HU194942B - Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them as active agents - Google Patents

Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them as active agents Download PDF

Info

Publication number
HU194942B
HU194942B HU852506A HU250685A HU194942B HU 194942 B HU194942 B HU 194942B HU 852506 A HU852506 A HU 852506A HU 250685 A HU250685 A HU 250685A HU 194942 B HU194942 B HU 194942B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
group
formula
dtr
hydroxy
vii
Prior art date
Application number
HU852506A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT41441A (en
Inventor
Hamao Umezawa
Masa Hamada
Takeshi Uchida
Masaya Imoto
Tomio Takeuchi
Tsutomu Sawa
Hiroshi Naganawa
Original Assignee
Microbial Chem Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Microbial Chem Res Found filed Critical Microbial Chem Res Found
Publication of HUT41441A publication Critical patent/HUT41441A/hu
Publication of HU194942B publication Critical patent/HU194942B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/252—Naphthacene radicals, e.g. daunomycins, adriamycins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás új antraciklinszármazékok és ezeket hatóanyagként tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására.
Az antraciklinszármazékok fontos rákellenes hatású antibiotikumok, néhányat közülük már javasoltak ilyen célra.
A kémiai anyagok fiziológiás aktivitása jelentős mértékben függ kémiai szerkezetüktől. Ez alól az antraciklinszármazékok sem képeznek kivételt. Ennek folytán folyamatos igény van az új típusú, az ágiikon vagy a cukor részen új helyettesítőket hordozó antra5 ciklinszármazékok kifejlesztése iránt.
A találmány tárgya az új (A) általános képletű antraciklinszármazékok előállítása.
Az (A) általános képletben az R,, R2, R3 és R4 helyettesítők jelentése az 1. táblázatban felsorolt 9 kombináció valamelyike.
1. Táblázat
Szám Vegyület Rí r2 r3 R,
a ditriszarubicin D H OH /1/ /V/
b ditriszarubicin F H OH /11/ /11/
c ditriszarubicin F H OH /1/ /VI/
d ditriszarubicin G H OH /1/ /111/
e ditriszarubicin CR H OH /IV/ /1/
f ditriszarubicin GR H OH /111/ /1/
g ditriszarubicin G/de-Ro H OH /1/ /VII/
h ditriszarubicin GR/de-Ro H OH /VII/ /1/
k 1-hidroxi-szerirubicin OH H /1/ /1/
Az (I)-(VII) képletű csoportok a követke-
zők:
(I) RN-dF-CB
(ii) RN-dF-CA
(IH) RN-dF-Ro
(IV) RN-Ro-Ac
(V) RN-Ro-CA
(VI) RN-Ro-Ro
(VII) RN-dF
Az (I)-(VII) képletű csoportok jelölésében szereplő rövidítések jelentése a következő:
RN: rodózamin, dF: 2-dezoxifukóz, CB: ci- 40 nerulóz B,
CA: cinerulóz A, Ac: akulóz, Ro: rodinóz.
A találmány szerint előállított antraciklinszármazékok kémiai szerkezetét az (A) általános képlet mutatja. Ez az általános képlet az R,, R2, R3, R4 helyettesítők jelentése és kombinációi szerint 9 vegyületet foglal magában.
A találmány szerint előállított antraciklinszármazékok szerkezetét a leírás későbbi helyén szereplő kísérleti példákban ismertetett módon határoztuk meg.
A találmány szerint előállított antraciklinszármazékok fizikai-kémiai jellemzőit a
2. táblázatban ismertetjük.
2-1, Táblázat
Megjelenés
Elemzési eredmények /%/ /1/ számított /2/ talált
Ditriszarubicin D vörös por
Molekulatömeg /1/ FD-MS m/z /2/ Számított
A op.: Z°C/ 5 fajlagos forgatás
UV abszorpciós spektrum %
λ max nm /E / ' rm
IR abszorpciós spektrum /KBr tabletta/
C: 63,21 Ή: 6,89 N: 2,71
C: 61,74 E: 7,08 N: 2,40 a CeoHa2N202i képlet alapján
1167 /M+H/+
1167,3 139~ 143 + 136° /C 0,05 CHC13-ban/ /savas metanolban/
254/240/, 290/69/
495/130/ 530-/87/ s /lúgos metanolban/ 241/343/, 295/64/ 568/143/, 607/127/ 1. ábra
Ditriszarulicin E
vörös per
C: 60,63 F: 7,31
N: 2,52
C: 60,80 F: 7,14
N: 2,36
Ditriszarubicin F vörös por a C60Hai4N2C22 képlet alapján
1185 /M+H/+
1185,3 147~152 +48° /C 0,05 CHC13-ban/ /savas metanolban/
254/215/, 292/66/ 495/124/, 53Os/81/ /lúgos metanolban/ 241/308/, 298/59/ 568/135/, 607/121/
3. ábra
C: 62,61 H: 7,02 N: 2,51
C: 61,63 H: 7,24 N: 2,39 a C&ólig uN?.Ű21 képlet alapján
1169 /M+H/+
1169,3 178-- 181 + 161° /C 0,05 CHC13-ban/ /savas metanolban/
254/227/, 290/68/ 495/126/, 530^/83/ /lúgos metanolban/ 241/334/, 298/64/ 568/140/, 607/123/ 5. ábra
Ditriszarubicin G vörös por
C: 60,39 H: 7,26
Ni 2,21
C: 60,80 H: 7,14
N: 2,36 0: 29,69
a CaoHauN2O22 képlet alapján
1185 /M+H/
1185,3 110—112 + 132° /C 0,05 CHC13-ban/ /savas metanolban/
254/219/, 290/67/ 494/126/, 539g/83/ /lúgos metanolban/ 242/325/, 298/62/ 565/138/, 605/125/ 8. ábra
-2194942
4 /2-1. Táblázat folytatása/
Ditriszarubicin D Ditriszarubicin E Ditriszarubicin Γ Ditriszarubicin G
1 2 Megjelenés Elemzési eredmények /%/ vörös por vörös por vörös por vörös por
8 NMR spektrum 2, ábra 4. ábra 6, ábra 9. ábra
.* 250 MHz /CDCl3-ban/ 250 MHz /CHCl3-ban/ 250 MHz /CDC13-ban/ 250 MHz /CDC13-ban/
9. TLC 1 Rf érték CHC13:CH 3 OH:t ömé ny 0,31 0,27 0,25 0,22
vizes ammónia 100:5:0,1 100:5:0,1 100:5:0,1 100:5:0,1
10 HPLC * 2 érték 9,5 perc 3,8 perc 6,0 perc 3,4 perc
acetonitril:0,45% vizes foszforsav 35/65 35/65 35/65 35/65
11 Oldhatóság kloroform, etil-ace- kloroform, etil-ace- kloroform, etil- kloroform, etil-ace-
/1/ Oldható tát, metanol, acetonitril, piridin, dimetil-szulfoxid tát, metanol, acetonitril, piridin, dimetil-szulfoxid -acetát, metanol, acetonitril, piridin, dimetil-gzulfoxid tát, metanol, acetonitril, piridin, dimetil-szulfoxid
/2/ Gyengén oldható víz, petroléter, n-hexán víz, pertroléter, n-hexán víz, petroléter, n-hexán víz, petroléter, n-hexán
* 1 Vékonyréteg-kromatográfia szilikagél 60 F25U lemezen /a Merck Co. terméke/ * 2 Nagynyomású folyadék-kromatográfia 250 mm hosszú, 4,6 mm átmérőjű, Nucleofil 5Cia töltetű /Macherey-Napel,
