HU182322B - Process for preparing 1-nitro-9-/hydroxy-alkylamino/-acridines and salts thereof - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás az (I) általános képletű vegyületek — ebben a képletben R egyenes vagy elágazó szénláncú, 2—4 szcnatomos alkiléncsoportot jelent — és sóiknak az előállítására. A találmány szerint az (1) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy l-nitro-9-fenoxi-akridint fenolban oldunk, az oldathoz a megfelelő hidroxialkilamint vagy annak sóját adjuk közel ekvimoláris mennyiségben, a rcakcióclegyct 60— 100 °C-ra melegítjük, majd a reakciótermeket elkülönítjük és kívánt esetben sóvá alakítjuk.

A reakcióelegy feldolgozásakor előnyösen úgy járunk el, hogy az elegyet lehűtjük és nagyobb térfogatú apoláris oldószerbe öntjük. Alkalmas oldószerek például dietiléter és benzol. A kivált csapadékot kiszűrjük és valamilyen vízmentes poláris szerves oldószerből vagy az ilyenek elegyéből átkristályosítjuk. Poláris oldószerként például metanolt, etanolt vagy azok elegyét alkalmazhatjuk.

A kiindulási anyagként szükséges aminkomponcnsként az alábbiakat soroljuk fel: 2-amino-butan-l-ol, annak hidrokloridja, 3-amino-propanol-hidroklond, 4-amino-butan-l-ol-hidroklorid.

A sóképzéshez előnyösen sósavat használunk, de szerves savak, így citromsav, borkősav, tejsav és metánszulfonsav alkalmazása szintén lehetséges.

A találmány szerint előállított vegyületek a technika állásából ismert vegyületektől a 9-es helyzetben kapcsolódó szubsztituensben különböznek, ugyanis az (I) általános képletű amino-akridinck nem tartalmaznak omega-nitrogénatomot, helyét a hidroxiesoport foglalja el.

Az (I) általános képletű vegyületek in vivő és in vitro erős daganatgátló hatást mutatnak. Farmakológiai vizsgálatok kimutatták, hogy a vegyületek kevésbé toxíkusak, mint az ismert amino-akridin-származékok. Az (I) általános képletű vegyületek egyik képviselője már klinikai kipróbálás alatt van.

Az (I) általános képletű l-nitro-9-hidroxialkil-amino-akridinek növekedésgátló és ezen belül tumornövekedés-gátló hatását az alábbi tesztekkel vizsgáltuk in vitro és in vivő.

I. In vitro eljárások

a) A habfű csírázásának gátlása (Lepidium Sativum)

80. mm átmérőjű Petri-csészét két réteg szűrőpapírral bélelünk ki, és a papírra lehetőleg egyenletesen 20—25 habfűmagot helyezünk. A szűrőpapírt a vizsgálandó vegyület 1 mg/ml koncentrációjú oldatának 30 ml-ével átitatjuk, kontroll csészékben desztillált vizet alkalmazunk. A csészéket 24 órán át 20—30 ^cC-on inkubáljuk, utána a csírák hosszát megmérjük. A gátló hatást százalékban fejezzük ki, amikor is a kontroll csírák hossza 100%. Az (I) általános képletű vegyületek a csírahosszat 87— 94%-kal csökkentették.

b) Miyamura eljárás (Ehrlich-féle ráksejtekkel)

Az eljárás lényege, hogy 5 x 10⁶ sejt/ml koncentrációjú szuszpenziókban megvizsgáljuk a vegyületeknek a ráksejtek dehidrogenáz-aktivitására kifejtett gátló hatá >át. A vizsgált vegyület 1%-os oldatát tartalmazó henger körül 37 °C-on végzett 5 órás inkubálás után köralakú zóna alakul ki, amelyben az alkalmazott redoxszinezék nem redukálódott. Redox-színezékként resasurínt alkalmazunk. Általánosan elismert elv, hogy aktívnak minősül az olyan vegyület, amely körül legalább 20 mm átmérőjű gátolt zóna alakult ki. Az (I) általános képletű vegyületek ebben a tesztben 31—33 mm átmérőjű gátolt zónát eredményeztek.

