DK165747B - Anthracyclinglycosider, fremgangsmaade til deres fremstilling, pharmaceutisk middel med indhold heraf og anvendelse af anthracyclinglycosiderne til fremstilling af medikamenter - Google Patents

Description

i

DK 165747 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte anthracyclinglycosider, en fremgangsmåde til deres fremstilling, pharmaceutisk middel med indhold heraf og anvendelsen af anthracyclinglycosiderne til fremstilling af medikamenter 5 med antitumor aktivitet.

Anthracyclinforbindelser er vigtige cancer-bekæmpende antibiotika, og der har allerede været foreslået flere typer forbindelser af denne art.

Fra EP patentskrift nr. 110.155 kendes således anthra-10 cyclinglycosider med formlen

R

Ϊ ?H ? i5 LIaa/oh

OH 0 OH O

20 Æ%° N(Ch>>· o 25 og blandt disse især et sådant, hvori R betyder gruppen (A): (A) ^ Æfy ν(οη,,.

0_<gi 35

DK 165747 B

2

Denne forbindelse, der betegnes ditrisarubicin A, udviser antitumor-virkning.

Der er nu ifølge opfindelsen tilvejebragt anthracy-clinglycosider med forbedret antitumor-virkning i forhold 5 til ditrisarubicin A.

Opfindelsen angår således anthracyclinglycosider, som er ejendommelige ved, at de har formlen I

10 *1 ? 0B 0R4

Jill /C2H5 I i |\ (I)

0H

15 OK o r2 or,

hvor J

R^ er hydrogen, R2 er hydroxy, og R3 og R4 er en hvilken som helst af følgende 8 sukkerkombi-20 nationer: r3_R4 (I) (V) (II) (II) 25 (I) (VI) (I) (IH) (IV) (I) (III) (I) (I) (VII) 30 (VII) (I) eller R2 er hydroxy, R2 er hydrogen, og R3 og R4 repræsenterer hver sukkerkombinationen (I), idet 35 symbolerne (I)-(VII) repræsenterer følgende sukkerkæder:

DK 165747 B

3

(I) RN-&F-C3 (II) Rtf-dF-CA

0 fj v_y jV_y q N (CH.) 2 0NtCH3>2 0 ¢)

° ' OH

nJ 0 O

/ \l jt \ H K_/ ‘’n0*3; H3c II \ /

O

(III) RN-dF-Ro (IV) RN-Ro-Ac

/— O « O

0

1 I I

0N(CH3)2 0 N (CH3) 2 ø ø I i — OH 0 py w

OH

DK 165747 B

4 (V) RN-Ro-CA (VI) RN-Ro-Ro r— ° A 0

\ / H

i 7 M

N (CH ) 0HtCH3’2

OH

(VII) RN-dF

/r\ ψ N (CH-s) 2 O -5 Δ /1—0 i (&

OK

OH

(RN: rhodosamin , dF: 2-deoxyfucose, CB: cinerulose B, CA: cinerulose Ά, Ac: aculose, Ro: rhodinose) og syre additionssalte deraf.

DK 165747 B

5

Forbindelser med formlen I, hvori R3 betyder suk-* kerkæden (I) og R4 betyder rhodosamin, eller R3 betyder rhodosamin og R4 betyder sukkerkæden (I), er beskrevet i DK patentansøgning nr. 3528/84.

5 Anthracyclinglycosiderne ifølge opfindelsen har den kemiske struktur, der er gengivet ved formlen I. De består af 9 typer alt efter substituenttyperne for Ri~R4 i formlen I og hvorledes disse substituenter er kombineret. Disse 9 typer kan sammenfattes i tabelform som følger: 10

Nr. Forbindelse R^ R2 R3 R4 (1) ditrisarubicin D H OH (I) (V) 15 (2) ditrisarubicin E H oh (II) (II) (3) ditrisarubicin F H OH (I) (VI) 20 (4) ditrisarubicin G H OH (I) (III) (5) ditrisarubicin CR H OH (IV) (I) (6) ditrisarubicin GR H OH (III) (I) 25 (7) ditrisarubicin G/de-Ro H OH (I) (VII) (8) ditrisarubicin GR/de-RO H OH (VII) (I) 30 (9) l-hydroxyserirubicin OH Η (I) (I)

Anthracyclinglycosiderne ifølge opfindelsen har en dimethylaminogruppe i sukkerdelen og er derfor i stand til 35 at danne syreadditionssalte. De syrer, med hvilke forbindelserne reagerer til dannelse af additionssalte, omfatter hydrohalogensyrer, såsom saltsyre, samt svovlsyre og vinsyre.

DK 165747 B

6

Den kemiske struktur i anthracyclinglycosiderne ifølge den foreliggende opfindelse bestemmes ved hjælp af de metoder, der er illustreret i ·forsøgseksemplerne senere i denne beskrivelse.

5 Nogle af de fysisk-kemiske egenskaber hos anthracy clinglycosiderne ifølge opfindelsen er vist nedenfor. 1 t t

DK 165747 B

7

Si X~*S

ro ^

ø s. s. *-> Is· CO H -—. LO

*<3< i—I \D s-“'' 0 fN

C CM rH O^tflCVOH

•H wv C O O Π3 — — 0 Γ" —. rs σι m js °° m •hm ^ n + χ cm in P o o U Φ S 2 O cm ~ p qcvjvd 3 > P O 2 m <D - - 5 - -

Sh ,_| -- - (N + rH S Λ Λ 'T'CT

n3 3 σ. o 2 S ή -X ft ό · m ffl S ft O rH CO ID M* * Π X SH rH CM Λ! CM Γ0

w CM - ΓΛ CO - C O 3 CM rH rH CO rH

j_i jj o -o -2 m in cm w --- - rø '-r — jj ^ rr< ID (N ID (N O CO CO O On •'ST'C' CM ΙΠ •M «tf Ol ΙΟ rH i—I rH i—I -H ΙΠ CT> "H "tf Ό Q — Vi CJ 2 U 2 O ·—I ·—1 «-Η *i~ '—' N tf w N in <s - -— tj. - ^coniH—xfn

CM M· r-H in CO O 'tf (N

J- O CM o ~ C ID rH

^ - d o in fC ^ — n t'- r- (3 on o 2 °ο t'- -Hk Vi rH + J3 cm m P o o £} d) EC SON —. P m <U cm id 3 > m o ES «-Η <D - - E - -

Vt rH - — —· cm + co E

ctf 3 <h n 2 S h »< r- m · 'tf o 01 ft cm rH ιο σ> "tf '-'tn- Vi n cs ^ ^ tf

-ri - tn - CO CO - c; O 3 CNrHr-jrOrH

Vi P iN-i-i-2 σισ> HU) ---(3------ +J^nT3 ID CM ID CM O ID ID CO ΙΟ "tf m Ή co .^j CO Ό. ID rH r-tf- rH -H in (ji Ή tf ^ q — Vi U 2 υ 2 U rH p p + — <M 'tf — <N in ci - _ _ -

fri «* -r /— r--. rH iH ' - rH

w H tf ri li) 03 O O) N

M 3 ΠΗ o m—^ (S in rH

rH-P - C'-'lDlO·^'-' Φ ϋ r- r- ro <M o -C <» Γη -h Vi Vi cm + -C 03 cn P c* o es n c; 2 2 o ^ — --’ ·'-' 7; :

Eh 3 > ‘Ή C 2 cm o ~ - ~ - ' I

P ,-ι - — cm tf· m E ·— — CTT: c3 3 cn O 2 S ·—l Π tf · » ΙΊ οι ft ίο μ o ίο tf -- m ^ ·Κ Vi h cm ,¾ o cn

-H ^ If) - Μ Μ - Γ S3 CM rH rH C-) rH

j_i jj o-o-2 mm o w --- ·—

CM O CN O OCOO-CO *tf m rH CO

CM -e. o rJ Η M· 'tf *H m O -H -tf o j Q — Vi U2U2U rH M « -r n -- r-» ^ t-· ι-H ^ r—