NSZK/ oszlopon
2-2 Táblázat
Ditriszarubicin CR Ditriszarubicin GR Ditriszarubicin G/de-Ro Ditriszarubicin
1 Megjelenés vörös por vörös pár vörös por GR/de-Ro vörös por
2 Elemzési eredmények /%/ /1/ Talált C: 61,05 II: 7,13 C: 60,44 H: 7,41 C: 60,61 H: 6,82 C: 60,39 H: 6,78
/2/ Számított N: 2,38 C: 61,84 H: 6,92 N: 2,48 C: 60,80 H: 7,14 N: 2,37 C: 60,55 H: 6,96 N: 2,83 C: 60,55 H: 6,96
3 Molekulatömeg /1/ FD-MS m/z N: 2,40 a C60H80N2O21 képlet alapján 1165 /M+H/+ N: 2,36 a C6oH8tN20>2 képlet alapján 1184 /M+H/+ N: 2,61 a C5i.H71.N2O20 képlet alapján 1071 /M+H/+ N: 2,61 a C51.H71.N2O20 képlet alapján 1071 /M+H/+
/2/ Számított 1165,3 1185,3 1071,2 1071,2
4- op.: /°C/ 182—184 168 — 170 191 ~195 192-194
5 ωΓ fajla8°s + 199° + 167° + 176° + 194°
forgatás /C 0,06 CHCl3-ban/ /C 0,1CHC1a-ban/ /C 0,05 CHC13-ban/ /C 0,05 CHCl3-ban/
6 UV abszorpciós /savas metanolban/ /savas metanolban/ /savas metanolban/ /savas metanolban/
spektrum 253/265/, 290/92/ 254/219/, 290/67/ 254/256/, 290/75/ 254/256/, 290/72/
- /rJX/ A max nm / E / 495/125/, 53Og/76/ 494/120/, 530g/83/ 495/142/, 53Os/93/ 495/136/, 530g/90/
cm /lúgos metanolban/ /lúgos metanolban/ /lúgos metanolban/ /lúgos metanolban/
7 IR abszorpciós spek- 240/410/, 295/85/ 566/134/, 606/119/ 11. ábra 240/325/, 298/62/ 565/132/, 605/118/ 13. ábra 242/374/, 300/67/ 565/159/, 605/141/ 15. ábra 241/370/, 300/67/ 565/151/, 605/133/ 17. ábra
8 trum /KBr tabletta/ NMR spektrum 12. ábra 14. ábra 16. ábra 18. ábra
9 TLC *1 400 MHz CDC1,-ban 0,37 400 MHz CDC13-ban 0,21 400 MHz CDC13-ban 0,38 400 MHz CDC13-ban 0,35
CHC13:CH30H:tömény vizes ammónia 100:5:0,1 100:5:0,1 100:10:0,05 100:10:0,05
10 HPLC *2 tD érték 11,5 perc 3,9 perc 3,0 perc 3,8 perc
acetonitril:0,45% foszforsav 35/65 35/65 35/65 35/65
11 Oldhatóság kloroform, etil-ace- kloroform, etil-ace- kloroform, etil-acetát, kloroform, etil-
/1/ Oldható tát, metanol, aceto- tát, metanol, aceto- metanol, acetonitril, -acetát, metanol,
/2/ Gyengén oldható nitril, piridin, dimetil-szulfoxid víz, petroléter, nitril, pirilin, dimet i 1 -szulf oxid víz, petroléter, piridin, dimetil-szulfoxid víz, petroléter, acetonitril, piridin, dimetil-szulfoxid víz, petroléter,
n-hexán n-hexán n-hexán n-hexán
*
2: A jelölések jelentése a 2-1. táblázatnál ismertetett
-3194942
2-3. Tábl
Megjelenés
Elemzési eredmények /«/ /1/ Talált /2/ Számított
Molekulatömeg /1/ FD-MS m/z /2/ Számított op.: /°C/ 5 ί E)5 faÍla§os forgatás
UV abszorpciós spektrum
107
Λ max nm /Ε Λ/ cm
IR abszorpciós spektrum /KBr tabletta/
NMR spektrum
TLC *1 Rf érték
CHC13:CH 3 OH:tömény vizes ammónia
HPLC *2 t érték
R acetonitril: 0,45« foszforsav
Oldhatóság /1/ Oldható /2/ Gyengén oldható zat hidroxi-szerubicin vörös por
C: 60,83 H: 7,12 N: 2,27
C: 61,01 H: 6,83 N: 2,37 a 060Η8οΝ2θ22 képlet alapján
1181 /M+H/+
1181.3 189~192 +1 /±2/
C 0,1 CHCl3~ban /savas metanolban/
256/190/, 290/68/ 493/119/, 513g/89/ /lúgos metanolban/ 238/373/, 290/69/ 565/145/, 606/139/
24. ábra
25. ábra
400 MHz CDCl3-ban 0,41
100:5:0,1
6.3 perc 35/65 kloroform, etil-acetát, metanol, acetonitril, piridin, dimetil-szulfoxid víz, petroléter, n-hexán
M: * . ·
1, 2: A jelölések jelentése mertetett a 2-1 táblázatnál isA találmány szerint az antraciklinszármazékokat mikroorganizmusok tenyésztésével állítjuk elő, illetve így előállított vegyületek hidrolizálásával nyerjük. Előállíthatok azonban ezek a vegyületek rokonvegyületek kémiai vagy mikrobiológiai módosításával, 55 vagy teljes kémiai szintézissel is.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazható mikroorganizmusok az (A) általános képletű antraciklinszármazékok termelésére képes Streptomyces cyaneus MG-344-hF θθ 49 törzs, ennek mutánsai és variánsai.
A fenti, az (A) általános képletű vegyületek termelésére képes mikroorganizmusok termelőképessége radioaktív besugárzással vagy más kezelésekkel növelhető.
Az MG 344-hF 49 törzs jellemzői a következők:
A Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 törzset, amely az Actynomyceták közé tartozik, 1980. augusztusában talajból izoláltuk. A törzset FERM BP-314 számon 1982. június 28-án a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology deponálási helyen helyeztük letétbe.
1.) A törzs mikológiái jellemzői
A.) Morfológiai jellemzők
Mikroszkópos megfigyelés szerint az MG 344-hF 49 törzs elágazó szubsztrátmicéliumokat és tüskés vagy spirális légmicéliumokat képez, de örvényvonal nem figyelhető meg. Minden érett spóralánc legalább 10 spó-4194942 rát tartalmaz. A spórák mérete közelítőleg 0,4—0,6 x 0,8—1,0 pm, és a spórák felülete tüskés.
B.) Növekedés különféle táptalajokon
A zárójelben megadott színmegjelölések a Color Harmony Manual (Container Corporation of America kiadványa) szerintiek.
a) Ciniclose-nitrátagar táptalaj (a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Matt bíborvörös [9 le, Raspberry] tenyészethez tapadó, vékony fehér légmicélium film. Oldható, bíborszínű pigment képződik.
b. ) Glükóz-aszparagin agartáp (a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Sárgásvörös [6 la, Lt Coral Red 6 pc, paprika] tenyészethez tapadó, halvány kékesszürke [18 ec, Lt Aqua] légmicéliumok. Vöröses oldható pigment képződik.
c. ) Glicerin-aszparagin agartáp (ISP-5 táptalaj, a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Szürkésbíbor [9 lg, Rose Plum] tenyészethez tapadó, fehértől szürkésfehéren át halvány kékesszürkéig terjedő színű légmicéliumok. Oldható pigment képződése nem észlelhető.
d. ) Keményítő-szervetlen só agartáp (ISP-4 táptalaj, a tenyésztési hőmérséklet 27°C).
