMAQG)	30	NB	NB
8.	D-Om	-	D-Mel		11,51	0,34
9.	D-Om	-	CPC	40	-	44,2
10.	D-Om	-	HMAQG	56	-	1,3
11.	D-Om	-	MTX
12.	D-Om	L-A2pr	(D-Mel)2		6,47	-
13.	D-Om	L-A2pr	(CPC)2		NB	NB
14.	D-Om	L-A2pr	(HMAQG)2
33.	D-Lys	Glt	DOX	12	-	14,4
34.	D-Lys	Ahx	MTX	6,7	4,42	-

*Az LH-kibocsátási aktivitás 3 nM LHRH-val kiváltotthoz viszonyítottuk **'²⁵l-[D-Trp]⁶LHRH-t alkalmazunk jelölt ligandumként.

HU 208 159 Β

2. táblázat

Antiovuláns aktivitása és affinitása az Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-R³-Ser-R⁵-D-Lys-[AX]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH₂ peptideknek, melyek humán mellrák sejteknek receptormembránjaira nézve citotoxikus gyököket tartalmaznak

Peptid	Affinitást állandó
Példa száma	R3	R5	A	X	Ovuláció %-os gátlása	Kal nM-'	Κώ μΜ’1
15.	D-Trp	Tyr	-	D-Mel	100	3,58	-
16.	D-Trp	Tyr	-	CPC		NB	NB
17.	D-Trp	Tyr	-	HMAQG		NB	NB
18.	D-Trp	Tyr	-	MTX		3,58	1,07
19.	D-Trp	Arg	-	D-Mel	40	-	32,54
20.	D-Trp	Arg	-	CPC	80	NB	NB
21.	D-Trp	Arg	-	HMAQG	80	0,29	-
22.	D-Trp	Arg	-	MTX		NB	-
23.	D-Trp	Arg	L-A2pr	(D-Mel)2		3,82	-
24.	D-Trp	Arg	L-A2pr	(CPC)2	60	0,42	-
25.	D-Trp	Arg	L-A2pr	(HMAQG)2	0	7,05	8,6
26.	D-Pal(3)	Arg	-	D-Mel	100	0,97	1,34
27.	D-Pal(3)	Arg	-	CPC	100	NB	NB
28.	D-Pal(3)	Arg	-	HMAQG	100	NB	NB
29.	D-Pal(3)	Arg	-	MTX	100	0,44	1,04
30.	D-Pal(3)	Arg	L-A2pr	(D-Mel)2		NB	NB
31.	D-Pal(3)	Arg	L-A2pr	(CPC)2	100	1,52	-
32.	D-Pal(3)	Arg	L-A2pr	(HMAQG)2	40	2,28	-

*A peptideket 20 pg/patkány adagolásnál vizsgáltuk. **^l25I-[D-Trp]⁶-LHRH-t alkalmaztunk ligandumként. NK: nincs kötődés

3. táblázat (I) általános képletű citotoxikus LHRH analógok gátló hatása MCF-7 humán mellrák sejtvonal DNS-ébe való ³H-timidin beépülésre nézve

Példa száma	Dózis pg/ml	%-os gátlás a 4. órában	%-os gátlás a 24. órában
Kontroll		0	0
3.	1	29**	J4**
10	32**	71**
7.	1	26**	24**
10	38**	44**
10.	1	32**	28**
5	36**	51**
11.	1	34**	7
10	29**	3
19.	1		34**
10		49**
21.	1		0
10		0
24.	1	25**	8
10	34**	37**
25.	1		3
10		11
26.	1	31**	33**
10	49**	54**
28.	1		0
10		0

HU 208 159 B

Példa száma	Dózis gLg/ml	%-os gátlás a 4. órában	%-os gátlás a 24. órában
29.	1		10
10		16
32.	1	31**	15
10	28**	40**
33.	1	19**	0
5	34**	61**
34.	1		16
10		21

**P<0,01 Duncan-féle meghatározás (multiple rangé test)

4. táblázat

Az (I) általános képletű citotoxikus LHRH analógok gátló hatása különféle humán mellrák sejtvonalak DNS-ébe való ³H-timidin beépülés esetén

Példa száma	Dózis gg/ml	%-os gátlás a 4. órában	%-os gátlás a 24. órában
T47D sejtvonal
Kontroll	-	0	0
4.	1	38**	26
10	54**	41
5.	1	31**	15
10	39**	28
24.	1	44**	22
10	50**	12
25.	1	37**	20
10	41**	54
33.	1	32**	11
10	44**	10
MDA-MB-231 setvonal
Kontroll	-	0	0
4.	1	23*	0
10	31**	8
5.	1	20*	15
10	20*	62**
24.	1	25*	8
10	73**	11
25.	1	36**	0
10	40**	90**
33.	1	20*	0
10	9	0
SKBr-3 sejtvonal
Kontroll	-	0	0
4.	1	21**	16**
10	36**	10
5.	1	24**	30**
10	21**	66**
24.	1	37**	18*
10	42**	29**
25	1	30**	9
10	53**	88**
33.	1	27**	0
10	24**	14**

*p<0,05 Duncan-féle meghatározás (multiple rangé test) **p<0,01 Duncan-féle meghatározás (multiple rangé test)

Claims (11)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás az (I) általános képletű peptidek - ahol R¹ jelentése pGlu vagy D-Nal(2),

   R² jelentése His vagy D-Phe(4Cl),

   R³ jelentése Trp, D-Trp vagy D-Pal(3),

   R⁵ jelentése Tyr vagy Arg,

   R⁶ jelentése D-Lys vagy D-Orn,

   R¹⁰ jelentése Gly vagy D-Ala,

   X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport, vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu,

