HRP970528A2 - Mycosis vaccine - Google Patents
Mycosis vaccineInfo
- Publication number
- HRP970528A2 HRP970528A2 HR96115954.8A HRP970528A HRP970528A2 HR P970528 A2 HRP970528 A2 HR P970528A2 HR P970528 A HRP970528 A HR P970528A HR P970528 A2 HRP970528 A2 HR P970528A2
- Authority
- HR
- Croatia
- Prior art keywords
- dsm
- vaccine
- subspecies
- suspension
- trichophyton
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 242
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 title claims description 14
- 208000024386 fungal infectious disease Diseases 0.000 title claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 210
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 claims description 156
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 claims description 142
- 241000223229 Trichophyton rubrum Species 0.000 claims description 124
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 85
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 claims description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 68
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 66
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 59
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 56
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 55
- 241001045770 Trichophyton mentagrophytes Species 0.000 claims description 55
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 54
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 54
- 241001480043 Arthrodermataceae Species 0.000 claims description 50
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 230000037304 dermatophytes Effects 0.000 claims description 50
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 46
- 102000008934 Muscle Proteins Human genes 0.000 claims description 45
- 108010074084 Muscle Proteins Proteins 0.000 claims description 45
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 41
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 38
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 38
- 239000006159 Sabouraud's agar Substances 0.000 claims description 35
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 35
- 239000012449 sabouraud dextrose agar Substances 0.000 claims description 35
- 241000223238 Trichophyton Species 0.000 claims description 34
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 claims description 26
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 25
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 18
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 14
- 241000893980 Microsporum canis Species 0.000 claims description 12
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 claims description 9
- 208000010195 Onychomycosis Diseases 0.000 claims description 9
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 claims description 9
- 201000005882 tinea unguium Diseases 0.000 claims description 9
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 8
- 241001480037 Microsporum Species 0.000 claims description 7
- 208000007163 Dermatomycoses Diseases 0.000 claims description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 201000003929 dermatomycosis Diseases 0.000 claims description 6
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 3
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 3
- YCHXNMPJFFEIJG-UHFFFAOYSA-N 3-methyloxiran-2-one Chemical compound CC1OC1=O YCHXNMPJFFEIJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 claims description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims 6
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 claims 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 101
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 92
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 62
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 61
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 56
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 56
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 55
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 53
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 42
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 39
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 38
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 38
- MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N ciprofloxacin Chemical compound C12=CC(N3CCNCC3)=C(F)C=C2C(=O)C(C(=O)O)=CN1C1CC1 MYSWGUAQZAJSOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 37
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 36
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 33
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 28
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 26
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 20
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 15
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000012286 potassium permanganate Substances 0.000 description 9
- JYLNVJYYQQXNEK-UHFFFAOYSA-N 3-amino-2-(4-chlorophenyl)-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(CN)C1=CC=C(Cl)C=C1 JYLNVJYYQQXNEK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 8
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 8
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 8
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 7
- 201000000297 Erysipelas Diseases 0.000 description 6
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 5
- LRJOMUJRLNCICJ-JZYPGELDSA-N Prednisolone acetate Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@@](C(=O)COC(=O)C)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O LRJOMUJRLNCICJ-JZYPGELDSA-N 0.000 description 5
- 206010067409 Trichophytosis Diseases 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 244000132059 Carica parviflora Species 0.000 description 4
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 4
- 210000000282 nail Anatomy 0.000 description 4
- 229960002800 prednisolone acetate Drugs 0.000 description 4
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 4
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 4
- AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N urea hydrogen peroxide Chemical compound OO.NC(N)=O AQLJVWUFPCUVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020565 Hyperaemia Diseases 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 3
- 208000002474 Tinea Diseases 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 3
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 3
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 3
- 201000010153 skin papilloma Diseases 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 201000009861 cutaneous mycosis Diseases 0.000 description 2
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N Cellulose, microcrystalline Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 PTHCMJGKKRQCBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000040311 Eucharis candida Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 206010034016 Paronychia Diseases 0.000 description 1
- 241000029132 Paronychia Species 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 208000006311 Pyoderma Diseases 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 206010037888 Rash pustular Diseases 0.000 description 1
- 206010043275 Teratogenicity Diseases 0.000 description 1
- 241000130764 Tinea Species 0.000 description 1
- 241000893966 Trichophyton verrucosum Species 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- FHKPLLOSJHHKNU-INIZCTEOSA-N [(3S)-3-[8-(1-ethyl-5-methylpyrazol-4-yl)-9-methylpurin-6-yl]oxypyrrolidin-1-yl]-(oxan-4-yl)methanone Chemical compound C(C)N1N=CC(=C1C)C=1N(C2=NC=NC(=C2N=1)O[C@@H]1CN(CC1)C(=O)C1CCOCC1)C FHKPLLOSJHHKNU-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000004905 finger nail Anatomy 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000005095 gastrointestinal system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 208000029561 pustule Diseases 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000211 teratogenicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004906 toe nail Anatomy 0.000 description 1
- 229940055035 trichophyton verrucosum Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0002—Fungal antigens, e.g. Trichophyton, Aspergillus, Candida
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/165—Yeast isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/72—Candida
- C12R2001/725—Candida albicans
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Predloženi izum spada u područje mikologije i odnosi se na cjepiva koja sadrže homogenizirane inaktivirane dermatofitne mikrokonidije i inaktivirane homogenizirane bastospore kvasnice ili antigenski materijal spomentih spora, metode za njihovu proizvodnju i na njihovu upotrebu za profilaksu i/ili liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije ljudi. Cjepiva prema predloženom izumu su naročito korisna za prifilaksu i/ili liječenje kožnih mikoza, ponajprije dermatomikoza i/ili kandidoza i/ili onihomikoza.
Zasada, postotak gljivičnih infekcija (mikoza) je dramatično porastao. Posebno, postotak gljivičnih infekcija na koži (kožne mikoze) porasle su na 4-8% od svih kožnih bolesti u ljudi. Taj postotak je porastao u tropskim uvjetima na sve do 15-20%. Najčešće opći patogeni povezani s kožnim mikozama jesu dermatofiti roda Trichophytona, kao Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes i/ili Trichophyton verrucosum. Drugi gljivični patogeni povezani s kožnim mikozama jesu kvasnice, na primjer rod Candida, tj. Candida albicans.
Tipičan primjer kožne mikoze je onihomikoza, tj Tinea unguinum. Onihomikoza pogađa otprilike 2-8% ljudske populacije, Glavni patogeni povezani s onihomikozom u europskim zemljama jesu dermatofiti vrste Trichophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes kao i kvasnice vrste Candida albicans. Candida albicans je mnogo češće nađena u infektiranom noktu prsta ruke, nego nožnim noktima. Slično drugim kožnim mikozama, onihomikoze nikad ne prolaze spontano, i ako se ne liječe u krajnjem stupnju uvijek dovode do onihoditorfije.
Kožne mikoze liječe se normalno primjenom kožne terapije s protugljivičnim kemijskim tvarima. Međutim te kemijske tvari imaju značajne sporedne efekte (npr. hepatotoksičnost, jaka teratogeničnost, iritacije gastrintestilnog i središnjeg nervnog sistema kao i alergijske reakcije) i/ili se ciljnu stranu ne dohvaća dovoljno, kao u slučaju onihomikoze, gdje je infektirana strana pokrivena s noktom. Posebno kod kroničnih infekcija, gdje su inficirani korijenovi kose ili nokata, te kemijske terapije su dugotrajne i razočaravajuće, za oboje, za liječenika i za pacijenta. Nadalje, brzina ponavljanja infekcije je ekstremno visoka.
Kožne mikoze mogu se razviti u sistemske gljivične infekcije (sistemske mikoze), tj. u imunosno ugrožene osobe. Sistemske infekcije obično se moraju liječiti s kemijskim sredstvima tjednima ili mjesecima. Liječenje ponekad može trajati i do jedne godine. Pacijenat koji pristane na takovo liječenje često pati od pojave sporednih efekata, i odnos korisnog i opasnog postane posebno problematičan.
Prema sadašnjem znanju, kronične gljivične infekcije javljaju se kod inače zdravih osoba, tj . nema imunosne deficijencije pojedinaca, jer je u tih pojedinaca odgovor antitijela usmjeren samo protiv gljivica, tj. IgE posredovan imunosni odgovor, ali nema stanično posredovanog imunosnog odgovora. Međutim, sam imunosni odgovor posredovan antitijelom nije dovoljan za uspješnu borbu s gljivičnom infekcijom. Posljedica je kronična mikoza (Sorensen, G.W., Arch. Dermatol. 112, 1976, 40-42; Hay, R.J., Shennan, G-, Br. J. Dermatol. 106, 1982, 191-198; Dahl, M.V., Adv. Dermatol. 2, 1987, 305-320).
Cjepiva koja sadrže dermatofite dobro su poznata po njihovoj sposobnosti izazivanja obadva odgvora, međutim, kao i sa svim živim pripravcima cjepiva, injekcija zdravih pojedinaca preko svježe cijepljenih pojedinaca je trajna opasnost. Inaktivirana cjepiva često ne uspijevaju izazvati dovoljno stanično posredovanog odgovora i s tim u skladu nisu dovoljno djelotvorna kao živo cjepivo.
Napori usmjereni na inaktivirane dermatofite kao dermatomikozno cjepivo poznati su iz stanja tehnike. Na primjer, Wharton, M. et al., (1950), J. Invest. Derm. 14, 291-303) predlažu aktivnu imunizaciju protiv infekcije s Trichophytonom purpureum u zečeva s inaktiviranom suspenzijom hifa Trichophyton rubrum. Ep 393371 i WO 9307894 predlaže inkativirano dermatomikozno cjepivo koje sadrži dermatofite roda Trichophyton i/ili Microsporum. Prema našem znanju, prema stanju tehnike nije poznato nijedno mikozno cjepivo koje sadrži homogenizirane inaktivirane dermatofitne mikrokonidije i inaktivirane homogenizirane blastospore kvasnica.
Sada je iznadujuće pronađeno, da cjepiva koja sadrže homogenizirane inaktivirane dermatofitne mikrokonidije i inaktivirane homogenizirane blastospore kvasnica daju dobru otpornost protiv gljivičnih infekcija.
Predloženi izum sada osigurava cjepiva koja sadrže homogenizirane inaktivirane dermatofitne mikrokonidije i inaktivirane homogenizirane blastospore kvasnica ili antigeni materijal spomenutih spora, metode za njihovu proizvodnju i njihovu upotrebu za profilaksi ili liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije čovjeka. Cjepiva u skladu s predloženim izumom posebno se mogu upotrijebiti za profilaksu i/ili liječenje kožnih mikoza, ponajprije dermatomikoza i/ili kandidoza i/ili onihomikoza.
Cjepiva predloženog izuma imaju izvanredna imunogena svojstva bez neželjenih sporednih efekata. Posebno, cjepiva predloženog izuma ne izazivaju alergološke reakcije.
U jednoj izvedbi cjepiva predloženog izuma sadrže inaktivirane blastospore kvasnice i/ili blastospore kvasnice koje su u nabubrenom stanju i/ili imaju tubus klice i/ili dermatofitne mikrokonidije i/ili dermatofitne mikrokonidije koji su u nabubrenom stanju i/ili imaju tubus klice, ili antigeni materijal spomenutih spora. Ponajprije, blastospore kvasnice spadaju u rod Candida, potanje u vrstu Candida albicans i/ili dermatofitne mikrokonidije spadaju u rod Trichophytona i/ili Microsporuma, tj . vrstu Trichophyton rubrum i/ili Trichophyton mentagrophytes i/ili Microsporum canis. Visoku prednost daje se podvrstama Candida albicans DSM-9456 i/ili Candida albicans DSM-9457 i/ili Candida albicans DSM-9458 i/ili Candida albicans DSM-9459 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9469 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9470 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9471 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9472 i/ili Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i/ili Microsporum canis DSM-7281. Visoku prednost daje se kombinacijama podvrsta prema primjerima. Ponajprije, 50% blastospora kvasnica i/ili dermatofitnih mikrokonidija su u nabubrenom stanju i/ili imaju tubus klice. Ponajprije, koncentracija spora je 40 do 90 milijuna po ml, još bolje koncentracija je pribl. 60 milijuna po ml. Za inaktivaciju spora upotrebljava se ponajprije tiomersal, formaldehid ili 2-propiolakton.
U drugoj izvedbi predloženog izuma blastospore kvasnica i/ili dermatofitne mikronidije su modificirane kemijskom obradom, ponajprije obradom s H2O2 i/ili s natrijevim permanganatom i/ili s kalijevim permanganatom.
Cjepiva predloženog izuma mogu modulirati imunosni sistem, tj. ona imaju imunostimulacijska svojstva i mogu se dati bez dodatnih imunostimulacijskih tvari. Zbog toga, u jednoj izvedbi cjepiva predloženog izuma ne uključuju dodatke ili druge imunomodulacijske ili imunostimulacijske tvari.
Za daljnje povećanje njihovih imunogenskih svojstava, u drugoj izvedbi, cjepiva predloženog izuma sadrže, nadalje, najmanje jednu tvar s imunomodulacijskim djelovanjem, ponajprije dodatnu tvar izabranu ponajprije između skupine koju čine vitamin-E-acetat, o/w-emulzija, aluminijev fosfat, aluminijev oksid, aluminijev hidroksi/metil celulozni gel, uljne emulzije, muramil-dipeptidi, Freundov dodatak i saponini i/ili najmanje jedan citokin, odabran ponajprije iz skupine IL 2, IL 12, INF-gama.
U jednoj izvedbi, cjepiva predloženog izuma upotrebljavaju se za liječenje i/ili profilaksu mikoza, ponajprije kožnih mikoza, ponajprije dermatomikoza i/ili kandidoza i/ili onihomikoza u sisavaca, ponajprije ljudi.
U drugoj izvedbi cjepiva predloženog izuma upotrebljavaju se kao imunomodulatori, ponajprije imunostimulatori.
U drugoj izvedbi cjepiva predloženog izuma upotrebljavaju se za stimulaciju imunosnog odgovora u imunosno ugroženom biću.
Cjepiva predloženog izuma mogu se dati parenteralno, ponajprije intramuskularnom injekcijom i/ili parenteralno intraperitonealnom injekcijom i/ili intrakutanom injekcijom i/ili perkutanom injekcijom i/ili površinski, ponajprije kutano.