Halványrózsaszín tenyészethez tapadó, fehértől szürkés kékeszöldig [19 ie, Turquoise Green] terjedő színű légmicéliumok. Rózsaszín árnyalatú oldható pigment képződik.
e. ) Tirozin agartáp (ISO-7 táptalaj, a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Halványbarnától sötétbarnáig terjedő színű tenyészethez tapadó, szürkésfehértől halvány kékesszürkéig terjedő színű légmicéliumok. Halványbarnás árnyalatú oldható pigment képződik.
f. ) Tápagar táp (a tenyésztési hőmérséklet 27°C). Szürkés-bíborvörös [8 le, Rose Wine] tenyészethez tapadó, halvány bíboros-szürke légmicéliumok. Barna oldható pigment képződik.
g. ) Élesztő-maláta agartáp (ISP-2 táptalaj, a tenyésztési hőmérséklet 27°C). Szürkés bíborvörös [9 ne, Raspberry] tenyészethez tapadó, fehértől bíboros fehéren át kékesfehérig terjedő színű légmicéliumok. Oldható pigment képződése nem észlelhető.
h. ) Zabliszt agartáp (ISP-3 táptalaj, a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Halványrózsaszíntől matt bíborig [10 pc, Fuchsia Purple] terjedő színű tenyészethez tapadó, kékesszürkétől szürkés-kékes-zöldig [21 li, Dk Jade Gray] terjedő színű légmicéliumok. Vörös árnyalatú oldható pigment képződik.
i. ) Glicerin-nitrát agartáp (a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Szürkésbíbor [9 le, Raspberry] tenyészethez enyhén tapadó, fehér légmicéliumok. Bíbor árnyalatú oldható pigment képződik.
j. ) Keményítő agartáp (a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Matt szürkés bíborvörös [7 1/2 le, Rose Wine] tenyészet. Légmicélium képződés nincs. Bíboros árnyalatú oldható pigment képződik.
k. ) Kalcium-malát agartáp (a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Halvány bíbor tenyészethez tapadó, vékony fehér légmicélium-film. Bíboros árnyalatú oldható pigment képződik.
l. ) Cellulóz (szintetikus oldathoz adott szűrőpapír; a tenyésztési hőmérséklet 27°C)
Nincs növekedés.
m. ) Zselatin szúrt kultúra 20°C-on, egyszerű zselatintápban halványsárga tenyészethez enyhén tapadó fehér légmicéliumok. Barna oldható pigment képződik. 27°C-on tenyésztve glükóz-pepton-zselatin tápon színtelentől halványsárgáig terjedő színű tenyészethez tapadó, rózsaszínes fehér légmicéliumok. Sötétbarna oldható pigment képződik.
n. ) Sovány tej (a tenyésztési hőmérséklet 37°C) Rózsaszíntől szürkésvörösig terjedő színű tenyészethez enyhén tapadó fehér légmicéliumok. Barna árnyalatú oldható pigment képződik.
2.) Fiziológiai jellemzők
A) Általános leírás
a. ) A szaporodás hőmérséklettartománya. Glükóz-aszparigin-agaron, 20, 24, 27, 30, 37 és 50°C-on végzett tenyésztési kísérletekben azt észleltük, hogy a törzs az 50°C hőmérsékletet kivéve valamennyi hőmérsékleten nő. A hőmérsékleti optimum körülbelül 30—37°C.
b. ) Zselatin elfolyósításának vizsgálata.
A vizsgálatot 15%-os egyszerű zselatintápon' 20°C tenyésztési hőmérséklet, illetve glükóz-pepton-zselatin tápon, 27°C tenyésztési hőmérséklet alkalmazásával végeztük.
Egyszerű zselatintáp alkalmazásakor az elfolyósodás körülbelül a tenyésztés ötödik napján következik be.
Glükóz-pepton-zselatin táp alkalmazásakor kéthetes tenyésztés alatt sem következik be elfolyósodás, a tenyésztés harmadik hetében enyhe elfolyósodás lép fel. Az elfolyósodás mértéke az egyszerű zselatintápnál közepes-gyenge, a glükóz-pepton-zselatin tápnál gyenge.
c. ) Keményítő hidrolizálása (27°C-os tenyésztési hőmérséklet mellett, keményítő-szervetlen só agartápon vagy keményítő agartápon.)
A keményítő hidrolizálása a tenyésztés harmadik napján következik be, mértéke közepes és gyenge közötti.
d. ) Sovány tej koagulálása és peptonizálása (a tenyésztés 37°C-on, sovány tejen történik).
A koagulálás körülbelül a tenyésztés harmadik napján kezdődik, és körülbelül a hetedik napon válik teljessé, a hetedik napon ugyanakkor megkezdődik a peptonizálás. A peptonizálás mértéke közepes.
-5194942
e.) Melaminszerű pigmentek képződése [a tenyésztés 27°C hőmérsékleten, tripton-élesztő-levesen (ISP-1 táptalaj), pepton-élesztő-vas-agaron (ISP-6 táptalaj) vagy tirozin-agaron (ISO-7 táptalaj) történik]. Mindegyik táptalajon észleltünk pigmentképződést.
f). Szénforrások hasznosítása [a tenyésztés 27°C-on, Pridham-Gottlieb agartápon (ISP-9 táptalaj) történik],
A törzs valamennyi, a következő felsorolásban szereplő szénforrást hasznosítja, rajtuk nő:L-arabinóz, D-xilóz,D-glükóz,D-fruktóz, szacharóz,inozit, L-ramnóz, raffinóz, D-mannit.
g. ) Oldódás kalcium-malátban (a tenyésztés 27°C-on, kalcium-malát-agaron történik).
A kalcium-malát a tenyészet szélét körülbelül a tenyésztés hetedik napján oldja, az oldás mértéke gyenge.
h. ) Nitrát redukálása [1,0% kálium-nitrát tartalmú vizes peptonon (ISP-8 táptalaj), 27°C hőmérsékleten történik a tenyésztés].
Az eredmény pozitív.
B). összegzés és az új törzs azonosítása
Az MG 344-hF 49 törzs a Streptomyces nemzetségbe sorolható és a sejtfalban L,L-típusú 2,6-diamino-pimelinsavat tartalmaz. Sporangium nem figyelhető meg. A légmicéliumok spirálisak, de nem örvényvonalasak. A spórák felülete tüskés. A törzset különböző táptalajokon tenyésztve szürkés-bíborvöröstől sárgásvörösig terjedő színű tenyészet és ehhez tapadó, fehértől halvány kékesszürkén át szür5 kés-kékes-zöldig terjedő színű légmicéliumok fejlődnek ki. Bíborszínű vagy vöröses oldható pigment képződik. A tenyészet másik oldala pH-indikátorként működik, 1 n nátrium-hidroxid-oldat hatására színét bíboros színről kékes-bíborra vagy kékre változtatja. Melaminszerü pigmentet képez, proteolítikus hatása közepes és gyenge közötti. Keményítő hídról izá ló képessége ugyancsak közepes és gyenge közötti mértékű.
Ezeknek az adatoknak az alapján végigvizsgálva az ismert törzseket, arra az eredményre jutottunk, hogy az MG 344-hF 49 törzshöz a Streptomyces cyaneus faj áll legköze20 lebb [International Journal of Systematic Bacteriology, 22, 290 (1972) (1. irodalmi hivatkozás); Waksman: The Actinomycetes, 2, 199 (1961) (2. irodalmi hivatkozás); Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology,
7. kiadás, 757 (1957) és 8. kiadás, 822., (1974) (3. irodalmi hivatkozás)].
A 3. táblázatban az MG 344-hF 49 törzs tulajdonságait a Streptomyces cyaneusnak a fent hivatkozott irodalmi forrásokban ismertetett tulajdonságaihoz hasonlítjuk.
