MXPA02000817A - Oligonucleotidos oara la inhibicion de la expresion de eg5 humana. - Google Patents

Oligonucleotidos oara la inhibicion de la expresion de eg5 humana.

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Abstract

La invencion se refiere a un oligonucleotido o uno de sus derivados que esta caracterizado por una secuencia que corresponde a una secuencia de nucleotidos que codifica una parte definida de la eg5 humana o una forma mutante de la misma. La invencion ademas se refiere a un metodo para producir dicho oligonucleofido y a su uso.

Description

OLIGONUCLEÓTIDOS PARA LA INHIBICIÓN DE LA EXPRESIÓN DE EG5 HU MANA DESCRIPCIÓN 5 La presente invención se refiere a un oligonucleótido derivados del mismo, el cual tiene una secuencia que corresponde a una parte particular de una secuencia de ácido nucleico, la cual codifica eg5 humana o una forma mutante de la misma, y la invención además se 10 refiere a un método para hacer el oligonucleótido y el uso del mismo. Durante la mitosis, un aparato de red basado en microtúbulos ayuda a distribuir los cromosomas duplicados igualmente a las células hijas. Las proteínas de motor relacionadas con cinesina son parte de unas fuerzas que se requieren para el ensamble de red y 15 segregación de cromosomas. La formación de una red mitótica bipolar involucra a la actividad de muchas diferentes proteínas de motor. Una proteína de motor relacionada con cinesina humana es eg5 humana, la cual interactúa con los centrosomas mitóticos y se ha mostrado que es esencial para la formación de red bipolar (Blangy y 20 otros, Cell (1995) 83, 1 159). La microinyección de anticuerpos anti- eg5-humana específicos bloquear la migración de centrosomas y hace que las células detengan la mitosis. Otra posibilidad para bloquear formación de red bipolar puede ser la inhibición de la expresión de eg5. Una forma para inhibir 25 específicamente la expresión de eg5 es a través del uso de oligonucleótidos antisentido, los cuales pueden ser modificados opcionalmente con el fin de mejorar sus propiedades (E. Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990); S. Agrawal, TI BTECH 1996, 376). Los oligonucleótidos antisentido se cree que se unen a secuencias específicas del ARNm, dando como resultado la degradación del ARNm y/o inhibición de síntesis de proteínas. La presente invención proporciona un oligonucleótido o un derivado del mismo, el cual corresponde a una parte de la secuencia que codifica eg5, preferiblemente eg5 humana o una eg5 de un organismo patógeno, por ejemplo, Plasmodium falciparum (malaria). El oligonucleótido preferiblemente corresponde a 8 a 100 nucleótidos, en particular de 8 a 20 nucleótidos de la secuencia de eg5. El oligonucleótido o derivado del mismo se une a dicha secuencia e inhibe la formación de la proteina eg5. La secuencia de eg5 humana ha sido reportada (Blangy y otros, Cell (1995) 83, 1 159). La SEC ID NO. : 20 proporciona un ejemplo para una secuencia que codifica eg5 humana. SEC ID NO. : 21 proporciona un ejemplo para la secuencia de eg5 de Plasmodium falciparum. Preferiblemente, el oligonucleótido tiene una secuencia que corresponde a una parte de un ácido nucleico que codifica eg5 humana o eg5 de Plasmodium falciparum. La frase "que corresponde a" significa que la secuencia base del oligonucleótido es complementaria a una parte de una secuencia de ácido nucleico que codifica eg5 (por ejemplo, gen, ADNc, ARNm) y, por lo tanto, permite que el oligonucleótido hibridice a (se una a) esa "parte sentido" de la . . . . ^ . i t .i.Á****. -. - . . » . '. » Jts^SßJ eg5 que codifica el ácido nucleico. Este es el por qué se denomina "oligonucleótido antisentido". Por lo tanto, en una mortalidad preferida de la invención, el oligonucleótido es un oligonucleótido antisentido. En otra mortalidad preferida de la invención el 5 oligonucleótido es una ribozima. Una ribozima es un ácido nucleico catalítico, el cual divide al ARNm. Preferiblemente, la ribozima se selecciona del grupo que consiste de ribozima de cabeza de martillo (Vaish y otros, Nucleic Acids Res. (1998) 26, 5237). Un oligonucleótido de acuerdo con la invención se une a una 10 parte del ARNm del eg5, que es apropiado para la hibridación e inhibe la formación de la proteína eg5. Los oligonucleótidos que son apropiados para unirse al ARNm de eg5 e inhibe la expresión, son, por ejemplo, dirigidos contra la región iniciadora de traducción de eg5. 15 La parte de la eg5 que codifica la secuencia de ácido nucleico que corresponde a al oligonucleótido tiene una longitud de 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos y, preferiblemente, el oligonucleótido corresponde a una longitud de 12 en nucleótidos o 19 nucleótidos de una eg5 que codifica la secuencia. 20 Por lo tanto, un oligonucleótido de acuerdo con la invención tiene una longitud de 10 (10mer), 1 1 (11 mer), 12 (12mer) , 13 (13mer), 14 (14mer), 15 (15mer) , 16 (16mer), 17 (17mer), 18 (18mer) o 19 (19mer) nucleótidos. En una mortalidad preferida de la invención, el oligonucleótido 25 tiene una longitud de 12 o 19 nucleótidos; tales oligonucleótidos • -" — aAlfatwtr*- . .« - . . . .. , ,, , - . -. ¿?á ?sÉ» deben tener, por ejemplo, una de las secuencias SEC ID NO. 1 , SEC I D NO. 2 , SEC I D NO. 3 , SEC I D NO. 4, SEC I D NO . 5, SEC I D NO. 6, SEC I D NO. 7, SEC I D NO. 8 , SEC I D NO. 9 o una parte de las mismas, en donde: SEC ID NO. 1: 3-OTTAAGGCAGTACCGCAGC-5'; 5'CGACGCCATGACGGAATTC-3' SEC ID NO. 2: 3'-ACCACTCTACGTCTGGTAA-5; 5'-AATGGTCTGCATCTCACCA-3' SEC ID NO. 3: 3'-GGCAGTACCGCAGCGTCGG-5; 5'-GGCTGCGACGCCATGACGG-3' SEC ID NO. 4: 3'-CTTAAGGCAGTA-5; 5'-ATGACGGAATTC-3' SEC ID NO. 5: 3'-TAAGGCAGTACC-5; 5'-CCATGACGGAAT-3' SEC ID NO. 6: S'-GGCAGTACCGCA-S*; S'-ACGCCATGACGG-S1 SEC ID NO. 7: 3'-AGTACCGCAGCG-5'; 5'-GCGACGCCATGA-3' SEC ID NO. 8: 3'-CCGCAGCGTCGG-5'; d'-GGCTGCGACGCC-S' SEC ID NO. 9: 3'-GCAGCGTCGGTT-5'; 5'-TTGGCTGCGACG-3'.
Muy particular y preferiblemente, el oligonucleótido es modificado con el fin de mejorar sus propiedades, por ejemplo, con el fin de incrementar su resistencia a nucleasas o hacer que éste sea resistente a nucleasas, para mejorar su afinidad de unión a una eg5 complementaria que codifica un ácido nucleico, por ejemplo, ARNm, o con el fin de incrementar su eliminación celular. Por lo tanto, la presente invención preferiblemente se refiere a un oligonucleótido que tiene una secuencia particular cómo se presentó anteriormente y el cual tenga además una o más modificaciones químicas en comparación con un ADN "natural", el cual está compuesto de la desoxiadenosina de nucleósidos "naturales" (adenina + ß-D-2'-desoxiribosa), desoxiguanosina (guanina + ß-D-2'-desoxiribosa), desoxicitidina (citosina + ß-D-2'-desoxiribosa) y tiamidina (tiamina + ß-D-2'-desoxiribosa) en las a través de fuentes de internucleósido de fosfodiéster. Los nucleótidos pueden tener uno o más modificaciones del mismo tipo y/modificaciones de un tipo diferente; carácter de modificación se puede selecciona independientemente de los otros tipos de modificaciones conocidos modificar oligonucleótidos. La invención también se refiere a derivadas de los oligonucleótidos, por ejemplo, sus sales, en particular su sales fisiológicamente toleradas. La sales y las sales fisiológicamente toleradas se describen en, por ejemplo, Remingtons Pharmaceuticals Science (1985) Mack Publishing Company, Easton, PA (pág . 1418). Los derivadas también se refieren a oligonucleótidos modificados, los describen en una o más modificaciones (por ejemplo, en posiciones particulares del nucleótido y/o en puentes particulares del internucleósido, análogos del oligonucleótido (por ejemplo, poliamida-ácidos nucleicos (PNAs), ácidos nucleicos de fosfomonoéster (PHONAs=PMENAs), quimeras de oligonucleótidos (por ejemplo, que consiste de un ADN y una parte de PNA o que consiste en deuda ADN y un PHONA)). Los derivadas también se refieren a oligonucleótidos que corresponden a alelos y/formas mutantes de una egd normal o natural, por ejemplo, alelos y/o mutantes de egd humana (por ejemplo, con respecto a SEC I D NO. 20) mi alelos y/o mutantes de eg5 de Plasmodium falciparum (por ejemplo, con respecto a SEC ID NO. 21). Aquellos expertos en la técnica conocen ejemplos de modificaciones