c) Szövctkullúra — ún. KB-vonal

Ezt a vizsgálatot Eagle és Foley [Cancer Research 18, 1017—25, (1958)] módszerének Smith és munkatársai [Cancer Research 19, 843 -846 (1959)] által módosítón változata szerint végeztük. Embertől származó daganatsejteket, az ún. KB-vonalat alkalmaztuk, a sejteket 10% borjúsavót tartalmazó Eagle tápközegben tenyésztettük kémcsövekben. Mindegyik kémcsőbe egy milliliter sejt-szuszpenziót (40 —80 000 sejt) adtunk, ami 40 -80 sejtfehérjének felel meg. A tenyészet növekedését a sejtfehérje mennyiségének meghatározása alapján mértük. A mérést fotometrikusan, Folin—Cicaltanreagens alkalmazásával Oyam et al. [Proc. Soc. Exp. Bioi. Med. 91, 305—307 (1956)] módszere szerint végeztük. A kémcsövek beoltásával egyidejűleg a vizsgálandó vegyület vízzel készített oldatából 0,9-0,9 ml-t adtunk a kémcsövekbe. Az oldatok koncentrációját úgy választottuk meg, hogy a tápközegben a koncentráció 100, 10, 1, 0,1, 0,01, 0,001, illetve 0,0001 μg/ml volt. A kémcsöveket ezután 37 °C-on 72 órán át inkubáltuk. Ezt követően mind a kísérleti vegyületeket tartalmazó, mind a kontroll kémcsövekben meghatároztuk a sejtfehérje megnövekedett mennyiségét. Minden kísérletet kétszeres ismétléssel végeztünk. Azt a koncentrációt határoztuk meg, amely a sejtfehérje többletmennyiségét a kontrolihoz képest 50%-kal csökkentette (ID₅₀-érték). A gátlás százalékos értékét az alábbi képlet alapján számítottuk ki:

vm_Fk—km_Fk ahol vm_Fk=a fehérje végmennyisége a kontroliban, vm_Ft = a fehérje végmennyisége a tesztben, km_Fk—a fehérje kezdeti mennyisége a kontroliban.

Általánosan elfogadott szabályok szerint [Leitcr et al., Cancer Rés. Supl., Cancer Chemotherapy Screening Data XXXV, 2, 25, 522—580 (1965)] aktívnak az a vegyület minősül, amelynek gátló koncentrációja (ID₅₀) 1 μ§/πι1-ηέ1 kisebb. A fenti szerzők úgy vélik, hogy az ilyen vegyületeket — az in vivő kísérletek eredményétől függetlenül klinikailag ki kell próbálni.

Az (I) általános képletű vegyületekkel a fenti tesztet többször ismételtük. Az l-nitro-9-(hidroxietil-amino)-akridin (kódneve: C—857) ID₅₀ értéke 0,0007 μβ ml.

II. In vívó eljárások

a) A Crocker-féle egér-szarkóma (Sa—180) növekedésének gátlása

A kísérlethez 3 hónapos, mintegy 25 g súlyú egereket használtunk. Az egereket az Sa —180 jelű daganat egy metszetével megfertőztük és csoportokba osztottuk: 18 kontroli-egér, és 8-8 állatból álló kísérleti csoportok, amelyeket az (I) általános képletű vegyületekkel gyógyítani igyekeztünk.

A maximálisan tolerált dózis (MTD) meghatározása Után a vizsgálandó vegyületeket intraperitoneálisan alkalmaztuk. A daganat elleni hatás kritériumaként a daganatok súlya közötti különbséget tekintettük, továbbá a vegyületek toxicitását is figyelembe vettük. A toxicitás megítéléséhez tartozik a gyógyított egér súlycsökkenése a kontrolihoz képest, a kimúlt egerek száma a kontrolihoz képest, valamint a mikroszkóppal végzett hisztopatológiai vizsgálat. Aktívnak azt a vegyületet minősítettük, amely a szarkóma növekedését legalább 40%-kal gátolta anélkül, hogy 4 g-nál nagyobb súlycsökkenést vagy több, mint csoportonként két egér kimúlását idézte volna elő. Ezt a teszt-sorozatot többször megismételtük. Az l-nitro-9-hidroxi-etilamino-akridin például 0,1—0,8 mg/kg dózisokban a Sa—180 szarkóma növekedését 44—86%-kal gátolta, míg az l-nitro-9-hidroxi-butilamino-akridin 0,2—0,4 mg/kg dózisokban 45—60%-os gátlást eredményezett.

Farmakológiai vizsgálatok

A biológiai aktivitással párhuzamosan megvizsgáltuk a vegyületek akut és felhalmozódó toxicitását, valamint fontosabb farmakológiai tulajdonságaikat is, nevezetesen :

1. akut toxicitás és maximálisan tolerált dózis

2. felhalmozódó toxicitás

3. a vérkeringésre kifejtett hatás

4. a sima izomzatra kifejtett hatás

5. a központi idegrendszerre kifejtett hatás

6. immunoszupressziv hatás.

Az akut toxicitást és a maximálisan tolerált dózist mindkét nembeli Wister patkányokon, házinyulakon és nőnemű Albino-swiss egereken vizsgáltuk. Intraperitonealis beadással mind a három állatfajnak, orálisan a patkányoknak és a házinyulaknak adtuk be a vizsgálandó vegyületeket. 48 órás megfigyelés után az alábbi eredményeket kaptuk.

Az l-nitro-9-hidroxi-etilamino-akridin LD₅₀ és MTD-értékei (mg/kg)

Állatfaj	i. p.	p. o.
LDjg	MTD	LDS0	MTD
Egér	23,4	16
Patkány	9,2	7,5	69,1	30
Házínyúl	11,4	7,5	60,0	20

A felhalmozódó toxicitást 20-20 patkányból álló kísérleti csoportokon vizsgáltuk, az állatok a vizsgált vegyületet 14 napon át 1/100 LD_SO dózisban kapták. Utána az állatokat leöltük, és az izmokat, valamint a hasüreget makroszkóposán szemrevételeztük. Ügy látszik, hogy a találmány szerint előállított vegyületek csekély mértékben felhalmozódnak. Súlycsökkenést, küllemi és viselkedésbeli változást nem figyeltünk meg.

A vérkeringésre kifejtett hatást patkányokon vizsgáltuk meg, amelyeknek l-nitro-9-(hidroxi-etilamino)-akri dint 0,01—20 mg/kg dózisban adtunk. A vegyület az arteriális nyomást, a szivfrekvenciát, az EKG-görbéket, a légzés-frekvenciát és -amplitúdót nem befolyásolja. A vegyület csupán 20 mg/kg dózisban enyhe görcsoldó hatást fejtett ki a patkány belére és húgyhólyagára.

A központi idegrendszerre a vegyületek nem hatnak, 1/20—1/2 LD_S0 dózisban fájdalomcsillapító, görcsoldó hatásuk nincs, a mobilitást nem befolyásolják lényegesen, azonban a hexabarbital-narkózisra van bizonyos, de csekély hatásuk.

Ismételt beadás esetén, 1/5—1/10 LD₅₀ dózisban a vegyületeknek immunoszupressziv hatásuk van, amelyet az alábbi tesztekben megvizsgáltunk: a pikrilklorid által kiváltott kontakt allergia, és a transzplantátum által kiváltott helyi sejtreakció.

Megvizsgáltuk továbbá a vegyületek küszöb alatti toxicitását házinyulakon, amelyeknek a vizsgált vegyületet 1/120 LD_5ö dózisban intraperitoneálisan adtunk be. 21 nap elteltével a lép és a máj súlyának csekély csökkenését, valamint a leukociták számának emelkedését észleltük. A többi vérvizsgálati módszer nem mutatott ki különbséget a kontroll és a kezelt csoport között. 1/20—1/60 LD₅₀ dózisban 21 napon át orálisan alkalmazva a vegyületek a máj súlyának csökkenését okozták, de a lép/máj index a kontrolihoz képest változatlan volt.

A vérvizsgálat során megállapítottuk, hogy a vörös vértestek rendszere nem változott, bár a fehér vérsejtek száma megnőtt. A többi kémiai paraméter a kontrolihoz képest statisztikailag lényeges eltérést nem mutatott.

A találmányt az alábbi példákkal közelebbről megvilágítjuk.

1. példa

6,4 g l-nitro-9-fenoxi-akridint 20 g fenolban oldunk és az oldathoz 2 g 2-aminoetanol-hidrokloridot adunk. A reakcióelegyet 80 °C-on tartjuk 40 percen át, lehűlés után éterrel hígítjuk, majd lassan hidrogénkloridot tartalmazó éterrel savanyított száraz éter nagy feleslegébe folyatjuk. A kivált csapadékot leszűrjük, száraz éterrel mossuk és vízmentes etanolból átkristályosítjuk. Sötétsárga kristályok alakjában 91%-os hozammal kapjuk az l-nitro-9-(2-hidroxietil-amino)-akridin-hidrokloridot, amely bomlás közben 170 “C-on olvad.