A légmicéliumok 3. Táblázat MG 344-hF 49 Streptomyces cyaneus ISP 5108
alakja A spórák felüle- spirális spirális
te tüskés tüskés
A légmicéliumok fehér - halvány ké- halvány kék -
színe kes-szürke - szürkés-kékes-zöld - -kékes-szürke
A tenyészet halvány rózsaszín - sötét szürkés·
színe - szürkés bíborvörös kék - sötét szürkés-bíbor
Oldható pigment nincs pigment - bi- nincs pigment
képződése bor, néha vöröses pigment - bíbor vagy 1
Melaminszerű pigment képződése + +
Keményítő hidrolizálás + közepes és gyenge közötti mértékű + gyen;
Tej koagulálás Tej peptonizálás + + +
Zselatin elfolyósítás Nitrát reduká- + közepes és gyenge közötti mértékű + erős
lás Szénforrások hasznosítása +
D—glükóz + +
L-arabinóz + +
D-xilóz + +
D-fruktóz + +
Szacharóz + +
Inozit + +
L-ramnóz + +
Raffinóz + +
D-mannit + +
pH indikátor + +
*Az 1. és 2. irodalmi hivatkozás alapján
-6194942
Amint az a 3. táblázatból látható, az MG 344-hF 49 és a Streptomyces cyaneus ISP 5108 törzs lényegében azonos tulajdonságokkal bír, kivéve a nitrát redukálását. A nitrát redukálása azonban nem tekinthető egy adott mikroorganizmus Actinomycetaként való azonosítása megbízható paraméterének és nem alkalmas két törzs egymástól való megkülönböztetésére sem.
így az MG 344-hF 49 törzset a Streptomyces cyaneus fajjal igen szoros rokonságban levőnek tekinthetjük, és az MG 344-hF 49 törzset Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 törzsként azonosítottuk.
Az (A) általános képletű antraciklinszármazékokat a találmány szerint az ezek termelésére képes, Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmusoknak megfelelő táptalajon történő tenyésztésével, majd a vegyületeknek a tenyészetből való kinyerésével állíthatjuk elő.
A táptalaj bármely olyan tápanyagforrást tartalmazhat, amelyet az antraciklinszármazékok termelésére képes mikroorganizmus hasznosítani tud. Ilyen tápanyagforrások a szénforrások, például a glicerin, glükóz, szacharóz, maltóz, dextrin, keményítő, valamint zsírok és olajok; a nitrogénforrások, így szerves anyagok, például a szójaliszt, a gyapotmagolaj kinyeréséből visszamaradó pogácsa, a húskivonat, pepton, szárított élesztő, élesztőkivonat és kukoricalekvár; valamint szervetlen anyagok, például ammóniumsók és nitrátsók, így az ammónium-szulfát, nátrium-nitrát és ammónium-klorid. Kívánt esetben olyan szervetlen sók is adagolhatok, mint a nátrium-klorid, kálium-klorid, foszfátsók és nehézfémsók. A fermentálás alatt fellépő habzás megakadályozására adott esetben szokásos eljárással megfelelő habzásgátló anyag, például szilikonolaj is felhasználható.
Az antibiotikum-gyártásnál szokásos gyakorlatnak megfelelően az antraciklinszármazékokat termelő mikroorganizmusok tenyésztésére is a legalkalmasabb módszer a folyékony, levegőztetett, süllyesztett tenyészet alkalmazása. A tenyésztést célszerűen 20—35°C, előnyösen 25—30°C hőmérsékleten végezzük.
Attól függően, hogy rázott tenyészetet vagy levegőztető berendezéssel levegőztetett tenyészetet alkalmazunk, az antraciklinszármazékok termelése a találmány szerinti eljárással 3—7 nap alatt éri el a maximumot.
Ily módon az antraciklinszármazékokat tartalmazó tenyészetet nyerünk. Az antraciklinszármazékok egy része magában a tenyésztett sejtben lehet, de nagyobb része a tenyészet szűrletében található.
A találmány szerint előállított tenyészetből az antraciklinszármazékok bármely, a találmány céljára alkalmas ismert módon kinyerhetők.
Az alkalmas eljárások egyike extrakciós elven alapszik; a tenyészet szűrletében lévő antraciklinszármazékokat vízzel nem elegyedő, ditriszaru bicint oldó oldószerrel extraháljuk (lásd az előzőekben ismertetett szakirodalmi helyen), így használhatunk például etil-acetát, butil-acetátot, kloroformot vagy butanolt. Nagy hatékonysággal végezhető az extrahálás, ha a tenyészet szürlete semleges vagy enyhén lúgos. Ha az antraciklinszármazékok a tenyésztett sejten belül találhatók, a sejteket szűréssel, centrifugálással vagy bármely más alkalmas módon kigyüjtjük a fermentléből, és a kívánt vegyületet a sejtekből, például etil-acetátos, kloroformos, metanolos, etanolos, butanolos, acetonos, metil-etil-ketonos, vizes hidrogén-kloridos vagy vizes ecetsavas kezeléssel nyerjük ki. Extrahálhatjuk a tenyészetet a fenti oldószerekkel közvetlenüt, a sejtek elkülönítése nélkül is. Extrahálhatjuk a sejteket homogenizálás után is. Másik lehetséges extrahálási eljárás az ellenáramú megoszlásos módszer.
Más eljárás szerint az antraciklinszármazékokat adszorpciós elven alapuló eljárással nyerjük ki a tenyészetből. Az antraciklinszármazékot tartalmazó folyékony közegből, például a tenyészet szürletéből vagy valamely, az előzőekben ismertetett extrakciós eljárással nyert extraktumából oszlopkromatográfiás vagy folyadék-kromatográfiás eljárással vagy más adszorpciós eljárással, megfelelő adszorbens, például aktív szén, alumínium-oxid, szilikagél vagy „Cephadex LH 20 (Pharmacia Co.) alkalmazásával kinyerjük, majd az adszorbensről eluáljuk az (A) általános képletű·antraciklinszármazékot. Az így kapott oldatot vákuumban szárazra pároljuk, ily módon nyers antraciklinszármazékot nyerünk vörös por formájában.
A nyersterméket az extrakciós és adszorpciós lépések kívánt számú ismétlésével, kívánt esetben ezek kombinálásával tisztítjuk. Ha szükséges, az anyagot átkristályosíthatjuk. Például szilikagél, Cephadex LH 20* gyengén savas ioncserélő gyanta vagy Diaion HP 20 (a Mitsubishi Chemicals Industries Limited terméke) töltet alkalmazásával végzett oszlopkromatográfiás eljárást vagy gélszűrést használhatunk folyadék-kromatográfiás (ellenáramú megoszlásos), nagynyomású folyadék-kromatográfiás vagy vékonyrétegkromatográfiás eljárással kombinálva, a megfelelő oldószer alkalmazásával. Közelebbről, például a nyers antraciklinszármazék port kis mennyiségű kloroformban feloldjuk és az oldatot szilikagél oszlopon engedjük át.
A megfelelő eluálószer alkalmazásával a kívánt anyagot tartalmazó eluátumot nyerünk. A kívánt anyagot tartalmazó aktív frakciókat vákuumban bepároljuk. Ezután vékonyrétegkromatográfiás tisztítást végezve valamennyi végtermék lényegében tiszta formában nyerhető. További tisztításra nagy7
-7194942 nyomású folyadék-kromatográfiás eljárást alkalmazhatunk vagy megfelelő oldószerből átkristályosítást végezhetünk.
A találmány szerint előállított antraciklinszármazékok a leukémiás sejtek növekedését gátolják, tumor-ellenes hatásúak, így gyógyászati célra használhatók.