U drugoj izvedbi, predloženi izum osigurava postupak za pripravljanje cjepiva predloženog izuma. Spomenuta cjepiva su pripravljaju se iz dermatofita i kvasnica, odabranih ponajprije iz gore navedenih rodova i/ili vrsta i/ili podvrsta u skladu sa slijedećim metodama:
Prvi stupanj uzgajanja za sve postupke opisane u nastavku provodi se u skladu sa slijedećim:
Kulture dermatofita, ponajprije roda Trichophytona i/ili Microsporuma, još bolje vrste Trichophytona mentagrophytes i/ili Trichophytona rubrum ili drugih podvrsta Trichophyton rubrum DSM-9469 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9470 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9471 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9472 i/ili Trichophyton mentagrophves DSM-7279 i/ili Microsporum canis DSM-7281, uzgajaju se odvojeno ili na agar/travi, na primjer u 3-10 Roux boca. Svaka kultura uzgaja se 15-30 dana pri 26-28°C.
Kulture kvasnica goda Canidida, još bolje vrste Candida albicans ili podvrsta Candida albicans DSM-9456, i/ili Candida albicans DSM-9457, i/ili Candida albicans DSM-9458, i/ili Candida albicans DSM-9459, uzgajaju se odvojeno u, na primjer 2-8 Roux boca na agar Sabouraud ili agaru sa sladnim ekstraktom ili na drugom prikladnom sredstvu 1-7 dana pri 26-37°C.
Gljivični materijal dobiven u skladu s postupkom se zatim preradi kako slijedi:
Metoda 1 (prikazana u primjerima 1-7)
Gljivične mase dermatofita se izvade i odvojeno homogeniziraju u vodenoj otopini (na primjer 100-500 ml) 0,1-0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina ili 0,1-1% soj inog ili svinjskog peptona u kombinaciji s 5-6% glukoze i 0,1-1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namjesti se na 30-90 milijuna po ml za svaki homogenat. Zatim se svaku suspenziju mikrokonidija fermentira 1-2 dana pri 28°C dok se dobije 50 do 100% tubusa klica. Nakon fermentacije stanične suspenzije se mogu isprati s destiliranom vodom, fiziološkom otopinom soli, na primjer s natrijevim kloridom ili s drugom prikladnom otopinom.
Blastospore Candida albicans isperu se s fiziološkom otopinom natrijevog klorida ili s drugom prikladnom otopinom. Koncentraciju blastospora u suspenziji namjesti se na 10-90 milijuna po ml.
Jednaki volumeni svake kulture u suspenziji se pomiješaju u jednostrukoj posudi. Homogenati se inaktiviraju dodatkom tiomersala u omjeru 1:11000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se zatim inkubira 1-3 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo stavi se u bočice, provjeri glede sterilnosti, sigurnosnih i imunogenskih svojstva u skladu s prihvaćenim metodama i može se pohraniti u hladnjaku pri 4-10°C. Cjepiva pripravljena po ovoj metodi mogu se upotrijebiti za profilaksu ili za liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije čovjeka.
Metoda 2 (prikazana u primjerima 8-11)
Gljivičnu masu dermatofita se izvadi i odvojeno homogenizira u vodenoj otopini (na primjer 100-500 ml) 0,1-0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5-6% glukoze i 0,1-1% kvaščevog ekstrakta. Koncentraciju mikrokonidija namjesti se na 30-90 milijuna po ml za svaki homogenat. Da se dobije 50 do 100% tubusa klica svaku suspenziju mikrokonidija fermentirana 1-2 dana pri 28°C. Jednaki volumeni svake kulture u suspenziji pomiješaju se u jednostrukoj posudi. Homogenat se inaktivira dodatkom tiomersala u omjeru 1:10000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se zatim inkubira 1-3 dana pri sobnoj temperaturi.
Svaka kultura kvasnice se izvadi i homogenizira u 5000 ml medija RPMI br. 1640 koji sadrži L-glutamin (Serva), medij br. 199 (Serva) ili neki drugi prikladni medij za staničnu kulturu. Koncentraciju blastospora namjesti se na 10-30 milijuna po ml. Suspenziju gljivičnih stanica inkubira se pri 36-38°C u bocama za stanične kulture koje sadrže 5-6% jednog od gore spomenutih sredstava u atmosferi CO2. Nakon 2-4 sata inkubacije 50-100% blastospora općenito pokazuje tubus klice i nabubreno stanje. Blastospore se izvade i isperu 3-5 puta, na primjer centrifugiranjem pri 4-10°C s (4000-6000 okr./min), 25-45 minuta za svaki stupanj centrifugiranja. Zatim se koncentraciju stanica namjesti na 10-90 milijuna po ml. Homogenat se inaktivira dodatkom tiomersala u omjeru 1:10000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se inkubira 2 dana pri sobnoj temperaturi. Jednaki volumeni svake kulture Candida albicans u suspenziji pomiješaju se u jednostrukoj posudi.
Zatim se suspenzija dermatofita pomiješa sa staničnom suspenzijom kvasnice. Dobiveno cjepivo pohrani se u bočice, provjeri glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i drži se u hladnjaku pri 4-10°C. Cjepiva pripravljena po ovoj metodi mogu se upotrijebiti za profilaksu i liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije ljudi.
Metoda 3 (prikazana u primjerima 12-15)
Gljivične mase dermatofita se izvade i odvojeno homogeniziraju u vodenoj otopini (na primjer 100-500 ml) 0,1-0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5-6% glukoze i 0,1-1% kvaščevog ekstrakta. Koncentraciju mikrokonidija namjesti se na 30-90 milijuna po ml za svaki homogenat. Da se dobije 50 do 100% tubusa klica svaku suspenziju mikrokonidija fermentira se 1-2 dana pri 28°C.
Blastospore kvasnice se izvade ispiranjem s fiziološkom otopinom natrijevog klorida ili s drugom prikladnom otopinom. Koncentraciju blastospora u suspenziji namjesti se na 10-90 milijuna po ml.
Jednaki volumeni svake kulture u suspenziji se pomiješaju u jednostrukoj posudi. Homogenat se inaktivira dodatkom tiomersala u omjeru 1:11000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se zatim inkubira 1-3 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije staničnu suspenziju obradi se s H2O2. U tu svrhu dodaju se tvari koje sadrže H2O2 tako da se dobije krajnju koncentraciju od 3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa se 14-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta centrifugiranjem (4000 do 6000 okr./min) 20-50 minuta s destiliranom vodom ili s fiziološkom otopinom natrijevog klorida. Krajnju koncentraciju spora namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Umjesto obrade s H2O2, staničnu suspenziju može se obraditi s natrijevim ili kalijevim permanganatom. U tu svrhu doda se natrijev ili kalijev permanganat koncentracijom od 1:10000 do 1:30000 (masa/volumen) i suspenziju se miješa 10-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta, na primjer s destiliranom vodom, centrifugiranjem 25-45 minuta u svakom stupnju centrifugiranja (4000 do 6000 okr./min). Krajnju koncentraciju spora namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Zatim se suspenzija dermatofita pomiješa sa staničnom suspenzijom kvasnice. Dobiveno cjepivo pohrani se u bočice, provjeri glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i drži se u hladnjaku pri 4-10°C. Cjepiva pripravljena po ovoj metodi mogu se upotrijebiti za profilaksu i liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije ljudi.
Metoda 4 (prikazana u primjerima 16-19)
Gljivičnu masu dermatofita se izvadi i odvojeno homogenizira u vodenoj otopini (na primjer 100-500 ml) 0,1-0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5-6% glukoze i 0,1-1% kvaščevog ekstrakta. Koncentraciju mikrokonidija namjesti se na 30-90 milijuna po ml za svaki homogenat. Da se dobije 50 do 100% tubusa klica svaku suspenziju mikrokonidija fermentirana 1-2 dana pri 28°C. Jednaki volumeni svake kulture dermatofita u suspenziji pomiješaju se u jednostrukoj posudi. Homogenat se inaktivira dodatkom tiomersala u omjeru 1:11000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se zatim inkubira 1-2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije staničnu suspenziju obradi se s H2O2. U tu svrhu dodaju se tvari koje sadrže H2O2 tako da se dobije krajnju koncentraciju od 1-3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa se 14-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta centrifugiranjem (4000 do 6000 okr./min) 20-50 minuta s destiliranom vodom ili s fiziološkom otopinom natrijevog klorida. Krajnju koncentraciju spora namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Umjesto obrade s H2O2, staničnu suspenziju može se obraditi s natrijevim ili kalijevim permanganatom. U tu svrhu doda se natrijev ili kalijev permanganat koncentracijom od 1:10000 do 1:30000 (masa/volumen) i suspenziju se miješa 10-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta, na primjer s destiliranom vodom, centrifugiranjem 25-45 minuta u svakom stupnju centrifugiranja (4000 do 6000 okr./min). Krajnju koncentraciju spora namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Svaku kulturu kvasnice se izvadi i homogenizira u 5000 ml medija RPMI br. 1640 koji sadrži L-glutamin (Serva), medij br. 199 (Serva) ili neki drugi tip medija za stanične kulture. Koncentraciju blastospora namjesti se na 10-30 milijuna po ml. Suspenziju gljivičnih stanica inkubira se pri 36-38°C se u bocama za stanične kulture koje sadrže 5-6% jednog od gore spomenutih sredstava u atmosferi CO2. Nakon 2-4 sata inkubacije 50-100% blastospora općenito pokazuje tubus klice i nabubreno stanje. Blastospore se poberu i isperu 3-5 puta, na primjer centrifugiranjem (4000-6000 okr./min) 25-45 minuta za svaki stupanj centrifugiranja pri 4-10°C. Zatim se koncentraciju stanica namjesti na 10-90 milijuna po ml. Homogenat se inaktivira dodatkom tiomersala u omjeru 1:10000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se inkubira 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije staničnu suspenziju obradi se s H2O2. U tu svrhu dodaju se tvari koje sadrže H202 tako da se dobije krajnju koncentraciju od 1-3% H2O2- Staničnu suspenziju miješa se 14-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta centrifugiranjem (4000 do 6000 okr./min) 20-50 minuta s destiliranom vodom ili s fiziološkom otopinom natrijevog klorida. Krajnju koncentraciju spora namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Umjesto obrade s H2O2, staničnu suspenziju može se obraditi s natrijevim ili kalijevim permanganatom. U tu svrhu doda se natrijev ili kalijev permanganat koncentracijom od 1:10000 do 1:30000 (masa/volumen) i suspenziju se miješa 10-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta, na primjer s destiliranom vodom, centrifugiranjem 25-45 minuta u svakom stupnju centrifugiranja (4000 do 6000 okr./min). Krajnju koncentraciju spora namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Zatim se suspenzija dermatofita pomiješa sa staničnom suspenzijom kvasnice. Dobiveno cjepivo pohrani se u bočice, provjeri glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i drži se u hladnjaku pri 4-10°C. Cjepiva pripravljena po ovoj metodi mogu se upotrijebiti za profilaksu i liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije ljudi.
Metoda 5 (prikazana u primjerima 20-23)
Gljivične mase dermatofita se izvade i odvojeno homogeniziraju u vodenoj otopini (na primjer 100-500 ml) 0,1-0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5-6% glukoze i 0,1-1% kvaščevog ekstrakta. Koncentraciju mikrokonidija namjesti se na 30-90 milijuna po ml za svaki homogenat.
Blastospore kvasnice se izvade ispiranjem s fiziološkom otopinom natrijevog klorida ili s drugom prikladnom otpinom. Koncentraciju suspenzije blastospora namjesti se na 10-90 milijuna po ml.
Jednaki volumeni svake kulture dermatofita u suspenziji se pomiješaju u jednostrukoj posudi. Homogenat se inaktivira dodatkom tiomersala u omjeru 1:11000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se zatim inkubira 1-3 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo pohrani se u bočice, provjeri glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i drži se u hladnjaku pri 4-10°C. Cjepiva pripravljena po ovoj metodi mogu se upotrijebiti za profilaksu i liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije ljudi.
Metoda 6 (prikazana u primjerima 24-27)
Gljivične mase dermatofita se izvade i odvojeno homogeniziraju u vodenoj otopini (na primjer 100-500 ml) 0,1-0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, .5-6% glukoze i 0,1-1% kvaščevog ekstrakta. Koncentraciju mikrokonidija namjesti se na 30-90 milijuna po ml za svaki homogenat.
Blastospore kvasnice se izvade ispiranjem s fiziološkom otopinom natrijevog klorida ili s drugom prikladnom otpine. Koncentraciju suspenzije blastospora namjesti se na 10-90 milijuna po ml.
Jednaki volumeni svake kulture dermatofita u suspenziji se pomiješaju u jednostrukoj posudi. Homogenat se inaktivira dodatkom tiomersala u omjeru 1:11000 do 1:25000 (masa/volumen) izravno u staničnu suspenziju. Smjesu se zatim inkubira 1-3 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije staničnu suspenziju obradi se s H2O2. U tu svrhu dodaju se tvari koje sadrže H2O2 tako da se dobije krajnju koncentraciju od 1-3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa se 14-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta centrifugiranjem (4000 do 6000 okr./min) 20-50 minuta s destiliranom vodom ili s fiziološkom otopinom natrijevog klorida. Krajnju koncentraciju stanica namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Umjesto obrade s H2O2, staničnu suspenziju može se obraditi s natrijevim ili kalijevim permanganatom. U tu svrhu doda se natrijev ili kalijev permanganat koncentracijom od 1:10000 do 1:30000 (masa/volumen) i suspenziju se miješa 10-48 sati. Obrađene stanice isperu se 3-5 puta, na primjer s destiliranom vodom, centrifugiranjem 25-45 minuta u svakom stupnju centrifugiranja (4000 do 6000 okr./min). Krajnju koncentraciju spora namjesti se na 30-90 milijuna po ml.
Zatim se pomiješaju stanične suspenzije dermatofita i kvaščevih stanica. Dobiveno cjepivo pohrani se u bočice, provjeri glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i drži se u hladnjaku pri 4-10°C. Cjepiva pripravljena po ovoj metodi mogu se upotrijebiti za profilaksu i liječenje mikoza u sisavaca, ponajprije ljudi.