σηοο rH m C3 0 tf N

c CO O O id ^ c U) H

-H ^ C — W (β w O vo r- r-. doojSmr- ..H Vi VirH+ XjcrvmPOno

o Q3 ES ES 0 fN —> J-> (MinjycMiD

3 > MhO qj --E--

p-ι >- ·- ·— (M 4· 'tf S

(0 3 ^ 'tf 2 2 -< « . °°J^« cn ft cm rH r~~ o nj —- m P tf η M tf tf

k |s k tf 03 -pOSJ ΓΗ —IrHfOrH

Vi jj m-rH-ES r-· r- ίο w w w rø —- — o jj^o lonjioojoo voiDCTim M'in h co ή

•ΗΗ-Λ ID rH rH m rH Ή inon-H'tfiO U

q *— vi U2CJ2U i—i ή ι-n + -τ' CM tf — CM in S

• «r^s,

N U -p I cW £ ‘H

JJ\ 0 0 ·Ή E rH U

Ct> E · -P P -P 3 H m op tøC^ftP··- o <— .. >ætr>C>P-P5 <U -P <U2(U3ft0^i3 o

rrJQJ.. 0) rHIVlftCOWO

c 03 p c ehqoid iacux ii (DEHd) cr> ^hBUuinU®5 0) ri Ό <13 Φ rHCMul03E 3

OjnJd Vi rH r-k η— φ >—1 > C

3 C 3 <D 0rHCME32O ·τ- D < ft CQ S-r-'W'-1 « ,-1 cm m -<tf lo m i

DK 165747 B

8 ^ i) O 5 H tn O ro U 4J -Η Φ d Ή 3 q ^ £ 10 ^ y >1 «a - ju h •HQ s d s q oo σι u ΐ> - -H 3 g

-η <U ^ Φ S

n · · ·—i O'HTj'H

StnCn—rH g (3 >, d 8 ° H-H-W - . B .c S o -d m id fa Si N O C O +» *1-1 0> · 04

to S -H *H g _7 <d & S

-H Siri g m 8 S d ω - x 01 5-j CN·· VO q - U H TS 0) 0 +J 0040 \ r-4+J-P>iCj; _ •H in - o -m ,d rd -H æ td i g Q CNOfH ΓΟ CO L)4JC-P>C g I ^ lim - - — mos 5-t h m o 4J -H m c EJ 3 8 ·° i e

H Q C i IB

O u 4J *· *H 3 -H

•H m ιο a) «Η *0 Φ Ό

n >ri O -Η T3 H

d · r—I c § ^ ^ 8 na

MCntTi - · fi r g 8 3 <D

ιί ή -η n o d o 33 i« m g cn fa fas ·· -η *y §} t- *d & £

•H S lo gin 8 S d w - $ S

5-i in— vo O - Μ Η Ό m c

— -P O 04 O 0\ 3 +) -P >i g .G C

• -η m-o -in ,£ (d -η ,ς ro i O

ifl Q 04 O i—I VO CO q -P d +> > £ iH

4J O

k I M

O i L Qi IH — (DOS 5-1 Ή m m q +> -h m - * 38^:5- h d y >, ro - m 3

—'-Hn^Q Js1 c g C

H O CJ 3 - -H 3 (d T-t ·' · C* J _( -. ' r-iXitntn-H - ^ T 3 n c- g p r* jp w |—* g § ·>< x q om £! 54 fa fa ~ » M ,£ Ifa O -P >1 rom no d oov4mAi^i B 10 S - *H JLl r-H cl, c o ti s_ ^ Sl- 8 e 3 » - 3 j; _r ^ oKo » < s 4 s s 11n —ii in - o - -Ί .d :3 *h g c· i t n q οι o i—i mm q-PG-p>droro u s 1 !ϋ i iim - ^ >i *-- ro o g p = ro q ro υ -p -h ro g »H ,2 $ ^ 5 ^ ® d o - m »n £ η Q S1 C g 04 Jd

Ό O +3 ~ 3 _ § ^ S

Λ-Η04-Η - C 8 X O ° ? ~ -< fi § & 8 8 ® * 5-1· · - · R i ft ip -P = 00 ro tn tn n o d o +> -h ro h ro -H -hk - *h 'S Si JT S & S ω u •h fa |i| 2 m £ λ Rsdw-x,'au")

•P omo m \ H4-ii5>idJdr_,,H

•h m - o -m £j id i-ι .c S i & ·Η Q · CM Ο Ή OO m .U-Pd43>drH05 p m o -O -Η I DO O) ,χ g Ό — o - m cu id r-t

Hl -P 3 p S 04 γΗ·5-ι·η O qq amn «osi -HO>isa) --hd uirH+J > m o5 udtnmm υ η h 2 ΙΛΛί lSri-d +) nj M 1-1 -a tnm-H = • mm ή o s τΐ > o h ri dww to+JDj S - s« d smo< d·®. ό X5ICQ m'-x-HO^ftwO +J h »d ®

msi «nquO-Uinoj-si CBS

IQS OOdJlnm^rOrH^ S«S QS004«q-S0ir-l 04 4K«

H — S E-IU^S ><do CUO-r — 4K

r- co cn o r-i iH i—(

DK 165747 B

9

V r-- r' O M ~ CO

00 VO i—i cm σι O r*' co

c _ r- σ, or^'-'C^DH

.HOO ' ' g ^ M (|J ^ ^ M — KD VO r-» 3 O O 43 O m .-in i-ι o x:crin4Joo

XI Q) x 2 0 CM + 4J CM in Φ CO VO

3 0 > Ή O — "tf CD ' ~ S - ^

UdJr-i ' '—CM s cn 6 ^ Λ

3 13 σ\ in 2 + -l * vo vc · ο H

in 1) ft m to in γ-h ->a* 2 cm λ £ £ 12 d £ tI r(3 '00 'VC I'- 'CO 3 CM H r-i lO r-i J_l \ 4J ο ' O '2 I—I pH M* ID'—' — 1¾ — — jjpiO vo cm vo cm -<a* Γ'Γ'-'Ναι ό· in t-iin ri U $. in ο © σν ή -H m σ -Η ·μ· vo

Q — u U2U2U iH fH i-1 + — (N M1 — CM lO

* y“S, *»

*. v --- ΟΊ Ή—. T—I

cm vo r-ι m <λ 0 I-« e*

C . oo σ 0 — C vo iH

-ri p- - C — id ci — — η —· vo vo <—* 3 ο o 43 o in •H Vj U o Xjcncn+Joo

Xj ω a a 0 cm 4· 4-> cm in Φ cn vo 3 > mO'-'-fi 0) ' ' E ' ' i_t rH ' '—CMS σ S ~ 3 0 3 H in 2 + r-ι * vdcm ·^^ w Cd Οι vo o- in iH m· 2 cm λ

T-l I '00 'VO O' 'Co 3 CM rH cn iH

J_l QJ 4-J O'O'E p4H VO CD — — Π3 — — 40¾¾ VO CM VO CM 'S' Γ~- Η Γ~ '«Tin CMin i V. -q^ m o o oo i—i -.-itnov-Hrpvo QUM U 2 U 2 U HiHiH + — cm ^ — cm in — O' ' ^ ' —* rM ?h - -—- -—. m >H .—.co *__ ,—I *3* r—I I 00 0 IN rl

W C -«· Γ—l 0 VD — C VO H

1-1 ' ' ^ _ | r-c o ι— Γ' r-» ^ o — — -n qj-h Μ M cm + a cn co — οι o η χj Q) a a 0 CM -- 4-> cm in 0 cm vo 33 > <H0 2 0 <D - ' S v ^ o-i u ,h ' ' — cm + r- ^ 3 3 μ· o 2 2 r-i-K cn o · m cm CD £1, f VO O VO >? —('I'.. ri r-l CM 4d CM Γ1 —| ' Γ0 ' ro 00 ' 'd 0 3 N —' r-ί C-) —l C4 44 O ' C ' 2 M1 LO v Γ" I'. — — 3 — — +j — 33 vo cm vo cm o cc co co vo τνγ cn in

τΙ φ « VO r*4 r—I VO r—i -.-1 lD Ol 4 <f O

Q — S-t U 2 U 2 U HHH + — CM ^ — CM in eg rj w h o'—«. VO c-H <7*

r-{ CN 0 νΠ rM

c r-ι cn 0 σι — c co Ή •Η ν' C — 3 3 — — η i" vo — 3 Ο Ο X3 m vo -.-4 s-ι i4r-i+ a en en 4J σ o Λ 3 a a 0 CM u N in Q) CM vo 3 > U-iOK'vf· CD ' 6 *· - ^ r-l ^ --04 + 00 £ ' 3 3 ΙΛ ^ 2 S Ή ·κ ηιη·ο·Μ· · to α ο οο αο ο Ο — η- Μ ιο Ν y Η m en Τ-Ι 'Π ' 'Μ' CO 'C^O 3 CM f—1 Γ-4 Μ* ι-Η f-l

s-i 4J rH'H'a mm' σ id — — 3 — — U

44^-¾ VO CM VO CM O vo vo cm σ Cl ID OVD 30

*t4 in Ό, vo i—i f~4 oo *-4 '-imov-'^'TO U

Q — V4 U2U2U M^lrH + — CM — CM m T*1

.. N

^ .. \ . vo «0 4 j c · ε · υ ° — 3D1 > C CL) Q-i * 0)¾^ (DWD1 a C I» ^ ° ¾3C >4 rHSCDUCDO'c^S „

