HRP20020075A2 - Oligonucleotides for inhibiting the expression of human eg5 - Google Patents

Oligonucleotides for inhibiting the expression of human eg5 Download PDF

Info

Publication number
HRP20020075A2
HRP20020075A2 HR20020075A HRP20020075A HRP20020075A2 HR P20020075 A2 HRP20020075 A2 HR P20020075A2 HR 20020075 A HR20020075 A HR 20020075A HR P20020075 A HRP20020075 A HR P20020075A HR P20020075 A2 HRP20020075 A2 HR P20020075A2
Authority
HR
Croatia
Prior art keywords
oligonucleotide
seq
derivative according
modified
nucleoside
Prior art date
Application number
HR20020075A
Other languages
English (en)
Inventor
Uhlmann Eugen
Greiner Beate
Unger Eberhard
Gothe Gislinde
Schwerdel Marc
Original Assignee
Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma Deutschland Gmbh filed Critical Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Publication of HRP20020075A2 publication Critical patent/HRP20020075A2/hr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/11—Compounds covalently bound to a solid support
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Predloženi izum odnosi se na oligonukleotid ili njegov derivat sa sekvencom koja odgovara određenom dijelu sekvence nukleinskih kiselina koja kodira humani eg5 ili njegov mutirani oblik i izum se nadalje odnosi na postupak za proizvodnju oligonukleotida i njegovu upotrebu.
Tijekom mitoze, vretenasti aparat, koji se temelji na mikrotubulama, pomaže da se udvostručeni kromosomi jednoliko raspodijele na stanicama kćerima. Motorički proteini srodni kinezinu troše dio snage koja je potrebna za gradnju vretena i diobu kromozoma. Stvaranje bipolarnog mitotičnog vretena zahtjeva aktivnost mnogih različitih motoričkih proteina. Jedan od ljudskih motoričkih proteina koji je srodan kinezinu je eg5, koji djeluje uzajamno s mitotičkim centrozomima i za njega se je pokazalo da je bitan za stvaranje bipolarnih vretena (Blangy et al., Cell (1995) 83, 1159). Mikroinjekcija specifičnog anti-human-eg5 antitijela blokira putovanje centrozoma i dovodi do toga da su stanice postojane prema mitozi.
Druga mogućnost za blokiranje stvaranja bipolarnih vretena bila je inhibicija ekspresije eg5. Način da se specifično inhibira ekspresiju eg5 bila je upotreba komplementarnih oligonukleotida koji se prema potrebi mogu modificirati za poboljšanje njihovih svojstava (E. Uhlmann i A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990); S. Agrawal, TIBTECH 1996, 376) . Pretpostavlja se da se komplementarni oligonukleotidi vežu na specifične sekvence mRNA, što dovodi do razgradnje mRNA i/ili inhibicije sinteze proteina.
Predmet predloženog izuma je oligonukleotid ili njegov derivat, koji odgovara dijelu sekvence koja kodira eg5 -ponajprije humani eg5 ili eg5 uzročnika bolesti, npr. Plasmodium falciparum (malarija). Ponajprije, oligonukleotid odgovara sekvenci eg5 od 8 do 100 nukleotida, posebno povoljno 8 do 20 nukleotida. Oligonukteotid ili njegov derivat veže se na spomenutu sekvencu i inhibira stvaranje eg5 proteina. Humana eg5 sekvenca je poznata (Blangy et al., Cell (1995) 83, 1159). SEQ ID NO.: 20 pokazuje primjer jedne sekvence koja kodira humani eg5.
SEQ ID NO.: 21 pokazuje primjer eg5 sekvence u Plasinodium falciparum.
Oligonukleotid ima ponajprije sekvencu koja odgovara dijelu nukleinske kiseline koja kodira humani eg5 ili eg5 Plasmodium faiciparum. Pojam "odgovara" znači da spomenuta sekvenca baza oligonukleotida je komplentarna dijelu sekvence nukleinske kiseline koja kodira eg5 (npr. gen, cDNA, mRNA), što omogućuje hibridizaciju oligonukleotida s odgovarajućim dijelom ("sense" dio) nukleinske kiseline koji kodira eg5 (on se veže na taj dio). Zbog toga je nazvan "komplentarni oligonukleotid". U prednosnoj izvedbi izuma oligonukleotid je stoga komplementarni oligonukleotid. U daljnjoj prednosnoj izvedbi izuma oligonukleotid je ribozim. Ribozim je katalitička nukleinska kiselina koja cijepa mRNA. Ribozim je odabran ponajprije iz skupine Hammerhead ribozima (Vaish et al., Nucleic Acids Res. (1998) 26, 5237).
Oligonukleotid prema izumu veže se na dio eg5-mRNA koji je prikladan za hibridizaciju i inhibira vezanje proteina eg5. Oligonukleotidi prikladni za vezanje na eg5-mRNA i za inhibiciju ekspresije usmjereni su npr. na startno područje translacije eg5.
Dio sekvence nukleinskih kiselina koji kodira eg5 koji odgovara oligonukleotidu ima duljinu od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ili više nukleotida, i oligonukleotid odgovara ponajprije duljini sekvence koja kodira eg5 od 12 nukleotida ili 19 nukleotida. Oligonukteotid prema izumu ima dakle duljinu od 10 (10mer), 11 (11mer), 12 (12mer), 13 (13mer), 14 (14mer), 15 (15mer), 16 (16mer), 17 (17mer), 18 (18mer) ili 19 (19mer) nukleotida.
U prednosnoj izvedbi izuma oligonukleotid ima duljinu od 12 ili 19 nukleotida; takovi oligonukleotidi mogu imati na primjer jednu od slijedećih sekvenci:
SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO, 7. SEQ ID NO. 8, SEQ ID NO. 9 ili njezin dio, pri čemu
SEQ ID NO. 1 je 5' -CTTAAGGCAGTACCGCAGC-3';
5' -CGACGCCATGACGGAATTC-3';
SEQ ID NO. 2 je 3’-ACCACTCTACGTCTGGTAA-5' ;
5' -AATGGTCTGCATCTCACCA-3'
SEQ ID NO. 3 je 3'-GGCAGTACCGCAGCGTCGG-5'
5'-GGCTGCGACGCCATGACGG-3'
SEQ ID NO. 4 je 3'-CTTAAGGCAGTA-5' ;
5'-ATGACGGAATTC-3'
SEQ ID NO. 5 je 3'-TAAGGCAGTACC-5';
5' -CCATGACGGAAT-3'
SEQ ID NO. 6 je 3'-GGCAGTACCGCA-5';
5' -ACGCCATGACGG-3'
SEQ ID NO. 7 je 3'-AGTACCGCAGCG-5';
5'-GCGACGCCATGA-3'
SEQ ID NO. 8 je 3'-CCGCAGCGTCGG-5';
5'-GGCTGCGACGCC-3'
SEQ ID NO. 9 je 3'-GCAGCGTCGGTT-5';
5'-TTGGCTGCGACG-3'.
Posve prednosno je da se oligonukleotid modificira za poboljšanje njegovih svojstava; npr. za povišenje njegove otpornosti prema nukleazama, odnosno da ga učini postojanim prema nukleazama, za poboljšanje njegovog afiniteta vezanja na komplementarne nukleinske kiseline koje kodiraju eg5, npr. mRNA, ili da se poveća njegovo prihvaćanje u stanicama.
Predloženi izum odnosi se stoga ponajprije na oligonukleotid koji ima specifičnu sekvencu, kako je gore navedeno, i koji osim toga ima jednu ili više kemijskih modifikacija u usporedbi s "prirodnom DNA" koja se sastoji iz "prirodnih nukleozida dezoksiadenozina (adenin + (β-D-2'-dezoksiriboza), dezoksigvanozina (gvanin + β-D-2'-dezoksiriboza), dezoksicitidina (citozin + β-D-2'-dezoksiriboza) i timidina (timin +β-D-2' -dezoksiriboza), koji su međusobno povezani između nukleozida s fosfodiesterskim mostovima. Oligonukleotidi mogu sadržavati jednu ili više modifikacija iste vrste i/ili modifikacije različitih tipova; svaki tip modifikacije može se neovisno o drugom tipu modifikacije odabrati između tipova modifikacija koji su poznati za modificiranje oligonukleotida.
Izum se odnosi također na derivate oligonukleotida, na primjer na njihove soli, posebno na njihove fiziološki podnošljive soli. Soli i fiziološki podnošljive soli opisane su npr. u Remingtons Pharmaceuticals Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA (str. 1418) . Derivati se također odnose na modificirane oligonukleotide koji sadrže jednu ili više modifikacija (npr. na određene položaje nukleotida i/ili na određene internukleozidne mostove), alanole oligonukleotida (npr. poliamid-nukleinske kiseline (PNAs), fosfomonoester-nukleinskih kiselina (PHONAs = PMENAs), oligonukleotid-himere (koji se sastoje npr. iz jednog DNA-dijela i jednog PNA-dijela ili se sastoje iz jednog DNA dijela i jednog PHONA dijela)). Derivati se također odnose na oligonukleotide koji odgovaraju alelenima i/ili mutiranim oblicima (mutantima), normalnog ili prirodnog eg5, npr. aleleni i/ili mutanti humanog eg5 (npr. u pogledu SEQ ID NO. 20) i aleleni i/ili mutanti Plasmodium falciparum eg5 (npr. što se tiče SEQ ID NO. 21).