Cjepiva koja se mogu pripraviti metodama l do 6 mogu se kombinirati s nosačem koji sadrži tvari s imunomodulacijskim djelovanjem, ponajprije s dodatkom odabranim prednosno iz skupine koju čine vitamin-E-acetat, o/w-emulzija, aluminijev fosfat, aluminijev oksid, gel aluminijev hidroksid/metil celuloza, uljna emulzija, muramil-dipeptidi, Freundov dodatak i saponini i/ili najmanje jedan citokin, ponajprije dodatak odabran iz skupine IL 2, IL 12, INF-gama, za daljnje povećanje imunogenskog djelovanja cjepiva predloženog izuma.
1. Postupak za pripravljanje povećanog broja nabubrenih mikrokonidija i mikrokonidija s tubusima klica dermatofita
Kulture dermatofita rastu su 15-20 dana u Roux bocama na krutim površinama agara (sladni ekstrakt-agar, agar Sabouraud). Kulture se skinu i homogeniziraju sa sterilnim tekućim sredstvom, na primjer s 0,3-1,0%-tnim sirovim ekstraktom peptona iz mesa ili iz soje koji sadrži 5-6% glukoze i 0,1-1,0% kvaščevog ekstrakta ili juhu sladnog ekstrakta ili juhu mesne glukoze ili drugog. pH ovog sredstva drži se pri 6,2-7,2. Koncentraciju mikrokonidija u gljivičnoj suspenziji namjesti se na 30-90 milijuna po ml. Za drugi stupanj uzgoja (duboki uzgoj) suspenziju spora stavi se u posebnu posudu koja sadrži gore spomenut medij. Duboki uzgoj je gotov za 10-48 sati. 10-15 sati nakon završetka uzgoja izvrše se mikroskopske kontrole stanične suspenzije da se izračuna broj nabubrenih i proklijalih stanica. Takove kontrole se ponavljaju svakih 5-6 sati.
Uzgoj se zaustavlja kad najmanje od 50% mikrokonidija pokazuje nabubrenost ili stanje germinacije i najviše 7-10% stanica pokazuje drugu granu miocela. Promjer nabubrene ili germinirane mikrokonidije poraste za 1,2 ili više u usporedbi s običnom mikrokonidijom.
1. Postupak za pripravljanje povećanog broja nabubrenih blastospora i blastospora s tubusima klica kvasnica
Kulture kvasnica, ponajprije vrste Candida uzgajaju se 2-3 dana na krutim agarnim površinama (sladni ekstrakt-agar, agar Sabouraud). Kulture se izvade i homogeniziraju sa sterilnim tekućim sredstvom, na primjer s medijem br. 1640 (Serva) ili s medijem br. 199 (Serva) ili s 0,3-1,0%-tnim mesnim ekstraktom koji sadrži 5-6% glukoze i 0,1-1,0% kvaščevog ekstrakta namještenog na pH 6,2-7,2. Koncentraciju blastospora ove gljivične suspenzije namjesti se na 1-20 milijuna po ml. Zatim se dobivenu suspenziju spora stavi u bočice za stanične kulture ili u Petrijeve zdjelice (visina tekućeg sloja 2-5 mm) i inkubira se 2-4 saza pri 36-38°C u atmosferi s 5-6% CO2. Inkubaciju se prekida kad najmanje 50% ili više stanica pokazuje tubus klice ili nabubreno stanje. Nabubrene i germinirane blastospore, pripravljene u skladu s ovim postupkom, imaju povećani promjer za 1,2 ili više u usporedbi s običnim blastosporama.
U drugoj izvedbi predloženi izum daje visoko imunogene gljivične podvrste kako je opisano u nastavku. Te su podvrste posebno prikladne za proizvodnju visoko imunogenih cjepiva prema predloženom izumu. Sve su podvrste deponirane kod izumitelja u skladu s Budapeštanskim ugovorom pri "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" (DSM), Mascheroder Weg 1B, W-38124 Braunschweig, Njemačka.
TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DMS-9469
Podvrsta je deponirana u DSM-u-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9469.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi proizvodnje spora i smanjenjem epizootske podvrste br. 533, koja je 1985. identificirana na ljudskoj koži. Podvrsta je identificirana upotrebom "Rebell-Taplin" ključa (Rebell, g., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 3. izdanje, University of Miami Press, Coral Gables, Florida, SAD, 1978).
Biološka svostva podvrste opisana su u tablici A.
Podvrsta DSM-9469 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, enormnom produkcijom mikrokonidija i nižom virulencijom.
TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DMS-9470
Podvrsta je deponirana u DSM-u-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9470.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi proizvodnje spora i smanjenjem epizootske podvrste br. 535, koja je identificirana na ljudskoj koži 1990. Podvrsta je identificirana upotrebom "Rebell-Taplin" ključa (Rebell, g., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 3. izdanje, University of Miami Press, Coral Gables, Florida, SAD, 1978).
Biološka svojstva podvrste opisana su u tablici B.
Podvrsta DSM-9470 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, enormnom produkcijom mikrokonidija i nižom virulencijom.
TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DMS-9471
Podvrsta je deponirana u DSM-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9471.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi proizvodnje spora i smanjenjem epizootske podvrste br. 620, koja je identificirana na ljudskom noktu 1989. Podvrsta je identificirana upotrebom "Rebell-Taplin" ključa (Rebell, g., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 3. izdanje, University of Miami Press, Coral Gables, Florida, SAD, 1978).
Biološka svojstva podvrste opisana su u tablici C.
Podvrsta DSM-9471 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, enormnom produkcijom mikrokonidija i nižom virulencijom.
TRICHOPHYTON RUBRUM, br. DMS-9472
Podvrsta je deponirana u DSM-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9472.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi proizvodnje spora i smanjenjem epizootske podvrste br. 754, koja je identificirana na ljudskom noktu 1990. Podvrsta je identificirana upotrebom "Rebell-Taplin" ključa (Rebell, g., Taplin, D.: Dermatophytes, their recognition and Identification, 3. izdanje, University of Miami Press, Coral Gables, Florida, SAD, 1978).
Biološka svojstva podvrste opisana su u tablici D.
Podvrsta DSM-9472 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, enormnom produkcijom mikrokonidija i nižom virulencijom.
CANDIDA ALBICANS, br. DMS-9456
Podvrsta je deponirana u DSM-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9456.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi stabilizacije uzgojno-morfoloških karakteristika i smanjenjem epidemijske podvrste br. 008-L, koja je identificirana na čovjeku 1990. Podvrsta je identificirana upotrebom Lodderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdan-London (1970).
Biološka svojstva podvrste opisana su u tablici E.
Podvrsta DSM-9456 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, stabilnim biološkim svojstvima, enormnom produkcijom biomase i nižom virulencijom.
CANDIDA ALBICANS, br. DMS-9457
Podvrsta je deponirana u DSM-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9457.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi stabilizacije uzgojno-morfoloških karakteristika i smanjenjem epidemijske podvrste br. 012, koja je identificirana na čovjeku 1992. Podvrsta je identificirana upotrebom Lodderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdan-London (1970).
Biološka svojstva podvrste opisana su u tablici F.
Podvrsta DSM-9457 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, stabilnim biološkim svojstvima, enormnom produkcijom biomase i nižom virulencijom.
CANDIDA ALBICANS, br. DMS-9458
Podvrsta je deponirana u DSM-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9458.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi stabilizacije uzgojno-morfoloških karakteristika i smanjenjem epidemijske podvrste br. 047, koja je identificirana na čovjeku 1989. Podvrsta je identificirana upotrebom Lodderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdan-London (1970).
Biološka svojstva podvrste opisana su u tablici G.
Podvrsta DSM-9458 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, stabilnim biološkim svojstvima, enormnom produkcijom biomase i nižom virulencijom.
CANDIDA ALBICANS, br. DMS-9458
Podvrsta je deponirana u DSM-u 26.10.1994 pod serijskim brojem DSM-9459.
Podvrsta je dobivena izravnom selekcijom na osnovi stabilizacije uzgojno-morfoloških karakteristika i smanjenjem epidemijske podvrste br. 158, koja je identificirana na čovjeku 1990. Podvrsta je identificirana upotrebom Lodderovog ključa (Lodder, J: The yeast: A Taxonomic Study, North-Holland Publ. Co., Amsterdan-London (1970).
Biološka svojstva podvrste opisana su u tablici H.
Podvrsta DSM-9459 razlikuje se od epidemijske podvrste svojim bržim rastom u hranjivom mediju, stabilnim biološkim svojstvima, enormnom produkcijom biomase i nižom virulencijom.
Podvrste Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Microsporum canis DSM-7281 izumitelj je deponirao u DSM-u 01.10.1992 u skladu s Budapeštanskim ugovorom i opisane su, na primjer, u patentom spisu istog izumitelja br. PCT/EP92/02391, objavljenom 29.04.1993. kao WO 93/07894.
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
Kratki opis slika
Slika 1. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamorca (1. pokus, kompleksi I-I i I-II) .
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine, nakon 7, 13, 21 i 28 dana djelovanje kompleksa I-I bilo je 100%, 36,0%, 40,0% i 100%, a kompleksa I-II 40,0%, 44,0%, 30,0% i 55,6%.
Slika 2. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamorca (2. pokus, kompleksi II-i iII-II).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine, nakon 7, 13, 21 i 28 dana djelovanje kompleksa II-I bilo je 100%, 32,4%, 79,4% i 74,6%, a kompleksa II-II 84,4%, 33,8%, 53,1% i 42,3%.
Slika 3. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamorca (3. pokus, kompleksi III-I, III-II, III-III, III-IV i III-V). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 7, 16, 21 i 28 dana djelovanje kompleksa III-I bilo je 78,2%, 48,0%, 100% i 100%, kompleksa III-II 72,7%, 50,0%, 100% i 100%, kompleksa III-III 36,4%, 20,0%, 50,0% i 0%, kompleksa III-IV 9,1%, 20,0%, 43,8% i 37,5%, kompleksa III-V 34,5%, 36,0%, 35,0% i 20,0%. Za primijetiti je nisku jačinu zbirnih vrijednosti i brzi proces ozdravljenja životinja cijepljenih s kompleksima III-I i III-II.
Slika 4. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom mentagrophyes u zamorca (3. pokus, kompleksi III-I, III-II, III-III, III-IV i III-V). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 7, 16, 21 i 28 dana, djelovanje kompleksa III-I bilo je 50,0%, 9,1%, 37,5% i 71,5%, kompleksa III-II 55%, 13,6%, 33,3% i 69,2%, kompleksa III-III 0%, 0%, 65,6% i 63,9%, kompleksa III-IV 10,0%, 2,3%, 44,4% i 76,9%, kompleksa III-V 10,0%, 0%, 33,3% i 46,2%.
Kod zamoraca cijepljenih s kompleksom III-I i III-II jačina zbirnih kliničkih simptoma, kad se usporede vrijednosti dobivene u kontrolnoj skupini životinja, bile su niže tijekom cijelog perioda promatranja. Zamorci cijepljeni s kompleksima III-III, III-IV ili III-V imali su intenzivne simptome infekcije s Trichophytonom mentagrophytes 7 i 16 dana nakon infekcije, ali u usporedbi s kontrolnim skupinama ti su simptomi bili značajno smanjeni slijedećih dana promatranja.
Slika 5. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zeca (1. pokus, kompleks II-I). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 7, 15, 21 i 28 dana djelovanje kompleksa II-I bilo je 53,3%, 47,4%, 84,6% i 100%.
Slika 6. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamoraca (kompleksi IV-I, IV-II i IV-III). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine, nakon 7, 14, 23 i 28 dana, djelovanje kompleksa IV-I bilo je 28,6%, 19,1%, 91,3% i 100%, kompleksa IV-II 28,6%, 23,8%, 91,3% i 100%, kompleksa IV-III 50%, 21,4%, 87,0% i 100%.
Klinički simptomi trihofitoze nakon 7 dana bili su mnogo intenzivniji u životinja cijepljenih s komplksima IV-II i IV-III nego u necijepljenh kontrolnih, ali jačina zbirnih vrijednosti (prosjek) u cijepljenih zamoraca (kompleks IV-I, IV-II i IV-III) bili su značajno manji nego vrijednosti kontrolne skupine nakon 14, 23 odnosno 28 dana.
Slika 7. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamoraca (kompleks IV-II). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 10, 16, 22 i 29 dana djelovanje kompleksa IV-II bilo je 33,3%, 37,1%, 73,1% i 94,1%.
Slika 8. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamoraca (kompleksi IV-II).
Klinički simptomi infekcije s Trichophyton rubrum u zamoraca cijepljenih s kompleksom IV-II uspoređeni su s necijepljenom kontrolnom skupinom u različitim periodima promatranja.
Slika 9. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zečeva (kompleksi IV-II). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 10, 16, 22 i 29 dana djelovanje kompleksa IV-II bilo je 30,8%, 65,6%, 79,2% i 88,9%.
Slika 10. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zečeva.
Klinički simptomi infekcije s Trichophytonom rubrum u zečeva cijepljenih s kompleksom IV-II uspoređeni su s necijepljenom kontrolnom skupinom u različitim periodima promatranja.
Slika 11. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamoraca (kompleksi VI-I, VI-II, VI-III, VI-IV, VI-V, VI-VI). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 10, 13, 21, 28 i 33 dana djelovanje kompleksa V-VI bilo je 100%, 45,8%, 75,6%, 85,7% i 50,0%, kompleksa VI-II 70,0%, 25,0%, 47,1%, 100% i 100%, kompleksa VI-III 80,0%, 29,2%, 52,9%, 100% i 100%, kompleksa VI-IV 60,0%, 29,2%, 48,5%, 100% i 100%, kompleksa VI-V 60,0%, 16,7%, 29,4%, 100% i -25%, kompleksa VI-VI 60,0%, 12,5%, 100% i 75,0%.
Slika 12. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom mentagrophytes u zamoraca (kompleksi VI-I, VI-II, VI-III, VI-IV, VI-V, VI-VI). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 10, 13, 21, 28 i 33 dana djelovanje kompleksa V-VI bilo je 20,0%, 20,0%, 44,4%, 84,6% i 84,6%, kompleksa VI-II 13,3%, 16,0%, 27,8%, 46,2% i 76,9%, kompleksa VI-III 33,3%, 20,0%, 38,9%, 30,8% i 92,3%, kompleksa VI-IV 20,0%, 20,0%, 33,3%, 46,2% i 61,5%, kompleksa VI-V 13,3%, 20,0%, 27,8%, 53,8% i 80,8%, kompleksa VI-VI 26,7%, 20,0%, 38,9%, 76, 9% i 92,3%.