A találmány szerint előállított vegyületek kémiai szerkezetének vizsgálata
1. A ditriszarubicinek szerkezetének meghatározása:
A ditriszarubicin D, E, F, G, CR, G/de-Ro, GR/de-Roa továbbiakban gyűjtőnéven DTR-X szerkezetmeghatározásának áttekintése a 26. ábrán látható. Az ábrán RN jelentése rodózamin és K,, R2, R3, R4, R5 és R6 jelentése cukrok. A leírás további részében a megfelelő vegyületek jelölésére a 26. ábrán alkalmazott számozást használjuk.
DTR-X-et-(l) általános képletű vegyület — 0,1 n hidrogén-kloriddal 85°C-on 30 percig hidrolizálunk. Ily módon a vörös ágiikon részt (2) és a megfelelő cukrokat nyerjük. Szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal kapott Rf érték, UV abszorpciós spektrum, tömegspektrum [(m/z
386 (M+)] és Ή-NMR spektrum alapján az ágiikon részt β-rodomicinonként — (2) képletű vegyület -r- azonosítottuk.
A folyékony hidrolizátumot ezüst-karbo10 náttal semlegesítjük, majd szilikagél vékonyrétegen, futtatószerként n-butanol, ecetsav, víz 4:1:1 arányú elegyét alkalmazva kromatografáljuk; előhívószerként p-ánizsaldehidet alkalmazunk. Az azonosítást az R, értékek és a színváltozás alapján végezzük. A DTR-X, (1) általános képletű vegyület, cukorösszetevőit és az FD-tömegspektrummal kapott alapcsúcsokat a 4. táblázatban ismertetjük. A táblázatban a + + , + és — jelölések a szín20 változásokat jelentik a kontrol ditriszarubicin B (DTR-B) hidrolízisével kapott eredmények alapján.
Táblázat
DTR-X /1/
FD - MS m/ z „ *
Cukor-összetevők rodózamin 2-dezoxi- rodinóz cinerulóz cinerulóz fukóz A B
DTR-D 1167 /M+H/+ ++ + + + +
DTR-E 1 185 /M+H/ ++ ++ - ++ -
DTR-F 1169 /M+H/+ ++ + ++ - ++
DTR-G 1 185 /M+H/ ++ ++ + - +
DTR-CR 1165 /M+H/ ++ + + - ++
DTR-GR 1184 /M/+ ++ ++ + - +
DTR-G/de-Ro 1071 /M+H/ ++ ++ - - +
DTR-GR/
/de-Ro 1071 /M+H/+ ++ ++ - - +
DTR-B 1 181 /M+H/ ++ ++ - - ++
: ++, + es - jelentese a megfelelő színváltozás a vékonyrétegben ** : az 1H-NMR spektrum szerint a DTR-CR egy molekula akulózt és egy molekula cinerulóz B-t tartalmaz,
Az (I) általános képletű vegyületeket 0,1 n hidrogén-kloriddal 70°C-on 20 percig hidrolizálva minden esetben a (3) jelölésű vegyületet nyerjük. Ezt teljesen elhidrolizálva β-rodomicinont- (2) képletű vegyületet — és rodózamint nyerünk. A (3) jelölésű vegyületet FD-tömegspektrumban m/z 700-nál (M)+ alapcsúcsot ad. Ezt az információt a Ή-NMR spektrummal egybevetve a (3) jelölésű vegyületet β-rodomicin II-nek találtuk, amelyben a 7- és a 10-helyzetben egy molekula rodózamin kötődik. [Tetrahedron Lett., 1969 415—419 (1969).] így érthetővé vált, hogy a DTR-X-(l) általános képletű vegyületek — minden variánsának szerkezetében előfordul a β-rodomicin II.
Ha az (1) általános képletű vegyületeket környezeti hőmérsékleten és nyomáson 10—30 percig 5% fémtartalmú,bárium-szulfit hordozós palládiumkatalizátor jelenlétében hidro55 génezzük, a (4) általános képletű vegyületet nyerjük.
A (4) általános képletű vegyület 0,1 n hidrogén-kloriddal végzett teljes hidrolíziséθθ vei az (5) képletű vörös aglikont nyerjük és ezen kívül minden esetben különféle cukrokat is nyerünk. Az (5) képletű vegyületet szilikagélen végzett vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal kapott Rf értéke alapján, UV abszorpciós spektruma, tömegspektruma [m/z 370 (M) + ] és Ή-NMR spektruma alap-8194942 ján γ-rodomicinonként azonosítottuk. A cukrokat szilikagél vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálattal kapott Rj értékük és színváltozásuk alapján azonosítottuk. A DTR-X-(l) általános képietü vegyületek — redukciós
5. táblázat
DTR-X/H2 /4/ ED - MS m/z -------------rodóz- 2-dezi amin -fukó bomlástermékének-(4) általános képletű vegyület- (ezt a vegyületet a továbbiakban DTR-X/H2-ként jelöljük) cukorösszetevőit és FD-tömegspektrumuk alapcsúcsait az 5. táblázatban mutatjuk be.
*
Cukor-összetevők rodinóz cinerulóz cinerulóz A B
DTR-D/H2 754 /M+H/+ + — + + -
dtr-e/h2 770 /M+H/ + + - + -
dtr-f/h2 756 /M+H/+ + - ++ - -
dtr-g/h2 772 /M+H/ + + + - -
dtr-cr/h2 768 /M+H/ + + - -
dtr-gr/h2 768 /M+H/+ + + - - +
DTR-G/de-Ro/H2 658 /M+H/ + + - - -
DTR-GR/de- -Ro/H2 768 /M+H/+ + + - - +
: ++, + és - jelentése a megfelelő színváltozások
Ha DTR-X/H2-t-(4) jelölésű vegyület — 25
0,1 n hidrogén-kloridban 70°C-on 10 percig kezelve részlegesen hidrolizálunk, minden esetben a (6) jelölésű vegyületet nyerjük. A (6) jelölésű vegyület teljes hidrolízisével γ-rodomicint — (5) képletű vegyület — és rodóza- 3θ mint nyerünk. Az FD-tömegspektrum alapcsúcsa m/z 527 (M)+. Az Ή-NMR spektrum alapján olyan szerkezet tételezhető fel, amelyben az (5) képletű y-rodonomicinhez egy molekula rodózamin kötődik. Ezeknek az adatok- 35 nak az alapján a (6) jelölésű vegyületet y-rodomicin I-ként azonosítottuk [Naturwissenschaften, 48, 717 (1961)]. Arra a megállapításra jutottunk, hogy a (4) általános képletű vegyület minden variánsának szerkeze- 40 tében megtalálható a γ-rodomicin I.
A 27—32. ábrák a DTR-D/H2, E/H2, F/H2, G/H2, CR/H2 és G/de-Ro/H2 Ή-NMR képét mutatják. A DTR-GR/H2 és GR/de-Ro/H2 megfelelő Ή-NMR spektrumát nem mutatjuk külön be, mivel azok megegyeznek a DTR-CR/H2 spektrumával. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a DTR-X/H2-(4) általános képletű vegyület — variánsai olyan vegyü7. Táblázat letek, amelyekben a y-rodomicinonhoz 10-helyzetben a 6, táblázatban megadott cukorláncok kapcsolódnak.
6. Táblázat
DTR-X/H /4/ Cukorláncok
DTR-D/H2
DTR-E/H2
DTR-F/H2
DTR-G/H2
DTR-CR/H2
DTR-GR/H2
DTR-G/de-Ro/H2
DTR-GR/de-Ro/H2 /V/ képletű csoport /11/ képletíí csoport /VI/ képletű csoport /111/ képletű csoport /1/ képletű csoport /1/ képletéi csoport /VII képletű csoport /1/ képletű csoport
A 4. és 5. táblázatok, valamint a 2., 4.,
6., 9., 12., 14., 16. és 18. ábrákon bemutatott Ή-NMR spektrumok alátámasztják azt a következtetésünket, hogy a DTR-X-(l) képietü vegyület — megfelelő variánsainak szerkezete a 7. táblázatban megadottnak megfelelő.