Primjeri kemijskih modifikacija su stručnjaku poznati i opisani su na primjer u E. Uhlmann i A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 i "Protocols for oligonucteotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Technigues, S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, Totowa, USA 1993 i S. T. Crooke, F. Bennet. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 (1996) 107-129; J. Hunziker i C. Leuman (1995) Mod. Synt. Methods, 7, 331-417.
U usporedbi s prirodnom DNA, modificirati odnosno izmijeniti se može na primjer fosfodiesterski most između nukleozida, skupina β-D-2'-dezoksiriboze i/ili prirodna nukleozidna baza (adenin, gvanin, citozin, timin). Oligonukleotid prema izumu može imati jednu ili više tih modifikacija, pri čemu se svaka od tih modifikacija u usporedbi s onom iz oligonukleotida koji se sastoji iz jednake sekvence prirodne DNA može nalaziti na određenom fosfodiesterskom internukleozidnom mostu i/ili na određenoj β-D-2'-dezoksiriboznoj skupini i/ili na određenom položaju prirodne nukleozidne baze.
Izum se odnosi, na primjer, na oligonukleotid koji sadrži jednu ili više modifikacija, pri čemu je svaka modifikacija neovisno odabrana iz slijedećeg popisa:
a) zamjena fosfodiesterskog mosta između nukleozida koji se nalaze na kraju 3' i/ili na kraju 5' nukleozida s modificiranim internukleozidnim mostom,
b) zamjena fosfodiesterskog mosta koji se nalazi na kraju 3' i/ili na kraju 5' nukleozida s defosfo mostom,
c) zamjena šećer-fosfatnog ostatka iz šećer-fosfatnog kostura s drugim ostatkom,
d) zamjena β-D-2'-dezoksiribozne jedinice s modificiranom šećernom skupinom,
e) zamjena prirodne nukleozidne baze s modificiranom nukleozidnom bazom,
f) povezivanje na molekulu koja utječe na svojstva oligonukleotida,
g) povezivanje na 2',5'-povezani oligoadenilat ili njegov derivat, prema potrebi preko prikladnog linkera, i
h) uvođenje 3',3'- 5',5'-inverzije na kraju 3' i/ili na kraju 5' oligonukleotida.
Točni primjeri za kemijsku modifikaciju oligonukleotida jesu:
a) zamjena fosfodiesterskog mosta između nukleozida koji se nalazi na kraju 3' i/ili na kraju 5' nukleozida s modificiranim internukleozidnim mostom, pri čemu je modificirani internukleozidni most odabran, na primjer, između fosfortioatnog, fosforditioatnog, NR1R1’-foforamidatnog, boranfosfatnog, fosfat-(C1-C21)-O-alkil-esterskog, fosfat-[(C6-C12)-aril-((C1-C21)-O-alkil]-esterskog, (C1-C8)-alkilfosfonatnog i/ili (C6-C12)-aril-fosfonatnog mosta i (C7-C12)-α-hidroksimetilarilnog (poznat iz WO 95/01363), pri čemu su (C6-C12)-aril, (C6-C20)-aril i (C6-C14)-aril prema potrebi supstituirani s halogenim, alkilom, alkoksi, nitro, cijano, i pri čemu
R1 i R1’ su međusobno neovisno vodik, (C1-C18) -alkil, (C6-C20) -aril, (C6-C14)-aril-(C1-C8)-alkil, ponajprije vodik, (C1-C8)-alkil, ponajprije (C1-C4)-alkil i/ili metoksietil ili
R1 i R1’ zajedno s dušikom koji ih nosi tvore 5- do 6-člani heterociklički prsten, koji može dodatno sadržavati daljnji heteroatom iz skupine O, S i N,
b) zamjena fosfodiesterskog mosta koji se nalazi na kraju 3' i/ili na kraju 5' nukleozida s defosfo mostom (defosfo mostovi su opisani na primjer u Uhlmann, E. i Peyman, A. u "Methods u Molecular Biology", svezak 20, "Protocols for oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, Totowa 1993, poglavlje 16, str. 355 i dalje), pri čemu jedan defosfo most je, na primjer, form-acetal, 3'-tioformacetal, metilhidroksilamin, oksim, metilendimetil-hidrazo, dimetilensulfon i/ili siliIna skupina;
c) zamjena šećer-fosfatne skupine (β-D-2'-dezoksi-riboza i fosfodiesterski most između nukleozida tvore zajedno šećer-fosfatnu jedinicu) iz šećer-fosfatnog kostura (šećer-fosfatni kostur se sastoji iz šećer-fosfatnih skupina) s drugom skupinom, pri čemu je druga skupina prikladna na primjer za gradnju
- "morfolino derivata" oligomera (kako je opisano na primjer u E.P. Stirchaketal., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129); to jest npr. za zamjenu sa skupinom morfolino derivata;
- poliamid-nukleinske kiseline ("PNA") (kako je opisano na primjer u P.E. Nielsen et al., Bioconj. Chem. 5 (1994) 3 i u EP 0672677 A2); to jest npr. za zamjenu sa strukturnom jedinicom PNA, npr. s 2-aminoetilglicinom;
- fosfonska kiselina-monoester-nukleinske kiseline ("PHONA") (kako je opisano npr. u Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638 i u EP 0739898 A2) ; to jest npr. za zamjenu sa strukturnom skupinom PHONA;
d) zamjena skupine β-D-2'-dezoksiriboze s modificiranom skupinom šećera, pri čemu je modificirana skupina šećera odabrana na primjer između β-D-riboze, α-D-2'-dezoksiriboze, L-2'-dezoksiriboze, 2'-F-2'-dezoksi-riboze, 2'-O-(C1-C6)-alkilriboze, pri čemu se prednost daje 2'-O-(C1-C6) -alkilribozi i 2'-O-metilribozi, 2'-O-(C2-C6)-alkenil-ribozi, 2’-[O-(C1-C6)-alkil-O-(C1-C6)-alkil]-ribozi, 2'-NH2-2'-dezoksiribozi, β-D-ksilo-furanozi, α-arabino-furanozi, 2,4-didezoksi-β-D-eritro-hekso-piranozi i karbocikličkim (opisanim na primjer z Froehler, J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 8320) i/ili analozima šećera s otvorenim lancem (opisanim na primjer u Vandendriessche et al., Tetrahedron 49 (1993) 7223) i/ili analozima bicikličkih šećera (opisani na primjer u M. Tarkov et al., HelVo Chim. Acta 76 (1993) 481);
e) zamjena prirodne nukleozidne baze s modificiranom nukleozidnom bazom, pri čemu je modificirana nukleozidna baza odabrana, na primjer, iz skupine koju čine uracil, hipoksantin, 5-(hidroksimetil)uracil, N-dimetilgvanozin, pseudouracil, 5-(hidroksimetil)uracil, 5-aminouracil, dihidrouracil, 5-fluoruracil, 5-fluorcitozin, 5-kloruracil, 5-klorcitozin, 5-bromuracil, 5-bromcitozin, 2,4-diamino-purin, 8-azapurin, supstituirani 7-deazapurin, ponajprije 7-deaza-7-supstitutirani i/ili 7-deaza-8-supstituirani purin ili druge modifikacije prirodnih nukleozidnih baza (modificirane nukleozidne baze opisane su npr. u EP 0 710 667 A2 i EP 0 680 969 A2);
f) vezanje na molekulu koja utječe na svojstva oligonukleotida, pri čemu dolazi u obzir vezanje oligonukleotida na jednu ili na više molekula koje (povoljno) utječu na svojstva oligonukleotida, na primjer na sposobnost prodiranja oligonukleotida kroz staničnu membranu, odnosno prodiranja u stanicu, postojanost prema nukleazama, na afinitat prema ciljnoj sekvenci koja kodira eg5, na farmakokinetiku oligonukleotida, sposobnost komplementarnog oligonukleotida/ribozima odnosno molekule konjugirane s oligonukleotidom, koja u svakom slučaju zahvaća ciljnu sekvencu koja kodira eg5, npr. sposobnost za vezanje i/ili za poprečno umreživanje ako se oligonukleotid hibridizira sa ciljnom sekvencom koja kodira eg5), pri čemu kao primjeri molekula koje se mogu povezati na oligonukleotid u obzir dolaze polilizin, sredstva za interkaliranje kao piren, akridin, fenacin ili fenantridin, fluorescentna sredstva kao fluorescein, Cross-linkeri kao psoralen ili azidoproflavin, lipofilne molekule kao (C12-C20)-alkil, lipidi kao 1,2-diheksadecil-rac-glicerin, steroidi kao kolesterin ili testosteron, vitamini kao vitamin E, poli- ili oligoetilenglikol, ponajprije preko fosfatne skupine (npr. trietilenglikolfosfat, heksaetilen-glikolfosfat) na koji je povezan oligonukleotid, (C12-C18)-alkilfosfatdiester i/ili O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-alkil, pri čemu se te molekule mogu uvesti na kraju 5' i/ili na kraju 3' i/ili unutar sekvence, npr. na nukleozidnoj bazi za tvorbu oligonukleotidnog konjugata; postupci za proizvodnju oligonukleotidnih konjugata su stručnjaku poznati i opisani su, na primjer, u Uhlmann, E. & Peiman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543, M. Manoharan u "Antisense Research and Applications", Crooke i Lebleu, izd., CRC Press, Boca Raton, 1993, pogl. 17, str. 303 i dalje, i EP-A 0 552 766;