GtD3 cj >il(-iO τΐ ni ri u II

ai>,fc, ca 4dQ3m4JX}^w CU r—i 3^31-040333- 0

ID 3 -— iH *-i Qj >-i 4-J H

¾Π'-I cm Ο Ή CM E c) Ο > E *5 a <c — — g — — a —1 ii s c ίκ r-ι cm co rr m vo i

DK 165747 B

10

I H

I H >1 cl) c x;

U O Π P

id -P 0} 0) H 0) E s: c — ^ u 5 5 5 +j ro ό <u H CO Q) £ o o *· » 3 -H IT) id Η β Q) a ° -8¾¾ S a o . s I u a td « r- CO ·· β ΟΐΙ^ιΌΦ

to I Γ-1 Η Ο Η Ή 51 Λ ·Η ft C

•HO) Η gin 8 6 - S * 3 Ρ Ό * · in.. VD ο-Γ-ιΰηίδ -P \ Di Di no co \ JR -P Η H £ ,£ η pj ·Η h - o. ^ in ,β rd ρ β id i Q (5 li, oh nn Ο -P -P to > β ι i <u <d o £ u y -p η ω (d cu i:

5 - * a . I

3 ~ 3 j. 5 §

H in Q) Η Ό QJ

n r~> Ο ·Η ό H

3 ° £ § & $ 8 P O . 5 Λ S 0 Π rd o in o «· β oh 4-1 φ

--- tl) pi ri H O *H *3 Φ & S

•Ή1- ·-* £m 8 ^ id m - S

03 P <D · · 00 VD Ο-ΡΗΤίω -P Η Ό In Di coo o\ h-P+J>iHæ

P Η \ H H - o - in J5 <d H j3 id I

O Q O IP tn oh nn ϋ -P β -P > β

H

"" I

« 110 - 2 8 Bis H c Ά 8 10 5 c S. Π3 - Q)

Η Η ΙΟ Jr? β S

CD U — Π - H 3 π h c 75 2 - 3 id pQ ^ r-* <J .β -1

iH 3 H £ ?3 >i B

P - · P h 2 0 π (dn^ ο β ο H ih c ^

03 Η H .· Η P S j d S

_J iry p Lo Ο E Η β (0

Tl . „ c .2 p h to - κ 4-) Cn CD CM O Cl \ Π 4-) >, £ .£ •HCiH H ' O * in ^ d Ή " ιό ! q ϋ h Cn oH nn ϋ-ΡβΡ>β i i h ^

c ~ >, - Η «σ S

H in r η P H 0)

υ — H Q >ι κ E

H 0) g a p 3 o (OHO)

3 _i «· Λ - Η H

? H J £ Π Η β 0 P ^β h QJ H 03 4-) id H CM Ο H OBPHO)

03 Η H ·. g H-P^&C

-h 1/1 1/1 R 4j β 5 . I

M 2, 2 2: 2 ^ if5 8 * 8 ω -a 8 •P 01 Dl no - \ HH-PECÆ.

*H Dh Ή ·Η *-0 rH lO XJ Q) ¢) ·Η ?0 I

Q (J &4 fo O rH rH ΓΟ Ο υ υ Ό > C

•H

O'-' ^ . on ·· . .

p'-v'^'H··· H'M'.H h h 4-1 · u •'Ί 0 h o j3 0) & Φ ο^Η.απβ p co Di 03 o -y 03HPUOO H -P cm H "0. M J3 • (d4J S Ai fl Ό-HffiHH ^ ^ en 4J £iiHU··· c-k p β ωα c Λ i 01 -- Κ Id« « 0 OP to 0 3 ,Η as Ρ i 0>U>-Pm-& η |CQ0iNijrOHJ|(l)'q<H—. _ π PSXSa^SSfc.BiO ‘ΟιΗ cm 4t

Η — ZSE-iUZS-PidoO'-' — S

Γ» CO 31 O H

rH rH

DK 165747 B

11 ro

I—I

c υ

ϋ Ϊ O

,r-| v ** λ *, *» tH CO f“l *^· 0^ 7* CNfO rHCOOOOC^n S rH CO H S 40 Wm S S d ., j k. k. *· C v-' W fl3 u vo ^ O (Οοηχίονο

ni Li Li ol + £ <31 ri -P dl O

η Φ E K O OJ Λ U 4J <N tn Φ N W

£ > *** <w o a <n — o> - ' e * - V r-) w k K (!) + <J1 S r-. n-n ^ ^ 0 3 n r-i 2 s σ σι · m in

Li Qi o h o Is O — fO^CN S-l ΟΊ Ή Λί t^· T

£ ** ^rg-nco -?+! 3 γ-η ,η -i η ^ >, +) o - Η - E ΗΗν·~- cQwwrøww a* tj ό cn ό n o co oo σ von ootn 1 -o vor-ir-ioorw -wtnov-rinvo r-f Lt oaoiau Η h .-t + cn sr cn in

•P

ri N .OL; -O \ 0-0 ,—.. · tn g · ^-1 -¾ OP -O C ft) £. £< ε ν- dj tn > w σ' · w g

- φ Ό Q) Q) SJ O „ ^ C

n tj Q) C O Η I 0 U CÆ ·

CCDD CD >iQQ)0 WX

H s ifc “ IS h B .So ·§!*>? ® «CH N O 3 £ E β > 'm" XI — s ^ s_ w _ ^ — <ΰ E-.

,_! (M CO "3* in VD

DK 165747 B

12 h i i BO. <D •H xj

C ^ * U T

g H S δ! 1 Ή w Q) - p Λ UH G) p η JS u 5 P h ΰ -α ω

h U i1 S 3 I

P Q P £3 K S

ω u o q o οι

rn pi 4-1 H

S? _t _j - Q) rH O

>? H ^ S O 3 C

x - · fi ίο ω -P

0 ^ LO N O C OHO) P CM CM ffi ·♦ H ty >i cij Ό 2 in ε m S n 3 ^ — >. · · h co 3 8 ω -α h æ tn til o er o m\ H r3 E C ""

1 -Η -H o - o -in i i fl 3 H

H Eli B er O H CO 00 O P> Ό >

J

Γ; ”5 pi

rH

•H

Jj ^ o

. PJ

CD t-rx O

+> „ ij -P C

p 3 Ό Η Ό O · *H fi P tn 0)0

ih P Ό ·· nj W ·· Ό H JO UH

— -P P3>>H er 0 H 'Οχ: fij o i η o x: QJ q.

Λ O.HP >mroce;prøtnco η4 P

m CO XI pi ISKPIPCM-P^. ih — ·3χ; Uh U S H 35 Η H 4J -r-i copia « ·· -k g (ua ? η Xiico n-HKOtAocoo g <ΰρι «Huu-Pen«. 4J * ,-h iracr; υυπΡίω^Η-, *

qj ps w 2 pjaocpu-DiH

XJ H — 2 H U X5 S fCoO '-' ™ en

ns O

En r- co en o H

HH -K

DK 165747 B

13

For øjeblikket kan anthracyclinforbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kun fremstilles ved at dyrke mikroorganismer." De skulle imidlertid kunne fremstilles ved kemiske eller mikrobiologiske modifika-5 tioner af beslægtede forbindelser eller endog ved total syntese ud fra sådanne beslægtede forbindelser.

Opfindelsen angår således også en fremgangsmåde til fremstilling af anthracyclinglycosider ifølge opfindelsen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at stammen Strep-10 tomyces.cyaneus MG 344-hF 49 (FERM BP-314) eller mutanter eller varianter deraf med væsentlig samme egenskaber dyrkes i et passende dyrkningsmedium under aerobe betingelser, og at forbindelserne ifølge opfindelsen med formlen I derpå udvindes fra dyrkningsmediet.

15 Stammen S. cyaneus MG 344-hF 49, der kan producere anthracyclinglycosiderne ifølge opfindelsen, kan udsættes for radioaktiv stråling eller behandles på anden måde for at forøge dens evne til at producere anthracyclinforbindel- ser.

Stammen MG 2 i £ — k F 49 har ft leende r k f “ ri — stika:

Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 er en acti-nomveet, som i august 1980 blev isoleret fra jord fra Institute of Microbial Chemistry's ejendom. Stammen 25 blev deponeret hos Fermentation Research Institue, Agency of Industrial Science and Technology den 28. juni 1982 og fik betegnelsen FERM BP-314.

(1) Mycologiske egenskaber A. Morphologi. Ved iagttagelse under mikroskop 30 danner stammen MG 344-hF 49 tornede eller spiralformede mycelier ud fra forgrenet substratmycelier, men der iag-tages ingen hvirvler. Hver moden sporekæde består af mindst 10 sporer. Sporestørrelsen ligger groft taget i intervallet 0,4-0,6 x 0,8-l,0yUm, og sporeoverfladen 35 er tornet.