A ditriszarubicinek szerkezete
Vegyület A /B/ általános képlet helyettesítői /cukor láncok/
Rs Ru
DTR-D DTR-E DTR-F DTR-G DTR-CR DTR-GR DTR-C/de-Ro DTR-GR/de-Ro /1/ képletű csoport /11/ képletű csoport /1/ képletű csoport /1/ képletű csoport /IV/ képletű csoport /111/ képletű csoport /l/ képletű csoport /VII/ képletű csoport /V/ képletű csoport /11/ képletű csoport /VI/ képletű csoport /111/ képletű csoport /1/ képletű csoport /1/ képletű csoport /VII/ képletű csoport /1/ képletű csoport
-9194942
18
II. Az 1-hidroxi-szerirubicin szerkezetének meghatározása
1-hidroxi-szerirubicint (jelölése a továbbiakban 1-HSR) 0,1 n hidrogén-kloridban 85°C-on 30 percig hidrolizálva vörösesnarancs 5 színű ágiikon részt és háromféle cukrot nyerünk. Szilikagél vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal kapott R/ érték, tömegspektrum [m/z 386 (M)+ ] és ‘H-NMR spektrum (lásd a 34. ábrán) alapján az ágiikon részt a2-ro- 10 domicinonként azonosítottuk [Chem. Bér.,
101, 1341 —1348 (1968)]. A hidrolizátum cukrait szilikagél vékonyrétegen 4:1:1 arányú n-butanol-ecetsav-víz futtatóelegy alkalmazásával elválasztottuk és ánizsaldehid-kén- 15 sav reagenssel a megfelelő színreakciót kiváltottuk. Az R/ értékek és a színváltozások alapján az egyes cukrokat rodózaminnak,
2-dezoxiíukóznak és cinerulóz B-nek találtuk. Minthogy az 1-HSR FD-tömegspektrumának alapcsúcsa m/z 1181 (M+H) , feltételezzük, hogy ez a vegyület az a2 rodomicinonhoz kötve 2—2 molekula rodózamint, 2-dezoxifukózt, illetve cinerulózt tartalmaz.
A 8. táblázatban 1-HSR l3C-NMR spektrumának a cukorláncokra vonatkozó kémiai eltolódásait adjuk meg a ditriszarubicinhez [J. Antibiotics, 36, 1080—1083 (1983)] és a szerirubicinhez hasonlítva. Az adatok alapján feltételezhető, hogy a vizsgált 1-HSR vegyületek cukorláncai az összehasonlításul alkalmazott vegyületekével azonosak. A 25. ábrán az 1-HSR Ή-NMR spektrumát mutatjuk be. A spektrumanalízis alátámasztja azt a feltételezést, hogy az 1-HSR szerkezete a 35. ábrán bemutatottnak megfelelő.
8. Táblázat
Szén ditriszarubicin szerirubicin 1-hidroxi-szerirubicin
+ θ 9 NMe2 x 1 HU 2 3 4 un 5 !/// e,/,f 2 97.4, 29.4, 61,4 74.3, 68.3, 17,9, 43,2, X 101,9 29,8 2 74,6 68,5 18,1 43,3 96,6, 29,6 x 61.4, 74.4, 68,3, 17,9, 43,28, 100,2 2 61,6 74,6 68,5 18,1 43,31 96.3, 29,6 61.4, 74.3, 68.3, 18,0, 43,29, X 100,2 2 61.5 74.5 68,4 18,1 43,33
1 / ’ 1 ///// 99,1 X 2 99,2 X 2 99,1 X 2
2 , 2 >> > 26,9, 27,0 26,9, 27,0 26,9, 27,0
3/z , 7>’ 67,3, 67,4 67,28, 67,35 67,2, 67,3
4/z , 4 f/r 67,0 X 2 67,0 X 2 66,9 X 2
5ZZ , 5 /'/n 65,3, 65,4 65,3, 65,4 65,2, 65,3
6ZZ , 6 ZZ/ZZ 16,0 X 2 16,0 X 2 15,96, 16,00
1 >r 91,6 X 2 91,6 X 2 91,6 X 2
n f/ f ,,, ’ 2 // //// 63,0, 63, 1 63,0, 63,1 62,97, 63,04
~ /// 3 9 2 irtin 39,7, 39,8 39,7, 39,8 39,70, 39,75
4,/z , 4 'm 208,1 X 2 208,1 X 2 208,1 X 2
5,ZZ , 5 ftlttf 77,88, 77,94 77,88, 77,94 77,88, 77,94
6z, 6 16,1, 16,2 16,1, 16,2 16,16, 16,20
A 8. táblázatban szereplő vegyületek (A) 55 általános képletében a helyettesítők jelentése a következő
Rí R2
ditriszarubicin B 11 OÍI
szerirubicin H H
1-hidroxi-szerirubicin OH H
és mindháromban R3 jelentése /IX/képletü csoport,
Rí, jelentése /X/ képletü csoport.
Biológiai aktivitás
1.) P 388 leukémiasejtek szaporodásának gátlása
A találmány szerint előállított antraciklinszármazékok igen alacsony dózisban gátolják a tenyésztett sejteket. A 9. táblázatban a találmány szerint előállított vegyületeknek azt a koncentrációját adjuk meg, amelyek P 388 leukémiasejtek 2 napos tenyészetének szaporodását a kontrolihoz viszonyítva 50%-kal gátolják (IC50).
-10194942
9. Táblázat
Vegyület IC5o / ug/ml/
DTR-D 0,0040
DTR-E 0,0070
DTR-F 0,0038
DTR-G 0,0045
DTR-CR 0,0040
DTR-GR 0,0042
DTR-G/de-Ro 0,012
DTR-GR/de-Ro 0,020
1-HSR 0,012
2.) Tumor-ellenes hatás L 1210 leukémiasejtekkel fertőzött egéren
CDF, egerek egy csoportjába intraperitoneálisan L 1210 leukémiasejt-szuszpenziót viszünk be egerenként lxlO5 sejt mennyiségben. A sejtek beültetése után azonnal intraperitoneálisan 0,25 ml vizsgálandó vegyületet injektálunk be az egerekbe. Valamennyi vizsgálandó vegyületet 10 napon át adagoljuk. A megfigyelést 30 napon át végezzük, és megadjuk a százalékos túlélést, 100-nak tekintve azoknak a napoknak a számát, amenynyivel a fiziológiás sóoldattal kezelt kontrollcsoport túlélte a leukémiasejtek beültetését.
Az eredményeket a 10. táblázatban ismertetjük.
10. táblázat
Dózis [mg/kg/nap] Túlélés /7/
DTR-D DTR-E DTR-F DTR-G 1-HSR
1 — — - -. Toxin 1 14
0,5 - - - - 139
0,25 131 106 Toxin Toxin 145
1 33 125
0,125 1 14 156 152 138 151
0,0625 142 163 1 33 163 127
0,0313 125 119 127 117 108
0,0156 102 102 1 20 1 11 -
0,0078 97 102 101 109 —
A következőkben a találmány szerinti eljárást példákban mutatjuk be. A példák szerint előállított termékek fizikai állandói a leíró részben, a 2—1., 2—2., 2—3., 2—4., 4. és 8. táblázatokban megadott értékekkel azonosak.
1. Példa
a) Inokulum előállítása
Az alábbi összetételű táptalajt alkalmaz40
2%
0,12
0,3% g/1
zuk:
Galaktóz 2%
Dextrin 2%
Bacto-soyton*- (Difco Láb.) 1%
Kukoricalekvár 0,5%
Kalcium-karbonát 0,1%
A táptalaj pH-ját sterilezés előtt 7,4-re állítjuk.