g) vezanje na 2',5'-povezani oligoadenilat, ponajprije preko prikladne molekule linkera, pri čemu je 2', 5' povezani oligoadenilat odabran, na primjer, iz skupine koju čine molekule 2',5'-povezani triadenilat, 2',5'-povezani tetra-adenilat, 2',5'-povezani penta-adenilat, 2',5'-povezani heksa-adeniltat ili 2',5'-povezani hepta-adenilat i njihovi derivati, pri čemu 2',5'-povezani derivat oligoadenilata je, na primjer, kordicepin (2',5'-povezani 3'-dezoksiadenilat) i pri čemu prikladan linker je na primjer trietilenglikol i pri čemu kraj 5' 2',5'-povezanog oligoadenilata mora nositi fosfatni, difosfatni ili trifosfatni ostatak, u kojem se jedan ili više atoma kisika može zamijeniti na primjer s atomima sumpora, pri čemu se prednost daje zamjeni s fosfatnim ili tiofosfatnim ostatkom; i
h) uvođenje 3'-3' - i/ili 5'-5'-inverzije na kraju 3' i/ili na kraju 5' oligonukleotida, pri čemu je taj način kemijske modifikacije stručnjaku poznat i opisan je na primjer u M. Koga et al., J. Org. Chem. 56 (1991) 3757, EP 0 464 638 i EP 0 593 901.
Zamjena šećer-fosfatne skupine u šećer-fosfatnoj strukturi s drugom skupinom koja može biti npr. skupina PNA strukture ili skupina PHONA strukture, je ponajprije zamjena nukleotida s npr. PNA skupinom ili PHONA skupinom, koja već sadrži prirodne nukleozidne baze i/ili modificirane nukleozidne baze, npr. neku od modificiranih nukleozidnih baza iz skupine koju čine uracil, hipoksantin, 5-(hidroksimetil)uracil, N2-dimetilgvanozin, pseudouracil, 5-(hidroksimeti))uracil, 5-aminouracil, pseudouracil, dihidrouracii, 5-fluoruracil, 5-fluorcitozin, 5-kloruracil, 5-klorcitozin, 5-bromuracil, 5-bromcitozin, 2,4-diamino-purin, 8-azapurin, supstituirani 7-deazapurin, ponajprije 7-deaza-7-supstituirani i/ili 7-deaza-8-supstituirani purin ili druge modifikacije prirodne nukleozidne baze (modificirane nukleotidne baze opisane su npr. u EP 0 710 667 A2 i EP 0 680 969 A2).
Ovdje se izričito uzimaju u obzir oligonukleotidne modifikacije koje su opisane u EP 0 710 667 A2, EP 0 680 969 A2, EP 0 464 638, EP 0 593 901, WO 95/01363, EP 0 672 677 A2, EP 0 739 898 A2 i EP 0 552 766.
U posebnom obliku izvedbe izuma je jedan ili je više fosfodiesterskih mostova modificirano između nukleozida unutar oligonukleotidne sekvence; ponajprije je jedan ili je više fosfodiesterskih mostova između nukleozida zamijenjeno s fosfortioatnim mostom između nukleozida i/ili sa (C6-C12)-arilfosfonatnim mostovima između nukleozida, ponajprije s α-hidroksibenzilfosfonatnim mostom, u kojem je benzilna skupina supstituirana ponajprije s npr. nitro, metilom, halogenim. U jednom Nur-fosfortioatnom oligonukleotidu su svi fosfodiesterski mostovi između nukleozida modificirani s fosfortioatom. Izum se odnosi ponajprije na oligonukleotid u kojem svi fosfodiesterski mostovi između nukleozida nisu modificirani jednako s fosfortioatom (fosfortioatni mostovi između nukleozida). Prednosno, najmanje jedan internukleozidni most ima drugačiju vrstu modifikacije, ili on nije modificiran. Izum se odnosi posebno na oligonukleotid koji dodatno sadrži najmanje jednu drugačiju vrstu modifikacije. U daljnjem posebnom obliku izvedbe izuma modificiran je jedan ili je modificirano više nukleozida (α-D-2'-dezoksiriboza i/ili nukleozidna baza) unutar oligonukleotidne sekvence; ponajprije je α-D-2'-dezoksiriboza zamijenjena s 2'-O-(C1-C6)-alkilribozom, prednosno s 2'-O-metilribozom, i/ili je nukleozidna baza zamijenjena s 8-azapurinom, 7-deaza-7-supstituiranim purinom i/ili 7-deaza-8-supstitutiranim purinom (purin: adenin, gvanin). Izum se ponajprije odnosi na oligonukleotid u kojem nisu svi nukleozidi modificirani jednako. Izum se ponajprije odnosi na oligonukleotid koji sadrži dodatno najmanje jednu drugačiju vrstu modifikacije. U daljnjem posebnom obliku izvedbe izuma je jedna ili je više šećerfosfatnih skupina u šećer-fosfatnoj strukturi zamijenjeno s PNA-strukturnom skupinom, ponajprije s 2-aminoetilglicinskom skupinom. Prednosno su zamijenjene šećer-fosfatne skupine međusobno povezane barem do jednog određenog stupnja. Izum se ponajprije odnosi na oligonukleotid u kojem nisu zamijenjene sve šećer-fosfatne skupine. Izum se odnosi posebno na himerne oligonukleotide, npr. na takove koji su sastavljeni iz jednog ili više PNA dijelova i jednog ili više DNA dijelova. Mogući primjeri za takove himerne oligonukleotide su slijedeći uzorci modifikacija čija svrha nije ograničenje izuma: DNA-PNA, PNA-DNA, DNA-PNA-DNA, PNA-DNA-PNA, DNA-PNA-DNA-PNA, PNA-DNA-PNA-DNA. Slični uzorci bili bi mogući za himerne molekule sastavljene iz DNA dijelova i PHONA dijelova, npr. DNA- PHONA, PHONA- DNA, DNA- PHONA- DNA, PHONA- DNA- PHONA, DNA-PHONA-DNA- PHONA, PHONA-DNA-PHONA-DNA. Dodatno su moguće naravno također i himerne molekule iz tri različita dijela kao DNA-dijela (dijelova), PHONA-dijela (dijelova) i PNA-dijela (dijelova). Izum se ponajprije odnosi na oligonukleotid koji dodatno sadrži najmanje jednu drugačiju vrstu modifikacije.
U daljnjem posebnom obliku izvedbe izuma kraj 3' i/ili kraj 5' oligonukleotida povezan je sa (C12-C18)-alkilnim ostatkom, ponajprije s jednim C16-alkilnim ostatkom, s trietilenglikolnim ostatkom ili s heksaetilenglikolnim ostatkom - ti ostaci povezani su na oligonukleotid prednosno preko fosfatne skupine. Izum se odnosi ponajprije na oligonukleotid u kojem obadva kraja (kraj 3' i kraj 5' ) nisu (na isti način) modificirana. Izum se odnosi ponajprije na oligonukleotid koji sadrži dodatno najmanje jednu modifikaciju drugačije vrste.
U izvedbi izuma kojoj se daje posebnu prednost modificirani su samo određeni položaji unutar oligonukleotidne sekvence (npr. djelomično modificirani oligonukleotid). Djelomično modificirani oligonukleotidi u nekim se stupnjevima označavaju kao minimalno modificirani oligonukleotidi. Unutar sekvence modifikacija se može nalaziti u određenim položajima (kod određenih nukleotida, kod određenih nukleozida, kod određenih nukleozidnih baza, kod određenih internukleozidnih mostova).
U izvedbi izuma kojoj se daje posebnu prednost proizveden je djelomično modificirani oligonukleotid, u kojem je samo nekoliko fosfodiesterskih mostova zamijenjeno s modificiranim internukleozidnim mostovima, npr. s fosfortioatnim mostovima i/ili s α-hidroksibenzil-fosfonatnim mostovima. Izum se posebno odnosi na takove oligonukleotide koji su modificirani samo do određene mjere.
Izum se posebno odnosi na oligonukleotid u kojem je 1 do 5 terminalnih nukleotidnih skupina na kraju 5' i/ili na kraju 3' zaštićeno s modifikacijom internukleozidnih mostova koji se nalaze na kraju 5' i/ili na kraju 3' odgovarajućeg nukleozida, ponajprije zamjenom fosfodiesterskih mostova između nukleozida s fosfortioatnim mostovima i/ili α-hidroksibenzilfosfonatnim mostovima. Posebnu prednost daje se 1 do 5 terminalnim nukleotidnim skupinama na kraju 3' oligonukleotida zaštićenim s modificiranim internukleozidnim mostovima koji se nalaze na kraju 5' i/ili na kraju 3' odgovarajućih nukleozida. Prema potrebi 1 do 5 terminalnih nukleotidnug skupina na kraju 5' oligonukleotida su dodatno zaštićene s modificiranim intemukleozidnim mostovima, koji se nalaze na kraju 5' i/ili na kraju 3' odgovarajućeg nukleozida. Prema potrebi oligonukleotid može dodatno sadržavati modifikacije na drugim položajima.
Izum se, nadalje, odnosi na oligonukleotid u kojem je modificiran najmanje jedan interni pirimidinski nukleozid i/ili pirimidinski nukleozid internukleozidnog mosta koji se nalazi na kraju 5' i/ili na kraju 3' tog pirimidinskog nukleozida (nukleozid s pirimidinskom bazom kao što je citozin, uracil, timin), ponajprije zamjenom fosfodi-esterskog mosta (mostova) između nukleozida s jednim/više fosfortioatnim mostom (mostovima) i/ili s jednim/više α-hidroksibenzilfosfonatnim mostom (mostova).