DK 165747 B

14 o B. Vaskst på forskellige medier. Betegnelserne i parentes, der anvendes ved farveangivelserne i den følgende beskrivelse, er anført 1 overensstemmelse med Color Harmony Manual udgivet af Container Corporation of Ameri-5 ca.

(a) Ciniclose-nitrat-agarmedium (dyrket ved 27°C).

En hvis tynd film af luftmycelier klæber til en vækst af mat purpurrød [9 le, hindbær]. Let blåligrødt opløseligt pigment.

10 (b) Glucose-asparagin-agarmedium (dyrket v. 27°C).

Lys blågrå (18 ec, Lt Aqua] luftmycelier klasber til en gulligrød [6 la, Lt Coral Red - 6 pc, paprika] vækst.

Rødligt opløseligt pigment.

(c) Glycerol-asparagin-agarmedium (ISP-medium 5: 15 dyrket ved 27°C). Luftmycelier med farver i intervallet fra hvid via gråhvid til lys blågrå klasber til en grålig-blåligrød (9 Ig, Rose Plum) vækst. Der iagttages intet opløseligt pigment.

(d) Stivelse-uorganisk salt-agarmedium (ISP-me-20 dium 4: dyrket ved 27"C). Luftmycelier med farver i intervallet fra hvid til grålig blågrøn [19 ie, Turquoise Green] klasber til en blegt lyserød vækst. Opløseligt pigment med en lyserød tone.

(e) Tyrosin-agarmedium (ISO-medium 7: dyrket 25 ved 27°C). ‘ Luftmycelier med farver i intervallet fra gråhvid til lys blågrå klæber til en vækst, der ligger i farveintervallet fra lys til mørk brun. Opløseligt pigment med en lys brunlig tone.

(f) Næringsagarmedium (dyrket ved 27°C). Luft-30 mycelier med en lys blåligrødlig grå farve klasber til en grålig rødblåligrød [8 le, Rose Wine] vækst. Der produceres et brunt opløseligt pigment.

(g) Gær-maltagarmedium (ISP-medium 2: dyrket ved 27°C). Luft mycelier med farver i intervallet fra 35 hvid via blåligrødlighvid til blålighvid klæber til en grålig rødblåligrød [9 ne, hindbær] vækst. Der iagt-

O

DK 165747 B

15 tages intet opløseligt pigment.

(h) Havremelsagarmedium (ISP-medium 3: dyrket ved 27°C). Luftmycelier med farver i intervallet blålig grå til grålig blågrøn [21 li, Dk Jade Gray] klæber til 5 en vækst med farver i intervallet fra bleg lyserød til mat blåligrød [10 pc, Fuchsia Purple]. Opløseligt pigment med en rød tone.

(i) Glycerol-nitrat-agarmedium (dyrket ved 27°C).

Hvide luftmycelier klæber let til en grålig blåligrød 10 [19 le, hindbær] vaskst. Opløseligt pigment med en blå ligrødlig tone.

(j) Stivelseagarmedium (dyrket ved 27°C).

Vækst med mat rødblåligrød farve [7 1/2 le, Rose Wine] .

Ingen luftmycelier. Opløseligt pigment med en blålig- 15 rødlig tone.

(k) Calciummalat-agarmedium (dyrket ved 27°C).

En tynd film af hvide luftmycelier klasber til en bleg blåligrød vaskst. Opløseligt pigment med en blåligrødlig tone.: 20 (I) Cellulose (syntetisk opløsning uilsat "i filtrerpapir, dyrket ved 27°C). Ingen vakst.

(m) Gelatine-stikkultur. Med simpelt gelatinemedium (dyrket ved 20°C), hvide luftmycelier klæber let til en bleggul vækst. Der produceres brunt opløse- 25 ligt pigment. Med glucose-pepton-gelatine-medium (dyrket ved 27°C) klasber lyserød-hvide luftmycelier til en farveløs til bleggul vækst. Der produceres mørkebrunt opløseligt pigment.

(n) Skummetmælk (dyrket ved 37°C). Hvide luft- 30 mycelier klæber til en lyserød til gråligrød vækst. Opløseligt pigment med en brun tone.

(2) Fysiologiske egenskaber A. Almen beskrivelse (a) Væksttemperaturinterval. Prøver på gluco- 35 se-asparagin-agar ved 20, 24, 27, 30, 37 og 50°C viser, at suairmen vokser ved alle temperaturer undtagen 50°C.

O

DK 165747 B

16

Den optimale temperatur vil omtrentlig ligger i intervallet 30-37°C.

(b) FlydendegøreIse af gelatine (15% simpel gelatine: dyrket ved 20°C, glucose-pepton-gelatine, dyrket 5 ved 27°C). Med den simple gelatine begynder gelatinen at blive flydende omtrent på dyrkningens 5. dag. Med glucose-pepton-gelatinen bliver gelatinen ikke flydende, selv ikke når der er gået 2 uger efter dyrkningens begyndelse, og der iagttages svagt flydende gelatine ca. 3.

10 uge. Gelatinens flydenhedsgrad er fra moderat til svag med den simple gelatine og svag med glucose-pepton-gelatinen.

(c) Hydrolyse af stivelse: (dyrket ved 27°C på enten stivelse-uorganiske agar-medium eller stivelsesagar- 15 medium).

Stivelseshydrolyse viser sig at forekomme ca. på dyrkningens 3. dag, og graden er fra moderat til svag.

(d) Koagulering og peptonisering af skummetmælk 20 (dyrkning på skummetmælk ved 37°C). ”c=gulering begynder at indtræffe ca. på dyrkningens 3. dag, og ca. på 7. dagen er koagulationen fuldstændig og peptoniseringen begynder. Peptoniseringsgraden er moderat.

(e) Dannelse af melamin-lignende pigment (dyr-

25 O

ket ved 27 C på enten trypton-gær-næringsvæske (ISP-me-dium 1), pepton-gær-jern-agar (ISP-medium 6) eller ty-rosin-agar (ISO-medium 7)). Der iagttages pigmentdannelse på alle medier.

(f) Udnyttelse af carbonkilder (dyrket ved 27°C

30 på Pridham-Gottlieb agarmedium (IDP-medium 9)). Stammen vokser ved udnyttelse af enhver af følgende carbonkilder: L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, saccharose, inositol, L-rhamnose, raffinose og D-manni- tol.

35

O

DK 165747B

17 (g) Opløsning af calciummalat (calciummalatagar: dyrket ved 27°C). Calciummalat viser sig at opløses i periferien af væksten ca. på dyrkningens 7. dag, men i ret ringe grad.

5 (h) Reduktion af nitrat (vandig pepton indehol dende 1,0% kaliumnitrat (ISP-medium 8): dyrket ved 27°C). Positiv.

B. Konklusion og identificering af ny stamme.

Opsummering: Stamme MG 344-hF 49 hører til slæg-10 ten Streptomyces, og 2,6-diaminopimelinsyre indeholdt i cellevæggen er af L,L-typen. Der iagttages ingen sporehuse. Luftmycelier danner en spiral men ingen hvirvel. Sporeoverfladen er tornet. Med forskellige medier har luftmycelier farve i intervallet fra hvid via lys blålig-15 grå til grålig blågrøn og klæber til en vækst, hvis farve ligger i intervallet fra gråligrødblåligrød til gulligrød. Blåligrødligt eller rødligt opløseligt pigment dannes. Bagsiden af væksten fungerer som pH-indikator, og dens farve skifter fra blåligrødlig til blålig blålig-20 rød eller blå ved tilsætr.ir.r zf 1*' NaO.-!. Malar.!::-limende pigment er positivt, og den proteolytiske styrke er fra moderat til svag. Stivelseshydrolysegraden er ligeledes fra moderat til svag.

Screening af de kendte stammer på basis af dis-25 se data viser, at Streptomyces cyaneys er nærmet beslægtet med stamme MG 344-hF 49 (International Journal of Systematic Bacteriology 22, side 290, 1972 (henvisning 1), Waksman, The Actinomycetes 2, side 188, 1961 (henvisning 2), Bergey's Manual of Determinative Bacteriolo-30 gy, 7. udg., side 757, 1957, og ovennævnte, 8. udg. side 822, 1974 (henvisning 3))

Stamme MG 344-hF 49's egenskaber sammenlignes i den følgende tabel med Streptomyces cyaneus anført i den nævnte litteratur.

35

DK 165747B

18 o

Tabel II

Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49_ISP 5108_ 5 Luftmyceliers form spiral spiral

Sporeoverflade tornet tornet

Luftmyceliers farve hvid-lys blåliggrå blegblå - grålig blågrøn blåliggrå Vækstens farve bleg lyserød - mørk gråligblå - 10 grålig rødblålig- mørk grålig blårød ligrød

Opløseligt pigment fra (-) til blå- fra (-) til blå rødlig, underti- rødlig eller blå-den rødlig lig 15 Dannelse af mela- min-lignende pigment + +

Stivelseshydrolyse + moderat til svag + svag* Mælkekoagulation + + Mælkepeptonisering + + 20 Gelatine bliver + moderat til svag -f- stærk flydende

Nitratreduktion + -*

Udnyttelse af car-bonkilder 25 D-glucose + +-- L-arabinose + +- D-xylose + + D-fruntose + +

Saccharose + + 30 Inositol + + L-rhamnose + +

Raffinose + + D-mannitol + + pH-indikator + + 35 * Ifølge henvisningerne 2 og 3.