Slika 13. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamoraca (kompleksi VII-I, VII-II, VII-III, VII-IV, VII-V, VII-VI, VII-VII). Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 10, 14, 23 i 28 dana djelovanje kompleksa VII-I bilo je 16,7%, 22,2%, 30,0% i 40,0%, kompleksa VII-II 33,3%, 27,8%, 30,0% i 0%, kompleksa VII-III 0,0%, 33,3%, 80,0% i 60,0%, kompleksa VII-IV 100%, 11,1%, 60,0% i 60,0%, kompleksa VII-V 33,3%, 33,3%, 50,0% i 60,0%, kompleksa VII-VI 33,3%, 16,7%, 60,0% i 60,0%, kompleksa VII-VII 75,0%, 36,1%, 85,0% i 70,0%.
Slika 14. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom mentagrophytes u zamoraca (kompleksi VII-I, VII-II, VII-III, VII-IV, VII-V, VII-VI, VII-VII).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine nakon 7, 14, 23 i 28 dana djelovanje kompleksa VII-I bilo je -12,5%, 22,7%, 27,3% i 70,0%, kompleksa VII-II -25%, 9,1%, 18,2% i 37,5%, kompleksa VII-III -25%, 4,5%, 9,1% i 60,0%, kompleksa VII-IV -6,3%, 4,5%, 54,5% i 90,0%, kompleksa VII-V -6,3%, 0%, 0% i 40,0%, kompleksa VII-VI 6,3%, 13,6%, 9,1% i 50,0%, kompleksa VII-VII 6,3%, 18,2%, 36,4% i 100%.
Slika 15. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamoraca (kompleksi VIII-I, VIII-I+H, kontrola+H; H se odnosi na životinje koje su primile hostakortin H (prednisolon-acetat).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti neobrađene kontrolne skupine nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-I bilo je 100%, 27,8%, 33,3% i 100%, kompleksa VIII-I+H 40,0%, 27,8%, 0% i 100%.
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine koja je primila hostakortin H (prednisolon-acetatom) nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-I bilo je 100%, 38,1%, 57,1% i 100%, kompleksa VIII-I+H -50%, 38,1%, 35,7% i 100%.
Slika 16. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom mentagrophytes u zamoraca (kompleksi VIII-I, VIII-I+H, kontrola+H; H se odnosi na životinje koje su primile hostakortin H (prednisolon-acetat).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti neobrađene kontrolne skupine nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-I bilo je 20,0%, 25,0%, 44,4% i 100%, kompleksa VIII-I+H 25,0%, 25,0%, 33,3% i 100%.
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti kontrolne skupine koja je primila hostakortin H (prednisolon-acetatom) nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-I bilo je 20,0%, 25,0%, 41,2% i 100%, kompleksa VIII-I+H 25,0%, 25,0%, 29,4% i 100%.
Slika 17. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Candidom albicans u zamoraca (kompleks VIII-I).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti neobrađene kontrolne skupine nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-I bilo je 6,3%, 11,1%, 100% i 100%.
Slika 18. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Microsporum canis u zamoraca (kompleks VIII-II).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti neobrađene kontrolne skupine, nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-II bilo je 6,3%, 9,5%, -9,1% i 90,0%.
Slika 19. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophytonom rubrum u zamoraca (kompleks VIII-II).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti neobrađene kontrolne skupine nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-II bilo je 40,0%, 33,3%, 55,6% i 100%.
Slika 20. Dinamike kliničkih simptoma infekcije s Trichophyton mentagrophytes u zamoraca (kompleks VIII-II).
Uspoređeno s težinom zbirnih vrijednosti neobrađene kontrolne skupine nakon 7, 14, 20 i 29 dana djelovanje kompleksa VIII-II bilo je 25,0%, 25,0%, 50,0% i 100%.
Primjeri
Primjer 1
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Trichophyton mentagrophvtes DSM-7279 i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajani su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i DSM-9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Svaka suspenzija mikrokonidija fermentirana je 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica.
Blastospore podvrste DSM-9456 su izvađene ispiranjem s 500 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
Sjedinjeno je po 500 ml svake suspenzije i pomiješano u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 /masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 75 mg tiomersala dodano je u 1,5 litre homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom u zamoraca i zečeva prikazano je u tablicama 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 i na slikama 2, 3, 4, 5 (kompleksi II-I, III-I, VI-I).
Primjer 2
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophvtes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajani su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i DSM-9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Svaka suspenzija mikrokonidija fermentirana je 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica.
Zatim je stanična suspenzija isprana s fiziološkom otopinom natrijevog klorida 5 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta pri 10°C za svaki stupanj centrifugiranja.
Blastospore podvrste DSM-9456 su izvađene ispiranjem s 500 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
Zatim je sjedinjeno po 500 ml svake suspenzije i pomiješano u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 /masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 75 mg tiomersala dodano je u 1,5 litre homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom u zamoraca i zečeva prikazano je u tablicama 11, 12, 13, 14 i na slikama 3 i 4 (kompleks III-II).
Primjer 3
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajani su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i DSM-9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,5% soj inog peptona, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 65 milijuna po ml za svaki homogenat. Svaka suspenzija mikrokonidija fermentirana je 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica.
Blastospore podvrste DSM-9456 su izvađene ispiranjem s 500 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
Sjedinjeno je po 500 ml svake suspenzije i pomiješano u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 75 mg tiomersala dodano je u 1,5 litre homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom u zamoraca prikazano je u tablicama 11, 12, 13, 14 i na slikama 3, 4 (kompleks III-III).
Primjer 4
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajani su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i DSM-9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,5% soj inog peptona, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 55 milijuna po ml za svaki homogenat. Svaka suspenzija mikrokonidija fermentirana je 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. Suspenzija je isprana s fiziološkom otopinom natrijevog klorida 5 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta pri 10°C za svaki stupanj centrifugiranja.
Blastospore podvrste DSM-9456 su izvađene ispiranjem s 500 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
Sjedinjeno je po 500 ml svake suspenzije i pomiješano u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 75 mg tiomersala dodano je u 1,5 litre homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom u zamoraca prikazano je u tablicama 11, 12, 13, 14 i na slikama 3, 4 (kompleks III-IV).
Primjer 5
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9470, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457, Candida albicans DSM-9458, Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9470, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candida albicans DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 uzgajane su u l Roux boci za svaku kulturu na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Zatim je gljivična masa podvrste DMS-7279 homogenizirana u 500 ml otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Svaka kulture dermatofita fermentirana je l dan pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica u suspenziji. Nakon uzgoja po 150 ml svake suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 pomiješane su u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrsta DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 su izvađene ispiranjem s 200 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u svakoj suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Po 150 ml svake suspenzije pomiješano je u jednostrukoj posudi.
500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml mješavine suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 i sa 500 ml mješavine suspenzije Candida albicans DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:125000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 80 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana l dan pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 6
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472, te Candida albicans DSM-9456 i Candida albicans DSM-9457 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 4 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candida albicans DSM-9456 i 9457 uzgajana je u l Roux boci za svaku kulturu na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 200 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Zatim je gljivična masa podvrste DMS-7279 homogenizirana u 500 ml otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Svaka kultura dermatofita fermentirana je l dan pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica u suspenziji. Nakon uzgoja po 200 ml svake suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9471 i 9472 pomiješano je u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrsta DSM-9456 i 9457 su izvađene ispiranjem s 250 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u svakoj suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Po 250 ml svake suspenzije pomiješano je u jednostrukoj posudi. 500 ml suspenzije Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml miješane suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9471 i 9472 i sa 500 ml miješane suspenzije Candida albicans DSM-9456 i 9457 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:25000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 60 mg tiomersala dodano je u 1,5 litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom prikazano je u tablicama 24-27 i na slikama 11 i 12, a za napad sa Candida albicans prikazano je u tablici 44.
Primjer 7
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472, te Candida albicans DSM-9456 i Candida albicans DSM-9457 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 8 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candida albicans DSM-9456 i 9457 uzgajana je u l Roux boci za svaku kulturu na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Zatim je gljivična masa podvrste DMS-7279 homogenizirana u 500 ml otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 50 milijuna po ml homogenata za svaku kulturu. Svaka podvrsta dermatofita fermentirana je 2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica u suspenziji.
Blastospore podvrsta DSM-9456 i 9457 su izvađene ispiranjem s 250 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u namještena je na 60 milijuna po ml. Sjedinjeno je po 250 ml svake suspenzije kulture i pomiješano je u jednostrukoj posudi.
500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 i s 500 ml suspenzije kultura DSM-9456 i 9457 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:125000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 120 mg tiomersala dodano je u 1,5 litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 8
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrsta kulture Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9479 i DSM-9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:25000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 40 mg tiomersala dodano je u l litri homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Kultura podvrste DSM-9456 pobrana je i homogenizirana u 5000 ml medija RPMI br. 1640 s L-glutaminom (Serva) . Koncentracija blastospora namještena je na 20 milijuna po ml. 5000 ml te stanične suspenzije inkubirano pri 36-38°C je u bocama za stanične kulture koje su sadržavale medij br. 1640 u atmosferi s 5% CO2. Nakon perioda od 4 sata inkubacije 50% do 100% blastospora općenito je imalo tubus klice i nabubreno stanje. Blastospore su skupljene i isprane 3 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta pri 4-10°C za svaki stupanj centrifugiranja. Koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 80 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
750 ml suspenzije kulture DSM-9456 sjedinjeno je i pomiješano sa 750 ml mješavine suspenzije kultura DSM-7279 i 9472. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada Candida albicans na miševima prikazano je u tablicama l, 2 i 5 (kompleksi 1-1, 3-1) a nakon napada Trichophyton rubrum na zamorcima prikazano je u tablicama 7 i 8 i na slici l (kompleks I-I).
Primjer 9
Kulture podvrsta Trichophytona mentagrophytes DSM-7279, Trichophytona rubrum DSM-9469, Trichophytona rubrum DSM-9470, Trichophytona rubrum DSM-9471, Trichophytona rubrum DSM-9472 i Candide albicans DSM-9456, Candide albicans DSM-9457, Candide albicans DSM-9458 i Candide albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9470, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candide albicans DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 uzgajana je u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 100 ml otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivična masa podvrste DSM-9279 homogenizirana je u 500 ml otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Svaka kultura dermatofita fermentirana je 2 dan pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica u suspenziji mikrokonidija. Nakon uzgoja 150 ml svake suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 pomiješano je u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:16000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 62,5 mg tiomersala dodano je u l litri homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Kultura podvrsta DSM-9456, 9457, 9458, 9459 je pobrana i homogenizirana u mediju br. 1640 (Serva). Koncentracija blastospora namještena je na 20 milijuna po ml. 1500 ml te stanične suspenzije inkubirano pri 36-38°C je u bocama za stanične kulture koje su sadržavale medij br. 1640 u atmosferi sa 6% CO2. Nakon perioda od 3 sata inkubacije 50% do 100% blastospora imalo je tubus i nabubreno stanje. Blastospore su skupljene i isprane 3 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta pri 4-10°C za svaki stupanj centrifugiranja. Koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:25000 (masa/vol.) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 40 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana l dan pri sobnoj temperaturi. Po 150 ml svake suspenzije kultura DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 sjedinjeno je i pomiješano u jednostrukoj posudi.
500 ml mješavine suspenzija kultura DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 pomiješano je s 500 ml suspenzije kulture DSM-7279 i 500 ml suspenzije kultura DSM-9456, 9457, 9458 i 9459.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 10
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 4 Roux boc3 za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candida albicans DSM-9456, 9457, uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrste DSM-9279 i mješavine povrsta DSM-9469, 9471 i 9472 izvađena su i svaka je homogenizirana je u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml miješane suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Kulture podvrsta DSM-9456, 9457 su pobrane i homogenizirane u mediju br. 1640 (Serva) . Koncentracija blastospora namještena je na 20 milijuna po ml. 1500 ml staničnih suspenzija svake kulture inkubirano je pri 36-38 C u bocama za stanične kulture koje su sadržavale medij br. 1640 u atmosferi s 5% CO2. Nakon perioda od 4 sata inkubacije općenito 50% do 100% blastospora imalo je tubus i nabubreno stanje. Blastospore su skupljene i isprane 3 puta centrifugiranjem (5000 okr./min) 25 minuta pri 4-10°C za svaki stupanj centrifugiranja. Koncentracija stanica namještena je na 50 milijuna po ml. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana l dan pri sobnoj temperaturi. 150 ml svake suspenzije kultura DSM-9456, 9457 je sjedinjeno i pomiješano u jednostrukoj posudi.
500 ml mješavine suspenzija kultura DSM-9469, 9471 i 9472 pomiješano je s 500 ml suspenzije kulture DSM-7279 i s 500 ml suspenzije kultura DSM-9456, 9457.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4 C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 11
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM 9456, Candida albicans DSM-9457 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457 i 9459 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su l dan pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophvtes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litri homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Kulture podvrsta DSM-9456, 9457 i 9459 pobrane su i odvojeno homogenizirane u mediju br. 1640 (Serva) . Koncentracija blastospora namještena je na 10 milijuna po ml. Po 2000 ml stanične suspenzije inkubirano je odvojeno u bocama za kulture ili u Petrijevim zdjelicama koje su sadržavale medij br. 1640 pri 38°C u atmosferi sa 6% CO2. Nakon perioda od 3 sata inkubacije 50% do 100% blastospora imalo je tubus i nabubreno stanje. Blastospore su skupljene i isprane 3 puta centrifugiranjem (5000 okr./min) 25 minuta pri 4-10°C za svaki stupanj centrifugiranja. Koncentracija stanica namještena je na 20 milijuna po ml. Pomiješani su jednaki volumeni staničnih suspenzija svake povrste. Miješana suspenzija inaktivirana je dodatkom tiomersala u omjeru od 1:25000 (masa/vol.).
500 ml te suspenzije, pomiješano je s 1000 ml suspenzije mikrokonidija.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 12
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kultura podvrste Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi. Blastospore podvrste DSM-9456 su izvađene ispiranjem s 500 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 56 milijuna po ml.