U prednosnom obliku izvedbe izuma 1 do 5 terminalnih skupina nukleotidnih skupina na kraju 5' i/ili na kraju 3' oligonukleotida zaštićeno je s modificiranim internukleozidnim mostovima koji se nalaze na kraju 5' i/ili na kraju 3' odgovarajućeg nukleozida, pri čemu je dodatno modificiran barem interni pirimidinski nukleozid i/ili jedan internukleozidni most koji se nalazi na kraju 5' tog pirimidinskog nukleozida i/ili na kraju 3' tog pirimidinskog nukleozida.
Načelo djelomično modificiranih oligonukleotida opisano je npr. u A. Peyman, E. Uhlmann, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 377 (1996) 67-70 i u EP 0 653 439. Time se ovi dokumenti izričito uzimaju u obzir. U tom slučaju 1-5 terminalne nukleotidne skupine su zaštićene na kraju 5 i/ili na kraju 3', npr. fosfodiesterski mostovi između nukleozida koji se nalaze na kraju 3' i/ili na kraju 5 odgovarajućeg nukleozida zamijenjeni su s fosfortioatnim mostovima između nukleozida. K tome, povoljno je modificirati najmanje jedan interni položaj pirimidin-nukleozida (odnosno položaj nukleotida); prednosno se modificira(ju)/zamjenjuje(ju) 3' - i/ili 5'–internukleozidni most (mostivi) pirimidinskog nukleozida, na primjer s jednim/više fosforotioatnim mostom (mostovima) između nukleozida. Djelomično modificirani oligonukleotidi imaju posebno povoljna svojstva; oni imaju, na primjer, posebno visok stupanj postojanosti prema nukleazama, a pri tome su tek minimalno modificirani. Oni također imaju značajno smanjenu sklonost prema ne-komplementarnim učincima, koji su često povezani s upotrebom Nur-fosfortioatnih oligonukleotida (Stein i Krieg (1994) Antisense Res. Dev. 4, 67) . Djelomično modificirani oligonukleotidi pokazuju također viši afinitet vezanja nego Nur-fosforotioati.
Izum se odnosi posebno na djelomično/minimalno modificirane oligonukleotide:
[image]
gdje
"*" označava mjesto modifikacije internukleozidnog mosta;
"*" je ponajprije fosfortioatni internukleozidni most.
Daljnji primjer posebno povoljnog oblika izvedbe izuma odnosi se na djelomično modificirani oligonukleotid, u kojem je modificiran nukleozid, npr. s modifikacijom nukleozidne baze i/ili modifikacijom β-D-2'-dezoksi-ribozne skupine. Prednosno je β-D-2'-dezoksiriboza zamijenjena s 2'-O-(C1-C6)-alkilribozom, posve posebno je povoljna zamjena s 2'-O-metilribozom (zamjena β-2'-dezoksi-ribonukleozida s 2'-O-metilribonukleozidom).
Dodatno, uz jednu vrstu modifikacije oligonukleotid prema izumu može također imati i druge vrste modifikacije.
U daljnjem obliku izvedbe izuma oligonukleotid ima modificirane internukleozidne mostove na određenim položajima i dodatno ima modifikacije nukleozida na određenim položajima, ponajprije zamijenjenu β-D-2'-dezoksiriboze. U prednosnom obliku izvedbe izuma modifikacija internukleozida je zamjena fosfodiesterskog mosta s fosfortioatnim mostom, a modifikacija β-D-2'-dezoksiriboze je zamjena s 2'-O-metilribozom; u tom slučaju oligonukleotid je himerni oligonukleotid, koji se sastoji iz modificiranih i nemodificiranih DNA i RNA dijelova koji između nukleozida sadrže 2'-O-metilribonukleozide i β-D-2'-dezoksi-ribonukleozide kao i fosfor-diesterske i fosfortioatne mostove.
Daljnji prednosni oblik izvedbe izuma odnosi se na oligonukleotid, koji na svom kraju 3' i/ili na svom kraju 5' ima jedan ili više (C12-C18) -alkilnih ostataka, ponajprije C16-alkilni ostatak. (C12-C18)-alkilni ostatak može biti povezan npr. kao fosfodiester, kako je opisano u EP 0 552 766 A2 (time se EP 0 552 766 A2 ovdje izričito uzima u obzir), ili kao 3'-fosfodiester O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-alkila. Prednost se daje oligonukleotidu u kojem je C16-alkilni ostatak povezan na kraju 3' i/ili na kraju 5'.
Izum se također odnosi na oligonukleotid u kojem je kraj 3' i/ili kraj 5' povezan s oligoetilenglikolnim ostatkom, ponajprije s trietilenglikolom ili s heksaetilen-glikolom, a posve posebno povoljno preko fosfodiestera (tri- ili heksaetilenglikolfosfatnog estera). Naravno takav oligonukleotid može također sadržavati još i daljnje modifikacije.
U daljnjem posebnom obliku izvedbe izuma oligonukleotid je preko linkera povezan s 2',5'-povezanim oligoadenilat-5'-(tio)fosfatom. Linker može biti npr. oligoetilenglikolfosfatni, ponajprije trietilenglikol-fosfatni, tetraetilenglikolfosfatni ili heksaetilenglikol-fosfatni ostatak. 2',5'-povezani oligoadenilat je povezan ponajprije preko svog kraja 2' kao tetra- ili kao penta-adenilat, čija 5'-hidroksi funkcionalna skupina je supstituirana s fosfatnim ili tiofosfatnim ostatkom. Poznato je da 2',5'-oligoadenilat inducira RNazu L, koja cijepa ciljnu mRNA (Torrence et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 1300). 2',5'-oligoadenilat služi za aktiviranje ribonukleaze L (RNaze L) koja tada razgrađuje eg5 mRNA. Umjesto 2',5'-povezanog adenilata također se može uvesti npr. 2',5'-povezani 3'-dezoksiadenilat, deriviran od nukleozidnog analoga kordicepina. U tom slučaju, oligonukleotidni dio koji je komplementaran sa ciljnom nukleinskom kiselinom, modificiran je ponajprije na određenim položajima s 2'-O-(C1-C6) -alkilribonukleozidom (ponajprije 2'-O-metilribonukleozidom) ili s PNA.
Daljnji prednosni izvedbeni oblik izuma odnosi se na zamjenu jedne ili više prirodnih nukleozidnih baza s neprirodnim odnosno modificiranim nukleozidnim bazama, ponajprije s 8-azapurinom i/ili 7-deaza-7-supstituiranim purinom i/ili s 7-deaza-8-supstituiranim purinom, kako je opisano npr. u EP 0 171 066 i EP 0 680 969.
U daljnjem prednosnom obliku izvedbe izuma nukleozid može imati inverziju 3',3' i/ili 5',5' na kraju 3' i/ili na kraju 5', kako je opisano na primjer u EP O 464 638 i EP O 593 901.
Daljnji prednosni oblik izvedbe izuma odnosi se na zamjenu jednog ili više fosfodiesterskih mostova s α-hidroksibenzilfosfonatnim mostovima, kako je opisano u WO 95/01363.
U daljnjem prednosnom obliku izvedbe izuma oligonukleotid sadrži modifikaciju šećer-fosfatne strukture, ponajprije sa skupinama PNA.
Također su mogući i drugi tipovi modifikacije, npr. DNA-PNA-DNA, PNA-DNA. Također su moguće slične vrste modifikacija za PHONA/DNA-himere. Ti tipovi modifikacija mogu se kombinirati sa svakim drugim načinom modifikacije, a naravno također su mogući i slični tipovi modifikacije za druge oligonukleotide prema izumu.
Gore navedeni konkretni oligonukleotidi - određena sekvenca, određeni tip modifikacije/određeni tipovi modifikacija na određenim položajima (specifični "uzorci modifikacije") predstavljaju samo primjere za različite izvedbene oblike izuma. Izum se ne ograničava na te konkretne oligonukleotide. Također su moguće i druge kombinacije sekvenci i uzoraka modifikacije.
Oligonukleotid prema izumu inhibira specifično ekspresiju ciljnog proteina (tj. eg5) odnosno ciljnu sekvencu (jedne nukleinske kiseline koja kodira eg5, ponajprije eg5 mRNA). Oligonukleotid prema izumu inhibira ponajprije specifično ekspresiju eg5. To ima za posljedicu smanjenje koncentracije proteina eg5 u usporedbi s neobrađenom ekspresijom. Specifičnost se može pokazati određivanjem učinka istog oligonukleotida na ekspresiju beta-aktina na mRNA- i/ili na količinu proteina. Nakon obrade s oligonukleotidom prema izumu bila je smanjena samo koncentracija eg5-mRNA- i/ili eg5-proteina, dok je npr. konzentracija beta-aktin-(protein domacina)mRNA- i/ili beta-aktin-proteina ostala nepromijenjena.