DK 165747 B

19

Som vist i tabel II er stammen MG 344-hF 49 og Streptomyces cyaneus i store træk ens med hensyn til e-genskaber undtagen med hensyn til nitratreduktion. Imidlertid anses nitratreduktion ikke for et pålideligt pa-5 rameter til identificering af en bestemt mikroorganisme som en Actinomycet og kan ikke anvendes til at skelne mellem de to stammer.

Derfor anses stamme MG 344-hF 49 for at; være den nærmest beslæftede med Streptomyces cyaneus, og af 10 denne grund identificeres stammen MG 344-hF 49 som Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49,

Anthracyclinglycosiderne ifølge opfindelsen kan som anført fremstilles ved aerobt på et passende medium at dyrke Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 (FERM BP-314) eller mutan-15 ter eller varianter deraf med væsentlig samme egenskaber og derpå udvinde forbindelserne fra dyrkningsmediet.

Det medium, der anvendes, kan indeholde en hvilken som helst af de næringskilder, der kan udnyttes af den anvendte mikroorganisme. Specifikke eksempler på næringsmid-20 delkilder omfarter carbonkilder, såsom glycerol, glucose, saccharose, maltose, dekstrin, stivelse samt fedtstoffer og olier, nitrogsnkilder, såsom organiske stoffer som sojabønne-mel, bomuldsfreoliskage, kødekstrakt, pepton, torgær, gær-ekstrakt og majsstøbevæske, samt uorganiske stoffer som 25 ammoniumsalt og nitratsalte, f.eks. ammoniumsulfat, natriumnitrat og ammoniumchlorid. Om nødvendigt kan der tilsættes uorganiske salte, såsom natriumchlorid, kaliumchlorid, phos-phatsalte og tungmetalsalte. For at forhindre den skumning, der kan forekomme under fermentering, kan der eventuelt 30 tilsættes et passende afskumningsmiddel såsom silicone ifølge gængs teknik.

Som ved gængs praksis ved fremstilling af antibiotika er aerob submers flydende dyrkning den mest egnede metode til dyrkning af den anvendte 35 mikroorganisme. Dyrkningstemperaturen ligger bedst i intervallet 20-35°C, idet 25-30°C er særlig fo-

O

DK 165747 B

20 retrukket. Hvadenten metoden ske'r ved rystekultur eller ved beluftet roterende kultur, når udbyttet af an-thracyclinglycosiderne ifølge opfindelsen et maksimum i løbet af 3-7 dage.

_ På denne måde fås en kultur, hvori . der er

O

akkumuleret et anthracyclinglycosid ifølge opfindelsen. En del af anthracyclinglycosidet kan forekomme i de dyrkede celler, men størstedelen af den findes i dyrkningsfiltratet.

10 Der kan anvendes en hvilken som helst metode, der passer til den foreliggende opfindelses specifikke formål, til at udvinde det ønskede anthracyclinglycosid ud fra den således opnåede kultur. En teknik er baseret på ektraktionsprincippetj specifikt kan anthra-15 cyclinglycosidet i dyrkningsfiltratet ekstraheres med et i vand blandbart ditrisarubicin-opløsende opløsningsmiddel (jfr. den ovennævnte litteratur), såsom ethylace-tat, butylacetat, chloroform eller butanol (der opnås høj ekstraktionseffektivitet, hvis dyrkningsfiltratet er neutralt til svagt basisk) , o c hvis anthrac^clir. gly-cosidet findes i de dyrkede celler, kan den nemt opsamles ved filtrering, centrifugering eller på anden passende måde, og den ønskede forbindelse kan udvindes ved at behandle de opsamlede celler med ethylacetat, chloroform, 25 methanol, ethanol, butanol, acetone, methylethylketon, vandig saltsyre, vandig eddikesyre eller lignende. Kulturen kan udsættes direkte for ekstraktionsoperationer, uden at cellerne fraskilles. Cellerne kan udsættes for ekstraktion efter homogenisering. En anden mulig eks-30 traktionsteknik er modstrømsfordelingsmetoden.

Endnu en metode til udvinding af anthracylingly-cosiderne ifølge opfindelsen fra kulturen er baseret på adsorptionsprincippet. Et allerede flydende stof såsom kulturfiltratet, der indeholder anthracyclinglyco-35 sidet ifølge opfindelsen, eller den ekstrakt, der fås ved de ovennævnte ekstraktionsteknikker, underkastes

O

DK 165747 B

21 søjlechromatografi, væskechromatografi eller andre adsorptionsteknikker, ved anvendelse af et passende adsor-bens, såsom aktivt kul, aluminiumoxid, silicagel eller "Sephadex LH 20" (Pharmacia Co.); adsorbatet elueres 5 derpå til udvinding af det ønskede anthracyclingly- cosid ifølge opfindelsen. Den således opnåede opløsning af anthracyclinglycosidet ifølge opfindelsen inddampes til tørhed under vakuum, hvilket giver en rå prøve af det endelige anthracyclinglycosid som et rødt pul-10 ver.

Den rå prøve renses ved at gentage ekstraktions- og adsorptionsprocedurerne ovenfor det nødvendige antal gange, kombineret efter behov. Om nødvendigt kan der foretages omkrystallisation. Således kan der søjlechro- 15 matograferes ved anvendelse af et adsorbent såsom silica cagel, "Sephadex LH 20"^, en svagt sur ionbytterharpiks, eller "Diaion HP 20'® (produkt fra Mitsubishi Chemicals Industries Limited), eller et gelfiltreringsmiddel kombineret med . væskechromatografi kan anvendes (modstrømsforde-20 ling) , højtryksvæskechrcr.atcgrafi eller tyndt lags -hrc-matografi ved hjælp af et passende opløsningsmiddel.

Sagt på en mere speciel måde, opløses det rå pulver af anthracyclinglycosid ifølge opfindelsen i en lille smule chloroform, og opløsningen ledes gennem en sili-25 cagelkolonne. Ved eluering med et passende opløsningsmiddel fås afgangsvæsker, der indeholder de respektive effektive komponenter. De ønskede aktive fraktioner opsamles og inddampes under vakuum. Ved efterfølgende tyndtlagschromatografi kan man få alle slutkomponenter-30 ne som hovedsagelig rene produkter. Med henblik på yderligere rensning kan der foretages højtryksvæskechroma-tografi eller krystallisation ud fra et passende opløsningsmiddel.

Anthracyclinforbindelserne ifølge opfindelsen 35 har den virkning, at de inhiberer vækst af leukæmi-celler, samt anti-tumor-aktivitet og er derfor værdifulde som lægemidler.

DK 165747 B

22

Opfindelsen angår derfor endvidere et pharmaceutisk middel, som er ejendommeligt ved, at det som aktivt stof indeholder en forbindelse med formlen I eller af syreadditionssalt deraf som ovenfor defineret kombineret med et 5 pharmaceutisk acceptabelt bærestof.

Opfindelsen angår endelig også anvendelsen af en forbindelse med formlen I eller et syreadditionssalt deraf som ovenfor defineret til fremstilling af et medikament med anti-tumor-aktiviteter.

10 Bestemmelse af kemisk struktur I. Bestemmelse af ditrisarubiciners struktur.

Grundtrækkene i metoden til bestemmelse af strukturen for ditrisarubicin D, E, F, G, CR, GR, G/de--Ro og GT/de-Ro (nedenfor kollektivt kaldt DTR-X) er vist i 15 fig. 26, hvor RN er rhodosamin, og RI, R2, R3, R4, R6 og R6 respektive sukkerforbindelser. I nedenstående beskrivelse anvendes symbolerne i fig. 26 til at identificere de respektive forbindelser.

DTR-X (1) hydrolyseres' fuldstændig ved opvarm-20 ning i 0,1K HC1 ved 35°C i 2D minutter. I dette viifalde fås rød agiycon (2) og respektive sukkerforbindelser.

På basis af Rf-værdien med TLC på silicagel, UV-absorptionsspektre, massespektrum (m/z 386 (M)T) og “H-NMR--spektrum identificeres (2) som β-rhodomycinon.

25 De flydende hydrolysater neutraliseres med sølv- carbonat, fremkaldes på silicagel-TLC med en blanding af n-butanol/eddikesyre/vand = 4:1:1 og underkastes farvereaktion med p-anisaldehyd. Rf-værdierne og farveændringer anvendes til identifikation. Sukkerbestandde-30 lene i DTR-X (1) og de oprindelige spidser, der fås ved FD-masse-spektre, ses i tabel III, hvor ++, + og - repræsenterer farveændringer fra det resultat, der fås med hydrolysatet af kontrol-ditrisarubicin B (DTR-B).

35

DK 165747 B

23 ll i .1. i T— I-1— .......— ....................... ·'"·* ~ ' ' 0)

to * CQ

O * >H + + + φ 3+I + + + + + + + m

W O

0) H

C 3

U

U (D

________C

----—--—-- -H

0) v (0 O Q) iH + r-i 3 + + I I I I I « I ^ l-ι x , (U CL) *, C ^ ^ T1 o tu o g

4J

C --—--— M

tu tu %

C CD

0 0 ^ p. C + o S-H+I + + + +II I υ o *0 Q) "m S to

tn £ O

tu n ^ W-------------------- 3 Η . n V g V, β

e O <U

5 8 O' (U

O 3 C r-H

«3 + + + + + + Ti i? 0>i++ + + + + + + + φ φ

X C —I

>H O (U Q

S f · I 1 I" s s H M ______________________________________ M-4 H J4 Η φ β r« ^ i-t

iH

® Ι-£+ + ·τ + + ν-Γ -i- Z- n * S & ά 0 i g r* vj U1 * ^ — ---—-----------—-—— d + + + + + ++ + S* w ζχεκκ+κκ a $ w «· 4- + + + +.^-+ + + ^ 2 .<££££££££ £ g” E w > O r-inc'tnm'Wr-ir-i ih ft) fu voosvooDUScor-r*' co i-ι £ rHrHr-lr-ir-liHOO f4 & 3 FHfHfHiHi-4*Hi-4iH iH (U )4 M + --o

I V

c.

01 CO

— o

Ή o K

w OK + S

K I z

Μ I (U ·> I

1 0) Ό + S

K Ό \ + *”l

E- K OS \ K

Qq&JC-OUOUO ffl i i r i i i i i i ....

CCKZKKKKZ K

fe * QOQQOQaQ Q * *

O

DK 165747 B

24 Når (1) opvarmes i 0,1N HC1 ved 70°C i 20 minutter, fås i hver tilfælde forbindelse (3). Efter fuldstændig hydrolyse giver forbindelsen (3) β-rhodomycinon (2) og rhodosamin. Forbindelsen (3) giver en oprindelig 5 spids ved m/s 700 (M)+ i FD-massespektrum. På basis af denne oplysningen sammen med resultaterne af ^H-NMR-spek-trum viser forbindelse (3) sig at være β-rhodomycin II, som har et molekyle rhodosamin bundet til både 7- og 10--stillingerne (Tetrahedron Ltt., 1969, 415-419 (1969)).

10 Det er således klart, at alle varianter af DTR-X (1) har β-rhodomycin II i deres delstruktur.

Når forbindelsen (1) reduceres katalytisk ved almindelig temperatur og tryk i 10-30 minutter i nærvær af 5% Pd/BaSO^/ fås forbindelsen (4).

15 Når forbindelsen (4) er fuldstændig hydrolyseret i 0,1N HCl, dannes der i hver tilfælde rød aglycon (5) og forskellige sukkerforbindelser. På basis af Rf-vær- di med TLC på silicagel, UV-absorptionspektre, massespek- + 1 trum (m/z 370 (M) ) og H.NMR-spektrum identificeres for-20 bindeisen (5) s cm γ-rhccerr.ycincn. Identificering af sukkerforbindelserne foretages på basis af Rf-værdierne på silicagel-TLC og farveændringer. Sukkerforbindelses-kcmponenterne i redukcicns-dekomponeringsproduktet (4) af DTR-X (1) (produktet anføres herefter som DTR-X/'x^) 25 og de oprindelige spidser i FD-massespektre herfor er vist i tabel IV.

30 35

DK 165747 B

25 tu w o 3 I f I I + + I + u O c u <u n 0

3 + + I I I I I I

HK M

^ 0)

Φ C

4-I

, c u

<P

c--—— ----------------- o <u O to ε c 0 c +

,M ·« + I + + I I I I

03 Ό 0) O

03 s: H l-i 03 Ό------- ---

CO) H

i-< 03 o Λ o O1 ti o e o? τ'

ι^ι ih M

Μ>ιΙ + Ι+ + + + + Ό d) X 3 Λ O »

M 0) O

3 Ό > > W I ^ i-C <N 3 r-1----------------- Q) (1) Λ C > <o\ ri ·- E-tr c — Π3 ii B34- + + + + + + + 0 O & T3 03

O O

.= U

____C

'O

+ + + + + + + + OJ ft

S + + + + + i + ± S

N øh* «£* Λ* Λ- «-4 *« 1 V «*** w w *-*» «·—* w ε q «rouscjcococoeo

t< inr>inr^tDtaLnvo O

Γ-Γ'Ρ'Γ-Γ-Γ'-νΟΓ·' w ___________ ^ α o

^ M

3 jn i (S sT* \ O1 = \ O o \ ok X Kl + 1 η CM I 0) OZ N N <N fS Ϊ2 K 0) Ό - E-iXSKK'v'vO'^ +

Ovs'^vn'^KK\K +

DCdKUUUUU I I I I I I I I piCiKKKKKK

OQOQQQQO *

DK 165747B

26 Når DTR-X/H2 (4) hydrolyseres delvis i 0,1N HC1 ved opvarmning ved 70°C i 10 minutter, fås i hvert tilfælde forbindelsen (6). Efter fuldstændig hydrolyse, giver forbindelsen (6) γ-rhodonomycin (5) og rhodosamin, 5 med en oprindelig spids, der fremkommer ved m/z 526 (M)+ i FD-massespektrum. Analyse ved hjælp af ^H-NMR-spek-trum tyder på en struktur, hvor et molekyle rhodosamin er bundet til forbindelsen (5). På basis af disse data identificeres forbindelsen (6) som γ-rhodomycin I [Natur-10 wissenschaften 48, 717 (1961)]. Det sluttes derfor, at hver variant af forbindelsen (4) indeholder γ-rhodomycin I som delstruktur.

Fig. 23-28 på tegningen er 1H-NMR-diagrammer for · DTR-D/H2, E/H2, F/H2, G/H2, CR/H2 og G/de-Ro/H2. Tilsvarende 15 1H-NMR-spektre for DTR-GR/H2 og GR/de-Ro/H2 er udeladt, fordi de er de samme som for DTR-CR/H2. Disse data viser, at DTR-X/H2-(4)-varianter er forbindelser, hvori de sukkerkæder, der er anført i tabel V er bundet til τ-rhodomyci-non (5) i 10-stillingen.

i 20 Dataene i tabellerne III og sar.t “H-XKR-sper.- trumdiagrammerne i fig. 2, 4, 6, 9, 12, 14, 16 og 18 taler til støtte for den konklusion, at de respektive varianter af DTR-X (1) har de i tabel VI viste strukturer.

25 30 35

O

DK 165747 B

27

Tabel V

DTR-'X/H (4)_Sukkerkader* dtr-d/h2 (V) DTR-E/H2 (II) 5 DTR-F/H2 (VI) DTR-G/H2 (III) DTR-CR/H2 (I) DTR-GF/H2 (I) DTR-G/de-Ro/H2 (VII) 10 DTR-GR/de-Ro/H2 (I) * Med hensyn til betydningen af de respektive 15 symboler henvises til fig- 31.

Tabel VI

De respektive ditrisarubiciners struktur *2

20 O OH O

QOCO^ °" 6 03 0 25 *1

Sukkerkader

Forbindelse_R·^_R2_ (1) DTR-D (I) (V) (2) DTR-E (II) (II) 30 (3) DTR-F (I) (VI) (4) DTR-G (I) (III) (5) DTR-CR (IV) (I) (6) DTR-GR (III) (I) (7) DTR-G/de-Ro (I) (VII) 35 (8) DTR-GR/de-RO (VII) (I)

Med henblik på betydningen af de respektive symboler henvises til fig. 31.

O

28

DK 165747 B

II. Bestemmelse af 1-hydroxyserirubicins struktur Når 1-hydroxyserirubicin (herunder forkortet til 1-HSR) opvarmes i 0,1N HC1 ved 85°C i 30 minutter, produceres der rødorange aglycon og tre sukkerforbindel-5 ser. På basis af Rf-værdien på silicagel-TLC, massespektrum (m/z 386 (M)+)og ^H-NMR-spektrum (fig. 34) i-dentificeres aglyconet som (^-rhodomycinon [Chem. Ber.

101, 1341-1348 (1968)J. Sukkerforbindelserne fremkaldes som hydrolysater på silicagel-TLC med en blanding 1Q af n-butanol/eddikesyre/vand = 4:1:1 og underkastes farvereaktion med anisaldehyd/svovlsyre. På basis af Rf-værdierne og deraf følgende farveændringer viser de respektive sukkerforbindelserne sig at være rhodosamin, 2-deoxyfucose og cinerulose B. Eftersom 1-HSR giver + 15 en oprindelig spids ved m/z 1181 (M+H) i FD-massespek-trum, menes denne forbindelse at have to molekyler af hver af rhodosamin, 2-deoxyfucose og cinerulose bundet til c^-rhodomycinon.

I tabel VII klassificeres de kemiske ændrin-13 2q oer i C-NMR-seektrundiacrammer fer srkkerkædsme i 1-HSR sammenlignet med dataene for ditrisarubicin B [J. Antibiotics 36, 1080-1083 (1983)) og serirubicin.

Dataene viser, at de afprøvede 1-HSR-forbindelser har identiske sukkerkæder. I fig. 21 vises ‘‘'H-NMR-spektre 25 for 1-HSR. Denne spektralanalyse støtter også antagelsen, at 1-HSR-forbindelser har de i fig. 30 viste strukturer.

30 35

DK 165747 B

29 c Ή u η o 'a' m 'T o -H(N ιλιπ-^γΗπ o en m o o r-- σ> ru 0 *» v * * *» »· —

DOrMiH^COCXjn M l> h (N 1/1 W IN Π ΟΝ ΓΝ f" UD

5-io vd t-- ud .—i f c\i ud ud.—i von r»i-i •Η .Η

5u X X X X

QJX «- ----- IS} - - - - - Ol - - V UD Γ- O CO U) ^fOVD'TrOrOOCN >-l OD <N CD ΓΝ OD UD OD t— .—I <0 r-l ^ S ·* »w *- K ·«. *. N. «t ·. ^ *t OUDODr-irroocom σι ίο h id in ι/ι r-ι ru od oo r- ud 5-l'<T>fMVOr'UDr-l'a> OD CM U> UD VD .-I OD UD OD O Γ'- >-l

13 CM

> Λ

H

fH in ^

C (N VDVDinHfO o ro ^ HCX? CTtiN

fH S. h. f. *·»*>. *- k. s K ··.«<. *. *· ΟοΓν/Η'Τοοωη ni h ni m ni ru ro en ru Γ" ud •H O ID h ID Η 1 IN ID UD UD ΓΟ Γ'Η Λ -π

ΟΧ - X ·> X X X X

- - — — co - οο - - - οο — τΐιοΐβ'ί'ίποιηι ru en ru ο m ο ud ο t'* r-ι οο .Η 5„| — — — — — -.— — — — — — — ^ S V ^ ^ ^ OJiooirHi'corni m id h h in id r-ι m od co r- ud

UOinilDr'lDH'T OD CM UD VO UD rH OD UD 00 Ο Γ" H

Η cm

H

> 1-1 05 r\ i I t /0 [

* „ I

er I

Cenoo VO 1.0 r-l eO O'? Ί1 ri CO Cl (N

*»W < k. >k. k «·* k. W ·*. V. *w *» ) υ rH en ον ·5τ cd cc ~n m h η- N en ni ον ο- o on r- o : •Hots > ID r-ι I1 CNO VO -O 00 Γ- .Η JQ «Η c

5-1 X X X X X X

(0 in tH ·* W <h V K S V k. V *> h. 00 k-

H'srTrrrromo'iCN H en ro o ro o νο ο Γ'· r-ι οο H

4J S ^ V s \ S ^ ·« k, K K ^ S V k ·« k, S S

·ΗΓ^σ\Η^οθΓ^Γθ σ» <£> r- m u? h m er* co r·"· u? T30DCNVOr^'VOr-l*i' 0D CM VO VO VO .H OD VO ΓΟ Ο Γ- .-1

ON

r-icsn^LDvDCN H cm ro ·μ· in vo .—i on m m vo c 0 X ------ XI <N.....-......

5.1------05------ ------ ro......S............

CjHrunfLnuDZ r-ι cm m in vo r-ι cm m -sr in vo 0

DK 165747 B

30 -*1-—2-

Ditrisarubicin B H OH

Serirubicin Η H

1-Hydroxyserirubicin OH H

5 *4

0 OH O

10 1 I I IN» OH O K2 ° R4: , 53 /Γ °\ R3! /r°J tJ- ti/1' J-3 I- 9 ^ch3 ' ch3 r°, 0 NcH3 ics2 y i”·· - ./T^ fV7 Λ/ΐ’' °l 01 /°~\ 25 ,° -\ i\_/ H3Co H3= Γ~^ O .

30

Biologisk aktivitet (1) Aktivitet med hensyn til inhibering af vasksten af leukæmiske celler P 388

Anthracyclinforbindelserne ifølge opfindelsen inhiberer væksten af dyrkede celler i meget lave doser. Ne-35 denstående tabel viser de koncentrationer (IC5q) af forbindelserne ifølge opfindelsen, ved hvilke der kan opnås 50%'s

O

DK 165747 B

31 inhibering af væksten af en 2-dages kultur af leukæmiceller P 388 sammenlignet med en gruppe, der ikke behandles .

5 Tabel VIII

Forbindelse IC50 DTR-D 0,0040 DTR-E 0,0070 DTR-F 0,0038 10 DTR-G 0,0045 DTR-CR 0,0040 DTR-GR 0,0042 DTR-G/de-Ro 0,012 DTR-GR/de-Ro 0,020 15 1-HSR 0,012 (2) Anti-tumor-vlrkning på mus med Leukæmi L 1210 20 _

En gruppe CDF.-nuo tr =r.jp_anterrncrapar:.·:;- **" 5 nealt med suspensioner af leukæmiceller L 1210 (1 x 10 celler/mus). Straks efter transplantationen injiceres 0,25 ml af hver af prøveforbindelserne peritor.ialt i musene i 10 dage. Der foretages observationer i 30 dage, 25 og overlevelsesprocenten for hver prøveforbindelse bestemmes, idet 100 repræsentere det antal dage, som kon-trolmusegruppen, der indgives fysiologisk saltvandsopløsning, overlever. Resultaterne er anført i tabel IX.

30 35

O

DK 165747 B

32

Tabel IX

Dosis _% overlevende_

mg/kg/dag_DTR-D DTR-E DTR-F DTR-G 1-HSR

Toxin 5 1 114 0,5 - 139

Toxin Toxin 0,25 131 106 133 125 145 0,125 114 156 152 138 151 10 0,0625 142 163 133 163 127 0,0313 125 119 127 117 108 0,0156 102 102 120 111 0,0078 97 102 101 109 15 Fremgangsmåden til fremstilling af forbindel serne ifølge den foreliggende opfindelse vil i det følgende blive nærmere belyst ved hjælp af eksempler.

Eksempel 1 20 (1) Fremstilling a:: roiakultur

Der anvendes et medium med følgende sammensætning Galactose 2,0%

Dekstrin 2.'·% "Bacto-soyton1^ (Difco Lab.) 1,0% 25 Majsstøbevæske 0,5%

Calciumcarbonat 0,1% pH før sterilisation 7,4 100 ml af dette medium fyldes i en 500 ml konisk 30 kolbe og steriliseres. Det steriliserede medium inoku-leres med en portion Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49, der tages fra en skråtstillet kultur med en platinstang.

Det inokulerede underkastes rystekultur ved 27°C i 72 timer.

35 (2) Fermentering

Der anvendes et medium med følgende sammensætning: 0 33

UK Ibb/il·/ IS

Dekstrin 3,00%

Glucose 0,30% "Toast-soya" (sojabønnemel fremst. af Nissin-Seiyu Co.) 2,00% 5 Koboltchlorid 0,12 g/llter

Calciumcarbonat 0,30% 15 liter af dette medium fyldes i en 30 liters fermenteringsbeholder, steriliseres og inokuleres med 500 10 ml af den under (1) fremstillede podekultur. Det inoku-lerede dyrkes ved 27°C i 90 timer ved 150 omdr./min, idet der tilføres luft med en hastighed på 15 liter/min.

(3) Indsamling af ditrisarubiciner

Den i afsnit (2) opnåede kultur filtreres, og 15 filtratets pH justeres til 8,0. Det således justerede filtrat underkastes ekstraktion med 10 liter butvlacetat, og ekstraktens øverste lag inddanpes, hvilket giver 20 g olie. 0-lien opløses i en smule chloroform. · Opløsningen ledes gennem en kolonne pakket med 100 g silicagel ("Kiesel Gel 60" fra Marck Co.) 20 og underkaste: ientslue::ing mal ™ tbu.dinr cMcrrfc:.·" cg methanol, idet forholdene mallen methanol og chloroform varieres.

Zonerne indeholdende ditrisarubicin D, Ξ, F, G og GR koncentreres til frembringelse af 230 mg di trisarubicinerne jr rødt pulver.

Eksempel 2 25 100 mg af det rå røde pulver, der fås i eksem pel 1, opløses i en lille smule chloroform, og der afsæt-' tes en dråbe af opløsningen på 10 tynde lag silicagel ("Kielsel Gel 60 ^254" ^ra Merc^ Co.), som er 0,25 mm tykke og 20 x 20 cm store. Efter fremkaldelse med en blan-30 ding af chloroform, methanol og koncentreret vandig ammoniak (100:5:0,02), opsamles separate zoner for ditrisarubicin D, E, F, G og GR og elueres ud fra silicagelen med en chloroform/methanol-blanding = 10:1. De således opnåede fraktioner inddampes og renses ved HPLC. Adskil-35 lelse foregår på en kolonne (diam. 20 x 300 mm) af "Nu-cleosil 5C^g" (Nagel Co.) med et opløsningsmiddelsystem

DK 165747B

34 o af acetonitril/0,45% vandig phosphorsyre.

De respektive eluater neutraliseres med natrium-bicarbonat og ekstraheres med chloroform. Chloroformla-get inddampes til tørhed. Prøverne, der er opløst i en 5 chloroform/methanol-blanding (1:1) påføres kolonner (di ameter 2,0 x 28 cm) af "Sephadex LH-20", som er bragt i ligevægt med samme opløsningsmiddelblanding. Efter elu-ering med samme opløsningsmiddelblanding og inddampning i vakuum til tørhed, fås ditrisarubicin D, E, F, G og GR 10 i mængderne hhv. 32,0, 31,5, 30,5, 65,5 og 67,5 mg.

Hver af disse prøver viser sig at bestå af en enkelt komponent ved analyse ved hjælp af TLC på silicagelplade og højtryksvæskechromatografi med "Nucleosil 5Clg".

15 Eksempel 3 50 mg ditrisarubicin G og GR omsættes med 0,1N HC1 ved 30°C i 20 minutter. Efter ekstraktion underkastes ekstrakterne silicagelchromatografi. Efter fjernelse af DTR-G eller DTR-GR med en CHCl^/MeOH-blanding 20 = 1 no · "? r-rr·'. /;.·~·ντ -- v .·» . = -Uu I w ,· —-- 3 -..«u . ..\- - ^/ i -C Χ-» -v . * - ; de respektive eluater inddampes under vakuum til tørhed. Opløsningerne af remanenserne ledes gennem en kolonne af "Saphadex LK-20,! og elueres med CHCl-/MeOK =1:1, hvorved fås DTR-G/de-Ro og DTR-GR/de-Ro i mængder på 25 hhv. 25 og 15 mg. Efter analyse ved hjælp af TLC og HPLC viser hver af de således opnåede prøver sig at bestå af en enkelt komponent.

Eksempel 4 30 800 mg af en blanding af DTR-B, C, CR, seriru- bicin (SR) og 1-hydroxyserirubicin (HSR) opløses i en lille smule chloroform, og den fremkomne opløsning afsættes som dråber på 80 tynde lag silicagel ("Kiesel Gel 50 ^254" ^ra Merck Co.), som er 0,25 mm tykke og 35 20 x 20 cm store. Efter fremkaldelse med en blanding

O

DK 165747 B

35 af chloroform, methanol og koncentreret vandig ammoniak = 100:5::0,02 opsamles zoner for DTR-C, SR og HSR og elueres med en chloroform/methanol-blanding = 10:1. Ef-' ter inddampning til tørhed afsættes opløsninger af re-5 manenserne som dråber på 20 tynde lag af samme silica-gel og fremkaldes med en blanding af ethylacetat, methanol og koncentreret vandig ammoniak - 25:1:0,08.

Dråberne indsamles, elueres, inddampes og underkates endnu en TLC på tre tynde lag af samme silicagel efter-10 fulgt af eluering med en blanding af chloroform, methanol og koncentreret vandig ammoniak = 100:5:0,02 for at fjerne den lille smule residual-DTR-B. Efter inddampning af eluaterne til tørhed fås en HSR-fraktion ved hjælp af søjlechromatografi på "Sephadex LH-20" 15 (elueringsmiddel MeOH), og denne inddampes under vakuum til tørhed, hvorved der fås 13,7 mg HSR som et rødorange pulver. Den således opnåede prøve viser sig at består af en enkelt komponent ved analyse ved hjælp af TLC og HPLC (omvendt fase).

20

Herefter følger en kort beskrivelse af tegningen, på hvilken fig. 1-21 er IR-, NMR- og UV-spektrum-diagrammer for forbindelserne (l)-(ll) som anført nedenfor: 25 30 35 36

O

DK 165747B

Fig. nr._Spektriim Forbindelse 1 IR (1) 2 NMR (1) 3 IR (2) 5 4 NMR (2) 5 IR (3) 6 NMR (3) 7 UV (4) 8 IR (4) 10 9 NMR (4) 10 UV (5) 11 IR (5) 12 NMR (5) 13 IR (6) 15 14 NMR (6) 15 IR (7) 16 NMR (7) 17 IR (8) 18 NMR (8) 20 19 UV (11) 20 IR (11) 21 NMR (11) fig. 22 er et reaktionsskema, der viser en 25 skitse til fremgangsmåderne ved bestemmelse af strukturerne af anthracyclinforbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse, fig. 23-29 er NMR spektrumdiagrammer for de dekomponeringsprodukter, der fås under fremgangsmåden 30 til bestemmelse af strukturerne for anthracyclinforbindelserne ifølge opfindelsen, fig. 30 viser strukturerne for forbindelse (11), og fig. 31 viser strukturerne af de respektive 35 sukkerforbindelser i samme forbindelse.

Claims (6)

37 UK Tbb/4/ B Patentkrav .

1. Anthracyclinglycosider, kendetegnet ved, at de har formlen i

2. Fremgangsmåde til fremstilling af anthracyclingly-cosider ifølge krav 1, kendetegnet ved, at stammen Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 (FERM BP-314) eller mutanter eller varianter deraf med væsentlig samme egenskaber 5 dyrkes i et passende dyrkningsmedium under aerobe betingelser, og at forbindelserne med formlen I derpå udvindes fra dyrkningsmediet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at dyrkningsmediet er en flydende submers kultur 10 bestående af næringscarbonkilder, nitrogenkilder og eventuelt uorganiske salte og/eller af skuinningsmidler, at dyrkningen gennemføres ved en temperatur fra 20 til 35eC, og at de producerede forbindelser udvindes fra dyrkningsmediet ved hjælp af gængse ekstraktions- eller adsorptionsmetoder.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 og 3, ken detegnet ved, at der ved dyrkningen anvendes stammen Streptomyces cyaneus MG 344-hF 49 (FERM BP-314).

5. Pharmaceutisk middel, kendetegnet ved,at det som aktivt stof indeholder en forbindelse med 20 formlen I eller et syre&ddicionssalt deraf som definerer i krav 1 kombineret med et pharmaceutisk acceptabelt bærestof.

5 R1 0 OH 0R4 Jl JL vi ^c.h. (i)

10 OH O R2 0R3 hvor er hydrogen, R2 er hydroxy, og R3 og R4 er en hvilken som helst af følgende 8 sukkerkombi-15 nationer: r3_r4 (I) (V) (II) (II) 20 (I) (VI) (I) (III) (IV) (I) (III) (I) (I) (VII) 25 (VII) (I) eller R;l er hydroxy, R2 er hydrogen, og R3 og R4 repræsenterer hver sukkerkombinationen (I) , idet 30 symbolerne (I)-(VII) repræsenterer følgende sukkerkæder: 35 DK 165747 B 38 (I) RN-dF-CB (IX) RN-dF-CA syJ fcy o M (CH3) 2 oN(CH3)2 /“°vj /r\ |\CK3 J (cb3 J _[ o 00K O k3c i ' \_y 0 : (III) RN-dF-Ro (IV) RN-Ro-Ac r\ r \ (ck3 ; fc) V7 0N(ch3)2 /T~°\ /—o. kch3 ; /1 \ \_/ yCH3 / V . >" .-(CN p w OH DK 165747 B 39 (V) RN-Ro-CA (VI) RN-Ro-Ro vi/ 0N(Ci'3)2 N(CH3)2 (S1 0 0 OR (VII) RN-dF r°. 0N(CH3)2 \CH3 / i / OH OK (RN: rhodosamin , dF: 2-deoxyfucose, CB: cinerulose B, CA: cinerulose A, Ac: aculose, Ro: rhodinose), og syre- additionssålte deraf. DK 165747 B 40

6. Anvendelse af en forbindelse med formlen I eller et syreadditionssait deraf som defineret i krav 1 25 til fremstilling af et medikament med anti-tumor-akti-viteter. 30 35