Kromatográfiai vizsgálat:

Semleges alumíniumoxidon (60 ^254’ Merek) benzol, aceton és metanol

3:1:1 arányú elegyével R₇=0,6; kovasavon (Kieselgel Merek) butanol, ecetsav és viz 4: 1 : 1 arányú elegyével R_f=0,45.

Analízis a C₁₅H_i4N₃OjC1 képlet alapján: számított: C 56,47% H 4,42% N 13,17% talált: C 56,44% H 4,40% N 13,03%.

2. példa

3,16 g l-nitro-9-fenoxi-akridint 15 ml fenolban feloldunk, és az oldathoz 1 g 3-aminopropanol-hidrokloridot adunk. A reakcióelegyet 30 percen át 60 °C-on, majd lehűlés közben száraz benzolban oldjuk és az oldatot száraz benzol nagy feleslegébe öntjük. A kivált narancsszínű csapadekot leszűrjük, szűrön többszörö3 sen vízmentes éterrel mossuk, majd etanol és éter elegyéből átkristályosítjuk. 88%-os hozammal kapjuk az l-nitro-9-(3-hidroxipropil-amino)-akridin-hidrokloridot, amely bomlás közben 180 °C-on olvad.

Kromatográfiai vizsgálat:

Az 1. példában megadott adszorbensek és futtató elegyek esetén R_f=0,55, illetve R.=0,45.

Analízis a C_I6H₁₆O₂N₃C1 képlet alapján: számított: C 57,53% H 4,83% N 12,58% talált: C 57,63% H 4,97% N 12,43%.

3. példa

3,9 g l-nitro-9-fenoxi-akridint 20 ml fenolban feloldunk, és az oldathoz 1,1 ml 2-amino-butan-l-olt adunk. A reakcióelegyet 20 percen át 90 °C-on tartjuk, utána lassan hűtött éterbe öntjük. Az oldószer egy részét ledesztilláljuk, és a kivált olajos masszát petroiéter és benzol elegyéből kristályosítjuk. 99%-os hozammal kap- 20 juk az l-mtro-9-(l-hidroximetil-propil-amino)-akridint a szabad bázis alakjában; a termék 107 °C-on olvad. A bázist szervetlen vagy szerves savakkal, igy éteres sósavval, vagy tej-, citrom- vagy metánszulfonsawal sóvá alakíthatjuk. 25

Kromatográfiai vizsgálat: az előzőekben megadott adszorbenseken az 1. példa szerinti összetételű futtató elegyekkel R_f=0,7, illetve R_f=0,6.

Analízis a C₁₇H|₈O₃N₃C1 képlet alapján (hidroklorid) számított: C 58,67% H 5,21% N 19,08% talált: C 58,80% H 5,17% Ν 11,84%.

4. példa

6,4 g l-nitro-9-fenoxi-akridint 30 ml fenolban oldunk, és az oldathoz 2,4 g 4-amino-butan-l-ol-hidro5 kloridot adunk. A reakcióelegyet 20 percen át 100 C-on tartjuk, majd lehűlés után 1,5 liter vízmentes éterbe öntjük. A kivált narancsszínű csapadékot metanolban oldjuk, majd éter hozzáadásával kristályosítjuk. 90%-os hozammal kapjuk az l-nitro-9-(l-hidroxibutiI-amino) 10 -akridinl, amely bomlás közben 168 °C-on olvad.

Az 1. példában megadott két kromatográfiás oldószerrendszerben R_f=0,65, illetve R_f=0,50.

Analízis a C₁₇H|₈O₃N₃C1 képlet alapján: számított: C 58,67% H 5,21% N 12,08% 15 talált: C 58,69% H 5,20% N 12,16%.

Claims (1)

1. Szabadalmi igénypontok

   Eljárás (I) általános képletű l-nitro-9-hidroxialkií-amino-akridinek — az (I) általános képletben

   R egyenes vagy elágazó szcnláncú 2, 3 vagy 4 szénatomos alkiléncsoportot jelent — és sóiknak az előállítására, azzal jellemezve, hogy l-nitro-9-fenoxi-akridint fenolban oldunk, az oldathoz a megfelelő hidroxialkilamint vagy annak sóját adjuk közel ekvimoláris mennyiségben, a reakcióelegyet 60— 100 ⁼C-ra melegítjük, majd a reakcióterméket bázis vagy savaddíciós só alakjában elkülönítjük, a bázist 30 kivánt esetben sóvá alakítjuk, vagy a savaddíciós sóból a bázist felszabadítjuk és kívánt esetben más sóvá alakítjuk.