Oligonukleotid prema izumu je prikladan ponajprije za učinkovitu inhibiciju ekspresije eg5 u humanim stanicama, i/ili ima sposobnost ihibicije tumora u životinjama kralježnjacima. Oligonukleotid prema izumu reducira ponajprije koncentraciju eg5-ruRNA i/ili eg5-proteina u tumorima liječenih pojedinaca u usporedbi s neliječenim pojedincima. Oligonukleotid prema izumu ograničava ponajprije veličinu tumora u životinji kralježnjaku, npr. u miševima, u usporedbi s neliječenim miševima, odnosno u usporedbi s veličinom tumora utvrđenog u istoj životinji prije liječenja.
Izum se odnosi također na postupak za proizvodnju nukleotida prema izumu. Proizvodni postupak obuhvaća kemijsku sintezu oligonukleotida. Kemijska sinteza se provodi ponajprije postupcima za sintezu oligonukleotida koji su poznati iz stanja tehnike, npr., fosforamiditnim postupkom prema Caruthers-u (1983) Tetrahedron Letters 24, 245, H-fosfonatnim postupkom (Todd et al. (1957) J. Chem. Soc. 3291) ili fosfotriesterskim postupkom (Sonveaux (1986) Bioorg. Chem. 14, 274; Gait, M.J. "Oligonucleotide Synthesis, A practical Approach", IRL Press, Oxford, 1984) ili poboljšanim ili promijenjenim postupcima koji se odvode od ovih standardnih postupaka. Oligonukleotid prema izumu može se proizvesti, na primjer, postupkom koji je opisan u primjeru 1. Oligonukleotid prema izumu sintetizira se ponajprije na krutoj fazi, pri čemu se na prikladan način zaštićen monomer (npr. nukleozid) kondenzira tako da se između tih monomera dobije internukleozidni most. Izum se odnosi npr. na postupak za proizvodnju oligonukleotida ili njegovog derivata, pri čemu nukleotidna skupina reagira s 3'- ili 2' -terminalnom fosfor(V) skupinom i slobodna 5'-hidroksilna ili merkapto skupina, s daljnjom nukleotidnom skupinom, reagira s fosfor(III)- ili fosfor(V) skupinom u položaju 3', ili s njezinim aktiviranim derivatima, i pri čemu se prema potrebi upotrebljavaju zaštitne skupine koje se prethodno mogu uvesti u oligonukleotid da se zaštite druge funkcionalne skupine i koje se nakon sinteze odstranjuju, i oligonukleotid odcijepljen od čvrste faze se prema potrebi može prevesti u fiziološki nedvojbenu sol. Za sintezu modificiranog oligonukleotida standardni postupci se mogu mijenjati u određenoj mjeri. Te inačice su stručnjaku poznate i opisane su npr. u Agrawal S. "Protocols for oligonucleotides and analogs" (1993, Human Press Inc., Totowa, New Jersey). Proizvodnja modificiranih oligonukleotida također je opisana u EP 0 710 667, EP 0 680 969, EP 0 464 638, EP 0 593 901, WO 95/01363, EP 0 672 677, EP 0 739 898 i EP 0 552 766. Ovime se gore navedeni dokumenti izričito uzimaju u obzir za proizvodnju modificiranih oligonukleotida.
Izum se odnosi nadalje na postupak za inhibiciju ekspresije eg5 i/ili za modulaciju ekspresije nukleinskih kiselina koje kodiraju eg5, pri čemu se oligonukleotid prema izumu dovodi u dodir s nukleinskim kiselinama koje kodiraju eg5 (npr. mRNA, cDNA) i oligonukleotid se hibridizira s tim nukleinskim kiselinama koje kodiraju eg5. Zbog toga se izum odnosni također i na postupak kojim se oligonukleotid dovodi u dodir s nukleinskim kiselinama koje kodiraju eg5 (npr. mRNA; cDNA) , kojim se na primjer oligonukleotid poznatim postupkom uvodi u stanicu, na primjer inkubacijom stanica s gore navedenim oligonukleotidom ili s njegovom formulacijom - pri čemu takova formulacija može sadržavati sredstvo za poboljšavanje prihvaćanja kao što je lipofektin, lipofektamin, Cellfectin ili polikatione (npr. polilizin).
Tako se, na primjer, oligonukleotid, koji je prethodno bio inkubiran Cellfectinom npr. 30 minuta pri sobnoj temperaturi, inkubira otprilike 5 sati ili manje sa stanicom da bi se oligonukleotid uključio u stanicu.
Izum se odnosi se, nadalje, na upotrebu oligonukleotida, ponajprije kao komplementarnog oligonukleotida (vezanje oligonukleotida na mRNA koja kodira eg5) ili kao ribozima (vezanje na mRNA koja kodira eg5 i cijepanje te mRNA). U daljnjem posebnom obliku izvedbe izuma oligonukteotid se može upotrijebiti da bi se induciralo cijepanje mRNA koja kodira eg5, što dovodi do smanjenja ekspresije eg5.
Izum se odnosi na upotrebu oligonukleotida za inhibiciju stvaranja bipolarnog mitotičkog vretena i time za inhibiciju proliferacije stanica, posebno rasta tumora.
Izum se odnosi nadalje na upotrebu oligonukleotida kao lijeka i na upotrebu oligonukleotida za proizvodnju farmaceutskog pripravka. Posebno, oligonukleotid se može upotrijebiti u farmaceutskom pripravku, koji je namijenjen za prevenciju i/ili za liječenje bolesti koje su povezane s ekspresijom eg5 ili koje se mogu izliječiti inhibicijom ekspresije eg5.
Izum se odnosi nadalje na farmaceutski pripravak koji sadrži oligonukleotid i/ili njegovu fiziološki nedvojbenu sol zajedno s farmaceutski nedvojbenim nosačima ili pomoćnim sredstvima.
Izum se odnosi na farmaceutski pripravak koji sadrži najmanje jedan nukleotid prema izumu koji se može upotrijebiti za liječenje bolesti koje se mogu izliječiti inhibicijom ekspresije eg5, kao što je restenoza i rak.
Izum se odnosi nadalje na postupak za proizvodnju farmaceutskog pripravka, pri čemu se jedan ili više oligonukleotida prema izumu pomiješa s fiziološki nedvojbenim nosačima i prema potrebi s dodatnim tvarima, npr. prema potrebi s prikladnim dodacima i/ili pomoćnim sredstvima.
Izum se odnosi posebno na upotrebu oligonukleotida ili iz njega proizvedenog farmaceutskog pripravka za liječenje raka, npr. za inhibiciju rasta tumora i tumarskih metastaza. Oligonukleotid ili iz njega proizveden farmaceutski pripravak može se upotrijebiti npr. za liječenje tvrdih tumora, kao što je rak dojke, rak pluća, rak glave i grla, rak mozga, rak abdomena, rak debelog crijeva, kolorektalni karcinom, rak ezofagusa, rak želuca-crijeva, gliatumor, rak jetre, rak jezika, neuroblastom, osteosarkom, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, retinoblastom, Wilmsov tumor, multipli mijelom, i za liječenje raka kože, kao što je melanom, za liječenje raka limfnih čvorova i raka krvi. Izum se odnosi nadalje na upotrebu oligonukleotida prema izumu ili iz njega proizvedenog farmaceutskog pripravka za inhibiciju ekspresije eg5 i/ili za inhibiciju akumulacije tekućine u trbušnoj šupljini i nakupljanja tekućine u prsnoj šupljini kod različitih vrsta raka, kao što je npr., rak dojke, rak pluća, rak grla, rak mozga, rak abdomena, rak debelog crijeva, kolorektalni rak, rak ezofagusa, rak želuca-crijeva, gliatumor, rak jetre, rak jezika, neuroblastom, osteosarkom, rak jajnika, rak pankreasa, rak prostate, retinoblastom, Wilmsov tumor, multipli mijelom, rak kože, melanom, rak limfnih čvorova i rak krvi. Zbog inhibirajućeg učinka na ekspresiju eg5, oligonukleotid prema izumu, odnosno iz njega proizveden farmaceutski pripravak može poboljšati kvalitetu života.
Izum se odnosi, nadalje, na upotrebu oligonukleotida ili farmaceutskog pripravka koji ga sadrži npr., za liječenje raka ili za sprečavanje tumorskih metastaza, zajedno s drugim lijekovima i/ili s drugim mjerama terapije, npr. s poznatim lijekovima i/ili poznatim mjerama terapije, kao što su na primjer one koje se zasad primjenjuju za liječenje raka i/ili za sprečavanje tumorskih metastaza. Povoljna je kombinacija terapije zračenjem i kemoterapeutskim sredstvima kao što su cisplatin, ciklofosfamid, 5-fluoruracil, adriamicin, daunorubicin ili tamoksifen.
Oligonukleotid i/ili njegova fiziološki nedvojbena sol može se dati životinji, ponajprije sisavcu i posebno ljudima, sam, u mješavini s drugim oligonukleatidom (ili s njegovom fiziološki nedvojbenom soli) ili u obliku farmaceutskog pripravka, koji omogućuje površinsku, perkutanu, parenteralnu ili enteralnu aplikaciju i koji kao aktivan sastojak sadrži učinkovitu dozu najmanje jednog oligonukleotida zajedno s uobičajenim farmaceutski nedvojbenim nosačima i pomoćnim sredstvima. Takav farmaceutski pripravak sadrži normalno otprilike 0,1 do 90 mas. % terapeutski aktivnog jednog ili više oligonukleotida. Dozu se može mijenjati u širokim granicama i u svakom slučaju se mora prilagoditi pojedinačnim okolnostima. Za liječenje lišajeva prednost se daje površinskoj aplikaciji. U slučaju raka prednost se daje infuzijama, oralnom i rektalnom davanju ili nazalnom davanju u aerosolu, ponajprije u slučaju raka pluća, dok se u slučaju dijabetičke retinopatije prednost daje površinskoj, intravitralnoj i oralnoj aplikaciji.
Farmaceutski pripravak može se proizvesti na poznat način (npr. Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.), pri čemu se upotrebljavaju farmaceutski inertni anorganski i/ili organski nosači. Za proizvodnju pilula, tableta, prevučenih tableta i tvrdih želatinskih kapsula može se upotrijebiti npr. laktoza, kukuruzni škrob i/ili njihovi derivati, talk, stearinska kiselina i/ili njezine soli itd. Nosači za meke želatinske kapsule i/ili za čepiće jesu npr. masti, voskovi, polukruti i tekući polioli, prirodna i/ili otvrdnuta ulja itd. Kao nosači za proizvodnju otopina i/ili sirupa prikladna je npr. voda, saharoza, invertni šećer, glukoza, polioli itd. Kao nosači za proizvodnju injekcijskih otopina prikladni su voda, alkoholi, glicerin, polioli, biljna ulja itd. Kao nosači za mikrokapsule, implantate i/ili štapiće prikladni su miješani polimerizati glikolne kiseline i mliječne kiseline. Također su moguće i liposomne formulacije koje su opisane npr. u N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics (Springer Verlag 1992) i Hayashi (Gene Therapy 3 (1996) 878). Farmaceutski pripravak može također obuhvaćati i formulaciju koja povisuje oralnu raspoloživost oligonukleotida, kao što su tvari za poboljšanje prihvaćanja preko crijeva, npr. manit, urea, soli žučne kiseline, kao CDCA (kenodezoksiholat) (2%).
Također je moguća dermalna aplikacija, na primjer uz upotrebu ionoforetičkih metoda i/ili pomoću elektroporacije. Mogu se upotrijebiti nadalje i lipofektini i drugi sistemi nosača koji se koriste, na primjer, u genskoj terapiji. Posebno prikladni su sistemi koji na vrlo učinkovit način omogućuju podizanje oligonukletida u eukariotske stanice ili u jezgre eukariotskih stanica. Farmaceutski pripravak može također sadržavati dva i/ili više različitih oligonukletida i/ili njihove fiziološki nedvojbene soli i osim najmanje jednog oligonukleotida on može sadržavati jednu ili više različitih teraputskih aktivnih tvari.
Osim aktivne tvari i nosača farmaceutski pripravak može sadržavati i dodatne tvari, kao npr. punila, rastezna, rasprsna, vezna, klizna i sredstva za kvašenje, stabilizatore, emulgatore, konzervanse, sladila, bojila, začinska ili mirisna sredstva, sredstva za zgušnjavanje, za razrjeđivanje, pufere, i daljnja otapala i/ili sredstva za pospješivanje otapanja i/ili sredstva za postizanje usporenog djelovanja, kao i soli za mijenjanje osmotskog tlaka, prevlake i/ili antioksidante.
PRIMJERI
Primjer 1
Sinteza oligonukleotida
Oligonukleotidi (ONs) su sintetizirani pomoću sintetizera DNA Applied Biosystems 394 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Inc., Foster City, USA) i standardnom kemijom fosforamidita. Fosfortioatni spojevi uvedeni su nakon povezivanja sumporiranjem uz upotrebu Beaucage-ovog reagenta i zatim pakiranjem s acetanhidridom i N-metil-imidazolom. Nakon odcjepljenja s krute faze i zatim odstranjivanja zaštitnih skupina obradom s koncentriranim amonijakom, ONs su očišćeni elektroforezom na poliakril-amidnom gelu. Proizvedeni su 2'-O-metil-modificirani ONs, u kojima su standardni fosforamiditi u odgovarajućem ciklusu zamijenjeni s 2'-O-metilribonukleozid-fosforamiditom. Svi ONs su analizirani masenom spektroskopijom s elektrosprejem s negativnim ionima (Fisons Bio-Q), koja je u svim slučajevima potvrdila izračunatu masu. C16-modificirani Oligonukleotidi sintetizirani su upotrebom heksadeciloksi-(cijanoetoksi)-N,N-diizopropil-aminofosfana umjesto standardnog amidita kao reagenta za fosfitiliranje u posljednjem stupnju sinteze oligonukleotida ili počevši od odgovarajuće derivatizirane krute faze. Trietilenglikolni linker je komercijalno dostupan od tvrtke Glen Research Corporation. 2'-fosforamiditi adenozina i kordicepina dobiveni su od tvrtke Chem. Genes Corporation, odnosno Chemogen Corporation. Uvođenje 5'-fosfata ili tiofosfatnih ostataka izvršeno je ranije opisanim postupkom (Uhlmann i Engels (1986) Tetrahedron Lett. 27, 1023). PNA-DNA-himere proizvedene su postupkom koji je opisan u EP 0 672 677.
Oligonukleotidi su analizirani
a) analitičkom elektroforezom na gelu u 20%-tnom akrilamidu, 8M urea, 45 pM trisboratni pufer, pH 7,0 i/ili
b) HPLC analizom: stupac Waters GenPak FAX, gradijent CH3CM (400 ml), H2O (1,6 1), NaH2PO4 (3,1 g), NaCl (11,7 g), pH 6,8 (0,1M NaCl) zatim CH3CN (400 ml), H2O (1,6 1), NaH2PO4 (3,1 g), NaCl (17,53 g), pH 6,8 (1,5MNaCl) i/ili
c) kapilarnom elektroforezom upotrebom gel-kapilarnog stupca U100P, Beckmann eCAP™, duljine 65 cm, unutarnjeg primjera 100 mm, pri čemu se je okno nalazilo 15 od kraja, pufer 140 μM Tris, 360 mM borat, 7M urea i/ili
d) masenom spektrometrijom s elektrosprejem s negativnim ionima, koja je u svim slučajevima potvrdila očekivane masene vrijednosti.
Metode za analizu oligonukleotida prema a), b), c) i d) su stručnjaku poznate. Te metode su opisane na primjer u Schweitzer i Engels, "Analysis of oligonucleotides" (u "Antisense - from technology to therapy", Labor-Handbuch und Lehrbuch, Scnlingensiepen et al., izd. Biol. Science sv. 6 (1997) str. 78 - 103).
Proizvedeni su i ispitani slijedeći oligonukleotidi (vidi opis):
[image]
pri čemu
"*" predstavlja fosfortioatni internukleozidni most, i
FITC je fluorescentni marker.
ON1 do ON12 su ispitani u pogledu njihove učinkovitosti da inhibiraju proliferaciju REH stanica leukemije pokusom koji se je temeljio na stanicama. ON1, ON2, ON64-ON71 su komplementarni oligonukleotidi koji su usmjereni prema području translacijskog startnog područja eg5-mRNA. ON4 je s 5'-fluoresceinom obilježeni analog od ON1. ON3 je usporedbeni oligonukleotid.
Rezultati pokusa inhibicije proliferacije prikazani su na slici 1.
Primjer 2
Određivanje antiproliferacijske učinkovitosti eg5-komplentarnih oligonukleotida
REH stanice (humane stanice pre-B-leukemije, DSM ACC 22) odnosno A549 tumorske stanice uzgajane su u OptiMEM (Gibco BRL) s 10% fetalnog telećeg seruma (FCS, GIBCO-BRL) pri 37 °C s 5% CO2. Gustoća stanica za pokus bila je otprilike 1x106/ml. Oligonukleotidi (0,17 mM) su pomiješani sa Cellfectin-om (0,83 mg/ml; Gibco-BRL) da se tvorbom kompleksa poboljša prihvaćanje u stanicama. Kompleks oligonukleotid/Cellfectin je inkubiran sa stanicama u odsutnosti seruma u pločicama s 24 jamice. Kompleks oligonukleotid/Cellfectin je zatim odstranjen i dodan je serum, tako da je krajnja koncentracija bila 10%. Nakon 96 sati inkubacije pri 37°C s 5% CO2, gustoća stanica je izmjerena sa Casy 1 (tvrtke Scharfe). U tu svrhu stanice su u svakoj jamici dobro promiješane i odmah razrijeđene 1:100 sa Casyton-om. Srednje vrijednosti gustoće stanica određene su iz 3 pojedinačne jamice s istom koncentracijom oligonukleotida. Reazultati antiproliferacijskog učinka prikazani su na slici 1.
Tablica 1: Nukleotidna sekvenca humanog eg5 (SEQ ID NO. 20)
[image]
[image]
[image]
[image]
Tablica 2: SEQ ID NO. 21: Sekvenca P. falciparum
(djelomična sekvenca; Genbank, ID Z98551).
[image]
[image]
[image]
Tablica 3:
Homologija sekvenci: Usporedba humane sekvence eg5 sa sekvencom eg5 Plasmodium falciparum
[image]
[image]
Slika 1:
Ova slika prikazuje zbirno rezultate iz primjera 1 i 2.
Prikazan je učinak oligonukieotida ON1 do ON12 (eg5-komplementarni) na inhibiciju proliferacije REH stanica (u postocima).
■ 1. pokus,
♦ 2. pokus,
CF: usporedba sa Cellfectinom.