químicas y se describen en, por ejemplo, Uhlmann y A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 y "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993 y S.T. Crooke, F. Bennet, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 (1996) 107-129; Hunziker y C. Leuman (1995) Mod. Synt. Methods, 7, 331-417. Por ejemplo, en comparación al ADN natural, un puente de internucleósido de fosfodiéster, una unidad de ß-D-2'-desoxiribosa y/o una base de nucleósidos natural (adenina, guanina, citosina, tiamina) puede ser modificado o reemplazado, respectivamente. Un oligonucleótido de acuerdo con la invención puede tener una o más modificaciones, en donde cada modificación está ubicada en un puente de internucleósido de fosfodiéster particular y/o en una unidad particular ß-D-2'-desoxiribosa y/o en una posición particular de bases de nucleósidos natural en comparación con un oligonucleótido de la misma secuencias que está compuesto de ADN natural. Por ejemplo, la invención se refiere a un oligonucleótido que comprende una o más modificaciones, y en donde cada modificación se selecciona independientemente de: a) el reemplazo de un puente de internucleósido de 1 t f » M&&&*& fosfodiéster localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósidos o a través de un puente de internucleósido modificados, b) el reemplazo de un puente de fosfodiéster localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósidos a través de un puente de 5 fosfono, c) el reemplazo de una unidad de fosfato de azúcar a partir de la estructura de base de fosfato de azúcar por otra unidad, d) el reemplazo de una unidad de ß-D-2'-desoxiribosa por una unidad de azúcar modificada, 10 e) el reemplazo de una base de nucleósidos natural por una base de nucleósidos modificada, f) la conjugación a una molécula que tiene influencia en las propiedades del oligonucleótido, g) la conjugación a un oligoadenilato enlazado a 2'5' o un 5 derivado del mismo, opcionalmente a través de un enlazador apropiado, y h) la introducción de una inversión 3'-3" y/o 5'-5' en el extremo 3' y/o 5' del oligonucleótido. Ejemplos más detallados a la modificación química de un 0 oligonucleótidos son: a) el reemplazo de un puente de internucleósido de fosfodiéster localizado en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósidos a través de un puente de internucleósido modificados, en donde el puente de internucleósido modificado por ejemplo, se selecciona de 5 fosforotiato, fosforoditioato, N R1 R1 '-fosforamidato, boranofosfato, na. - .* - j...— . ... . . fosfato-(C?-C2?)-O-alquiléster, fosfato-[(C6-C?2)-aril-(d-C2?)-O-alquiljéster, (Ct-CßJ-alquilo-fosfonato y/o (C6-C?2)arilfosfonato como puentes y (C7-C?2)---hidroximetil-arilo (por ejemplo, descrito en WO 95/01363), en donde (C6-C?2)-arilo, (C6-C20)-arilo y (C6-C14)-arilo están opcionalmente sustituidos por halógeno, alquilo, alcoxi, nitro o ciano, y en donde R1 y R1' son, independientemente de un modelo, hidrógeno, alquilo de 1 a 18 de átomos de carbono, arilo de 6 a 20 átomos de carbono, arilo de 6 a 14 átomos de carbono-alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, preferiblemente hidrógeno, alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, preferiblemente alquilo de 1 a 4 átomos de carbono y/o metoxietil, o R1 y R1 forman, junto al átomo de nitrógeno que los lleva, un anillo heterocíclico de 56 miembros, el cual además puede contener un átomo heterogéneo adicional del grupo O, S y N, b) el reemplazo de un puente de fosfodiéster localizado en ei extremo 3' y/o 5' de un nucleósidos a través de un puente defosfo (los puentes de defosfo se describen en, por ejemplo, Uhlmann y A. Peyman, "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, 1993, Capítulo 16, 355ff), en donde un puente defosfo es, por ejemplo, formacetal, 3'-tioformacetal, metilhidroxilamina, oxima, metilenodimetilhidrazo, dimetilenosulfona y/o un grupo sililo; c) el reemplazo de una unidad de fosfato de azúcar (ß-D-2'- desoxiribosa y puente de internucleósido de fosfodiéster juntos forman una unidad de fosfato de azúcar) de la estructura de base del fosfato de azúcar (la estructura de base de fosfato de azúcar está compuesta de unidades de fosfato de azúcar) por otra unidad, en donde la otra unidad es, por ejemplo, adecuada para formar: un oligómero de "derivado de morfolino" (como se describió en, por ejemplo E. P. Stirchak y otros, Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129), es decir el reemplazo por una unidad de derivado de morfolino; - una poliamida-ácido nucleico ("PNA") (como se describe en, por ejemplo P. E. Nielsen y otros, Bioconj. Chem. 5 (1994) 3 y en EP 0672677 A2); es decir, por ejemplo, que el reemplazo por una unidad de estructura de base de PNA, por ejemplo, a través de 2-aminoetilgiicina; - un ácido nucleico de monoéster de ácido fosfónico ("PHONA") (como se describe en, por ejemplo, Peyman y otros, Agew. Chem. Int. Ed. Engl. 75 (1996) 2632-2638 y en EP 0739898 A2); es decir, por ejemplo el reemplazo de una unidad de estructura de base de PHONA; d) el reemplazo de una unidad ß-D-2'-desoxiribosa a través de una unidad de azúcar modificada, en donde la unidad de azúcar modificada se selecciona por ejemplo de ß-D-ribosa, a-D-2'-desoxiribosa, L-2'-desoxiribosa, 2'-F-2'-desoxiribosa, 2'-O-(C1 -C6)-alquilribosa, el preferido 2'-O-(C 1 -C6)-alquilribosa siendo 2'-O-metilribosa, 2'-O-(C2-C6)-alquenilribosa, 2'-[O-(C1 -C6)-alquil-O-(C1 - • -J ^ *-*»— — C6)-alquil]ribosa, 2'-NH2-2'-desoxir¡bosa, ß-D-xilo-furanosa, a- arabinofuranosa, 2 ,4-dideoxi-ß-D-eritro-hexo-piranosa y carbocíclico (como se describe en, por ejemplo por ejemplo, Froehler, J. Am. Chem. Soc. 1 14 (1992) 8320) y/o análogos de azúcar de cadena 5 abierta (como se describe en, por ejemplo, Vandendriessche y otros, Tetrahedron 49 (1993) 7223) y/o análogos de bicicloazucar (como se describe en, por ejemplo, M. Tarkov y otros, Helv. Chim . Acta 76 481 ); e) el reemplazo de una base de nucleósido natural por una 10 base de nucleósido modificada, en donde la base de nucleósidos modificado a, por ejemplo, se selecciona de uracilo, hipoxantina, 5- (hidroximetil)uracilo, N2-dimetilguanosina, pseudouracilo, 5- (hidroximetil)uracilo, d-clorocistosina, d-bromouracilo, d- bromocistosina, 2,4-diaminopurina, 8-azapurina, una 7-deazapurina 15 sustituida, preferiblemente purina 7-deaza-J-substituida y/o 7-deaza- 8-substituida hubo otras modificaciones de bases de nucleósidos natural, (las bases de nucleósidos modificadas, por ejemplo, se describen en EP 0 710 667 A2 y EP 0 680 969 A2); f) la conjugación a una molecular que tiene influencia en las 20 propiedades del oligonucleótido, en donde la conjugación del oligonucleótido aún no más moléculas que (favorablemente) tienen influencia en las propiedades de los oligonucleótidos (por ejemplo, la habilidad del oligonucleótido para penetrar la membrana de célula o para entrar a unas célula, la estabilidad hacia nucleasas, la afinidad 25 para una secuencia u objetivo que codifica egd, la farmacocinética de oligonucleótido, la habilidad de un oligonucleótido/ribozima antisentido o una molécula con jugada al oligonucleótido respectivamente para atacar la secuencia u objetivo que codifica egd, por ejemplo, la habilidad para unirse a y/o entrelazarse a, cuando el 5 oligonucleótido hibridice a con la secuencia u objetivo que codifica egd), en donde los ejemplos para moléculas que pueden ser con jugada a un oligonucleótido son polilisina, a clientes de intercalación tales como pireno, acridina, fenazina o fenantridina, agentes fluorescentes tales como fluoresceína, agentes de entrelazamiento 10 tales como psoralén o acidoproflavin, moléculas lipofílicas tales como alquil o de 12 a 20 átomo de carbono, lípidos tales como 1 ,2- dihexadecil-rac-glicerol, esteroides tales como colesterol o testosterona, vitaminas tales como vitamina E, poli u oligoetilenglicol, preferiblemente enlazado al oligonucleótido a través de un grupo 15 fosfato (por ejemplo, fosfato de trietilenglicol, fosfato de hexaetilenglicol), (C?2-C18)-alquil fosfato diésteres y/o O-CH2- CH(OH)-O-(C?2-C?8)alquilo, estas moléculas pueden ser con jugadas en el extremo 5' y/o el extremo 3' y/o dentro de la secuencia, por ejemplo, a una base de nucleósidos con el fin de generar un 20 conjugado de oligonucleótido; los procedimientos para preparar un conjugado re oligonucleótido son conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Uhlmann, E. & Peyman, A. , Chem. Rev. 90 (1990) 543, M. Manoharan en "Antisense Research and Applications", Crooke y Lebleu, Eds. , CRC Press, Boca Ratón, 25 1993, Capítulo 17, p. 303ff y EP-A 0 5d2 766; üáu n M iiiÜiMiBMÉtr lÉr"» U * *•& ' •-- *. *— —fe-- g) la conjugación a un oligoadenilato 2'5'-enlazado , preferiblemente a través de una molécula enlazadora apropiada, en donde el oligoadenilato 2'd'-enlazado por ejemplo, se selecciona de triadenilato 2'd'-enlazado, tetraadenilato 2'd'-enlazado, pentaadenilato 2'5'-enlazado, hexaadenilato 2'5'-enlazado o moléculas heptaadenilato 2 '5'-enlazado y derivados de los mismos , en donde un derivado de oligoadenilato 2'd'-enlazado es, por ejemplo, Cordicepin (3'-desoxiadenilato 2'd'-enlazado) , y en donde una ejemplo para un enlazador apropiado es trietilenglicol, y en donde el extremo 5' dei oligoadenilato 2'd'-enlazado debe llevar un residuo fosfato, difosfato o trifosfato, en donde uno o más átomos de oxígeno pueden ser reemplazados, por ejemplo, por átomos de azufre, en donde se prefiere la sustitución a través de un residuo de fosfato o tiofosfato; y h) la introducción de una inversión de 3'-3' y/o d'-d' al extremo 3' y/o d' del oligonucleótido, en donde este tipo de modificación qu ímica es conocida por aquellos expertos en la técnica y se describe en, por ejemplo, M . Koga y otros, J . Org . Chem . d6 (1991 ) 3767, EP 0 464 638 y EP 0 693 901 . El reemplazo de una unidad de fosfato a su gran a partir de la estructura de bases de fosfato de azúcar por otra unidad , la cual puede ser, por ejemplo, una un idad de estructura de base de PNA o una unidad de estructura de base de PHONA, preferiblemente es el reemplazo de un nucleótido porque, por ejemplo, una unidad PNA o una unidad PHONA, que ya comprende bases de nucleósidos irúlßt^?l ***" naturales y/o bases de nucleósidos modificadas, por ejemplo, una de las bases de nucleósidos modificadas del grupo de uracilo , hipoxiantina, d-(hidroxi-metil)uracilo, N2-dimetilguanosina. pseudouracilo, d-(hidroximetil)uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, dihidrouracilo, d-fluorouracilo, d-fluorocitosina, d-clorouracilo. d- clorocitosina, d-bromouracilo, d-bromocitosina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, una 7-deazapurina substituida, preferiblemente purina 7-deaza-7-substituida y/o purina 7-deaza-8-substituida, hubo otras modificaciones de una base de nucleósidos natural (las bases de nucleósidos modificadas se describen, por ejemplo, en EP 0 710 667 A2 y EP 0 680 969 A2). Las modificaciones de oligonucleótido descritas en EP 0 710 667 A2 , EP 0 680 969 A2, EP 0 464 638, EP 0 693 901 , WO 96/01363, EP 0 672 677 A2, EP 0 739 898 A2 y EP 0 dd2 766 se incorporan aquí por referencia. En una modalidad especial de la invención, se modifican uno o más o antes de internucleósido de fosfodiéster dentro de la secuencia de oligonucleótido; preferiblemente uno o más puentes de internucleósido de fosfodiéster son reemplazados por puentes de internucleósido de fosforotioato y/o puentes de internucleósido de (Cß-C12)arilfosfonato, preferiblemente a través de puentes a- hidroxibencil fosfonato en donde el grupo bencilo preferentemente está sustituido, por ejemplo, con nitro, metilo, halógeno. En un oligonucleótido todo de fosforotioato, todos los puentes de internucleósido de fosfodiéster son modificados por fosforotioato. • • *>*<- > « Preferiblemente, la invención se refiere a un oligonucleótido en donde no todos los puentes de internucleósido de fosfodiéster son modificados uniformemente con fosforotioato (puentes de internucleósido de fosforotioato). Preferiblemente, por lo menos un puente de internucleósido tiene un tipo diferente de modificación o no está modificado. En particular, la invención se refiere a un oligonucleótido que comprende además por lo menos otro tipo de modificación. En otra modalidad especial de la invención, se modifican uno o más nucleósidos (ß-D-2'-desoxiribosa y/o base de nucleósidos) dentro de la secuencia de oligonucleótido; preferiblemente, la ß-D-2'-desoxiribosa está substituida por 2'-O-(C?-C6)alquilribosa, preferiblemente por 2'-O-metilribosa y/o la base del nucleósido está substituida por 8-azapurina, purina 7-deaza-7-substituida y/o purina 7-deaza-8-substituida (purina: adenina, guanina). Preferiblemente, la invención se refiere a un oligonucleótido en donde no todos los nucleósidos están modificados uniformemente. De preferencia, la invención se refiere a un oligonucleótido que comprende además por lo menos otro tipo de modificación. En otra modalidad especial de la invención, una o más unidades de fosfato de azúcar de la estructura de base de fosfato de azúcar son reemplazados por unidades de estructura de base de PNA, preferiblemente por unidades 2-aminoetilglicina. De preferencia, las unidades de fosfato de azúcar, las cuales son reemplazadas, están conectadas conjuntamente por lo menos a cierto grado. De preferencia, la invención se refiere a un oligonucleótido en donde no todas las unidades de fosfato de azúcar están uniformemente reemplazadas. En particular, la invención se refiere a oligonucleótidos quiméricos, por ejemplo, compuestos de una o más partes de PNA y una o más partes de ADN . Para tales oligonucleótidos quiméricos, por ejemplo, son posibles los siguientes ejemplos no limitantes de modificación: ADN-PNA, PNA-ADN, ADN-PNA-ADN , PNA-ADN-PNA, ADN-PNA-ADN-PNA, PNA-ADN-PNA-ADN . Los patrones comparables pueden ser posibles para moléculas quiméricos compuestas de partes de ADN y partes de PHONA, por ejemplo, ADN-PHONA, PHONA-ADN , ADN-PHONA-ADN , PHONA-ADN-PHONA, ADN-PHONA-ADN-PHONA, PHONA-ADN-PHONA-ADN . Además, por supuesto, son posibles las moléculas quiméricos las que comprende en tres partes diferentes como parte(s) de ADN , parte(s) de PHONA, y parte(s) de PNA. Preferiblemente, la invención se refiere a un oligonucleótido que comprende además por lo menos un tipo de modificación. En otra modalidad especial de la invención, el oligonucleótido está conectado en su extremo 3' y/o en su extremo 5' a un residuo alquilo de 12 a 18 átomos de carbono, preferiblemente un residuo de alquilo de 16 átomos de carbono, un residuo de trietilenglicol o un residuo de hexaetilenglicol, estos residuos preferiblemente están conectados al oligonucleótido a través de un grupo fosfato. Preferiblemente, la invención se refiere a un oligonucleótido en donde ninguno de los extremos (extremo 3' y d') están ...... i. i . , ajaj^tá ^T (uniformemente) modificados. De preferencia, la invención se refiere a un oligonucleótido que comprende además por lo menos otro tipo de modificación . En una modalidad preferida de la invención, solamente se 5 modifican posiciones particulares dentro de una secuencia de oligonucleótido (por ejemplo, oligonucleótido parcialmente modificados). Los oligonucleótidos parcialmente modificados también son denominados como oligonucleótidos modificados mínimos, en algunos documentos. Dentro de la secuencia, una 10 modificación puede ser localizada en posiciones particulares (en nucleótidos particulares, en nucleósidos particulares, envases de nucleósidos particulares, en puentes de internucleósido particulares). En una modalidad particular de la invención, se prepara un oligonucleótido parcialmente modificados solamente reemplazando 15 algunos de los puentes de fosfodiéster con puentes de internucleósido modificados, por ejemplo, puentes de fosforotioato y/o puentes de a-fosfonato. En particular, la invención comprende tales oligonucleótidos que son solamente modificados a cierto grado. En particular, la invención se refiere a un oligonucleótido, en 20 donde de uno a cinco unidades de nucleótidos terminales en el extremo d' y/o en el extremo 3' son protegidas modificando puentes de internucleósido localizados en el extremo 5' y/o 3' del nucleósido correspondiente, preferiblemente en a través del reemplazados de los puentes de internucleósido de fosfodiéster por puentes de 25 fosforotioato y/o puentes de a-hidroxibencil fosfonato. Muy particular y preferiblemente, las uno a cinco unidades de nucleótido terminales en el extremo 3' del oligonucleótido están protegidas por puentes de internucleósido modificados localizados en el extremo 5' y/o 3' de los nucleósidos correspondientes, óptimamente, las uno a cinco unidades de nucleótidos terminales en el extremo d' del oligonucleótido además son protegidas por puentes de internucleósido modificados localizados en el extremo d' y/o 3' del nucleósido correspondiente. Opcionalmente, el oligonucleótido puede comprender modificaciones adicionales en otras posiciones. Además, la invención se refiere a un oligonucleótido, en donde por lo menos un puente de nucleósido y/o internucleósido de pirimidina interno localizado en el extremo d' y/o el extremo 3' de este nucleósidos de pirimidina (un nucleósido con una base de pirimidina como citosina, uracilo, tiamina) es modificado, preferiblemente a través del reemplazados del puente(s) de internucleósido de fosfodiéster a través de (a) puentes de fosforotioato y/o puentes de a-hidroxibencil fosfonato. En una modalidad preferida de la invención, las uno a cinco terminales de nucleótidos terminales en el extremo d' y/o en el extremo 3' del oligonucleótido son protegidas modificando puentes de internucleósido localizados en el extremo d' y/o el extremo 3' del nucleósido correspondiente, y en donde además por lo menos un nucleósidos de pirimidina interna y/o un puente de internucleósido localizado en el extremo 5' de este nucleósido de pirimidina y/o localizado en el extremo 3' de este nucleósido de pirimidina es **. modificado. El principio de los oligonucleótidos parcialmente modificados se describe en, por ejemplo, A. Peyman, E. Uhlmann, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, 377 (1996) 67-70 y en EP 0 6d3 439. Estos 5 documentos se incorporan aquí por referencia. En este caso, las 1 -d unidades de nucleótidos terminales en el extremo d' y/o en el extremo 3' quedan protegidas, por ejemplo, los puentes de internucleósido de fosfodiéster localizados en el extremo 3' y/o d' de los nucleósidos correspondientes son, por ejemplo, reemplazados por 10 puentes de internucleósido de fosforotioato. Además, preferiblemente por lo menos un nucleósidos de pirimidina interna (o nucleótidos respectivamente), como oposición, es modificada; preferiblemente, el puente(s) de internucleósido 3' y/o d' de un nucleósidos de pirimidina es/son modificados/reemplazados, por 15 ejemplo, por (a) puentes de internucleósido de fosforotioato. Los oligonucleótidos parcialmente modificados exhiben propiedades particularmente ventajosas; por ejemplo, exhiben un grado particularmente a altos de estabilidad de nucleasas en asociación con modificación mínima. También tienen una propensión 20 significativamente reducida para efectos que no son antisentido, los cuales por lo general están asociados con el uso de todos los oligonucleótidos de fosforotioato (Stein y krieg (1994) Antisense Res. Dev. 4, 67). Los oligonucleótidos parcialmente modificados también muestran una afinidad de unión mayor que para todos los 25 fosforotioato. **-***& La invención se refiere en particular a oligonucleótidos parcial/mínimamente modificados.
SEC ID NO. 10: 3-'C*T*T*A A G G C*A G T*A C*C G*C A G*C-d\ (K3) d'-C G A C*G*C*C*A*T G A*C G G A A*T*T*C-3'; SEC ID NO. 11: 3'-A*C*C*A C*T C*T A C*G T*C*T G G*T A*A-d\ (K4) d'-A?T GGrC'TG'CArCPCA ^A-S'; SEC ID NO. 12: 3'-G*G*C*A G*T A C*C G C*A G*C G T*C G*G-d', (K6) d'-G*G C*T G C*G A*C G C*C A T*G A*C*G*G-3"; SEC ID NO. 13: 3'-C*T*T*A A G G*C A G*T*A-d', d'-A*T*G A C*G G A A*T*T*C-3'; SEC ID NO. 14: 3'-T*A*A G G C*A G*T A*C*C-d', d'-C*C*A TG A*C G G A*A*T-3'; SEC ID NO. 1d: 3'-G*G*C A G*T A C*C*G C*A-d, d'-A*C G*C*C A T*G A C*G*G-3'; SEC ID NO. 16: 3'-A*G*T A C*C G*C A G*C*G-d\ d'-G*C*G A C*G C*C A rG'A-31; SEC ID NO. 17: 3'-C*C*G*C A G*C G T*C G*G-5', d'-G*G C*T G C*G A C*G*C*C-3'; SEC ID NO. 18: 3'-G*C*A G C*G T*C G G*rT-d', d'-TT*G G C*T G C*G A*C*G-3\ En donde "*" denota la posición de una modificación del puente de internucleósido; preferiblemente "*" es un puente de internucleósido de fosforotioato.