100 ml fenti táptalajt 500 ml-es kónikus lombikba töltünk és sterilezzük. A steril táptalajt platina oltókaccsal Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 ferdeagar tenyészetről levett oltóanyaggal oltjuk be, majd 27°C-on 72 órán át rázatjuk.
b) Fermentálás
Az alábbi összetételű táptalajt alkalmaz zuk:
Dextrin 3%
Glükóz 0,3%
Toast-soya (a Nissin-Seiyu Co. szójaliszt készítményének márkaneve)
Kobalt-klorid Kalcium-karbonát liter fenti táptalajt 30 literes fermqntorba töltünk, sterilezzük, majd 500 ml, az a) lépés szerint készített inokulummal beoltjuk. A fermentálást 27°C-on, percenként 150 fordulatos keverés és 15 1/perc arányú levegőztetés mellett 90 órán át folytatjuk, c.) A ditriszarubicinek kinyerése A b) lépés szerint nyert tenyészetet megszűrjük, a szürlet pH-ját 8,0-ra állítjuk, majd .a szürletet 10 1 butil-acetáttal extraháljuk. A fázisokat szétválasztjuk, a'felső fázist bepároljuk. íly módon 20.g olajat nyerünk. A kapott olajat kevés kloroformban oldjuk,majd az oldatot 100 g szilikagéllel („Kiesel Gél 60”, a Merck Co. terméke) töltött oszlopon engedjük át és (100:0) — (100:10) között változó ará nyú kloroform-metanol eleggyel gradiens eluá lást végzünk. A ditriszarubicin D-t, E-t, F-t, G-t és GR-t tartalmazó frakciókat bepároljuk. Ily módon 230 mg ditriszarubicin elegyet nyerünk vörös por formájában.
2. Példa
Az 1. példa szerint előállított vörös por formájú nyerstermék 100 g-ját kevés kloro1 1
-11194942 formban oldjuk és az oldatot 10 darab szilikagél („Kiesel Gél 60 F254, a Merck Co. terméke) vékonyrétegre visszük fel. A szilikagél lemez 0,25 mm vastag, 20x20 cm méretű. A ditriszarubicin D, E, F, G és GR zónákat futtatószerként kloroform, metanol, tömény vizes ammónia 100:5:0,02 arányú elegyét alkalmazva elkülönítjük, majd a szétvált zónákat öszszegyűjtjük és az anyagot a szilikagélről kloroform, metanol 10:1 arányú elegyével eluáljuk. Az így kapott frakciókat bepároljuk, majd nagynyomású folyadék-kromatográfiás eljárással tisztítjuk. Az elválasztásra 20 mm átmérőjű, 300 mm magas, „Nucleosil 5C18” töltetű (a Nagel Co. terméke) oszlopot és 0,45% vizes foszíorsavat tartalmazó acetonitril oldószerelegyet alkalmazunk. A megfelelő eluátumot nátrium-hidrogén-karbonáttal semlegesítjük, majd kloroformmal extraháljuk. A kloroformos fázist szárazra pároljuk, A visszamaradó anyagot kloroform és metanol 1:1 arányú elegyében oldjuk, az oldatot 2,0 cm átmérőjű, 28 cm magas Cephadex LH-20 töltetű oszlopra visszük és azonos oldószerelegygyel ekvilibráljuk. Az eluálást ugyanezzel az oldószereleggyel végezzük, majd az eluátumot vákuumban szárazra pároljuk. Ily módon a ditriszarubicin D-t, E-t, F-t, G-t, illetve GR-t 32,0,31,5, 30,5, 65,5, illetve 67,5 mg menynyiségben nyerjük.
A kapott termékeket vékonyréteg-kromatográfiás eljárással és „Nucleosil 5C18” töltetű oszlopon végzett nagynyomású folyadék-kromatográíiás eljárással megvizsgálva valamennyi terméket homogénnek találtunk.
3. Példa mg ditriszarubicin G-t és GR-t 0,1 n hidrogén-kloridban 30°C-on 20 percig reagáltatunk. A reakcióelegyet extraháljük és az extraktumokat szilikagélen kromatografáljuk. A DTR-G-t vagy DTR-GR-t 100:3 arányú kloroform-metanol eleggyel eltávolítjuk, majd 100:5 arányú kloroform-metanol eleggyel végezzük az eluálást. A megfelelő eluátumokat vákuumban szárazra pároljuk. A viszszamaradó anyagból készült oldatot „Cephadex LH-20” töltetű oszlopra visszük, majd az anyagot az oszlopról 1:1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Ily módon 25 mg DTR-G/de-Ro-t és 15 mg DTR-GR/de-Ro-t nyerünk. Az így kapott termékek vékonyréteg-kromatográfiás és nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálattal homogénnek bizonyulnak.
4. Példa
800 mg DTR-B, C, CR, szerirubicin (SR) és 1 -hidroxi-szerirubicin (HSR) elegyet amelyet az 1. példa c) lépésében-végzett gradiens eluálás D, E, F, G és GR frakciók előtt lejövő eluátumának bepárlásával kapunk — kevés kloroformban oldunk, és a kapott oldatot 80 darab szilikagél („Kiesel Gél 60 F254”, a Merck Co. terméke) vékonyrétegre visszük fel. A vékonyréteg lemezek vastagsága 0,25 mm, mérete 20x20 cm. Futtatóelegy12 ként 100:5:0,02 arányú kloroform — metanol-tömény vizes ammónia elegyet használunk, majd a DTR-CR, SR és HSR zónákat összegyűjtjük és 10:1 arányú kloroform-metanol eleggyel eluáljuk. Az eluátumot szárazra pároljuk, majd a DTR-CR és HSR frakciókat 20 darab, a fentivel azonos szilikagél rétegre visszük fel. Futtatóelegyként 25:1:0,08 arányú etil-acetát-metanol-tömény vizes ammónia elegyet alkalmazunk. A foltok anyagát összegyűjtjük, eluáljuk, az eluátumot bepároljuk, majd minden egyes frakciót 3 darab, az előzővel azonos vékonyrétegre visszük fel, majd az anyagot 100:5:0,02 arányú kloroform-metanol — tömény vizes ammónia elegygyel eluáljuk. így eltávolítjuk a kis mennyiségben jelen lévő DTR-B maradékot. Az eluátumot szárazra pároljuk, és a DTR-CR és HSR frakciót oszlopkromatográfiásan tisztítjuk, („Cephadex LH-20”, eluens: metanol), majd vákuumban szárazra pároljuk. Ily módon
9,3 mg DTR-CR-t nyerünk vörös por formájában és 13,7 mg HSR-t nyerünk vöröses-narancs por formájában. Mindkét kapott anyag vékonyréteg-kromatográfiás és fordított fázisú nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálat alapján homogénnek bizonyult.
A következőkben az ábrák jelentését ismertetjük. Az 1 —18. és 23—25. ábrák az a-h és k jelölésű vegyületek IR, NMR és UV spektrumát mutatják a következők szerint:
Ábra száma Spektrum Vegyület jele
1 . IR a
2. NMR a
3. IR b
4, NMR b
5. IR c
6. NMR c
7. UV d
8. IR d
9. NMR d
10. UV e
11 . IR e
12. NMR e
13. IR f
14. NMR f
15. IR g
16. NMR g
17. IR h
18. NMR h
23. UV k
24. IR k
25. NMR ; k
A 26. ábrán a találmány szerint előállí
tott antraciklinszármazékok szerkezetmeghatározási eljárásának vázlatos folyamatábráját mutatjuk be.