Claims (14)

1. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat, naznačen time, da odgovara dijelu sekvence koja kodira eg5.
2. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema zahtjevu 1, naznačen time, da on dogovara sekvenci od 8-100 nukleotida koja kodira eg5.
3. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema bilo kojem zahtjevu 1 ili 2, naznačen time, da ima duljinu 8 do 20 nukleotida.
4. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjevu 1 do 3, naznačen time, da odgovara dijelu sekvence koja kodira humani eg5 i/ili eg5 Plasmodium falciparum.
5. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjevu 1 do 4, naznačen time, da ima jednu od sekvenci SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 , SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 ili SEQ ID NO. 9, pri čemu SEQ ID NO. 1 je 5'-CGACGCCATGACGGAATTC-3' SEQ ID NO. 2 je 5'-AATGGTCTGCATCTCACCA-3' SEQ ID NO. 3 je 5'-GGCTGCGACGCCATGACGG-3' SEQ ID NO. 4 je 5'-ATGACGGAATTC-3' SEQ ID NO. 5 je 5'-CCATGACGGAAT-3' SEQ ID NO. 6 je 5'-ACGCCATGACGG-3' SEQ ID NO. 7 je 5'-GCGACGCCATGA-3' SEQ ID NO. 8 je 5'-GGCTGCGACGCC-3' i SEQ ID NO. 9 je 5'-TTGGCTGCGACG-3'.
6. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjevu 1 do 5, naznačen time, da oligonukieotid ima jednu ili više modifikacija, pri čemu se svaka modifikacija, u usporedbi s oligonukleotidom iz građenim iz prirodne DNA s jednakom sekvencom, nalazi na određenom fosfodiesterskom internukleozidnom mostu i/ili na određenoj skupini β-D-2'-dezoksiriboze i/ili na određenom položaju prirodne nukleozidne baze,
7. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjevu 1 do 6, naznačen time, da je 1 do 5 terminalnih nukleotidnih skupina na kraju 5' i/ili na kraju 3' oligonukleotida zaštićeno s modificiranim internukleozidnim mostovima koji se nalaze na kraju 5' i/ili na kraju 3' odgovarajućeg, odnosno odgovarajućih nukleozida.
8. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjevu 1 do 7, naznačen time, da je modoficiran najmanje jedan unutarnji pirimidinski nukleozid i/ili internukleozidni most koji se nalazi na kraju 5' i/ili na kraju 3' tog pirimidinskog nukleozida.
9. Komplementaran oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjevu 1 do 8, naznačen time, da je svaka modifikacija, neovisno o drugoj modifikaciji, odabrana između a) zamjene fosfodiesterskog mosta na kraju 3' i/ili kraju 5' nukleozida s modificiranim internukleozidnim mostom, b) zamjene fosfodiesterskog mosta na kraju 3' i/ili na kraju 5' nukleozida s defosfo mostom, c) zamjene šećer-fosfatnog ostatka u šećer-fosfatnoj strukturi s drugim ostatkom, d) zamjene β-D-2'-dezoksiribozne skupine s modificiranom šećernom skupinom, e) zamjene prirodne nukleozidne baze s modificiranom nukleozidnom bazom, f) povezivanja na molekulu koja utječe na svojstva oligonukleotida, g) povezivanja oligoadenilatne molekule povezane preko 2',5' ili njezinog derivata, prema potrebi preko prikladne molekule linkera, i h) uvođenja inverzije 3',3'-5',5' na kraju 3' i/ili na kraju 5' oligonukleotida.
10. Postupak za proizvodnju komplentarnog oligonukleotida ili njegovog derivata prema jednom ili više zahtjeva 1 do 9, naznačen time, da se na prikladan način zaštićen monomer kondenzira na krutoj fazi.
11. Upotreba komplentarnog oligonukleotida ili njegovog derivata prema jednom ili više zahtjeva 1 do 9, naznačena time, da se on koristi za inhibiciju ekspresije eg5.
12. Postupak za inhibiciju ekspresije eg5, naznačen time, da se komplentarni oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjeva 1 do 9 dovede u dodir s nukleinskom kiselinom koja kodira eg5 i veže se na nju.
13. Postupak za proizvodnju farmaceutskog pripravka, naznačen time, da se jedan ili više komplentarnih oligonukleotida ili njegovih derivata prema jednom ili više zahtjeva 1 do 9 pomiješa s fiziološki nedvojbenim nosačem i prema potrebi s dodatnim tvarima.
14. Farmaceutski pripravak, naznačen time, da sadrži najmanje jedan komplentarni oligonukleotid ili njegov derivat prema jednom ili više zahtjeva l do 9.
HR20020075A 1999-07-28 2002-01-25 Oligonucleotides for inhibiting the expression of human eg5 HRP20020075A2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19935303A DE19935303A1 (de) 1999-07-28 1999-07-28 Oligonukleotide zur Inhibierung der Expression von humanem eg5
PCT/EP2000/007345 WO2001007602A2 (de) 1999-07-28 2000-07-21 Oligonukleotide zur inhibierung der expression von humanem eg5