500 ml suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u 1 litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji dodana je tvar koja sadrži H2O2, na primjer urea-hidrogen peroksid, tako da je dobivena krajnja koncentracija od 3% H2O2. Ta je stanična suspenzija miješana 24 sata. Obrađene stanice isprane su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada Candide albicans na miševima prikazano je u tablici 6, (kompleks 4-1), a nakon napada Trichophytona na zamorcima prikazano je u tablicama 11, 12, 13, 14 i na slikama 3, 4 (kompleks III-V).
Primjer 13
Kulture podvrsta Trichophytona mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9470, Trichophyton rubrum DSM-9471, TrichophyLon rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457, Candida albicans DSM-9458 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9470, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrsta DSM-7479 i mješavina podvrsta DSM-9469, 9470, 0471 i 0472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophvtes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml miješane suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore povrsta DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 pobrane su ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 150 ml svake suspenzije.
500 ml dobivene suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol.). U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi. Nakon inaktivacije stanična suspenzija obrađena je miješanjem 16 sati s natrijevim permanganatom u koncentraciji od 1:1000 (masa/vol.). Obrađene stanice isperu se 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 40 milijuna po ml.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 14
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture DSM-7279, 9469, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 4 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su pobrane i odvojeno homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrste DSM-7279 i mješavina podvrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su pobrane i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml miješane suspenzije Trichophyton rubrum DSM-9469, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrsta DSM-9456 i 9457 su izvađene ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 250 ml svake suspenzije.
500 ml dobivene suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji dodane su tablete vodikovog peroksida (Wasserstoff-Perokxid Tabletten WDT) tako da se je dobilo krajnju koncentraciju od 1% H2O2. Stanična suspenzija miješana je 24 sata. Obrađene stanice isprane su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 50 milijuna po ml.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 15
Kulture podvrsta Trichophytona mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457 i 9459 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno i homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore povrsta DSM-9456, 9457, i 9459 izvađene ispiranjem s 200 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 250 ml svake suspenzije.
500 ml dobivene suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala izravno u staničnu suspenziju u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) . U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije stanična suspenzija je miješana 36 sati s natrijevim permanganatom koncentracije od 1:20000 (masa/vol.). Obrađene stanice isprane su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta.
Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 16
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kultura podvrste Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 200 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji doda se na primjer urea-hidrogen peroksid tako da se dobije krajnju koncentraciju od 3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa 24 sata. Obrađene stanice isperu se 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 40 milijuna po ml.
Kultura podvrste DSM-9456 je pokupljena i homogenizirana u mediju br. 1640 (Serve). Koncentracija blastospora namještena je na 20 milijuna po ml. 2000 ml te stanične suspenzije inkubirano je u bocama za stanične kulture s medijem br. 1640 u atmosferi s 5% CO2 pri 36-38°C. Nakon perioda inkubacije od 3 sata 50 do 100% blastosprea općenito je pokazivalo tubus klixe ili nabubreno stanje. Blastospore su pobrane i isprane 3 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) pri 4-10°C 25 minuta za svaki stupnja centrifugiranja. Koncentracija stanica namještena je na 40 milijuna po ml. Suspenzija je inaktivirana s tiomersalom u omjeru 1:25000 (masa/vol.).
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji doda se tvar koja sadrži H2O2, na primjer urea-hidrogen peroksid (Wasserstoff-Peroxid Harnstoff zur Synthese CN2H4O H2O2), tako da se dobije krajnju koncentraciju od 3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa 24 sata. Obrađene stanice isperu se 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 120 milijuna po ml. 500 ml te suspenzije pomiješa se s 1000 ml suspenzija mikrokonidija.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada Candide albicans na miševima prikazano je u tablicama l, 2, 3, 4 i 5 (kompleksi l-II, 2-1, 3-II), a nakon napada Trichophytona rubrum na zamorcima prikazano je u tablicama 7 i 8 i na slici l (kompleks I-II).
Primjer 17
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9470, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457, Candida albicans DSM-9458 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9470, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i mješavine povrsta DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophyton rubrum DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) . U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije stanična suspenzija miješana je 24 sata s natrijevim permanganatom koncentracije od 1:30000 (masa/vol.). Obrađene stanice isprane su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta za svaki stupnja centrifugiranja. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
Kulture povrsta DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 su pobrane i odvojeno homogenizirane u mediju br. 1640. Koncentracija blastospora namještena je na 20 milijuna po ml. Po 130 ml staničnih suspenzija inkubirano je odvojeno u bocama za stanične kulture koje su sadržavale medij br. 1640 u atmosferi s 5% C02 pri 36-38°C. Nakon perioda inkubacije od 3 sata 50% do 100% blastospora općenito pokazuje tubus klica ili nabubreno stanje. Blastospore su pobrane i isprane 2-3 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta pri 4-10°C za svaki stupanj centrifugiranja. Koncentracja stanica namještena je na 40 milijuna po ml. Suspenzija se inaktivirana upotrebom tiomersala u omjeru 1:25000 (masa/vol).
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji dodane su tablete vodikovog peroksida (Wasserstoff-Peokxid Tabletten WDT) tako da se je dobilo krajnju koncentraciju od 3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa se 24 sata. Obrađene stanice isperu se 5 puta s destiliranom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
500 ml te suspenzije pomiješa se s 1000 ml suspenzija mikrokonidija. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 18
Kulture podvrsta Trichophytona mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candide albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457, upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 4 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456 i 9457 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i smjese povrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su izvađene, odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata.
Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophvtes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran izravnim dodatkom tiomersala u staničnu suspenziju u omjeru od 1:20000 (masa/vol.). U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji dodane su tablete vodikovog peroksida (Wasserstoff-Peokxid Tabletten WDT) tako da je dobivena krajnja koncentracija od 2% H2O2. Staničnu suspenziju miješa 36 sata. Obrađene stanice isperu se 5 puta s destiliranom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
Kulture povrsta DSM-9456, 9457 su pobrane i odvojeno homogenizirane u mediju br. 1640. Koncentracija blastospora namještena je na 10-20 milijuna po ml. Po 130 ml staničnih suspenzija inkubirano je odvojeno u bocama za stanične kulture koje su sadržavale medij br. 1640 u atmosferi s 5% CO2 pri 36-38°C. Nakon perioda inkubacije od 3 sata 50% do 100% blastospora općenito pokazuje tubus klica ili nabubreno stanje. Blastospore su pobrane i isprane 3 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta pri 4-10°C za svaki stupanj centrifugiranja. Koncentracja stanica namještena je na 40 milijuna po ml. Suspenzija je inaktivirana upotrebom tiomersala u omjeru 1:25000 (masa/vol).
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji dodane su tablete vodikovog peroksida (Wasserstoff-Peokxid Tabletten WDT) tako da je dobivena krajnja koncentracija od 3% H2O2-Staničnu suspenziju miješa 24 sata. Obrađene stanice isperu se 5 puta s destiliranom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
500 ml te suspenzije pomiješano je s 1000 ml suspenzija mikrokonidija. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 19
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophvtes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457 i 9459 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Obje suspenzije mikrokonidija fermentirane su 1-2 dana pri 28°C do stupnja od 50 do 100% tubusa klica. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi. Homogenat je inaktiviran izravnim dodatkom tiomersala u staničnu suspenziju u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) . U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije stanična suspenzija obrađena je miješanjem 24 sata s natrijevim permanganatom koncentracije od 1:30000 (masa/vol.). Obrađene stanice isprne su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta po svakom stupnju centrifugiranja. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 40 milijuna po ml.
Kulture povrsta Candide albicans DSM-9456, 9457 i 9459 su pobrane i odvojeno homogenizirane u mediju br. 1640 (Serva). Koncentracija blastospora namještena je na 20 milijuna po ml. Po 130 ml staničnih suspenzija inkubirano je odvojeno u bocama za stanične kulture koje su sadržavale medij br. 1640 u atmosferi s 5% CO2 pri 36-38°C. Nakon perioda inkubacije od 4 sata 50% do 100% blastospora općenito pokazuje tubus klica ili nabubreno stanje. Blastospore su pokupljene i isprane 3 puta centrifugiranjem (4000 okr./min) 30 minuta pri 4-10°C za svaki stupanj centrifugiranja. Koncentracja stanica namještena je na 60 milijuna po ml. Stanične suspenzije svake podvrste su pomiješane upotrebom jednakih volumena. Pomiješane suspenzija je inaktivirana upotrebom tiomersala u omjeru l:11000 (masa/vol).
Nakon inaktivacije stanična suspenzija je obrađena miješanjem 24 sata s natrijevim permanganatom koncentracije od 1:20000 (masa/vol.)- Obrađene stanice isprane su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta po svakom stupnju centrifugiranja. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
500 ml te suspenzije pomiješano je s 1000 ml suspenzije mikrokonidija. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada Trichophytonom prikazano je u tablicama 24-27 i na slikama 11 i 12, a nakon napada Candide albicans prikazano je u tablici 44 (kompleks VI-VI).
Primjer 20
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophvtes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrste Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Po 500 ml svake suspenzije pomiješano je u jednostrukoj posudi. Blastospore podvrste DSM-9456 su izvađene ispiranjem s 500 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
500 ml ove suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran izravnim dodatkom tiomersala u staničnu suspenziju u omjeru od 1:20000 (masa/vol.) . U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada Trichophytonom na zamorcima prikazano je u tablicama 9, 10 i na slici 2 (kompleks II-II).
Primjer 21
Kulture podvrsta Trichophytona mentagrophvtes DSM-7279, Trichophytona rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9470, Trichophyton rubrum DSM-9471 i Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candide albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457, Candida albicans DSM-9458 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9470, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9470, 7471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i mješavina podvrsta DSM-9469, 9470, 7471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml miješane suspenzije Trichophyton rubrum DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrsta DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 su izvađene ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 150 ml svake suspenzije.
Uzeto je 500 ml dobivene suspenzije i pomiješano sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 22
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9471 i Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 4 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida .albicans DSM-9456, 9457 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 7471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrste DSM-7279 i mješavina podvrsta DSM-9469, 7471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješa se s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrsta DSM-9456, 9457 su izvađene ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 250 ml svake suspenzije.
Uzeto je 500 ml dobivene suspenzije i pomiješano sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom na zamorcima i zečevima prikazano je u tablicama 24-27 i na slikama 11 i 12, a nakon napada sa Candida albicans na miševima prikazano je u tablici 44 (kompleks VI-I).
Primjer 23
Kulture podvrsta Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 i Trichophytona rubrum DSM-9472 i Candide albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kulture podvrsta Candida albicans DSM-9456, 9457, 9459 uzgajane su u l Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9297 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml za svaki homogenat. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophvtes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrsta DSM-9456, 9457, 9459 su izvađene ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 250 ml svake suspenzije.
500 ml dobivene suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom prikazano je u tablicama 24-27 i na slikma 11 i 12, a nakon napada sa Candidom albicans prikazano je u tablici 44 (kompleks VI-II).
Primjer 24
Kulture podvrsta Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 i Trichophytona rubrum DSM-9472 i Candide albicans DSM-9456, upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Trichophyton rubrum uzgajani su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Kultura podvrste Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9297 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. 500 ml svake suspenzije pomiješano je u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrste DSM-9456 su izvađene ispiranjem s 500 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 10 milijuna po ml.
500 ml te suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija.
Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije stanična suspenzija obrađena je miješanjem 36 sati s natrijevim permanganatom koncentracije od 1:20000 (masa/vol.)- Obrađene stanice isprane su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta po svakom stupnju centrifugiranja. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 25
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9470, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457, Candida albicans DSM-9458, Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9470, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candida albicans DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 uzgajane su u l Roux boci za svaku kulturu na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrste DMS-7279 i mješavine podvrsta DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9470, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrste DSM-9456, 9457, 9458 i 9459 su izvađene ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 150 ml svake suspenzije.
500 ml dobivene suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije stanična suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji dodane su tablete vodikovog peroksida (Wasserstoff-Peokxid Tabletten WDT) tako da je dobivena krajnja koncentracija od 3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa 24 sata. Obrađene stanice isperu se 5 puta s destiliranom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 80 milijuna po ml.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom prikazano je u tablicama 24-27 i na slikma 11 i 12, a nakon napada sa Candida albicans prikazano je u tablici 44 (kompleks VI-V).
Primjer 26
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9469, Trichophyton rubrum DSM-9471, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279, 9469, 9471 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 4 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candida albicans DSM-9456, 9457, uzgajana je u l Roux boci za svaku kulturu na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 100 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Gljivične mase podvrste DMS-7279 i mješavine podvrsta DSM-9469, 9471 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9469, 9471 i 9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrste DSM-9456, 9457 su izvađene ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 250 ml svake suspenzije.
500 ml dobivene suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije stanična suspenzija je obrađena miješanjem 36 sati s natrijevim permanganatom koncentracije od 1:10000 (masa/vol.). Obrađene stanice isprane su 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta po svakom stupnju centrifugiranja. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom prikazano je u tablicama 24-27 i na slikma 11 i 12, a nakon napada sa Candida albicans prikazano je u tablici 44 (kompleks VI-IV).
Primjer 27
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456, Candida albicans DSM-9457 i Candida albicans DSM-9459 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture podvrsta DSM-7279 i 9472 uzgajane su odvojeno na agaru s ekstraktom slada u 6 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Podvrste kultura Candida albicans DSM-9456, 9457, i 9459 uzgajane su u l Roux boci za svaku kulturu na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene, sjedinjene i homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. 500 ml suspenzije Trichophytona mentagrophytes DSM-7279 pomiješano je s 500 ml suspenzije Trichophytona rubrum DSM-9472 u jednostrukoj posudi.
Blastospore podvrste DSM-9456, 9457 i 9459 su izvađene ispiranjem s 200 ml destilirane vode. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml. Pomiješano je po 250 ml svake suspenzije.
500 ml dobivene suspenzije pomiješano je sa suspenzijom mikrokonidija. Homogenat je inaktiviran dodatkom tiomersala u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 50 mg tiomersala dodano je u l litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije suspenzija je obrađena s H2O2. K staničnoj suspenziji dodana je tvar koja sadrži H2O2, na primjer urea-hidrogen peroksid, tako da je dobivena krajnja koncentracija od 3% H2O2. Staničnu suspenziju miješa 36 sata. Obrađene stanice isperu se 5 puta s destilitanom vodom centrifugiranjem (4000 okr./min) 25 minuta. Krajnja koncentracija stanica namještena je na 60 milijuna po ml.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C. Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja intramuskularnom injekcijom.