   Q jelentése -Q⁴ vagy -A(Q³) vagy -B(Q')₂ vagy

   -B(AQ²)₂ általános képletű csoport, ahol

   A jelentése -CO-(CH₂)_n-NH- vagy -CO-(CH₂)_n-CO- csoport, ahol n jelentése 2-6,

   B jelentése -CO-(CH₂)_n-CH(NH₂)_m-NH- csoport, I ahol m jelentése 0 vagy 1 és n jelentése 0 vagy 1, az A és B jelentésében szereplő CO-csoportok az R⁶ csoporton található aminocsoporthoz kötődnek, és a B(AQ²)₂ csoport esetében az A csoport CO-csoportja a B csoport aminocsoportjához kötődik,

   Q¹ jelentése D- vagy L-Mel vagy ciklopropán-karbonil-csoport,

   Q² jelentése felöleli Q¹ jelentését és jelenthet továbbá antrakinon-n-2-metoxi- vagy doxorubicinil-csoportot,

   Q³ jelentése felöleli Q² jelentését és jelenthet továbbá metotrexoil-csoportot,

   Q⁴ jelentése felöleli Q¹ jelentését, továbbá jelenthet metotrexoil-csoportot és gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sói előállítására, azzal jellemezve, hogy

   a) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése -Q⁴ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VI) általános képletű peptidet

   - a képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-Q⁴ általános képletű vegyülettel - a képletben Q⁴ jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk,

   b) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése -AQ³ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VI) általános képletű peptidet — a képletben X* jelentése 2-5 szénatomos alkanoil-csoport egy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-AQ³ általános képletű vegyülettel - a képletben A és Q³ jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk,

   c) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése -AQ³ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VII) általános képletű peptidet

   - a képletben X* jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és A, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-Q³ általános képletű vegyülettel - a képletben Q³ jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk,

   d) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése —B(Q^!)₂ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VIII) általános képletű peptideta képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoil-csoport vagy hidrogénatom, amennyiben R¹ jelentése pGlu csoport és B, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-Q¹ általános képletű vegyülettel - a képletben Q* jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk,

   e) olyan (I) általános képletű vegyületek előállítása esetén, melyeknél Q jelentése -B(AQ²)₂ jelentésénél megadottakkal egyező, egy (VIII) általános képletű peptidet - a képletben X¹ jelentése 2-5 szénatomos alkanoil-csoport vagy hidrogénatom, amennyiben R* jelentése pGlu csoport és B, R¹, R², R³, R⁵, R⁶ és R¹⁰ jelentése a fentiekben megadott, egy Y-AQ² általános képletű vegyülettel - a képletben A és Q² jelentése a fentiekben megadott és Y jelentése egy távozó csoport - reagáltatunk, kívánt esetben a kapott peptidet tisztítjuk és kívánt esetben a kapott peptidet gyógyászatilag elfogadható savaddíciós sójává alakítjuk.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, melyeknél Q jelentése Q⁴ és a többi jelölés jelentése az 1. igénypont tárgyi körében megadott, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, melyeknél R¹ jelentése pGlu, R² jelentése His, R³ jelentése Trp, R⁵ jelentése Tyr, R⁶ jelentése D-Lys vagy D-Om, R¹⁰ jelentése Gly, X jelentése hidrogénatom és Q jelentése a 2. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, melyeknél R¹ jelentése D-Nal(2), R² jelentése D-Phe(4Cl), R³ jelentése D-Trp vagy D-Pal(3), R⁵ jelentése Tyr vagy Arg, R⁶ jelentése D-Lys vagy D-Om, R¹⁰ jelentése D-Ala, X jelentése 2-5 szénatomos alkanoil csoport és Q jelentése a 2. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, melyeknél Q jelentése -A(Q³), azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
6. 6. Az 5. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, melyeknél R¹ jelentése pGlu, R² jelentése His, R³ jelentéséé Trp, R⁵ jelentése Tyr, R⁶ jelentése D-Lys vagy D-Om, R¹⁰ jelentése Gly X jelentése hidrogénatom, és Q jelentése az 5. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
7. 7. Az 5. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, melyeknél R¹ jelentése D-Nal(2), R² jelentése D-Phe(4Cl), R³ jelentése D-Trp vagy D-Pal(3), R⁵ jelentése Tyr vagy Arg, R⁶

   HU 208 159 Β jelentése D-Lys vagy D-Orn, R¹⁰ jelentése D-Ala X jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport és Q jelentése az 5. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek előállítására, melyeknél Q jelentése -B(Q’)₂, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános 10 képletű peptidek előállítására, melyeknél R¹ jelentése pGlu, R² jelentése His, R³ jelentése Trp, R⁵ jelentése Tyr, R⁶ jelentése D-Lys vagy D-Orn, R'° jelentése Gly,

   X jelentése hidrogénatom és Q jelentése a 8. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyette- 15 sített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás olyan (I) általános képletű peptidek elöllítására, melyeknél R¹ jelentése D-Nal(2), R² jelentése D-Phe(4Cl), R³ jelentése D-Trp vagy D-Pal(3), R⁵ jelentése Tyr vagy Arg, R⁶

    5 jelentése D-Lys vagy D-Orn, R¹⁰ jelentése D-Ala, X jelentése 2-5 szénatomos alkanoilcsoport és Q jelentése a 8. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazzuk.
11. 11. Eljárás gyógyászati készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-10. igénypontok bármelyike szerint előállított (I) általános képletű pepiidet - a képletben alkalmazott jelölések jelentései az 1-10. igénypontban megadottakkal egyező - gyógyászatilag elfogadható hordozó és/vagy vivőanyagokkal összekeverve gyógyászati készítménnyé alakítjuk.