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HRP20020075A2 true HRP20020075A2 (en) 2005-10-31

Family

ID=7916259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HR20020075A HRP20020075A2 (en) 1999-07-28 2002-01-25 Oligonucleotides for inhibiting the expression of human eg5

Country Status (26)

Country Link
US (1) US6472521B1 (hr)
EP (1) EP1204742A2 (hr)
JP (1) JP2003505080A (hr)
KR (1) KR20020033744A (hr)
CN (1) CN1165617C (hr)
AR (1) AR024953A1 (hr)
AU (1) AU6568200A (hr)
BR (1) BR0013180A (hr)
CA (1) CA2380192A1 (hr)
CZ (1) CZ2002324A3 (hr)
DE (1) DE19935303A1 (hr)
EE (1) EE200200044A (hr)
HK (1) HK1048337B (hr)
HR (1) HRP20020075A2 (hr)
HU (1) HUP0202794A3 (hr)
IL (1) IL147541A0 (hr)
MX (1) MXPA02000817A (hr)
NO (1) NO20020365L (hr)
NZ (1) NZ516839A (hr)
PL (1) PL353733A1 (hr)
RU (1) RU2249458C2 (hr)
SK (1) SK1162002A3 (hr)
TR (1) TR200200201T2 (hr)
WO (1) WO2001007602A2 (hr)
YU (1) YU91901A (hr)
ZA (1) ZA200200655B (hr)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6617115B1 (en) * 1999-10-27 2003-09-09 Cytokinetics, Inc. Methods of screening for modulators of cell proliferation
US6440686B1 (en) 2000-06-15 2002-08-27 Cytokinetics, Inc. Methods for screening and therapeutic applications of kinesin modulators
US6809102B2 (en) 2001-03-29 2004-10-26 Bristol-Myers Squibb Company Cyano-substituted dihydropyrimidine compounds and their use to treat diseases
US6900214B2 (en) 2001-03-29 2005-05-31 Bristol-Myers Squibb Company Cyano-substituted dihydropyrimidine compounds and their use to treat diseases
US20040009156A1 (en) * 2001-10-12 2004-01-15 Christoph Reinhard Antisense therapy using oligonucleotides that target human kinesin genes for treatment of cancer
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7163927B2 (en) * 2002-05-23 2007-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
WO2004074301A2 (en) * 2003-02-14 2004-09-02 Smithkline Beecham Corporation Differentially expressed nucleic acids that correlate with ksp expression
US7662581B1 (en) 2003-12-18 2010-02-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Eg5 co-crystals
EP1737979B9 (en) * 2004-03-23 2011-09-21 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosing non-small cell lung cancer
US7700567B2 (en) 2005-09-29 2010-04-20 Supergen, Inc. Oligonucleotide analogues incorporating 5-aza-cytosine therein
KR101462874B1 (ko) * 2006-03-31 2014-11-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｅｇ5 유전자의 발현을 억제하는 이본쇄 리보핵산
RU2464030C2 (ru) * 2006-05-26 2012-10-20 Регадо Байосайенсиз, Инк. Введение противосвертывающей системы reg1
CN101453891B (zh) * 2006-05-26 2013-12-11 雷加多生物科学公司 Reg1抗凝系统的给药
ES2530215T3 (es) * 2007-11-06 2015-02-27 Adiutide Pharmaceuticals Gmbh Análogos de oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen restos de oligofosfato modificados
DE102010007562A1 (de) 2010-02-10 2011-08-11 sterna biologicals GmbH & Co KG, 35043 Dermatologische, pharmazeutische Zusammensetzung geeignet für Oligonukleotide
PH12018501678B1 (en) 2011-08-30 2022-08-10 Astex Pharmaceuticals Inc Decitabine derivative formulations
US9498540B2 (en) 2013-03-15 2016-11-22 Novartis Ag Cell proliferation inhibitors and conjugates thereof
SG10201801507RA (en) 2013-05-01 2018-03-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
RU2712559C9 (ru) * 2013-08-28 2020-10-08 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Модуляция экспрессии прекалликреина (пкк)
AU2014331652B2 (en) * 2013-10-11 2020-05-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating C9ORF72 expression
KR102369736B1 (ko) * 2014-05-01 2022-03-02 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 보체 인자 b 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
MX2018000016A (es) 2015-07-02 2019-01-31 Otsuka Pharma Co Ltd Composiciones farmaceuticas liofilizadas.
JP2020529409A (ja) 2017-08-03 2020-10-08 大塚製薬株式会社 薬物化合物およびその精製方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0171066A3 (de) 1984-08-09 1989-02-01 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren und Schaltungsanordnung zum Adressieren von Signalabgabe-/Signalaufnahmeeinrichtungen von einer zentralen Verarbeitungseinrichtung her
ES2099718T3 (es) 1990-07-02 1997-06-01 Hoechst Ag Analogos de oligonucleotidos con uniones internucleotidicas de 3'-3' o 5'-5' terminales.
US6033909A (en) 1992-01-22 2000-03-07 Hoechst Aktiengesellschaft Oligonucleotide analogs, their preparation and use
NZ245720A (en) 1992-01-22 1995-12-21 Hoechst Ag Oligonucleotide analogues; use as gene expression inhibitor or dna probe
ATE151773T1 (de) 1992-09-24 1997-05-15 Hoechst Ag Oligoribonucleotid- und ribozym-analoga mit terminalen 3'-3'-bzw.5'-5'-verknüpfungen
GB9311113D0 (en) * 1993-05-28 1993-07-14 Medical Res Council Probes
DE4321946A1 (de) 1993-07-01 1995-01-12 Hoechst Ag Methylphosphonsäureester, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
DE4338704A1 (de) 1993-11-12 1995-05-18 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung
DE4408528A1 (de) 1994-03-14 1995-09-28 Hoechst Ag Peptid-Oligonucleotid-Derivate, deren Herstellung und Verwendung
DE4415370A1 (de) 1994-05-02 1995-11-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE4438918A1 (de) 1994-11-04 1996-05-09 Hoechst Ag Modifizierte Oligonukleotide, deren Herstellung sowie deren Verwendung
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
ES2165446T3 (es) 1995-03-13 2002-03-16 Aventis Pharma Gmbh Fosfonomonoester-acidos nucleicos, procedimiento para su preparacion y su utilizacion.
US6309821B1 (en) * 1996-05-16 2001-10-30 Incyte Genomics, Inc. DNA encoding a PAC10 human homolog
WO1999005278A1 (en) * 1997-07-23 1999-02-04 Brigham & Women's Hospital, Inc. Lens epithelial cell derived growth factor
WO1999038972A2 (en) * 1998-01-28 1999-08-05 Chiron Corporation Human genes and gene expression products ii

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA02000817A (es) 2002-07-30
KR20020033744A (ko) 2002-05-07
YU91901A (sh) 2003-02-28
NO20020365D0 (no) 2002-01-23
CN1367828A (zh) 2002-09-04
EE200200044A (et) 2003-06-16
HUP0202794A3 (en) 2006-03-28
US6472521B1 (en) 2002-10-29
CA2380192A1 (en) 2001-02-01
TR200200201T2 (tr) 2002-05-21
NO20020365L (no) 2002-03-25
ZA200200655B (en) 2003-09-23
CZ2002324A3 (cs) 2002-05-15
JP2003505080A (ja) 2003-02-12
WO2001007602A3 (de) 2001-05-17
PL353733A1 (en) 2003-12-01
CN1165617C (zh) 2004-09-08
RU2249458C2 (ru) 2005-04-10
HK1048337B (zh) 2005-02-25
WO2001007602A2 (de) 2001-02-01
DE19935303A1 (de) 2001-02-08
HK1048337A1 (en) 2003-03-28
EP1204742A2 (de) 2002-05-15
HUP0202794A2 (en) 2003-03-28
IL147541A0 (en) 2002-08-14
BR0013180A (pt) 2002-04-09
AU6568200A (en) 2001-02-13
SK1162002A3 (en) 2002-06-04
NZ516839A (en) 2004-04-30
AR024953A1 (es) 2002-10-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HRP20020075A2 (en) Oligonucleotides for inhibiting the expression of human eg5
JP4643906B2 (ja) 遺伝子発現の標的化阻害のための合成二本鎖オリゴヌクレオチド
EP2850190B1 (en) Compositions and methods for modulating mecp2 expression
EP2850186B1 (en) Compositions and methods for modulating smn gene family expression
AU711792B2 (en) G cap-stabilized oligonucleotides
US20010021772A1 (en) Short oligonucleotides for the inhibition of vegf expression
JP2015523853A (ja) Ａｔｐ２ａ２発現を調節するための組成物及び方法
AU765928B2 (en) Antisense modulation of transforming growth factor-beta expression
JP2003505517A (ja) 接合体ならびにそれらの製造方法および生体膜を横切り分子を輸送するためのそれらの使用
JP2001523451A (ja) 白斑治療のためのテナシンアンチセンスオリゴヌクレオチド
KR20010072312A (ko) Ｖｅｇｆ 발현의 억제를 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드
JP4690649B2 (ja) 標的化された遺伝子発現阻害のための新規なオリゴリボヌクレオチド誘導体
CZ2001454A3 (cs) Krátké oligonukleotidy pro inhibici exprese VEGF, způsob jejich přípravy a jejich použití
MXPA01000908A (en) Short oligonucleotides for the inhibition of vegf expression
MXPA01000910A (en) Antisense oligonucleotides for the inhibition of vegf expression
CZ2001419A3 (cs) Oligonukleotidy pro inhibici exprese VEGF, způsob jejich přípravy a jejich použití

Legal Events

Date Code Title Description
A1OB Publication of a patent application
PNAN Change of the applicant name, address/residence

Owner name: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH, DE

OBST Application withdrawn