A 27—34. ábrákon a találmány szerint előállított antraciklinszármazékokból a szerkezetmeghatározási eljárás során kapott bomlástermékek NMR spektrumát mutatjuk be.
-12194942
A 35, ábrán a k jelű vegyület szerkezete, a 36. ábrán pedig az (A) általános képletű vegyületekben található cukrok szerkezete látható.

Claims (4)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás az (A) általános képletű antra ciklinszármazékok előállítására— a képlet ben — R, jelentése hidrogénatom, — R2 jelentése hidroxilcsoport és — R3 és R4 jelentése a következő nyolc cukorkombináció valamelyike r3 (I) képletű csoport (II) képletű csoport (I) képletű csoport (I) képletű csoport (IV) képletű csoport (III) képletű csoport (I) képletű csoport (VII) képletű csoport r4 (V) képletű csoport (II) képletű csoport (VI) képletű csoport (III) képletű csoport (I) képletű csoport (I) képletű csoport (VII) képletű csoport (I) képletű csoport vagy — R, jelentése hidroxilcsoport, — R2 jelentése hidrogénatom és — R3 és R4 jelentése egyaránt (I) képletű csoport, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 (FERM BP-314) törzset, valamely mutánsát vagy variánsát nitrogén- és szénforrást, valamint ásványi sókat tartalmazó táptalajon aerob körülmények között tenyésztjük, majd a ferment25 léből kinyerjük az (A) általános képletű antraciklinszármazékokat, és kívánt esetben R, jelentésében hidrogénatomot, R2 jelentésében hidroxilcsoportot, R3 jelentésében (I) képletű csoportot és R4 jelentésében (VII) képletű csoportot, valamint R, jelentésében hidrogénatomot, R2 jelentésében hidroxilcsoportot, R3 jelentésében (VII) képletű csoportot és R4 jelentésében (l) képletű csoportot tartalmazó vegyületek előállítására, a megfelelő (VII) képletű csoport helyén (III) képletű csoportot tartalmazó (A) általános képletű vegyületet hidrolizáljuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy szén- és nitrogénforrásul szolgáló tápanyagokat, adott esetben szervetlen sókat és/vagy habzásgátló anyagot tartalmazó folyékony táptalajban 20—35°C hőmérsékleten szubmerz tenyésztést végzünk, és a kapott vegyületeket a táptalajból ismert extrakciós vagy adszorpciós eljárásokkal kinyerjük.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 (FERM BP-314) törzset alkalmazzuk.
  4. 4. Eljárás gyógyászati készítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely, az 1. igénypont szerint előállított (A) általános képletű vegyületet — a helyettesítők jelentése az 1. igénypontban megadott — gyógyászati célra alkalmas hordozó- és/vagy egyéb segédanyaggal összekeverve gyógyászati készíménnyé alakítunk.
    31 lap rajz
HU852506A 1984-07-03 1985-06-26 Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them as active agents HU194942B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP59137486A JPS6117597A (ja) 1984-07-03 1984-07-03 アントラサイクリン化合物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT41441A HUT41441A (en) 1987-04-28
HU194942B true HU194942B (en) 1988-03-28

Family

ID=15199762

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU852506A HU194942B (en) 1984-07-03 1985-06-26 Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them as active agents

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0167935B1 (hu)
JP (1) JPS6117597A (hu)
AT (1) ATE45953T1 (hu)
DE (1) DE3572668D1 (hu)
DK (1) DK165747B (hu)
ES (1) ES8704148A1 (hu)
GR (1) GR851608B (hu)
HU (1) HU194942B (hu)
ZA (1) ZA854979B (hu)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10029433A1 (de) * 2000-06-15 2001-12-20 Bioleads Gmbh Rhodomycinon-Derivate

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6023679B2 (ja) * 1979-07-13 1985-06-08 メルシャン株式会社 ロドマイシン群抗生物質とその製造法
JPS5982395A (ja) * 1982-11-02 1984-05-12 Microbial Chem Res Found アントラサイクリン化合物、その製造法およびその用途
DE3323025A1 (de) * 1983-06-25 1985-01-10 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Anthracyclin-derivate, ein mikrobiologisches verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika
DE3325957A1 (de) * 1983-07-19 1985-02-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Anthracyclin-derivate, ein verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung als cytostatika

Also Published As

Publication number Publication date
DE3572668D1 (en) 1989-10-05
ES544745A0 (es) 1987-03-16
DK301685A (da) 1986-01-04
EP0167935A3 (en) 1986-10-08
HUT41441A (en) 1987-04-28
DK301685D0 (da) 1985-07-02
EP0167935A2 (en) 1986-01-15
ES8704148A1 (es) 1987-03-16
ATE45953T1 (de) 1989-09-15
DK165747B (da) 1993-01-11
ZA854979B (en) 1986-02-26
EP0167935B1 (en) 1989-08-30
JPS6117597A (ja) 1986-01-25
GR851608B (hu) 1985-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0022574B1 (en) Rhodomycin-group of antibiotics and process for preparing same
DK161091B (da) Svovlholdige antibiotiske forbindelser med antitumorvirkning, betegnet cl-1577a og cl-1577b, fremgangsmaade til fremstilling deraf, samt farmaceutiske praeparater indeholdende forbindelserne
AU634247B2 (en) Antitumor substance be-13793c
EP0318056A2 (en) Novel antibiotics and process for preparing the same
FI59613B (fi) Foerfarande foer framstaellning av ett tumoerfoerhindrande rhodirubinkomplex och dess komponenter a och b
EP0110155B1 (en) Novel anthracycline derivatives, a process for preparing the same by a microorganism strain, the novel strain streptomyces cyaneus, and use of the anthracycline derivatives as medicaments
US4386198A (en) 2-Hydroxyaclacinomycin A and 2-hydroxyaklavinone and process for preparing same
HU194942B (en) Process for producing antracyclin derivatives and pharmaceutical compositions containing them as active agents
US4626503A (en) Antitumor agents LL-D49194α1, LL-D49194β1, LL-D49194β2, LL-D49194β3, LL-D49194γ, LL-D49194δ, LL-D49194ε, LL-D49194ξ, LL-D49194η, LL-D49194ω1, LL-D49194ω2, and LL-D49194ω3
EP0206138B1 (en) Anthracycline compounds, a process for their preparation and their use as medicaments
EP0118732B1 (en) An anthracycline compound, a process for the production thereof, a pharmaceutical composition containing the same and its use as a medicament
EP0189330B1 (en) Antitumor antibiotics and their production
US4424342A (en) Anthracycline antibiotic compounds
DK161338B (da) Fremgangsmaade til fremstilling af 2-hydroxyaclacinomycin a, b og n eller syreadditionssalte deraf samt en rekombinant mikroorganisme til anvendelse derved
US4912133A (en) BU-3862T antitumor antibiotic
EP0157203A2 (en) Antitumor agents LL-D49194 alpha 1, LL-D49194 beta, LL-D49194 beta 2, LL-D49194 upsilon, LL-D49194 delta, LL-D49194 epsilon, LL-D49194 zeta, and LL-D49194 eta
JPH0576958B2 (hu)
EP0191399B1 (en) Benz[a]anthraquinone compounds, a microbial process for their preparation and their use as medicaments
US5756320A (en) Bioactive substances K93-0711 I-1 and I-2 and process for production thereof
US5093248A (en) BU-3862T antitumor antibiotic
EP0121121B1 (en) Novel compound, arugomycin
EP0205981A2 (en) A novel anti-tumor and antimicrobial compound, its microbiological preparation and its use as medicament
JP2002284799A (ja) 新規生理活性物質ｍｋ６００−ａ、ｂ、ｃおよびｄとその製造方法
JPS62226981A (ja) 新規抗生物質ｓｓ５０９０５ｂ及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee