HU198102B - Process for producing anthracycline derivates and pharmaceutical copositions comprising these compounds as active ingredient - Google Patents

Process for producing anthracycline derivates and pharmaceutical copositions comprising these compounds as active ingredient Download PDF

Info

Publication number
HU198102B
HU198102B HU862601A HU260186A HU198102B HU 198102 B HU198102 B HU 198102B HU 862601 A HU862601 A HU 862601A HU 260186 A HU260186 A HU 260186A HU 198102 B HU198102 B HU 198102B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
barminomycin
formula
culture
compounds
compound
Prior art date
Application number
HU862601A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT45563A (en
Inventor
Hamao Umezawa
Tomio Takeuchi
Tsutomu Sawa
Hiroshi Naganawa
Masa Hamada
Yoshikazu Takahashi
Masaya Imoto
Atsuo Odagawa
Takeshi Uchida
Original Assignee
Microbial Chem Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Microbial Chem Res Found filed Critical Microbial Chem Res Found
Publication of HUT45563A publication Critical patent/HUT45563A/hu
Publication of HU198102B publication Critical patent/HU198102B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/03—Actinomadura

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

Λ találmány tárgya eljárás új Ímtracíklin-szárma· zékok, és hatóanyagként c vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására.
Az antraciklin-vegyületek — például adriamicin, daunomicin és aklacinomicin — fontos tumorgátló hatású antibiotikumok, amelyeket a rák-kemoterápiában elterjedten használnak. Számos kísérlet történi a fenti antraciklin-vegyületek analógjainak és származékainak előállítására is.
A vegyületek többségének fiziológiai aktivitása nagymértékben függ a vegyület kémiai szerkezetétől. Az antraciklin-vegyületek sem kivételek e szempontból, ezért egyre nagyobb az igény olyan származékok előállítására, amelyek mind a cukor-rész, mind az aglükon-rész típusa, mind a fenti inolckularészekben található szubsztituensek szempontjából különböznek a már ismert vegyületektől.
A találmány szerinti eljárás az (I) általános képletű antracíklin-származékok (bárminőiméinek) előállítására vonatkozik. Az (I) általános képletben R jelentése (a), (b), (c) vagy (d) képletű csoport.
A találmány szerinti eljárással előállított antraciklinek kémiai szerkezetét az (1) általános képlet jellemzi. Az R szubsztituens (a), (b), (c) vagy (d) képletű csoportot jelenthet, és a fenti vegyületek az 5w-ös helyzetű aszimmetriás szénatom következtében két optikai izomer formában létezhetnek. Az R helyén (a), (b) vagy (c) képletű csoportot tartalmazó (í) általános képletű vegyületek az 1. ábra szerinti tautomer elegyek formájában léteznek, sztereospecifikusan egymásba könnyen átalakíthatok, és egyensúlyi állapotban rendszerint két ilyen tautomer elegyének formájában léteznek.
A fenti egyensúlyi állapot szerves oldószerekben hajlamos a (c) irányába eltolódni, míg víz és savak jelenlétében az egyensúly az (a) képződésének irányába tolódik el.
Mivel az R szubsztituens szempontjából két optikai izomer létezik, a tautomer is a két forma egyikében létezhet, amelyet a leírásban mint barinitiomlciii l et, illetve barminomicin ΙΙ-t említünk. Az R helyén (d) képletű csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületeket — amint azt a leírásban alább ismertetjük — a barminomicin I vagy II redukálásával állítjuk elő; azokat a vegyületeket, amelyeket a bárminőiméin I NaBH3CN-es redukálásával állítunk elő, a továbbiakban barminomicin Ir-nek, a barminomicin ll NaBH3CN-es redukálásával előállított vegyületeket pedig barminomicin Hr-nek nevezzük.
A barminomicin I-et és ΙΙ-t jelenleg mikroorganizmus-tenyészetekből állítjuk elő, és kémiai szerkezetüket a 2, ábrán feltüntetett analízis-sorozat szerint határozzuk meg.
A barminomicin I és II fő ion-csúcsa FD--MS meghatározással m/z = 639 értéknél van, és a két vegyület hasonló abszorpciós spektrummal rendelkezik az ultraibolya és látható tartományban, továbbá infravörös abszorpciós spektrumuk és ’H-NMR-spcktrumuk is nagyon hasonló. Azonban vékonyréteg-kromatográfiás Rf értékük és fajlagos forgatóképességük eltérő, és a fenti különbségek alapján arra következtethetünk, hogy a vegyületek két különböző sztereo2 izomernek felelnek meg. Mimikéi vegyiikíhií! vörös ágiikon képződik, ha 0,1 n sósavohíatban 85 °C-on 30 percen át melegítjük, és a fenti ágiikon 'H-NMRspektruma, tömegspektruma és egyéb analízisek ered ménye alapján kamrinomicinnek [(2) képlet, Journal of Antibiotics, 29, 469—471 (197ó)J bizonyult. Λ vegyületekből származó aglükonnal 1%-os kénsawal 30 °C-on végzett részleges hidrolízissel egy vörös glükozik is képződik. Az így kapott glükozidok ..
(3) képletű autentikus karminomicin I-re emlékeztetnek, szilikagélen mutatott Rf értékük, fajlagos forgatóképességük és ^-NMR-spektrumuk alapján [Journal of Antibiotics, 27, 254-259 (1974)].
Ha a bárminőiméin I-ct metanol és 1 n sósavoldat 2 :1 térfogatarányű elegyében oldjuk, és az oldatot NaBH3CN-del redukáljuk, két vörös glükozik képződik. Az egyik glükozid fajlagos forgatóképessége ([a]p9 = +178° (c = 0,02, kloroform); dokumentált érték +170,4° (c- 0,053. kloroform), és az 1. táb- < lázaiban közölt ’jf-NMR-spcktruma alpján (4) képletű karminotniein IH-nak (azonos a 4-hodroxi-bí>;imicin A;-gyd vagy rubcomicin Aj-gyel) bizonyuk [Antibiotiki, 488—492 (1980); Journal of Anfibiotics, 34, 774—776 (1981); és Journal of Antibiotics,
34, 938—950 (1981)]. A másik redukált forma (barminomicin Ír) nagyon hasonlít az előző g’ükozidhoz, azzal az eltéréssel, hogy fő ioncsúcsa m/z = 642 (M + Hj FD—MS módszerrel mérve; Í3C-NMRspektrumában (9. ábra) 33 szénatomot azonosítottunk, és a 3'-he!yzetű szénatom kémiai eltolódása (51,6 ppm), és a 6' helyzetű szénatom kémiai eltolódása (52,8 ppm) a 13 C—NMR-spektrumban jelentősen eltér a karminomicin Ili megfelelő kémiai eltolódásaitól. A barminomicin ír ’H—NMR-spektrumának (6. ábra) analízise azt mutatja, hogy a fenti vegyület szerkezete az (5) képlettel jellemezhető.
Ha a barminomicin Η-t redukáljuk a fenti módon NaBH3CN-del, (4) képletű karminomicin ΙΙ-t (azonos a 4-hidroxi-baumicin A2-vcl vagy rubeomicin A-val; lásd a karminomicin Ií! cselén megadott irodaimi forrásokat) ([α]θ = + 124° (c = 0,015, kloroform); dokumentált érték 120,6° (c — 0,199 kloroform); m/z = 660 (M + H)+ FD—MS módszerrel mérve; és ’H-NMR-spektruma (1. táblázat alapján), és barminomicin Ilr-t kapunk. Az utóbbi vegyület FD—MS spektruma (m/z = 642 (M + H)+) és ’H-NMR-spektrum adatai (8. ábra) alapján az (5) szerkezeti képlettel jellemezhető. Megjegyezzük azonban, hogy a barminomicin ír és llr az 5’'-helyzetű szénatom következtében valószínűleg eltérő sztereoizomer formában vannak, figyelembevéve a vékonyréteg-kromatográfiás Rf értékekben (szilikagél) és a fajlagos forgatóképessegben mutatkozó jellegzetes eltéréseket.
A fenti adatok és a két vegyület alább ismertetett fizikai-kémiai tulajdonságai arra engednek következtetni, hogy a barminomicin I és barminomicin II az (í) képletű vegyületek egyike, vagy annak tautomer, elegye, és a két vegyület az 5-lielyzctű szénatomra nézve egymásnak optikai izomerje. A barminomicin 1 és II fenti szerkezeteit az is alátámasztja, hogy azok például oldat-formában tárolva egymásba kölcsönösen átalakulhatnak.
193 102
1. táblázás
Kanninotnicin Hl és II lH-NMR-spektni»ia (400 MHz, d-CHClybanj
Karminoinicin 111 Karminoinicin II Karminoinicin 111 Karminoinicin II
δ (ppm) Jel alakja δ (ppm) J el alakja δ (ppm) Jel alakja δ (ppm) Jel alakja
7-CH3 1,06 d 1,17 d 3'-H 4,17 m 4,23 IB
4-CH3 1,23 d 1,20 d l'-H 4,74 t 4,85 dd
6'-CIl3 1,32 d 1,30 d 10 7-H 5,20 széles s 5,18 széles s
2'-CH2 ~l,80 ni — 1,90 111 l'-H 5,44 dd 5,48 dd
2-CH2 1,85 m 1,86 m 3-H 7,31 dd 7,26 dd
8-Hax 2,08 dd 2,09 dd 2-H 7,71 dd 7,67 dd
8-Heq coch3 2,29 2,42 ddd s 2,31 2,41 ddd s 15 1-H 7,87 dd 7,77 dd
10-Hax 2,98 d 2,94 d
3-H 10-Heq 6-Hb 6-Ha 5-H 4'-H 5'-ll 3,09 3,23 3,41 3,51 3,80 3,93 4,14 m dd széles d i dd 1 m széles s dq 3,29 3,20 3,54 m dd m 20 Barminomicin fizikai-kémiai tulajdonságai A találmány szerinti eljárással előállított bárminőiméin I és II, illetve azok megfelelő redukált formái,
~3,84 3,80 4,14 m ni dq a barminomicin Ir és Hr fizikai-kémiai tulajdonságait a 2. táblázatban foglaljuk össze. A vizsgálatokat a 2. példa szerint előállított tautoincr barminomicin 1-gyel és 11-vel véoeztük.
25
2. táblázat
Barm momicin-vegy iiletek fizikai-kém iái tulajdonságai
I II ír Ilr
1. Szín narancsvörös narancsvörös narancsvörös narancsvörös
2. FD—MS, m/z 639 (M)+ 639 (M)+ 642 (M + 1I)+ 642 (M + H)+
3. Olvadáspont - - 129—134°C 124-132 °C
4. Fajlagos forgatás + 235° (c = 0,017, CHC13) + 184° (c = 0,025, CHC13) + 294° (c = 0,043, CHC13) + 187° (c = 0,023, CHC13)
5. Abszorpciós spektrum 233 (712) 233(702) 233(666) 233 (663)
UV és látható tartományban 253 (505) 291(150) 253(499) 291(145) 253(489) 290(145) 253 (486) 290(148)
max' nm (E^°m) 491(275) 491 (270) 491 (272) 490(270)
0,1 n HCI—90% metanol, 525 (180) 525 (176) 525 (179) 525 (177)
elegyben
6. IR-abszorpciós spektrum 3. ábra (CHCl3-ban) 4. ábra (CHCl3-ban) 5. ábra (KBr-tabletta) 7. ábra (KBr-tabletta)
7. ’H—NMR-spektrum 3. táblázat 3. táblázat 6. ábra 8. ábra
8. Rf érték szilikagél 0,42 0,35 0,34 0,29
vékonyrétegen
9. tR HPLC 7,0 perc 3,5 perc 7,6 perc 7,2 perc
10. Stabilitás szilikagélen koncentrálás közben bomlik, sav- és fényérzékeny szilikagélen koncentrálás közben bomlik, sav- és fényérzékeny sav- és fényérzékeny sav- és fényérzékeny
11. Oldhatóság
a) oldódik kloroform, etil-acetát, etanol, metanol, acetonitril, dimetil-szulfoxid kloroform, etil-acetát etanol, metanol, ncctoi ál 1 il, dimet. 1-szulfoxid kloroform, etil-acetát, etanol, metanol, acetonl tril, dimetil-szulfoxid kloroform etil-acetát, etanol, metanol, acetoui 11 il, dimetil-szulfoxid
198 102 ο
2. táblázat (folytatás)
I II ír Hr
b) rosszul oldódik víz, hexán, petroléter víz, hexán, petroléter víz, hexán, petroléter víz, hexán, petroléter
*: futtatóelegy: kloroform—metanol—ecetsav—víz (60:10:1 :1). **: oszlop: Nuclcosil5Ci8 (4,6X250 mm) (M-Nagel terméke), eluens: acetonitril-0,2 %-os vizes foszforsav (40 átfolyási sebesség: 1,5 ml/perc.
60),
3. táblázat
Barminomicin I és H * 1 * * 4II -NMR -spektruma [400MHz, d-CHCl3-d-MeOH (2:1/}
Barminomicin I Barminomicin II
δ (ppm) Integ- ráció Jelalak δ (ppm) Integ- ráció Jelalak
1,21 3H d
1,23 3H d 1,18-1,33 9H dX3
1,27 3H d
1,72 2H m 1,75-1,98 4H m
1,89 2H in
2,15 IH dd 2,13 IH dd
2,37 IH ddd 2,38 IH ddd
2,43 3H s 2,43 3H s
3,07 IH d 3,05 IH d
3,18 IH in 3,15 IH in
3,23 IH dd 3,21 IH dd
3,53 IH m 3,47 IH ni
3,60 IH széles s 3,57 . IH széles s
4,03 IH m 3,96 IH m
4,17 IH dq 4,20 IH dq
5,24 IH dd 5,23 IH dd
5,47 IH dd 5,47 IH dd
7,35 IH dd 7,33 IH dd
7,76 IH dd 7,75 IH dd
7,91 IH dd 7,90 IH dd
Az antraciklin-származékokat — a barminomicin
I és 11-t — mint már említettük, jelenleg kizárólag mikroorganizmusok fermentálásával állítjuk elő. A fenti vegyületeket azonban előállíthatjuk analóg vegyületek szintetikus kémiai vagy mikrobiológiai módosításával, vagy teljes egészében kémiai szintetikus úton is.
A találmány értelmében az (I) általános képletű vegyületeket egy, az Actinomadura nemzetségbe tartozó, barminomicin I vagy II termelésére képes mikroorganizmus fermentálásával állítjuk elő.
Vizsgálataink szerint az általunk izolált MG— 463—yF4 törzs képes barminomicin I és ΙΙ-t termelni, megjegyezzük azonban, hogy más erre alkalmas törzset is lehet az antibiotikum-termelő mikroorganizmusok izolálására szokásosan alkalmazott eljárásokkal izolálni természetes forrásokból. Az MG463—yF4 vagy más barminomicin I és/vagy U termelésére képes törzs barminomicin I és/vagy II termelőképességét is fokozhatjuk, ha a fenti törzseket besugározzuk, vagy más szokásos kezelésnek vetjük alá. Barmino20 micin I vagy II termelőtörzseket génsebészeti eljárással is előállíthatunk oly módon, hogy a barminomicin termelésére vonatkozó genetikus információt tartalmazó DNS-gént transzformálással, sejtfúzióval, vagy más szokásos eljárással bevisszük a gazdasejtbe.
A barminomicin Ir-t és llr-t a barminomicin I, illetve II redukálásával állítjuk elő, kémiái eljárások segítségével.
Az antraciklin-származék bárminőiméin termelésére képes mikroorganizmusként azonosított MG463—yF4 ?0 törzs jellemzőit az alábbiakban foglaljuk össze.
(A) Eredet és letétbe helyezés
Az actinomycesek közé tartozó MG463—yF4
-ag törzset az Institute of Microbial Chemistry izolálta 1982. októberében Japánban (Nagoku-shi, Kochi). A törzset a Fermentation Research Institute, tbc Agency of Industrial Science and Technology-nál helyeztük letétbe 1983. november 24-én, FERM—P
7352 szám alatt, amely később a FÉM BP—1044 letéti számot kapta.
(B) Mikológiái tulajdonságok ^5 (1) Morfológia
Az MG463-yF4 törzs mikroszkópos képe alapján meglehetősen hosszú micéliummal rendelkezik, amely elágazó lég-hifából ered.
A lcg-micéliumon hajlott spóralánc van, és a 60 végén egy 2-4 μιη átmérőjű pscudo-sporangium, 10 vagy több spórából álló lánccal, amely tömör spirális tekercset alkot, A spórák felülete sima.
(2) Szaporodás különféle tápközegekben f.5
A zárójelben levő szín—jelöléseket a Color Harmony Manual of Container Corporation of America szerint adjuk meg.
(a) Szaccharóz-nitrát-agar tápközeg θθ . (inkubálás 27 °C-on).
Narancsszínű [5g, Peach Tan] — halványvörös [6—l/2ic, Coral Rose] tenyészethez tapadó fehér - halványrózsaszín [5ba, Shell Pink] légmicéliumok. Enyhén bíborba játszó oldható pigment képződik.
198 102 (b) Glükóz-aszparagin-agar tápközeg (inkubálás 27 °C-on).
A tenyészet színe halványsárgától [2ea, LtWheat — 2gc, Bamboo] fakó narancssárga [31c, Amber] változik. Nincs tapadó lég-micélium. Nem észlelhető' oldható pigmentképződés.
(c) Glicerin-aszparagin-agar tápközeg (ISP—5. tápközeg, inkubálás 27 C-on).
A tenyészet színe fakó narancsszínű [3ic, Pástéi Orange], Nincs tapadó lég-micélium. Nem észlelhető oldható pigmentképződés.
(d) Keményítő-szervetlen só-agar tápközeg (ISP—4. tápközeg, inkubálás 27 °C-on).
Halvány narancsvöröstől [5ic, Lt Persiimnon] halvány vörösig lóié, Coral Rose] változó színű ' tenyészethez tapadó fehér — halvány rózsaszín lég-micéliumok. Nincs oldható pigmentképződés.
(e) Tírozin-agar tápközeg (ISP—7. tápközeg, inkubálás 27 °C-on).
A tenyészet színe halvány narancsszíntől halvány sárgásbarnáig [3ic, Lt Amber] változik. Nincs tapadó lég-micélium képződés. Nem figyelhető meg oldható pigmentképződés.
(f) Tápagar (inkubálás 27 C-on).
A tenyészet színe fakó lilásvörösig [6—1,2ni, Rose Brown] változik. Nincs tapadó lég-micélium. Nem képződik oldható pigment.
(g) Élesztő-maláta-agar tápközeg (ISP-2. tápközeg, inkubálás 27 °C-on).
A tenyészet fakó vörös [6—l/2ne, Brick Red] színű. Nincs tapadó lég-micélium. Nem képződik oldható pigment.
(h) Zabliszt-agar tápközeg . (ISP—3. tápközeg, inkubálás 27 °C-on).
Halvány bíborvöröstől [7ic, Colonial Rose] fakó bíborvörösig [8 le, Rose Wine] változó színű tenyészeten tapadó fehér — halvány rózsaszín lég-micéliumok. Az oldható pigment bíborvörös árnyalatú. Néhány csepp 0,5%-os vizes nátriumhidroxid hozzáadására az oldható pigment színe kékes bíborra változik, míg néhány csepp 0,5 n vizes sósavoldat hozzáadására a szín narancsszínűre változik.
(i) Glicerin-nitrát-agar tápközeg (inkubálás 27 °C-on).
A tenyészet színe halvány vöröses narancsszínű [4ic, Pástéi Orange — Sic, Lt Pcrsimmon]. Nincs tapadó lég-micélium. Nincs oldható pigmentképződés.
(j) Keményítő-agar tápközeg (inkubálás 27 °C-on). Színtelentől halvány rózsaszínig változó színű tenyészeten fehér lég-micéliumokból' vékony film képződik. Nem képződik oldható pigment.
(k) Kalcium-malát-agar tápközeg (inkubálás 27 °C-on).
A tenyészet színe színtelen — sárgásbarna [3gc, Lt Tan]. Nincs lég-micélium képződés. Nem észlelhető oldható pigment.
(l) Cellulóz (szűrőpapír-darabkákat tartalmazó oldat, inkubálás 27 °C-on).
Halvány rózsaszínű tenyészeten [7ec, Rose Mist] fehér lég-micéliumokból vékony film képződik.
(uí) Zselatinos szűrt tenyészet
Egyszerű zselatlnos tápkozegben inkubáiva 20 °Con, a tenyészet halvány narancsszínű — fakóvörös [6ic, Coral Rose — 71e, Antique Rose]. Nincs tapadó lég-micélium képződés, és nem észlelhető oldható pigment.
Glükóz-pepton-zselatin tápközegen 27 °C-ou inkubáiva, a tenyészet színtelen - halvány narancsszínű. Nincs tapadó lég-micélium és oldható pigmentképződés.
(n) Lefölözött tehéntej (inkubálás 37 °C-on).
A tenyészet halvány vörösesbarna [5ic, Lt Persimmon] színű. Nincs tapadó lég-micélium, és nincs oldható plgmcntképződés.
(3) Fiziológiai tulajdonságok (a) Szaporodási hőmérséklet
A vizsgálatot keményítő-szervetlen só-agar tápközegen (ISP—4. tápközeg) végezzük, 20, 24, 27, 30, 37 és 50 °C-on).
A mikroorganizmus az 50 °C-os inkubálási hőmérséklet kivételével képes szaporodni, az opti25 malis szaporodási hőmérséklet 27-37 °C.
(b) Zselatin elfolyósítás (15 %-os egyszerű zselatinos tápközegben 20 °C-on, illetve glükóz-peptonzselatin tápközegen, 27 °C-on).
napos tenyésztési idő alatt nem észlelhető 30 zselatin elfolyósítás sem egyszerű zselatinos, sem glükóz-pepton-zselatinos tápközegben.
(c) Keményítő hidrolízise (inkubálás keményítőszervetlen só-agar tápközegben vagy keményítőagar tápközegben 27 °C-on).
21 napos tenyésztési idő alatt nem figyelhető meg hidrolízis, sem keményítő-szervetlen só-agar, sem keményítő-agar tápközegben.
(d) Lefölözött tehéntej koagulálása és peptonizálása (lefölözött tehéntejben 37 °C-on inkubáiva). Sem koaguláció, sem pcptonizáeió nem észlelhető 28 napos tenyésztési idő alatt.
(e) Melanin pigmentképződés (inkubálás 27 °C-on), (i) tripton-élesztö tápfolyadékban (ISP—1. tápközeg), (ü) pepton-élcsztő-vas-agaron (ISP—6. tápközeg), (iii) tirozin-agaron (ISP—7. tápközeg).
Minden egyes tápközeg esetén negatív eredményt kapunk.
(f) Szén-források hasznosítása (Pridham— Gottliebagar tápközeg, ISP-9. tápközeg, inkubálás 27 °C-on).
A mikroorganizmus hasznosítja az L-arabinózt, D-xilózt, D-glükózt és D-ramnózt, de nem képes gg hasznosítani a D-fruktózt, szaccharózt, inozitot, raffinózt vagy D-mannitot.
(g) Kalcium-malát oldása (kalcium-malát-agaron, 27 °C-on).
Nem figyelhető meg a kalcium-malát oldása.
01) Nitrát indukciója (0,1 % KNOs-ot tartalmazó vizes peptonoldatban, ISP-8. tápközeg, 27 °C-on).
Pozitív eredmény.
A fenti eredményeket az alábbiak szerint összegez65 hetjük: morfológiailag a törzs kiteijedt lég-micélium 5
193 102 spin!(képzüllés figyelheti) meg, és jellegzetes psendosporangiuinmal rendelkezik. A spórák sima fclületüek.
A törzs különféle tápközegekben szaporodik, a tenyészet halvány narancssárga — halvány vörös, vagy fakó bíborvörös színű, tapadó fehér — halvány rózsa- 5 színű lég-inicéiiumokkat. Zablísz.t-agar tápközegbeu bíborvörös oldható pigment képződik, amelynek színe a pH-tól függően változik. Nem képződik melaninszerű festék, a proteolízis és keményítő liidrolízis eredménye negatív.
Az MG463-yF4 törzs a IIIB típusra tartozik, a Lechevalier és munkatársai által [International Journal of Systematic Bacteriology 20, 435 (1970)] javasolt, a sejtfal jellegzetes komponensei alapján való osztályozás szerint, mivel a teljes sejt nem tartalmaz mezo-2,6-diamino-pimelinsavat, és a cukor-komponensek közül glükózt, mannózt, ribózt és madurózt.
A fenti tények figyelembevételével megállapíthatjuk, hogy az MG463-yF4 törzs az Actinomadura nemzetsége tartozó Actinomycesek közé tartozik.
Az alábbi két faj - amelyeket az Actinomadura nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok azonosítására szolgáló láblázatluin isincrlcllek l'ihe Biology ol' tbc Actonomycetes and Related Organisms 12, 30, (1977)] homológnak tűnik az MG463~yF4 törzzsel; ezek az Actinomadura roseoviolacea [Nonomura és munkatársai: Hakko Kogaku Zasshi 49, 904 (1971)], és az. Actinomadura carminata [Gorsc és munkatársai: Antibiotiki 8, 675 (1973)].
A fenti két faj mindenben hasonlít egymásra, kivéve a lég-hifák színét. A fenti táblázat adatai szerint 10 az Actinomadura carminata zabliszt-agaron halvány lillás-vöröses, vagy vöröses bíborszínű lég-hifákat képez, míg az Actinomadura roseviolacea rózsaszínpiros lég-hifákat növeszt. A fentieket tekintetbe véve mindkét fenti fajt kísérletesen kellene összehasonlí'5 tani az MG363-yF4 törzzsel, azonban az Actino madura carminatát nem sikerült beszereznünk.
Az Actinomadura roseviolacea IMC A-0013 (KCC A-0145) és az MG463-yF4 törzs összebason,θ Utó vizsgálatainak eredményét a 4. táblázatban fogz latjuk össze; az Actinomadura carminatara vonatkozó adatokat az irodalmi források figyelembevételével tüntettük fel.
4. táb'ázat
Összehasonlító vizsgálat
Jellemző MG 463-yF4 Actinomadura roseviolacea, IMC A-0013 (KCC A-0145 λ Actinomadura carminata J
Lég-micélium morfológiája hajlott — tömör spirális tekercs, pseudosporangiummal hajlott - tömör spirális tt keres, pseudosporangiummal egyenes — tömör spirális tekercs, pseudosporangiummal
Spóra felülete sima si na sima
Lég-micélium színe fehér — halvány rózsaszín fehér — halvány rózsaszín fehér — rózsaszín
Tenyészet színe fakó narancs — halványpiros — fakó bíborvörös hrlvány narancs — hrlványpiros — fakó bíborvörös halványpiros — bíborvörös — feketés bíbor
Oldható pigment negatív - bíborvörös negatív - bíborvörös negatív - bíborvörös
Oldható pigmentek színének pH-függése + NaOH: kékes bíbor + HCI: narancsszínű 4 NaOH: kékes bíbor + HCI: narancsszínű
Mclanin-szcrű pigment képződés (ISP 1,6 és 7) negatív negatív negatív
Keményítő hidrolízise negatív negatív
Tehéntej koagulálása negatív negatív
Tehéntej peptonizálása negatív negatív (irodalom szerint gyengén pozitív)
Zselatin elfolyósítása egyszerű zselatin giükóz-pepton-zsel atin negatív negatív negatív (irodalom szerint pozitív) negatív
Szén-források hasznosítása D-glükóz L-arabinóz D-xilóz D-laktóz szaccharóz inozit pozitív pozitív pozitív negatív negatív negatív pO7 tív. pozitív negatív negatív negatív negatív
-6ϊ ί
198 102
4. táblázat (folytatás)
Jellemző MG463- yF4 Actinomadura roseviolacea, IMC A—0013 (KCC A-0145' j Actinomadura carminata
L-ramnóz pozitív pozitív
raffinóz negatív negatív
D-mannit negatív negatív
Optimális tenyésztési 27-37 °C 27—37 °C 28-30 °C
hőmérséklet (iroda’om szerint 30—40 °C)
Antibiotikum termelés karminomicin,
rubeomicin, stb. irodalom szerint semmi karminomicin
A fentiek szerint az MG463-yF4 törzs nagyon hasonlít az Actinomadura roseviolacea IMC A—0013 törzsre, kivéve a D-xilóz hasznosításában mutatkozó kis eltérést. Az irodalmi adatok szerint az Actinomadura roseviolacea zselatin elfolyósítása és tehéntej 20 peptonizáiása gyengén pozitív, kísérleteink szerint a vonatkozó eredmények negatívak. A karminomicin termelő mikroorganizmusként ismert Actinomadura carminatára vonatkozó fiziológiai és biokémiai adatok többsége hiányzik; ez a fajta az MG463-yF4 törzstől 25 az optimális tenyésztési hőmérsékletben különbözik; de nem tudjuk, hogy a két fajta egyéb tulajdonságaiban is különbözik-e egymástól. A morfológiai és tenyésztési tulajdonságok szempontjából nem látszik lényeges különbség az MG463-yF4 és az Actino- 30 madura carminata között. Az Actinomadura carminata és Actinomadura roseviolacea közötti különbségek is tisztázatlanok. Ezért — noha határozottan megállapíthatjuk, hogy az MG463—yF4 törzs nagyon hasonlít az Actinomadura roseviolaceara - nem zár- 35 hatjuk ki annak a lehetőségét sem, hogy a hasonló antibiotikumot termelő Actinomadura carminata is rokon faj. Szükségesnek tartjuk tehát beszerezni egy Actinomadura carminata mintát, és az összehasonlító vizsgálatokat az MG463—yF4 törzzsel erre a mikro- 40 organizmusra is elvégezni.
A fenti vizsgálatok eredményeként arra a következtetésre jutottunk, hogy az MG463—yF4 törzs mind az Actinomadura roseviolacea, mind az Actinomadura carminata mikroorganizmussal·szoros rokon- 45 ságban van.
A barminomicin I-et és ΙΙ-t a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hogy egy barminomicin I és II termelésére képes, az Actinomadura MG463—yF4 mikroorganizmust vagy annak barminomicin I és/vagy II 50 termelésére képes mutánsát, vagy variánsát megfelelő tápközegben aerob körülmények között tenyésztjük, és a keletkezett antibiotikumot a tenyészetből kinyerjük. A tápközeg bármely olyan tápanyagforrást tar- 55 talmazhat, amelyet a barminomicin I-et és/vagy Il-t termelő fenti mikroorganizmus hasznosítani képes. Szénforrásként például glicerint, glükózt, szaecharózt, maltózt, dextrint, keményítőt és zsírokat, és olajokat tartalmazhat a tápközeg. Nitrogénforrásként például θθ szerves anyagokat - így szójabab-lisztet, gyapotmagoiajpogácsát, húskivonatot, peptont, szárított élesztőt, vagy kukoricalckvárt —, vagy szervetlen anyagokat - így aminóniumsókat vagy nitrátokat, például ammónium-szulfátot, nátrium-nitrátot vagy ammó- 65 nium-kloridot — használhatunk. Szükség esetén szervetlen sókat — például nátrium-kloridot, káliumkloridot, foszfátokat és nehézfémsókat — is adhatunk a tápközcgliez. A fermentáció során a habképződést habzásgátló szerek - például szilikon- vagy szójabab□laj — hozzáadásával akadályozhatjuk meg, a habzásgátló szereket a szokásos koncentrációban használjuk.
A tenyésztést az antibiotikumok fermentálására szokásosan alkalmazott aerob folyékony merített tenyészetben végezzük előnyösen. A tenyésztési hőmérséklet célszerűen 20—35 °C, előnyösen 25—30 °C. A képződött barminomicin I és/vagy II mennyisége 3—5 nap alatt éri el a maximális értékét, attól függően, hogy a tenyésztést rázott tenyészetben vagy levegőztetett és kevert tenyészetben végeztük-e.
A fenti módon barminomicin I-ben vagy H-ben feldúsult tenyészetet kapunk. A barminomicin I vagy II részben a mikroorganizmus-sejten belül található, az antibiotikum fő tömege azonban a tenyészet szüretében van.
A barminomicin I-et és/vagy ΙΙ-t ismert módon nyerhetjük ki a tenyészetből. Az egyik elválasztási módszer extrakción alapul. Közelebbről, a tenyészet szűrletében levő barminomicin I-et és/vagy ΙΙ-t, a banninomicin I és/vagy II vízzel nem elegyedő oldószereivel - például etil-acetáttal, butil-acctáttal, Horofomimal, butanollal — extraliálhatjuk (nagy I atékonyságú extrakciót érhetünk el, ha a tenyészet szűrletének pH-ja semleges, vagy enyhén bázikus). Ha az antibiotikum a tenyésztett mikroorganizmus sejtjeiben van, a sejteket szűréssel, centrifugálással vagy egyéb módszerrel összegyűjtjük, és az antibiotikumot etil-acetáttal, kloroformmal, metanollal, etanollal, butanollal, acetonnal, metil-etil-ketonnal, sósavoldatt il vagy ecetsavoldattal végzett kezeléssel kinyerjük. A tenyészetet a sejtek elválasztása nélkül, közvetlenül ir extrahálhatjuk a fenti oldószerekkel. A sejteket az extrahálás előtt feltárhatjuk. Az extrahálást ellenáramú megoszlásos eljárással is végezhetjük.
A barminomicin I-et és/vagy ΙΙ-t adszorpción a’apuló eljárással is kinyerhetjük, oly módon, hogy a kívánt antibiotikumot tartalmazó folyadékot — például a tenyészet szűrletét vagy extraktumát, amelyet a fenti eljárással állítunk elő — oszlopkromatográfiás, folyadék-kromatográfiás vagy egyéb elválasztási eljárásnak vetjük alá, megfelelő adszorbenst - például Dia-Ion I1P20 (Mitsubishi Chemie;,I Industries, Limited) gyantát, alumínium-oxidot, szilikugélt vagy Sephadex LH20 (Pharmacia Fine Chemicals) gyantát 7
-713
198 102 használva, és az adszorbcáit antibiotikumot megfelelő oldószerrel eluáljuk. Az eluátumot ezután vákuumban szárazra párolva nyerstermékként bartuinomiein I-et és/vagy H-t kapunk, vörös por formájában.
A nyerstermék barminomicin I-et és/vagy H-t megfelelő számú, fent említett extrakciós és adszorpciós eljárással, vagy azok kombinálásával tisztíthatjuk, kívánt esetben átkristályosítással kiegészítve. Tisztítási eljárásként célszerűen adszorbensen vagy gélszűrő anyagokon, például szilikagélen, enyhén savas ioncserélő gyantán, például Sephadex LH20-on vagy Dia-Ion HP20-on végzett oszlopkromatográfiát, megfelelő oldószerrel végzett folyadék-kromatográfiát, ellenáramú megoszlást, és vékonyréteg-kromatográfiát használhatunk, külön-külön, vagy egymással kombinálva. A tisztítást közelebbről például az alábbiak szerint végezhetjük. A nyerstermék barminomicin I-et vagy ΙΙ-t kevés kloroformban oldjuk; az oldatot szilikagél-oszlopra visszük, és az oszlopot megfelelő oldószerrel eluáljuk; a kívánt terméket tartalmazó frakciókat egyesítjük és vákuumban koncentráljuk; a koncentrátumot vékonyréteg-kromatográfiás elválasztásnak vetjük alá, és a kívánt terméket lényegében homogén formában kinyerjük. A kapott terméket nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással tovább tisztíthatjuk.
A barminomicin Ir-t vagy Ilr-t a találmány értelmében úgy állíthatjuk elő, hogy a megfelelő barminomicin I-et vagy H-t szintetikus kémiai eljárásokkal redukáljuk. A redukálást a szerves kémia területén szokásosan alkalmazott eljárásokkal végezhetjük; például a barminomicin I-et és/vagy H-t metanolban oldjuk, és NaBHaCN-del redukáljuk. A kapott barminomidin Ir-t és/vagy Ilr-t megfelelő eljárásokkal — például az antraciklin glikozidok területén szokásos szilikagélen végzett kromatográfiás eljárással — izolálhatjuk és tisztíthatjuk.
A találmány szerinti eljárással előállított barminomicin-származékok rákellenes hatással, és igen erős mikróbaellenes hatással rendelkeznek, fenti hatásuk következtében gyógyszerkészítmények hatóanyagaként használhatók. Biológiai tulajdonságaikat az alábbiakban ismertetjük.
(1) Citotoxikus hatás (szövettenyészetben)
A találmány szerinti eljárással előállított banninomicin-származékok igen alacsony koncentrációban gátolják a tenyésztett P388 leukémia-sejtek szaporodását. A fenti vegyületek citptoxicitása 1 —100-szor nagyobb, mint az adriamiciné vagy a karminomicinsorozatba tartozó egyéb antraciklin-számiazékoké. Az eredményeket részletesen az 5. táblázatban ismertetjük. A vizsgálatot a J. Antibiotics 38, 1171 — 1181 (1985) irodalmi helyen ismertetett módon végezzük.
5. táblázat
Antraciklin-származékok citotoxikus hatása ___Vegyület ICSO (pg/ml)
Találmány szerinti vegyületek barminomicin I ~0,00001 barminomicin II ~0,00002
5. táblázat (folylátás)
Vegyület ICS0 (jug/ml)
barminomicin ír 0,0015
barminomicin lír 0,002
Kontroll vegyületek
kanninomicin I 0,002
karminomicin ll 0,010
kanninomicin Ili 0,006
adriamicin 0,0013
(2) Tumorellenes aktivitás
CDFj egerekbe intiapcriloncálisan egerenként 1X105 L1210 leukémia-sejtet transzplantálunk. A transzplantálás után azonnal 0,25 ml vizsgálandó vegyületet tartalmazó oldattal kezeljük íntraperitoneálisan az állatot, a ő. táblázatban feltüntetett kísérleti elrendezés szerint. A vizsgált vegyületek tumorellenes aktivitását - melyet a túlélési idő %-os meghosszabbodásával fejezünk ki (T/C%) — szintén a 6. táblázatban adjuk meg. 100%-nak vesszük a kontroll — vagyis a csak fiziológiás sóoldattal kezelt - állatok napokban mért túlélési idejét (a 0. nap az L1210 transzplantálás napját jelenti). [J. Antibiotics 36, 1080-1083 (1983); és Biomedicine and Pharmacotherapy 41, 227-232(1987)].
6. táblázat
Tumorellenes aktivitás
Dózis* (pg/egér/nap) Barminomicin I Barminomicin ll
0,25 pusztulást okozó mérgezés a 4. napon, 120% pusztulást okozó mérgezés a 4. és 5. napon
0,125 mérgezési tünet, 147% mérgezési tünet, 173%
0,0625 mérgezési tünet, 213%, 147% mérgezési tünet, >500%, 173%
0,0313 mérgezési tünet, >500%, 147% mérgezési tünet, 140%.
0,0157 mérgezés; tünet, 187%, 120% mérgezési tünet, 120%
0,0078 mérgezési tünet, mérgezési tünet,
160% >500%, >500% *: adagolás: 0-10. napon (naponta)
Dózis** (pg/egár/nap) Barminomicin ír Barminomicin Ilr
40 mérgezés, 25% mérgezés, 37%
20 mérgezés, 37% mérgezés, 43 %
10 mérgezési tünet, mérgezési tünet,
49% 86%
5 141% 123%
2,5 129% 129%
1,25 97% í 23 %
**: adagolás: 0—9. napon (naponta).
-815
198 102 (3) Antimikrobiális aktivitás
A találmány szerinti eljárással előállított barminomicin I és ír, valamint a karminomicin III antimikrobiális aktivitását agar-hígításos módszerrel [J. Antibiotics 38, 1171 — 1181 (1985)] határozzuk meg. Λ minimális inhibitor koncentráció (MIC) értékeket a 7. táblázatban ismertetjük.
7. táblázat
Antimikrobiális hatás
MIC (pg/ml)
Mikroorganizmus Barminomicin I Barminomicin ír Karminomicin III
Staphylococcus aureus FAD 209P 0,2 0,78 3,12
S. aureus Smitlr 0,2 0,78 3,12
S. aureus MS8710 0,2 1,56 1,56
S. aureus MS9610 0,2 1,56 1,56
Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 0,2 0,78 1,56
Bacillus subtilis PCI 219 <0,1 0,39 1,56
Escherichia coli NlIíJ 3,12 50 >50
E. coli K-l2 0,78 6,25 >50
E. coli BEI 121 <0,1 0,2 1,56
E. coli BEI 186 <0,1 0,2 1,56
Klebsiella pneumoniae PCI 602 0,39 6,25 50
Serratia marcescens 0,78 3,12 25
Proteus vulgáris OX19 3,12 >50 >50
Pseudomonas aeruginosa A3 1,56 12,5 >50
Mycobacterium smegmatis 607 0,78 6,25 6,25
1. példa
(1) Inokulum előállítása
A tenyésztést az alábbi összetételű tápközegben végezzük:
glükóz 1 %
glicerin 1 %
szaccharóz 1 %
zabliszt 0,5%
adipron (kereskedelmi név) 2 %
press-yeast (kereskedelmi név) 1 %
kazein-aminosavak 0,5%
kalcium-karbonát 0,2%
(pH 7,0-re állítva sterilezés előtt)
A fenti tápközeg 100 ml-ét 500 ml-es Erién-
meyer-lombikba öntjük és sterilizáljuk. A tápközeget 1 kacsnyi ferde agaron tenyésztett MG463-YF4-gyel leoltjuk. A lombikot rotációs rázógépen 30 °C-on 5 napon át rázatva tenyésztjük.
(2) Fermentálás
A fermentálást az alábbi összetételű tápközegben végezzük:
glicerin 3, .% balliszt 2 ’ % kalcium-karbonát 0,2 % liter fenti tápközeget 30 1-es fermentorba töltünk, majd leoltjuk 500 ml fenti módon előállított inokulummal. A tenyésztést 27 °C-on 48 órán át végezzük, 150 fordulat/perc keverési sebesség és
1/perc levegőztetés mellett.
(3) Barminomicin I e's II kinyerése
A fenti módon kapott folyékony tenyészetet szűrjük, a szűrlet pH-ját 5-re állítjuk, majd a szűrletet Dia-Ion HP—20-szal töltött oszlopon (4,0X40 cm) adszorbeáljuk. Az oszlopot 6 liter vízzel, majd 6 liter 50%-os metanollal mossuk, és 5 liter 100%-os metanollal eluáljuk. Az cluátumokat koncentrálva 3,0 g vörös színű nyersterméket kapunk, por formájában, amely barminomicin I-et és ΙΙ-t tartalmaz.
A port kevés kloroformban oldjuk, és az oldatot 50 g szilikagéllel (KieselgélR 60, Merck) töltött oszlopra visszük. Az oszlopot kloroform és metanol elegyével eluáljuk, sűrűség-gradienst alkalmazva. A barminomicin I-ct és ΙΙ-t tartalmazó frakciókat koncentrálva 40 mg barminomicin I-et és ΙΙ-t tartalmazó nyersterméket kapunk, vörös por formájában.
2. példa mg 1. példa szerinti előállított nyers vörös port kevés kloroformban oldunk, és az oldatot felvisszük 10 db 20X20 cm-es, szilikagél vékonyréteget tartalmazó lemezre (Kiese lgélR 60 F2S4, Merck) és a kromatogramot kloroform, metanol, ecetsav és víz 70:10:1:1 terfogatarányú clegyével kifejlesztjük. A barminomicin I és II szétvált foltjait összegyűjtjük, és kloroform és metanol 2:1 arányú elegyével eluáljuk a szilikagélről. Az így kapott frakciókat Nucleosil 5Cig-on nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással tovább tisztítjuk, az eluálást acetonitril, és 0,2%-os vizes foszforsav 40:60 térfogatarányú elegyével végezzük. 3,06 mg tiszta barminomicin I-et, és 3,07 mg tiszta barminomicin ΙΙ-t kapunk, vörös porok formájában. A termékek fizikai állandóit a 2. és 3. táblázat tartalmazza.
3. példa
4,5 mg 2. példa szerinti előállított barminomicin I-et 5 ml metanolban oldunk, és 2 mg NaBH3CN-del reagáltatjuk 15 percen át. A reakcióelegyet 20 ml vízzel és 20 ml kloroformmal extraháljuk, a kloroformos fázist vákuumban koncentráljuk. A konccntrátumot szilikagél-vékonyrétegen adszorbeáljuk, a futtatást kloroform és metanol 10:1 térfogatarányú elegyével végezzük. A barminomicin Ír frakciókat összegyűjtjük, és kloroform és metanol 1 :1 térfogatarányú elegyével eluáljuk a szilikagélről. A kapott frakciókat 9
-917
Í98 J02 koncentráljuk, és kloroform és metanol 1 :1 térfogatarányú elegyével ekvilibrált Sephadex LH20 töltetű oszlopra (1,0X20 cm) visszük. Az oszlopot a fenti összetételű oldattal eluáljuk. Az eluátumokat vákuumban szárazra pároljuk. 2,5 mg barminomicin Ir-t kapunk. A fenti eljárást megismételve a barminomicin
II-ből barminomicin Ilr-t kapunk. A termékek fizikai állandóit a 2. táblázat tartalmazza.

Claims (4)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az (I) általános képletű antraciklinszármazékok — a képletben
    R jelentése (a), (b), (c) vagy (d) képletű csoport — előállítására, azzal jellemezve, hogy az olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében
    R jelentése (a), (b) és/vagy (c) képletű csoport, az Actinoinadura nemzetségbe tartozó, MG463-yF4 (FERM BP—1044) mikroorganizmus törzset vagy annak a fenti antibiotikumok termelésére képes mutánsát vagy variánsát aerob körülmények között szén-, nitrogén-forrást és adott esetben szervetlen sókat és/vagy habzásgátló szereket tartalmazó tápközegben tenyésztjük, és a képződött antibiotikumokat a tenyészetből ismert módon, előnyösen szerves oldószerekkel végzett extrakcióval, és az extraktum kromatográfiás tisztításával kinyerjük, kívánt esetben a kapott optikai izomereket elválasztjuk, és kívánt
    5 esetben, olyan (I) általános képletű vegyületek előállítására, amelyek képletében R jelentése (d) képletű csoport, egy kapott x R helyén (b) és/vagy (c) képletű csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületet NaBH3CN-del redukálunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 20—35 C-on, 3—5 napon át folytatjuk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a sejtek és/vagy a tenyészet szűrletének extraktumát oszlopkromatográfiásan, folyadékkromatográfiásán vagy egyéb, megfelelő adszorbenst alkalmazó módszerrel tisztítjuk.
  4. 4. Eljárás gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (1) általános képletű vegyületet — a képletben
    R jelentése az 1. igénypontban megadott — a gyógyszerkészítésben szokásosan használt hordozóés/vagy egyéb segédanyagokkal összekeverve gyógyszerkészítménnyé alakítjuk.
HU862601A 1985-06-24 1986-06-20 Process for producing anthracycline derivates and pharmaceutical copositions comprising these compounds as active ingredient HU198102B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP60137193A JPS6297A (ja) 1985-06-24 1985-06-24 アントラサイクリン化合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT45563A HUT45563A (en) 1988-07-28
HU198102B true HU198102B (en) 1989-07-28

Family

ID=15192969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU862601A HU198102B (en) 1985-06-24 1986-06-20 Process for producing anthracycline derivates and pharmaceutical copositions comprising these compounds as active ingredient

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0206138B1 (hu)
JP (1) JPS6297A (hu)
AT (1) ATE41155T1 (hu)
DE (1) DE3662270D1 (hu)
DK (1) DK293986A (hu)
ES (1) ES8706835A1 (hu)
GR (1) GR861600B (hu)
HU (1) HU198102B (hu)
PT (1) PT82825B (hu)
ZA (1) ZA864661B (hu)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8606204D0 (en) * 1986-03-13 1986-04-16 Erba Farmitalia Biosynthetic anthracyclines
JPH02145598A (ja) * 1988-11-29 1990-06-05 Snow Brand Milk Prod Co Ltd 新規アンスラサイクリン系化合物及びこれを含有する抗腫瘍剤
JP2779652B2 (ja) * 1988-12-27 1998-07-23 武田薬品工業株式会社 生理活性物質ｔａｎ―１１２０，その還元体，それらの製造法および用途ならびに微生物
GB2315067B (en) * 1996-07-11 2000-02-16 Pharmacia Spa Morpholinyl anthracycline derivatives

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL124284B1 (en) * 1979-10-17 1983-01-31 Politechnika Gdanska Process for preparing n-glycosyl derivatives of antibiotics from anthracyclines group

Also Published As

Publication number Publication date
JPS6297A (ja) 1987-01-06
EP0206138B1 (en) 1989-03-08
ES556415A0 (es) 1987-07-01
EP0206138A1 (en) 1986-12-30
HUT45563A (en) 1988-07-28
ATE41155T1 (de) 1989-03-15
JPH0479355B2 (hu) 1992-12-15
GR861600B (en) 1986-10-20
PT82825A (en) 1986-07-01
DK293986A (da) 1986-12-25
PT82825B (pt) 1988-12-15
DK293986D0 (da) 1986-06-23
ES8706835A1 (es) 1987-07-01
DE3662270D1 (en) 1989-04-13
ZA864661B (en) 1987-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4923990A (en) Pyrindamycins A and B and duocarmycin A antibiotics derived from certain streptomyces culture
US5055453A (en) Benanomicins a and antibiotic compositions
HU181999B (en) Process for producing new citostatic antracycline antibiotics
US4734493A (en) Novel anthracycline antibiotics
US4198480A (en) Process for producing antibiotic baumycin complex and components
EP0110155B1 (en) Novel anthracycline derivatives, a process for preparing the same by a microorganism strain, the novel strain streptomyces cyaneus, and use of the anthracycline derivatives as medicaments
HU198102B (en) Process for producing anthracycline derivates and pharmaceutical copositions comprising these compounds as active ingredient
US4612371A (en) Anthracycline antibiotics
EP1001957B1 (en) Macrolides with antitumor activity
US5109122A (en) Antibiotics, dexylosylbenanomicin B
EP0118732B1 (en) An anthracycline compound, a process for the production thereof, a pharmaceutical composition containing the same and its use as a medicament
EP0205981B1 (en) A novel anti-tumor and antimicrobial compound, its microbiological preparation and its use as medicament
CA2171116C (en) Substance it-62-b and medicinal composition containing the same
JPH0576958B2 (hu)
EP0167935B1 (en) Anthracycline derivatives, a process for the production thereof, a pharmaceutical composition containing the same and their use as medicaments
JP4443740B2 (ja) アントラサイクリン抗生物質
US5656736A (en) Compound UCH9
US4598146A (en) Compound, arugomycin
JP2701069B2 (ja) 抗腫瘍性アントラサイクリン系化合物
JP3561550B2 (ja) 新規抗腫瘍性抗生物質
JPH0462317B2 (hu)
JPH05222086A (ja) 抗生物質アルデカルマイシンとその製造法、並びにその誘導体とその製造法
JPH0539242A (ja) 新規アントラサイクリン化合物
JPH05178881A (ja) 新規マクロライド抗生物質ｓｆ２７４８物質およびその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee