HU200611B - Method of processing raction mixtures obtained during production of insulin precursors by disulfide bridge formation, by utilizing wrong recombinants - Google Patents

Description

A találmány új eljárás a teljes inzulinvázat tartalmazó inzulin-prekurzoroknak a megfelelő nyíltláncú, az inzulin A-láncot és az inzulin B-láncot a cisztein kénatomokon képezett S-szulfonátok alakjában tartalmazó előtermékből, valamely merkaptán jelenlétében, a nyíltláncú S-szulfonátot legfeljebb 10 mg/ml koncentrációban tartalmazó vizes közegben, 0 °C és 37 ’C közötti hőmérsékleten, 7 és 11 közötti pH-értéknél lefolytatott diszulfidhíd-kapcsolási reakció útján történő előállítása során kapott reakcióelegyek feldolgozására, a helytelen rekombinánsok elkülönítésével és újbóli hasznosításával; a talámány értelmében ezt a reakcióelegyet, kívánt esetben 1^100 mg/1 fiziológiailag ártalmatlan felületaktív anyag, előnyösen polietilén és/vagy polipropilén-glikol típusú, vízben oldódó polimer hozzáadása után, 4 és 6 közötti pHértékre állítjuk be, a levált csapadékot elkülönítjük és szulfitolízis útján visszalakítjuk az inzulin A-láncot és inzulin B-láncot tartalmazó újbóli diszulfidhíd-képzési reakciónak alávethető S-szulfonáttá.

Az említett inzulin-prekurzorok fent leírt módon, diszulfidhíd-képzéssel történő előállítása már ismeretes volt a 37 255 sz. európai szabadalmi leírásból, ahol ezeket a prekurzorokat az (I) általános képlettel ábrzolják; ebben a képletben

R jelentése hidrogénatom, vagy kémiai vagy enzimes úton lehasítható aminosav-maradék, vagy pedig egy kémiai vagy enzimes úton lehasítható, legalább két aminosav-maradékból álló peptid-maradék;

Y jelentése -Lys^B29-Z-^B3B - és ebben

Z jelentése Alá, Thr vagy Ser, mimellett az (A-l)-től (A-21)-ig terjedő híd egy inzulin-A-lánc, a (B-l)-től (B-30)-ig terjedő híd egy inzulin-B-lánc;

X egy az (A-1) aminocsoportján az inzulin-Alánchoz és a /B-30/ karboxilcsoportján az inzulin-B-lánchoz kapcsolódó híd, amely a természetes eredetű inzulin-prekurzorokban általában 30-35 aminosav-maradékot tartalmazó peptidlánc, például a humán proinzulinban -Arg-Arg-Glu-Glu-Ala-Asp-Leu-Gln-ValGly-Gln-Val-Glu- Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-GlySer-Leu-GIn-Pro-Leu-AIa-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln -Lys-Arg-.

Ezeket az inzulin-prekurzorokat az idézett leírás szerint (Π) általános képletű nyíltláncú, a ciszteinkénatomokon képzett S-szulfonátokat tartalmazó előtermékből - ahol R, X és Y jelentése egyezik a fent megadottal - állítják elő, oly módon, hogy valamely (II) általános képletű S-szulfonátot egy 7-11,5 pHértékű és 10 mg/literig terjedő S-szulfonát koncentrációjú vizes közegben valamely merkaptán oly mennyiségével reagáltatnak, amely SSO3- egységenként 1-5 HS-csoportot ad. A diszulfidhíd-képzés hozam ebben az eljárásban több paramétertől, így a pH- értéktől, az SSO3- és -SH egymás közötti arányától, a koncentációtól, a merkaptán fajtájától, a hőmérséklettől és a reakció időtartamától is függ. A gyakorlatit megközelítő körülmények között az az eljárás kb. 60 % diszulfidhíd-képzési hozamra optimalizálható.

Más szóval, az idézett leírásban egy inzulin-prekurzomak diszulfidhíd-kapcsolás útján történő előállításáról van szó, amelynek során diszulfidhidak képzésével alakítják ki a három diszulfidhidat tartalmazó szerkezetet^ ebből a prekurzorból azután proteáz en2 zimekkel való kezelés során a melléktermékként képződött helytelenül kapcsolódó inzulin-prekurzorok töredékekre bomlanak, amelyek azután már nem alakíthatók vissza az egyszerű módon a kívánt inzulinprekurzorokká.

„Inzulin-prekurzorok” alatt itt mind proinzulinok, mind pre-proinzulinok értendők, mimellett a „pre” előtag a proinzulin N-terminusán jelenlevő egy vagy több további aminosavra vonatkozik, és maga a proinzulin-rész előnyösen az emberi vagy majom-proinzulin szekvenciájának felel meg. Elvileg természetesen más, hasnyálmirigyből elkülöníthető proinzulinok, például sertés-, marha- vagy juh- proinzulinok, vagy szintetikus, a humán-inzulin szekvenciát tartalmazó, gén-technológiai eljárásokkal előállított, illetőleg sertés-inzulin esetében félszintetikusan humán-inzulinná feldolgozható proinzulinok is tekintetbe jöhetnek.

Ismeretes, hogy az inzulinnak nem mindegyik diszulfídja egyformán reakcióképes, hanem a diszulfid enyhe redukciója esetén először az A7 és B7 ciszteinek közötti diszulfidhíd nyílik fel, mielőtt még a B19 és A20 ciszteinek közötti második diszulfidhíd felnyílnék. Az A7 és B7 közötti diszulfidhíd elsőként bekövetkező redukcióját saját kísérleteinkben az inzulinprekurzor-S-szulfonát merkaptán csekély feleslegével történő reakciója alkalmával is megfigyeltük.

A diszulfidhíd-képzés útján kapott inzulin-prekurzor további feldolgozása az irodalom szerint kromatográfiás eljárásokkal, például gélkromatográfiás sótlanítással, pl. Sephadex^ G25, majd ezt követően Sephadex G50 superfine gyantán történő gél-kromatográfiával folytatható le, amikor is a gél- kromatografálás második lépésében a natív inzulin-prekurzorok „aggregált alakjaitól” választják el a kívánt terméket, vö. pl. 37 255 sz. európai szab. leírás.

Meglepő módon azt találtuk, hogy az inzulin-prekurzoroknak a megfelelő S-szulfonátokból történő diszulfidhíd-képzés során képződő helytelen rekombinánsok - amelyek részaránya általában a kiindulási mennyiség 30-50 %-a szokott lenni - 4 és 6 közötti pH- értéknél közvetlenül leválaszthatók a diszulfidhíd-képzési reakcíóközegból, míg az inzulin-prekurzor natív alakja csaknem teljesen az oldatban marad. Ez fennáll abban az esetben, ha a diszulfidhíd-képzéshez mintegy 2 ekvivalens -SH csoportot alkalmazunk

S-szulfonát-csoportonként, és abban az esetben is, ha valamivel nagyobb mennyiségű merkaptánt alkalmazunk, amikor is a ciszteincsoportok további redukciója és ezzel olyan inzulin-prekurzorok képződése következik be, amelyek csak részlegesen tartalmaznak diszulfid-hidakat. A csapadékot azután a szokásos módon, például centrifugálással elkülönítjük és a szulfitolízis útján a (Π) általános képletnek megfelelő

S-szulfonáttá alakítjuk át. Ez ezután újbóli diszulfidhíd-képzésnek vethető alá.

A találmány szerinti eljárás a diszulfidhíd-kapcsolási összhozam növelését teszi lehetővé azáltal, hogy a helytelen rekombinánsokból álló (eddig kiselejtezett) melléktermék egyszerű eljárással, újrafeldolgozásra alkalmas minőségben és koncentrációban történő kinyerését teszi lehetővé, így ez a melléktermék technológiailag előnyös és gazdaságos módon a kiindulási prekurzor-származékokká alakítható vissza.

A találmány szerinti elejárás során előnyös, ha a lecsapási reakcióközeghez a 4 és 6 közötti pH-érték

HU 20061 IB beállítása valamely fiziológiailag ártalmatlan felületaktív anyagot adunk, mert ezáltal csökkenthetjük az oldatban maradó helyes rekombinánsnak a csapadék alakjában kiváló helytelen rekombinánsok felületén való esetleges adszorbeáldódását, és így kiküszöbölhetünk vagy legalább is csökkenthetünk egy esetleges veszteségforrást az eljárás során. Erre a célra előnyösen polietilén-glikol vagy polipropilén-glikol típusú felületaktív anyagokat, különösen (Hl) általános képletű polimereket - ahol X 2-3 szénatomos alkoxicsoportot, R¹ és R² hidrogénatomot képvisel, n jelentése egész szám 4 és 80, előnyösen 15 és 45 között, azzal a megszorítással, hogy a vegyűlet legalább 12 szénatomot tartalmaz - alkalmazhatunk,

1-400 mg/1, előnyösen 2-200 mg/1 mennyiségben.

A 37 255 sz. európai szabadalmi leírásban ismertetett módon, 0 ’C és 37 ’C, előnyösen 2 ’C és 10 'C közötti hőmérsékleten, 7 és 11,5, előnyösen 9 és 11 közötti pH-tartományban, egy -SSO3· csoportra számítva 1-5, előnyösen 2-3 -SH egységnek megfelelő mennyiségű merkaptán, előnyösen 2-merkapto-etanol, tioglikolsav vagy hasonlók jelenlétében, célszerűen oxigén messzemenő kizárásával lefolytatott diszulfidhíd-képzési reakció után kapott reakcióelegynek a találmány szerinti feldolgozás során a pH-érték átállítását pl. híg ásványi savak, mint sósav, kénsav vagy foszforsav hozzáadásával végezzük, de használhatók erre a célra az inzulin-perkurzorokkal reakcióba nem lépő szerves savak, mint ecetsav, vagy savanyú sók, mint foszfátok is.

A pH-érték átállításakor kiváló csapadék centrifugálással könnyen elkülöníthető. Ezt a kivált csapadékot azután közvetlen szulfitolízissel, például a Swan [Natúré, 180, 643-645 (1957)] által lein módon, messzemenően visszaalakíthatjuk az S-szulfonát alakban. Ezt azután adott esetben kromatográfiás eljárással tisztíthatjuk, majd például a fentebb leírt módon, előnyösen valamely fiziológiailag ártalmatlan, fentebb leírt fajtájú felületaktív anyag csekély mennyiségének jelenlétében a kívánt diszulfidhidas inzulin-prekurzorrá alakítjuk át. Történhet azonban a feldolgozás a találmány szerinti eljárás egy további kiviteli alakja szerint oly módon is, hogy a merkaptán csekély feleslegével való kezelés útján kapott diszulfidhidakkal csak részlegesen kapcsolt inzulin-prekurzorhoz valamely fentebb leírt fajtájú felületaktív anyagot adunk, majd oxigént, például levegő-oxigént gyöngyöztetünk az oldaton keresztül és így folytatjuk le a reoxidációt. így a felületaktív anyag jelenléte meggátolja az inzulin-prekurzomak pl. a gázbuborékon bekövetkező denaturálódását.

A fentiek értelmében a találmány szerinti eljárással a diszulfidhíd-képzési hozamot, a helytelen rekombinánsok visszanyerését is beleszámítva, mintegy 80, sőt egészen 90 %ig növelhetjük.

A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módjait közelebbről az alábbi példák szemléltetik.

1. példa

Humán pre-proinzulin előállítása pre-proinzulin-S-szulfonátból

1,2 g (Π) általános képletű pre-inzulin-S-szulfonátot, amely R helyén a Gly-Asn-Ser-Ala-Arg- preszekvenciát, Y helyén a -Lys- Thr- csoportot és X helyén a fenti humán X szekvenciát tartalmazza, feloldunk 2,5 liter 50 millimólos, 10,6 pH-értékű gáztalanított glicin-pufferoldatban, és 147 ml merkapto-etanol hozzáadásával éjjelen át lassan keverjük 4 ’C hőmérsékleten.

A reakcióközegben nagynyomású folyadék-kromatográfiás módszerrel mért diszulfidhíd-képzési hozam 0,32 mg/ml (az elméleti mennyiség 67 %-a); Staphylococcus aureus(Protease V8) alkalmazásával végzett „ujjlenyomat” (Fingerprint) elemzéssel megállapítottuk, hogy az A7-B7 diszulfidhíd 65 %-ban, a B19-A20 diszulfidhíd 93 %- bán jött létre.

Az „ujjlenyomat’-analízist a következőképpen végezzük: egy 50 millimólos trisz-(hidroxi-metil)-metil-ammónium-klorid(„trisz”) pufferoldattal (pH=7,5) készített 0,5 mg/ml koncentrációjú inzulin-prekurzoroldat 200 ml-jéhez 0,1 egység S. aureus V8 proteázt adunk és az oldatot 37 ’C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. Az így előkészített oldat egy alikvot-részét azután közvetlenül a nagynyomású folyadék-kromatográfiás berendezésbe visszük. A nagynyomású folyadék-kromatográfiás elemzést Cl8 fordítófázissal. 20-45 % B lineáris grádienssel végezzük. Az eljáráshoz A-pufferként 0,05 mól tetraetil-ammóniumfoszfátot, 0,25 mól nátrium-perklorátot és a teljes fázisban 10 % acetonitrilt tartalmazó, 3 pH-értékű pufferoldatot, B-pufferként 0,05 mól tetraammóniumfoszfátot és a teljes fázisban 90 % acetonitrilt tartalmazó, 3 pH-értékű pufferoldatot használunk. A körülbelül 7, 10 és 14 perc után fellépő fragmentcsúcsok viszonya alapján, egy humán-proinzulin standard figyelembevételével az adott kísérletben a fentebb émlített 65 % illetőleg 93 % értékeket állapítottuk meg.

Az oldatot 9 pH-értékre állítjuk be és 25 mg felületaktív polietilén-propilén-glikolt adunk hozzá. Azután 4 ’C-ra hűtjük és ezen a hőmérsékleten egy óra alatt kb. 50 liter oxigéngázt gyöngyöztetünk át az oldatotn.

Ezt követően az oldatot 1 n sósavoldattal 5,4 pH-értékre savanyítjuk, amikor is zavarosodás következik be, amelyet centrifugálással eltávolítunk. A kapott csapadékot acetonnal és dietil-éterrel vagy metil-terc-butil-éterrel mossuk és megszárítjuk, súlya 520 mg. A tiszta szupematáns folyadékból 250 g nátrium-klorid hozzáadásával, 3 pH-értéknél leválasztjuk a natív pre-proinzulint. Hozam 720 mg (60 %).

Az 5,4 pH-értéknél leválasztott csapadékot 100 ml 7 mólos karbamidoldatban 800 mg nátrium-szulfit és 600 mg nátrium- tetrationát hozzáadásával 7,6 pH-értéknél, 4 ’C hőmérsékleten szulfitolízisnek vetjük alá, és a reakcióterméket 3 pH-értékű vizes puferoldattal szemben dializálva leválasztjuk. A csapadékot megszárítva 540 mg terméket kapunk, ennek 382 mg-nyi részét visszanyert pre-proinzulin-S-szulfonát képezi. Ezt 40 μΐ merkapto-etanollal a fentebb leírt módon redukáljuk, amikoris további 226 mg pre-proinzulint kapunk (ennek a lépésnek a külön számított hozama 59 %), így tehát a diszulfidhídképzés összhozama 946 mg (az elméleti mennyiség

78,8 %).

Egy második, analóg módon megismételt műveletben az első művelet során kapott 144 mg anyagból

5,4 pH-értéken történő leválasztás útján további 78 mg natív pre-proinzulint kapunk (ennek a lépésnek a külön számított hozama 54 %). így tehát a teljes 3

HU 200611 Β eljárásban a natív pre-proinzulin összhozama 1,024 g (az elméleti mennyiség 85,3 %-e).

2. példa

Sertés proinzulin képzése és feldolgozása

0,4 g sertés-proinzulin-S-szulfonátot 800 ml 50 millimól/liter koncentrációjú, 10,5 pH-értékű glicinpufferoldatban 4 °C hőmérsékleten oldunk, az oldatot gáztalanítjuk és 49,1 mg tioglikolsavat adunk hozzá. Az oldatot 4 ’C hőmérsékleten éjjelen át gyengén keverjük, majd 4 n sósavoldattal 5,2 pH-értékre állítjuk be, amikor is csapadék válik ki az oldatból. Ezt centrifugálással elkülönítjük, acetonnal és dialkil-éterrel mossuk és megszántjuk; mennyisége 115 mg. A tiszta szupematáns folyadék nagynyomású folyadék kromatográfiai elemzés szerint 239 mg proinzulint tartalmaz, ami 60 %-os hozamnak felel meg.

A csapadékot az 1. példában leírt módon szulfitolízisnek vetjük alá, amikor is 120 mg nyers terméket kapunk, amelyből a fentebb leírt kezelés útján 88 mg proinzulin-S-szulfonátot különítünk el. Ezt 12,3 mg tioglikolsavval az első bekezdésben leírt módon újból diszulfidhíd képzésnek vetjük alá. 5,2 pH-értéknél gyenge zavarosodás képződik; a reakcióelegyet centrifugálva további 43 g száraz anyagot kapunk.

A centrifugálisnál kapott szupematáns folyadékot, amely nagynyomású folyadék-kromatográfiai elemzéssel meghatározva 55 mg proinzulint tartalmaz (az erre a lépésre számított hozam 62 %; az összhozam ennek megfelelően 73,5 %), egyesítjük az első lépésben 5,2 pH-értéknél végzett centrifugálás szupernatáns folyadékával.

Az elegyhez 6 g trisz-(hidroxi-metil)-metil-ammónium-kloridot adunk, az oldatot 7,2 pH-értékre állítjuk be, majd 0,6 egység tripszint és 6 egység B-karboxipeptidázt adunk hozzá. Az oldtot 25 ’C hőmérsékleten gyengén keverjük és nagynyomású folyadékkromatográfiai vizsgálattal ellenőrizzük a reakció előrehaladását. Körülbelül 3-4 óra múlva a proinzulin teljesen eltűnik az oldatból; helyette C-peptid és sertés-inzulin képződött.

A reakciót 40 ml 1 5-os cink-klorid-oldat hozzáadása és a pH- érték 5,4-re állítása útján befejezzük. Könnyen centrifugálható, pelyhes csapadék képződik, amely messzemenően sertés-inzulinból áll. A hozam 201 mg, ami a feldolgozott proinzulinra számítva 91 % termelési hányadnak felel meg. Az így elkülönített sertés-inzulin továbbtisztítása a szokásos módszerekkel, például ioncserélőn történhet.

Claims (3)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás a teljes inzulinvázat tartalmazó inzulin-prekurzoroknak a megfelelő nyíltláncú, az inzulin

   A-láncot és az inzulin B-láncot a cisztein-kénatomokon képezett S-szulfonátok alakjában tartalmazó előtermékből, valamely merkaptán jelenlétében, a nyíltláncú S-szulfonátot legfeljebb 10 mg/ml koncentrációban tartalmazó vizes közegben, 0 ’C és 37 ’C közötti hőmérsékleten, 7 és 11 közötti pH-értéknél lefolytatott diszulfidhíd-kapcsolási reakció útján történő előállítása során kapott reakcióelegyek feldolgozására, a helytelen rekombinánsok elkülönítésével és újbóli hasznosításával, azzal jellemezve, hogy a reakcióelegyet, kívánt esetben 1-400 mg/1 fiziológiailag ártalmatlan felületaktív anyag, előnyösen polietilén- és/vagy polipropilén-glikol típusú vízben oldódó polimer hozzáadása után, 4 és 6 között pH értékre állítjuk be; a levált csapadékot elkülönítjük és szulfolízis útján visszaalakítjuk az inzulin A- láncot és inzulin B-láncot tartalmazó, újbóli diszulfidhíd-képzési reakciónak alávethető S-szulfonáttá.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy felületaktív anyagként egy (III) általános képletű - ahol X jelentése 2-3 szénatomos alkoxicsoport, R² és R³ jelentése hidrogénatom, n jelentése egész szám 4 és 80, előnyösen 15 és 45 között, azzal a megszorítással, hogy a (III) általános képletű vegyület legalább 12 szénatomot tartalmaz - vegyületet alkalmazunk.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a felületaktív polimert 2-200 mg/1 mennyiségben adjuk a reakcióelegyhez.