Primjer 28
Djelovanje cjepiva nakon napada LD50 Candida albicans na miša
Napad je apliciran intraperitonealnom injekcijom od 45 milijuna blastospora Candida albicans po mišu. Jednostruka doza od 0,3 ml cjepiva aplicirana je subkutano istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva. Na isti način ispitani su kompleksi 1-1, I-II, 2-1 (vidi tablice 1, 2, 3, 4).
Primjer 29
Djelovanje cjepiva nakon napada ID50 Candida albicans na miševima
Napad je apliciran intraperitonealnom injekcijom od 10 milijuna blastospora Candida albicans po mišu. Jednostruka doza od 0,3 ml cjepiva aplicirana je subkutano istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva.
Na isti način ispitani su kompleksi 3-1, 3-II, 4-1 (vidi tablice 5, 6, 23, 44, 45).
Primjer 30
Djelovanje cjepiva nakon napada Trichophytonom na zamorcima
Napad s mikrokonidijama Trichophytona rubrum sastojao se je od 500 tisuća mikrokonidija po cm2 (1,5 milijuna mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Napad s mikrokonidijama Trichophytona mentagrophvtes sastojao se je od 100-200 tisuća mikrokonidija po cm (300-600 tisuća mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Jednostruka doza od 1,0 ml cjepiva aplicirana je intramuskularnom injekcijom istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva.
Ispitani su kompleksi I-I, I-II, II-I, II-II, III-I, III-II, III-III, III-IV, III-V (vidi tablice 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i slike l, 2, 3, 4).
Klinički simptomi infekcije s Trichophytonom u zamoraca procijenjeni su primjenom slijedećih zbirnih ocjena težine:
0 = nema simptoma,
1 = hiperemija na koži na mjestu aplikacije gljivica,
2 = jednostruka mrlja Ijuštenja,
3 = ljuštenje kože na mjestu aplikacije gljivica,
4 = tanka mala krasta na mjestu aplikacije gljivica,
5 = krasta slična kori na mjestu aplikacije gljivica.
Primjer 31
Djelovanje cjepiva nakon napada Trichophytonom na zečevima
Napad s mikrokonidijama Trichophytona rubrum sastojao se je od 500 tisuća mikrokonidija po cm2 (1,5 milijuna mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Jednostruka doza od 2,0 ml cjepiva aplicirana je intramuskularnom injekcijom istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva.
Ispitan je kompleks II-I (vidi tablice 15, 16 i sliku 5) . Klinički simptomi infekcije s Trichophytonom u zečeva procijenjeni su primjenom istih zbirnih ocjena težine navedenih u primjeru 30.
Primjer 32
Kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456 upotrijebljene su za pripravu 1,5 litre cjepiva. Kulture Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajane su odvojeno na agar/travi u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C. Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine 0,3%-tnog svinjskog peptona (oksoid). 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Da se dobije 50% do 100% tubusa klica svaka suspenzija fermentirana je l do 2 dana pri 28°C. Stanične suspenzije su isprane pet puta s fiziološkom otopinom natrijevog klorida centrifugiranjem (4000 okr./min) pri 10°C s 25 minuta za svaki stupanj centrifugiranja.
Blastospore podvrste DSM-9456 izvađene su ispiranjem s 500 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
500 ml svake kulture u suspenziji je sjedinjeno i pomiješano u jednostrukoj posudi.
Za inaktivaciju smjese homogenata staničnoj suspenziji izravno je dodan tiomersal u omjeru od 1:20000 (masa/vol). U tu svrhu 75 mg tiomersala dodano je u 1,5 litru homogenata. Smjesa je inkubirana 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C.
Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja.
Dobivena suspenzija je upakirana i odmah upotrijebljena za sisavce.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophvtes na zamorce i zečeve prikazano je u tablicama 17, 18, 19, 20, 21, 22 i na slikma 6, 7, 8, 9 i 10 (kompleks IV-II), a nakon napada sa Candida albicans na miševima prikazano je u tablici 23.
Primjer 33
Za pripravu 1,5 litre cjepiva upotrijebljene su kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456. Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajani su odvojeno na agar/travi u 3 Roux boce za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 2 Roux boci na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine koja je sadržavala 0,3% svinjskog peptona (Biteck, Difco), 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po svakoj ml homogenata. Da se dobije 50% do 100% tubusa klica svaka suspenzija mikrokonidija fermentirana je l do 2 dana pri 28°C.
Zatim su stanične suspenzije isprane pet puta s fiziološkom otopinom natrijevog klorida centrifugiranjem (4000 okr./min) pri 10°C s 25 minuta za svaki stupanj centrifugiranja.
Blastospore podvrste DSM-9456 izvađene ispiranjem s 500 ml fiziološke otopine natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
Uzeto je po 500 ml svake kulture u suspenziji i pomiješano u jednostrukoj posudi.
Za inaktivaciju smjese homogenata staničnoj suspenziji izravno je dodan tiomersal u omjeru od 1:20000 (masa/vol) izravno u staničnu suspenziju. U tu svrhu 75 mg tiomersala dodano je u 1,5 litru homogenata. Smjesa je zatim ostavljena stajati 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenskih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i odloženo u hladnjaku pri 4°C.
Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja.
Dobivena suspenzija je upakirana i odmah upotrijebljena za sisavce.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorce prikazano je u tablicama 17, 18 i na slici 6 (kompleks IV-III).
Primjer 34
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom, Microsporumom i Candidom na zamorce Napad s mikrokonidijama Trichophyton rubrum sastojao se je od 500 tisuća mikrokonidija po cm2 (1,5 milijuna mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Napad s mikrokonidijama Trichophyton mentagrophytes sastojao se je od 100-200 tisuća mikrokonidija po cm2 (300-600 tisuća mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Napad s mikrokonidijama Microsporum canis sastojao se je od 500 tisuća mikrokonidija po cm (1,5 milijuna mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Napad s 0,3 ml suspenzije blastospora Candida albicans slične pasti dobiven je aplkacijom s površine kulture stare 2 dana apliciranih površinski na svaku životinju.
Jednostruka doza od 1,0 ml cjepiva aplicirana je intramuskularnom injekcijom istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva.
Ispitani su kompleksi IV-I, IV-II, IV-III (vidi tablice 17, 18, 19, 20 i slike 6, 7, 8).
Jednostruka doza od 0,75 ml cjepiva aplicirana je intramuskularnom injekcijom istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva. Ispitan je kompleks VIII-II, (vidi tablice 38, 39, 40, 41, 42, 43 i slike 18, 19, 20).
Jednostruka .doza od 0,5 ml cjepiva aplicirana je intramuskularnom injekcijom istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva. Ispitani su kompleksi VI-I, VI-II, VI-III, VI-IV, VI-V, VI-VI, VII-I, VII-II, VII-III, VII-IV, VII-V, VII-VI, VII-VII, VIII-I (vidi tablice 24-37 i slike 11-17).
Klinički simptomi infekcije s Trichophytonom, Microsporumom i sa Candidom na zamorcima procijenjeni su primjenom slijedećih zbirnih ocjena težine:
0 = nema simptoma,
1 = hiperemija na koži na mjestu aplikacije gljivica,
2 = jednostruka mrlja ljuštenja,
3 = ljuštenje kože na mjestu aplikacije gljivica,
4 = tanka mala krasta na mjestu aplikacije gljivica,
5 = krasta slična kori na mjestu aplikacije gljivica.
Primjer 35
Djelovanje i sigurnost ispitana na miševima
Jednostruka doza od 0,2 ml cjepiva aplicirana je subkutano, a druga doza nakon 7 dana, istog dana s napadom. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva. Ispitani su kompleksi IV-II, VI-I, VI-II, VII-III, VI-IV, VI-V, VI-VI (vidi tablice 23, 44).
Ispitana je sigurnost i profilaktičko djelovanje cjepiva u različitim dozama. Jednostruke doze od 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 i 2,0 ml cjepiva aplicirane su subkutano, a druga doza aplicirana je nakon 7 dana. Doza od 0,5 ml cjepiva ubrizgana je na dva mjesta, 1,0 i 2,0 ml aplicirano je na tri mjesta tijela životinje. Miševi su napadnuti nakon 4 tjedna. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva i 4 tjedna nakon napada. Na taj način ispitan je kompleks VIII-I (vidi tablice 45 i 46).
Primjer 36
Djelovanje cjepiva nakon napada Trichophytonom na zečevima
Napad s mikrokonidijama Trichophyton rubrum sastojao se je od 500 tisuća mikrokonidija po cm2 (1,5 milijuna mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Jednostruka doza od 2,0 ml cjepiva aplicirana je intramuskularnom injekcijom istog dana kad i napad, a druga doza nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva.
Ispitan je kompleks IV-II (vidi tablice 21, 22 i slike 9, 10). Klinički simptomi infekcije s Trichophytonom u zečeva procijenjeni su primjenom istih zbirnih ocjena težine navedenih u primjeru 34.
Primjer 37
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom na zamorcima s imunosupresivnom obradom Napad s mikrokonidijama Trichophyton rubrum sastojao se je od 500 tisuća mikrokonidija po cm (1,5 milijuna mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Napad s mikrokonidijama Trichophyton mentagrophytes sastojao se je od 100-200 tisuća mikrokonidija po cm2 (300-600 tisuća mikrokonidija) apliciranih površinski na svaku životinju.
Kao imunosupresant upotrijebljen je hostakorin H. l ml suspenzije kristala sadržavala je 10 mg prednisolon-21-acetata i 9,45 mg benzilalkohola. Jednostruka doza od 0,1 ml suspenzije hotrakortina aplicirana je intramuskularnom injekcijom isog dana kad i napad, druga doza aplicirana je nakon 3 dana, a treća doza aplicirana je nakon 7 dana.
Jednostruka doza od 0,5 ml cjepiva aplicirana je intramuskularnom injekcijom isog dana kad i napad, a druga doza aplicirana je nakon 7 dana. Promatranje je nastavljeno 4 tjedna nakon početne injekcije cjepiva.
Ispitani su kompleksi VIII-I+H i kontrola+H (necijepljene životinje koje su primile samo hostakortin H) (vidi tablice 32-35 i slike 15, 16).
Klinički simptomi infekcije s Trichophytonom u zamoraca procijenjeni su primjenom slijedećih zbirnih ocjena težine:
0 = nema simptoma,
1 = hiperemija na koži na mjestu aplikacije gljivica,
2 = jednostruka mrlja Ijuštenja,
3 = ljuštenje kože na mjestu aplikacije gljivica,
4 = tanka mala krasta na mjestu aplikacije gljivica,
5 = krasta slična kori na mjestu aplikacije gljivica.
Primjer 38
Šarža br. 851 cjepiva proizvedena je u tvornici.
Za proizvodnju 15 litara cjepiva upotrijebljene su kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456. Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajani su odvojeno na agar/travi u 10 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 4 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine koja je sadržavala 0,3% svinjskog peptona oksoida, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Da se dobije 50% do 100% tubusa klica svaka suspenzija mikrokonidija fermentirana je l do 2 dana pri 28°C.
Zatim su stanične suspenzije isprane sistemom unakrsnog protoka s fiziološkom otopinom natrijevog klorida.
Blastospore podvrste DSM-9456 izvađene su ispiranjem sistemom unakrsnog protoka s fiziološkom otopinom natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
Za inaktivaciju homogenata staničnoj suspenziji izravno je dodan tiomersal u omjeru od 1:20000. Zatim je uzeto 5000 ml svake kulture i inaktivirano s tiomersalom. U tu svrhu 250 mg tiomersala dodano je u 5 litara homogenata. Nakon toga suspenzije su stajale 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije 5000 ml svake suspenzije provjereno je glede sterilnosti i inaktivacije. Inaktivne i sterilne suspenzije su pomiješane. Dobiveno cjepivo je stavljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i držano je u hladnjaku pri 4°C.
Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja.
Dobivena suspenzija je upakirana i odmah upotrijebljena za sisavce. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 28-31 i na slikama 13 i 14 (kompleks VTI-VTI), a za napad sa Candidom albicans je prikazano u tablicama 45 i 46.
Primjer 39
Šarža br. 851/NF7522LO01 (28. svibanj 1997.) cjepiva proizvedena je u tvornici.
Za proizvodnju 15 litara cjepiva upotrijebljene su kulture podvrsta Trichophyton mentagrophytes DSM-7279, Trichophyton rubrum DSM-9472 i Candida albicans DSM-9456. Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i Trichophyton rubrum DSM-9472 uzgajane su odvojeno na agar/travi u 10 Roux boca za svaku kulturu 20 dana pri 28°C. Candida albicans DSM-9456 uzgajana je u 4 Roux boce na agaru Sabouraud 3 dana pri 28°C.
Gljivične mase podvrsta DSM-7279 i 9472 su izvađene i odvojeno homogenizirane u 500 ml vodene otopine koja je sadržavala 0,3% svinjskog peptona oksoida, 5% glukoze i 0,1% kvaščevog ekstrakta. Koncentracija mikrokonidija namještena je na 60 milijuna po ml homogenata. Da se dobije 50% do 100% tubusa klica svaka suspenzija mikrokonidija fermentirana je l do 2 dana pri 28°C.
Zatim su stanične suspenzije isprane sistemom unakrsnog protoka s fiziološkom otopinom natrijevog klorida.
Blastospore podvrste DSM-9456 izvađene ispiranjem sistemom unakrsnog protoka s fiziološkom otopinom natrijevog klorida. Koncentracija blastospora u suspenziji namještena je na 60 milijuna po ml.
Za inaktivaciju homogenata staničnoj suspenziji izravno je dodan tiomersal u omjeru od 1:20000. Zatim je uzeto 5000 ml svake kulture i inaktivirano s tiomersalom. U tu svrhu 250 mg tiomersala dodano je u 5 litara homogenata. Nakon toga suspenzije su stajale 2 dana pri sobnoj temperaturi.
Nakon inaktivacije 5000 ml svake suspenzije provjereno je glede sterilnosti i inaktivacije. Inaktivne i sterilne suspenzije su pomiješane.
Dobiveno cjepivo je stabljeno u boce, provjereno glede sterilnosti, sigurnosti i imunogenih svojstava u skladu s prihvaćenim metodama i držano je u hladnjaku pri 4 C.
Cjepivo pripravljeno na ovaj način upotrijebljeno je za imunizaciju životinja. 600 ml dobivenog cjepiva šarže br. 851 upakirano je u 1080 bočica sa po 0,6 ml cjepiva gotovog za upotrebu u svakoj bočici.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 32-37 i na slikama 15, 16 i 17 (kompleks VIII-I).
Primjer 40
5,5 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 0,7 ml Imunokina® (inerferon gama-lb), kojeg je 12.12.96. g. proizvela tvrtka Dr. Karl Thomae GmbH, šarža br. 612608 koncentracije 0,1 mg u 0,5 ml vodene otopine. Kompleksi su pripravljeni neposredno prije aplikacije na životinjama.
Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama. Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 28-31 i na slikama 13 i 14 (kompleks VII-I).
Primjer 41
5,5 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 10 μg rh TNF-alfa, kojeg je proizvela tvrtka Promega (SAD), šarža br. 7186801. Kompleksi su pripravljeni neposredno prije aplikacije na životinjama.
Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 28-31 i na slikama 13 i 14 (kompleks VII-II).
Primjer 42
5,5 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 5 μg rekombinatnog IL-2, humanog, kojeg je proizvela tvrtka Promega (SAD), šarža br. 5970601. Kompleksi su pripravljeni neposredno prije aplikacije na životinjama.
Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 28-31 i na slikama 13 i 14 (kompleks VII-III).
Primjer 43
5,5 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 5 μg rekombinatnog IL-2, humanog, kojeg je proizvela tvrtka Sigma, šarža br. 86H6661. Kompleksi su pripravljeni neposredno prije aplikacije na životinjama.
Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 28-31 i na slikama 13 i 14 (kompleks VII-IV).
Primjer 44
5,5 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 20 μg rekombinatnog hIL-8 (72-Aa) , kojeg je proizvela tvrtka Boehringer Manheim, šarža br. 14788621.
Kompleksi su pripravljeni neposredno prije aplikacije na životinjima.
Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 28-31 i na slikama 13 i 14 (kompleks VII-V).
Primjer 45
5,5 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 2,5 μg rekombinatnog IL-4, humanog, kojeg je proizvela tvrtka Promega, šarža br. 7099101. Kompleksi su pripravljeni neposredno prije aplikacije na životinjama.
Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum i Trichophytonom mentagrophytes na zamorcima prikazano je u tablicama 28-31 i na slikama 13 i 14 (kompleks VII-VI).
Primjer 46
50 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 25 ml inaktivirane Microsporum canis, DSM br. 7281, suspenzijom mikrokonidija sa 60% tubusa zametaka i koncentracijom od 50 milijuna po ml fiziološke vodene otopine natrijevog klorida.
Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama.
Djelovanje cjepiva nakon napada s Trichophytonom rubrum, Trichophytonom mentagrophytes i Microsporum canis na zamorcima prikazano je u tablicama 38-43 i na slikama 18-20 (kompleks VII-II).
Primjer 47
10 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 25 ml inaktiviranog "Rotlauf" cjepiva protiv erisipelaze (standardni RF-2 tvrtke Paul-Ehrlich-Institute, Njemačka) s 0,2 IU aktivnosti po dozi.
Drugih 10 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 25 ml inaktiviranog "Rotlauf" cjepiva protiv erisipelaze (standardni RF-2 tvrtke Paul-Ehrlich-Institute, Njemačka) s 1,0 IU aktivnosti po dozi.
Slijedećih 10 ml cjepiva iz šarže br. 851 (vidi primjer 38) pomiješano je s 25 ml inaktiviranog "Rotlauf" cjepiva protiv erisipelaze (standardni RF-2 tvrtke Paul-Ehrlich-Institute, Njemačka) s 5,0 IU aktivnosti po dozi. Dobivene suspenzije su pakirane u bočice kao gotove za upotrebu na životinjama. Djelovanje cjepiva nakon napada s erisipelazom u miševa prikazano je u tablici 47 (RF-2 + kompleks VIII-I).
Pozitivne kontrole djelovanja bila su cjepiva erisipelaze (standardni RF-2 tvrtke Paul-Ehrlich-Institute, Njemačka) s 0,2 IU, 1,0 IU i 5,0 IU aktivnosti po dozi.
Nakon 21 dana sve su životinje, cijepljene i kontrolne, napadnute s virulentnim kulturama erisipelaze. Djelovanje je izračunato po standardnoj metodi Paul-Ehrlich-Instituta, Njemačka.
Primjer 48
Djelovanje cjepiva pripravljenog kako je opisano u primjeru l od Candide albicans DSM br. 9456, Trichophytona mentagrophvtes DSM br. 7279 i Trichophytona rubrum DSM br. 9472 pokazano je cijepljenjem čovjeka starog 41 godinu s Herpes simplex labialis.
Intramuskularna injekcija volumena 1,0 ml cjepiva u intervalima od 14 dana između svake aplikacije rezultirala je ozdravljenjem cijepljenog pacijenta 4 do 5 dana nakon prve injekcije. Svi klinički simptomi, ukjučiv svrbež, su nestali. Nisu opaženi nikakvi sporedni efekti.
Primjer 49
Djelovanje cjepiva pripravljenog kako je opisano u primjeru 2 od Candide albicans DSM br. 9456, Trichophytona mentagrophytes DSM br. 7279 i Trichophytona rubrum DSM br. 9472 pokazano je cijepljenjem čovjeka starog 42 godinu s kroničnom folikularnom piodermom.
Intramuskularna injekcija volumena 1,0 ml cjepiva u intervalima od 14 dana između svake aplikacije rezultirala je ozdravljenjem cijepljenog pacijenta 4 do 6 tjedana nakon posljednje injekcije, što je pokazano značajnim smanjenjem količine subkornealnih pustula i intenzitetom kliničkih simptoma. Nisu opaženi nikakvi sporedni efekti.
Primjer 50
Djelovanje cjepiva pripravljenog kako je opisano u primjeru 2 od Candide albicans DSM br. 9456, Trichophytona mentagrophytes DSM br. 7279 i Trichophytona rubrum DSM br. 9472 pokazano je cijepljenjem dječaka starog 12 godinu s Common warts (Vecurae vulgares i paronihijlane bradavice).
Cjepivo ubrizgano intramuskularno dva puta u intervalima od dva mjeseca, rezultiralo je značajnim smanjenjem količine bradavica nakon prve injekcije i nestankom bradavica 30 dana nakon druge injekcije. Nisu opaženi nikakvi sporedni efekti.
Rezultati napada s LD50 Candida albicans na cijepljenim miševima (1. pokus)
Tablica 1
Akutno patogeno djelovanje
[image]
Pri upotrebi LD50 doze za napad omjer uginulih miševa (40-50%) bio je isti u pokusnoj i u kontrolnoj skupini životinja tijekom perioda akutne patogenosti (3 dana nakon injekcije).
[image]
Tijekom narednog perioda (od dana 4 do dana 28) u 100% od preživjelih iz necijepljene skupine razvili su se klinički simptomi kandidaze, dok je omjer učinkovitosti u cijepljenih životinja bio 60% (kompleks 1-1) i 66,7% (kompleks I-II) .
[image]
Pri upotrebi LD50 doze za napad broj uginulih miševa od 40% i 36% bio je isti u pokusnoj i u kontrolnoj skupini životinja tijekom perioda akutne patogenosti (3 dana nakon injekcije) .
[image]
Tijekom narednog perioda (od dana 4 do dana 28) u 100% od preživjelih iz necijepljene skupine razvili su se klinički simptomi kandidaze, dok je omjer učinkovitosti u cijepljenih životinja bio 50% (kompleks 2-1).
Rezultati napada a ID100 Candida albicans na cijepljenim miševima (3. Pokus)
Tablica 5
[image]
Pri upotrebi ID100 70% životinja cijepljenih s kompleksom 3-1 i 30% životinja cijepljenih s kompleksom 3-II bilo je zdravo, dok je 82% životinja iz kontrolne skupine patilo od kliničkih simptoma kandidaze.
[image]
Pri upotrebi ID100 90% životinja cijepljenih s kompleksom 4-1 bilo je zdravo, dok je 80% miševa iz kontrolne skupine imalo kliničke simptome kandidaze.
Klinički simptomi bolesti Trichophytona rubrum u zamoraca (1. pokus)
Tablica 7
[image]
Težina kliničkih simptoma zamoraca napadnutih s rubrofitozom prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleksi I-I i I-II) necijepljene životinje imale su mnogo teže kliničke simptome (vidi sliku 1).
[image]
[image]
Težina kliničkih simptoma zamoraca napadnutih s rubrofitozom prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleksi II-I i II-II) necijepljene životinje imale su mnogo teže kliničke simptome (vidi sliku 2).
[image]
[image]
Težina kliničkih simptoma u zamoraca napadnutih s rubrofitozom prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleksi III-I, III-II, III-III, III-IV, III-V) necijepljene životinje imale su više teških kliničkih simptoma (vidi sliku 3).
Broj zamoraca s kliničkim simptomima bolesti Trichophyton rubrum u zamoraca (3. pokus) Tablica 12 (Metodu vidi u primjeru 30.)
[image]
Težina kliničkih simptoma zamoraca napadnutih infekcijom Trichophyton mentagrophytes prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleksi III-I, III-II, III-III, III-IV, III-V) necijepljene životinje imale su više teških kliničkih simptoma (vidi sliku 4).
[image]
[image]
Težina kliničkih simptoma zečeva napadnutih s infekcijom Trichophyton rubrum prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleks I-II) necijepljene životinje imale su mnogo teže kliničke simptome (vidi sliku 5).
[image]
[image]
Težina kliničkih simptoma zečeva napadnutih s infekcijom Trichophytona rubrum prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleks IV-I, kompleks IV-II, kompleks IV-III) necijepljene životinje imale su mnogo teže kliničke simptome (vidi sliku 6).
[image]
[image]
Težina kliničkih simptoma zamoraca napadnutih s infekcijom Trichophyton rubrum prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleks IV-II) necijepljene životinje imale su mnogo teže kliničke simptome (vidi sliku 7).
[image]
[image]
Težina kliničkih simptoma zamoraca napadnutih s infekcijom Trichophyton rubrum prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama (kompleks IV-II) necijepljene životinje imale su mnogo teže kliničke simptome (vidi sliku 9).
[image]
[image]
Primjenom ID100 45% životinja cijepljenih s kompleksom IV-II bilo je zdravo, dok je 80% životinja iz kontrolne skupine patilo od kliničkih simptoma kandidaze.
[image]
Težina kliničkih simptoma zamoraca napadnutih s infekcijom Trichophytona rubrum prikazana je u različitim periodima promatranja. U usporedbi sa cijepljenim životinjama, necijepljene životinje imale su mnogo teže kliničke simptome na dane 28 i 33. Samo žiotinje cijepljene s kompleksom VI-V imale su više kliničkih simtoma dana 33 (vidi sliku 11) .
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
[image]
Claims (32)
1. Cjepivo, naznačeno time, da sadrži inaktivirane dermatofitne mikrokonidije i inaktivirane blastospore kvasnice ili njihov antigeni materijal.
2. Cjepivo prema zahtjevu l, naznačeno time, da su blastospore u nabubrenom stanju i/ili imaju tubus klice i/ili su mikrokonidije u nabubrenom stanju i/ili imaju tubus klice.
3. Cjepivo prema zahtjevu l ili 2, naznačeno time, da je najmanje 50% blastospora u nabubrenom stanju i/ili imaju tubus klice i/ili je najmanje 50% mikrokonidija u nabubrenom stanju i/ili imaju tubus klice.
4. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 3, naznačeno time, da blastospore kvasnice spadaju u rod Candida, a dermatofitne mikrokonidije spadaju u rodove Trichophyton i/ili Microsporum.
5. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 4, naznačeno time, da blastospore kvasnice spadaju u vrstu Candida albicans, a dermatofitne mikrokonidije spadaju u vrstu Trichophyton rubrum i/ili Trichophyton mentagrophytes i/ili Microsporum canis.
6. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 5, naznačeno time, da blastospore kvasnice spadaju u podvrste Candida albicans DSM-9456, i/ili Candida albicans DSM-9457 Candida albicans DSM-9458 i/ili Candida albicans DSM-9459, a dermatofitna mikrokonidija spada u podvrste Trichophyton rubrum DSM-9469 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9470 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9471 i/ili Trichophyton rubrum DSM-9472 i/ili Trichophyton mentagrophytes DSM-7279 i/ili Microsporum canis DSM-7281.
7. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 6, naznačeno time, da se gljivične spore inaktiviraju s tiomersalom, formaldehidom ili 2-propiolaktonom.
8. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 7, naznačeno time, da se gljivične spore modificiraju nakon inaktivacije.
9. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 8, naznačeno time, da se gljivične spore modificiraju obradom s H202 ili sa parmanganatnim solima.
10. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 9, naznačeno time, da rečeno mikozno cjepivo ne sadrži nikakvu dodatnu imunomodulacijsku tvar.
11. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 10, naznačeno time, da rečeno mikozno cjepivo ne sadrži nikakvu pomoćnu tvar.
12. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 11, naznačeno time, da rečeno mikozno cjepivo sadrži dodatnu s imunomodulacijskim djelovanjem.
13. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 8 ili 12, naznačeno time, da rečeno mikozno cjepivo sadrži pomoćnu tvar i/ili najmanje jedan citokin.
14. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 13, naznačeno time, da sadrži 10 do 90 milijuna spora po ml.
15. Cjepivo prema bilo kojem od zahtjeva l do 14, naznačeno time, da sadrži približno 60 milijuna spora po ml.
16. Upotreba cjepiva prema bilo kojem od zahtjeva l do 15, naznačena time, da se ono koristi za profilaksu i liječenja mikoza.
17. Upotreba cjepiva prema bilo kojem od zahtjeva l do 16, naznačena time, da se ono koristi za profilaksu i liječenja mikoza u ljudi.
18. Upotreba cjepiva prema bilo kojem od zahtjeva l do 17, naznačena time, da se ono koristi za profilaksu i liječenje dermatomikoze i/ili onihomikoze i/ili kandidoze.
19. Upotreba cjepiva prema bilo kojem od zahtjeva l do 15, naznačena time, da se ono koristi za modulaciju imunosnog odgovora.
20. Upotreba cjepiva prema bilo kojem od zahtjeva l do 15, naznačena time, da se ono koristi za stimulaciju imunosnog odgovora.
21. Upotreba cjepiva prema bilo kojem od zahtjeva l do 15, naznačena time, da se ono koristi za stimulaciju imunosnog odgovora u imunosno ugroženom biću.
22. Trichophyton rubrum, naznačen, time, da spada u podvrstu DSM-9469 i/ili DSM-9470 i/ili DSM-9471 i/ili DSM-9472.
23. Candida albicans, naznačena time, da spada u podvrstu DSM-9456 i/ili DSM-9457 i/ili DSM-9458 i/ili DSM-9459.
24. Postupak za pripravljanje cjepiva, naznačen time, da uključuje: A: rast dermatofita na prikladnom krutom mediju, ubiranje i homogenizaciju dermatofita, B: rast kvasnica na prikladnom mediju, ubiranje i homogenizaciju kvasnica, C: kombiniranje i inaktivaciju homogenata A i B.
25. Postupak za pripravljanje cjepiva prema zahtjevu 24, naznačen time, da se dermatofit homogenizira u vodenoj otopini koja sadrži 0,1-0,3% fermentiranog hidroliziranog mišićnog proteina ili 0,1-1% sojinog ili svinjskog peptona u kombinaciji s 5-6% glukoze i 0,1-1% kvaščevog ekstrakta i zatim inkubira od 1-2 dana pri 28°C.
26. Postupak za pripravljanje cjepiva prema zahtjevu 24, naznačen time, da se kvasnica nakon homogenizacije inkubira 2 do 4 sata u prisutnosti 5-6% CO2 tijekom.
27. Postupak za pripravljanje cjepiva prema zahtjevima 24 do 26, naznačen time, da se gljivični homogenizat obraduje s H2O2, ili s permanganatnom soli.
28. Postupak za pripravljanje povećane količine nabubrenih mikrokonidija ili mikrokonidija s tubusom klice dermatofita, naznačen time, da uključuje: uzgoj dermatofita na krutom mediju, ubiranje i homogenizaciju kulture u tekućem mediju, održavanje pH vrijednosti tekućeg medija pri 6,2 do 7,2, prijenos suspenzije u posebnu posudu koja sadrži svježi tekući medij, promatranje rasta i morfološkog izgleda dermatofitnih stanica, ubiranje stanica kad najmanje 50% mikrokonidija pokazuje nabubrenost ili stanje germinacije, i najviše 7-10% stanica pokazuje drugu granu micelija.
29. Postupak prema zahtjevu 28, naznačen time, da su mediji za uzgoj kulture ekstrakt agara ili agar Sabouraud, a tekući medij sadrži 0,3-1,0% sirivig ekstrakta ili peptona iz mesa ili soje, uključiv 5-6% glukoze i 0,1-1,0% kvaščevog ekstrakta ili juhu sladnog ekstrakta ili mesno-glukoznu jugu.
30. Postupak za pripravljanje povećane količine nabubrenih blastospora i blastospora s tubusom klice kvasnice, naznačen time, da uključuje: uzgoj kvasnice na krutom mediju, ubiranje i homogenizaciju kvasnice u tekućem mediju, inkubaciju homogenata u atmosferi koja sadrži 5-6% CO2 2-4 sata pri 36-38°C, promatranje rasta i morfološkog izgleda stanica kvasnice, ubiranje stanica kad najmanje 50% blastospora pokazuje tubus klice ili nabubreno stanje.
31. Postupak prema zahtjevu 30, naznačen time, da tekući medij za kulturu ima pH od 6,8-7,0.
32. Postupak prema bilo kojem od zahtjeva 24 do 31, naznačen time, da dermatofit spada u rod Trichophyton i/ili Microsporum i/ili vrste Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophvtes i/ili Microsporum canis i/ili podvrstu Trichophyton rubrum DSM-9469 i/ili DSM-9470 i/ili DSM-9471 i/ili DSM-9472 i/ili Trichophyton mentagrophvtes DSM-7279 i/ili Microsporum canis DSM-7281, a kvasnica je odabrana iz roda Candida ili vrste Candida albicans i/ili između povrsta Candida albicans DSM-9456 i/li DSM-9457 i/ili DSM-9458 i/ili DSM-9459.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP96115954A EP0834322A3 (en) | 1996-10-04 | 1996-10-04 | Mycosis vaccine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HRP970528A2 true HRP970528A2 (en) | 1998-08-31 |
Family
ID=8223269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HR96115954.8A HRP970528A2 (en) | 1996-10-04 | 1997-10-02 | Mycosis vaccine |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6290950B1 (hr) |
| EP (2) | EP0834322A3 (hr) |
| JP (1) | JP4698771B2 (hr) |
| AR (1) | AR008491A1 (hr) |
| AT (1) | ATE347372T1 (hr) |
| AU (1) | AU740389B2 (hr) |
| CA (1) | CA2268138C (hr) |
| CO (1) | CO4650185A1 (hr) |
| DE (1) | DE69737067T2 (hr) |
| DK (1) | DK0956042T3 (hr) |
| ES (1) | ES2279546T3 (hr) |
| HR (1) | HRP970528A2 (hr) |
| PE (1) | PE2399A1 (hr) |
| PT (1) | PT956042E (hr) |
| RU (1) | RU2219945C2 (hr) |
| WO (1) | WO1998015284A2 (hr) |
| ZA (1) | ZA978799B (hr) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2020959C1 (ru) * | 1991-10-21 | 1994-10-15 | Игорь Дмитриевич Поляков | Вакцина поливак-тм для профилактики и лечения дерматофитозов животных |
| US6720576B1 (en) * | 1992-09-11 | 2004-04-13 | Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. | Plasma processing method and photoelectric conversion device |
| GB2304347A (en) | 1995-08-11 | 1997-03-19 | Boeringer Ingelheim Vetmedica | Antigenic preparations |
| WO2001015725A1 (en) * | 1998-09-24 | 2001-03-08 | Alpharma As | Vaccine for the protection of a vertebrate animal against fungal skin infection |
| ATE476987T1 (de) * | 2000-06-19 | 2010-08-15 | Hunter Immunology Ltd | Zusammensetzungen und methoden zur behandlung von candidosen |
| US20040043003A1 (en) * | 2002-01-31 | 2004-03-04 | Wei Chen | Clinical grade vectors based on natural microflora for use in delivering therapeutic compositions |
| US20040009937A1 (en) * | 2002-01-31 | 2004-01-15 | Wei Chen | Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the respiratory system |
| US20050075298A1 (en) * | 2002-01-31 | 2005-04-07 | Wei Chen | Methods and composition for delivering nucleic acids and/or proteins to the intestinal mucosa |
| RU2281110C1 (ru) * | 2005-02-10 | 2006-08-10 | Владислав Николаевич Ласкавый | Лекарственное средство против кандидоза человека для инъекций |
| CA2663377A1 (en) | 2006-09-18 | 2008-03-27 | Raptor Pharmaceutical Inc. | Treatment of liver disorders by administration of receptor-associated protein (rap)-conjugates |
| US20080220023A1 (en) * | 2007-03-08 | 2008-09-11 | Stevens David A | Antifungal vaccines with saccharomyces cerevisiae |
| US20120077778A1 (en) | 2010-09-29 | 2012-03-29 | Andrea Bourdelais | Ladder-Frame Polyether Conjugates |
| MX2018010710A (es) * | 2016-03-15 | 2019-01-14 | Polyakov Igor | Composiciones para el tratamiento y prevención de enfermedades podales y de las pezuñas. |
| CN109152793B (zh) | 2016-03-15 | 2022-05-17 | 伊戈尔.波利亚科夫 | 免疫学产品 |
| WO2021001540A1 (en) | 2019-07-04 | 2021-01-07 | Proxi Biotech Aps | Detoxification of proteins |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU547928B2 (en) * | 1981-11-03 | 1985-11-14 | Sutka, K. | Antigenic preparation from candida guilliermondii |
| US4762710A (en) * | 1986-06-16 | 1988-08-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Novel method of preparing toxoid by oxidation and metal ions |
| CA2011896C (en) * | 1989-04-21 | 2001-05-08 | Mark Werner | Ringworm vaccine |
| DE4007927A1 (de) * | 1990-03-13 | 1991-09-19 | Bayer Ag | Pathogenese-faktoren von dermatophyten |
| US5277904A (en) * | 1990-10-26 | 1994-01-11 | Pier Allan C | Broad spectrum dermatophyte vaccine |
| RU2020959C1 (ru) | 1991-10-21 | 1994-10-15 | Игорь Дмитриевич Поляков | Вакцина поливак-тм для профилактики и лечения дерматофитозов животных |
| GB9417880D0 (en) * | 1994-09-06 | 1994-10-26 | Auspharm Int Ltd | Vaccine |
| GB2304347A (en) * | 1995-08-11 | 1997-03-19 | Boeringer Ingelheim Vetmedica | Antigenic preparations |
| EP0970966B1 (en) * | 1996-09-04 | 2008-02-20 | Takara Bio Inc. | Fungal antigens and process for producing the same |
-
1996
- 1996-10-04 EP EP96115954A patent/EP0834322A3/en not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-09-22 PT PT97942957T patent/PT956042E/pt unknown
- 1997-09-22 JP JP51711998A patent/JP4698771B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-22 EP EP97942957A patent/EP0956042B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-22 WO PCT/EP1997/005181 patent/WO1998015284A2/en active IP Right Grant
- 1997-09-22 US US09/269,342 patent/US6290950B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-22 AT AT97942957T patent/ATE347372T1/de active
- 1997-09-22 DK DK97942957T patent/DK0956042T3/da active
- 1997-09-22 RU RU99108989/15A patent/RU2219945C2/ru active
- 1997-09-22 DE DE69737067T patent/DE69737067T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-22 ES ES97942957T patent/ES2279546T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-22 AU AU44604/97A patent/AU740389B2/en not_active Ceased
- 1997-09-22 CA CA002268138A patent/CA2268138C/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-10-01 ZA ZA9708799A patent/ZA978799B/xx unknown
- 1997-10-02 CO CO97057661A patent/CO4650185A1/es unknown
- 1997-10-02 HR HR96115954.8A patent/HRP970528A2/hr not_active Application Discontinuation
- 1997-10-02 PE PE1997000879A patent/PE2399A1/es not_active Application Discontinuation
- 1997-10-03 AR ARP970104552A patent/AR008491A1/es not_active Suspension/Interruption
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001503975A (ja) | 2001-03-27 |
| ES2279546T3 (es) | 2007-08-16 |
| CO4650185A1 (es) | 1998-09-03 |
| PT956042E (pt) | 2007-04-30 |
| CA2268138A1 (en) | 1998-04-16 |
| PE2399A1 (es) | 1999-02-10 |
| EP0834322A3 (en) | 1998-04-22 |
| ZA978799B (en) | 1998-04-06 |
| ATE347372T1 (de) | 2006-12-15 |
| WO1998015284A2 (en) | 1998-04-16 |
| DE69737067T2 (de) | 2007-07-05 |
| JP4698771B2 (ja) | 2011-06-08 |
| CA2268138C (en) | 2009-01-06 |
| WO1998015284A3 (en) | 1999-09-23 |
| EP0834322A2 (en) | 1998-04-08 |
| AU740389B2 (en) | 2001-11-01 |
| AU4460497A (en) | 1998-05-05 |
| RU2219945C2 (ru) | 2003-12-27 |
| DK0956042T3 (da) | 2007-04-10 |
| US6290950B1 (en) | 2001-09-18 |
| EP0956042A2 (en) | 1999-11-17 |
| AR008491A1 (es) | 2000-01-19 |
| EP0956042B1 (en) | 2006-12-06 |
| DE69737067D1 (de) | 2007-01-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HRP970528A2 (en) | Mycosis vaccine | |
| KR100847104B1 (ko) | 아토피 피부염 개선제 조성물 | |
| JP2001169774A (ja) | 発芽活性化された赤色ガノデルマルシダム胞子及びその製造方法 | |
| EP0304786A2 (de) | Intranasale Impfung von Pferden mit inaktivierten Mikroorganismen oder antigenem Material | |
| CN109666609A (zh) | 一种赤红球菌发酵方法及其作为佐剂在动物疫苗中的应用 | |
| WO2006090940A1 (en) | Composγπon for prevention and treatment of stretch mark comprising citric acid, zinc and arginine | |
| EP3429616B1 (en) | Compositions for the treatment and prevention of hoof and claw diseases | |
| KR20170031291A (ko) | 디이노코커스 라디오두란스 유래 엑소폴리사카라이드 및 이를 포함하는 조성물 | |
| TWI743747B (zh) | 育毛髮、生毛髮用外用劑 | |
| JP2001017158A (ja) | 桑黄菌糸体培養用培地組成物及びこれを用いる桑黄菌糸体の培養方法 | |
| WO2018223668A1 (zh) | 一种预防和/或治疗猪圆环病毒感染的二联疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| KR102379274B1 (ko) | 유용성분을 함유하는 기능성 귀리 제조방법 | |
| CN110693920A (zh) | 蝉花活性物质及其制备方法和应用 | |
| SU955571A1 (ru) | Вакцина ТФ-130 (К) против трихофитии крупного рогатого скота и способ профилактики лечени трихофитии крупного рогатого скота | |
| WO2001015725A1 (en) | Vaccine for the protection of a vertebrate animal against fungal skin infection | |
| KR20180125354A (ko) | 천연 복합 버섯 성분이 함유된 아토피 개선 연고 및 로션 | |
| KR20120039113A (ko) | 돼지 다발성 장막염 예방용 백신 조성물 및 그 제조방법 | |
| CN108660115A (zh) | 一种猪圆环病毒3型毒株、及其疫苗组合物、制备方法和应用 | |
| Trojacka et al. | Mycotic corneal ulcers caused by Fusarium spp.-available therapeutic options | |
| US20040151726A1 (en) | Novel vaccine for prophylaxis and theraphy in vetirinary and human medicine | |
| CN113692272A (zh) | 弹性蛋白酶活性抑制剂、弹性蛋白酶活性抑制外用剂、及弹性蛋白酶活性抑制饮食用组合物 | |
| Campaign | Research in Preventive Medicine | |
| Campaign | RESEARCH IN PREVENTIVE MEDICINE | |
| Strong | Protective inoculation against Asiatic cholera (an experimental study) | |
| EA040511B1 (ru) | Композиции для лечения и предупреждения заболеваний копыт и когтей |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1OB | Publication of a patent application | ||
| AIPI | Request for the grant of a patent on the basis of a substantive examination of a patent application | ||
| ODBC | Application rejected |