Otro ejemplo para una modalidad especial de la invención se refiere a un oligonucleótidos parcialmente modificado , en donde un nucieósido es modificado, por ejemplo, una modificación de una base del nucleósido y/o una modificación de una unidad ß-D-2'- 5 desoxiribosa. Preferiblemente una ß-D-2'-desoxiribosa es reemplazada por 2'-O-(C? -C6)-alquilribosa ; muy particularmente preferido ese reemplazo por 2'-O-metilribosa (reemplazo de un ß-D- 2'-desoxiribonucleósido por un 2'-O-metilribonucleósido) . De acuerdo con la invención, el oligonucleótido puede tener, 10 además de un tipo de modificación, también otros tipos de modificación. Por lo tanto, en otra modalidad de la invención , el oligonucleótido comprende puentes de internucleósido mod ificado en posiciones particulares y además modificaciones de un nucleósido en 15 posiciones particulares, preferiblemente el reemplazo de ß-D-2'- desoxiribosa. En una modalidad preferida de la invención, la modificación de internucleósido ese reemplazo de un puente de fosfodiéster a través de un puente de fosforotioato y la modificación de la ß-D-2'-desoxiribosa en el reemplazo por 2'-O-metilribosa; en 20 este caso, el oligonucleótido es un oligonucleótido quimérico, el cual está compuesto de parte es de ADN y AR N modificada y no modificadas, las cuales comprenden los 2'-O-metil ribonucleósidos y ß-D-2'-desoxiribonucleósidos y puentes de internucleósido de fósforo-diéster y fosforotioato. 25 Una modalidad preferida adicional de la invención proporciona un oligonucleótido, el cual tiene uno o más residuos alquilo de 12 a 18 átomos de carbono, preferiblemente un residuo alquilo de 16 átomos de carbono en su extremo 3' y/o d*. Un residuo alquilo de 12 a 18 átomos de carbono puede, por ejemplo, estar unido como un 5 fosfodiéster, como se describe en EP 0 dd2 766 A2 (EP 0 dd2 766 A2 se incorpora aquí por referencia) o un 3'-fosfodiéster de O-CH2- CH(OH)-O-(Ci2-C?8)-alquilo. Se prefiere un oligonucleótido que tenga un residuo alquilo de 16 átomos de carbono unido a su extremo 3' y/o d". 10 La invención también se refiere a un oligonucleótido, en donde el extremo 3' y/o 5' está conectado a un residuo de oligoetilenglicol, preferiblemente un trietilenglicol o un hexaetilenglicol, muy particular y preferiblemente a través de un fosfodiéster (tri-o hexaetilenglicol fosfato éster). Claro que, dicho oligonucleótido también puede 15 comprender modificaciones adicionales. En otra modalidad específica de la invención, el oligonucleótido está conectado a través de un enlazador a un oligoadenilato-5'- (tio)fosfato 2'5'-enlazado. El enlazador puede ser, por ejemplo, un oligoetilenglicol fosfato, preferiblemente un residuo trietilenglicol 20 fosfato, tetraetilenglicol fosfato o hexaetilenglicol fosfato. El oligoadenilato 2'5'-enlazado preferiblemente esta unido a través de su extremo 2' como un tetra- o como un pentaadenilato, cuya función d'-hidroxi está sustituida por un residuo de fosfato o tiofosfato. El 2'5'-oligoadenilato se sabe que induce a RNase L para dividir el 25 ARNm objetivo (Torrence y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1993) 90, 1300). El 2'd'-oligoadenilato sirve para activar ribonucleasa L (RNase L), la cual después degrada el ARNm de egd. En lugar de un adenilato 2'5'-enlazado, por ejemplo, un 3'- desoxiadenilato 2'd'-enlazado, derivados de la cordiceptina de 5 análogo del nucleósido, puede ser introducido. En este caso, la parte de oligonucleótido, la cual es complementaria al ácido nucleico objetivo, preferiblemente es modificada en posiciones particulares por 2'-O-(C?-C6)-alquilribonucleósido (preferiblemente, 2'-O- metilribonucleósido) o a través de PNA. 10 Otra modalidad preferida de la invención involucra el reemplazo de una o más bases de nucleósido naturales a través de bases de nucleósido no naturales o modificadas, respectivamente, de preferencia, a través de 8-azapurina y/o purina 7-deaza-7- substituidas y/o purina 7-deaza-8-substituida, por ejemplo, como se 15 describe en EP 0 171 066 y EP 0 680 969. En otra modalidad preferida de la invención, el oligonucleótido puede exhibir inversiones 3'3' y/o d'd' en el extremo 3' y/o d', por ejemplo como se describe en EP 0 464 638 y EP 0 693 901 . Otra modalidad preferida de la invención se retire al reemplazo 20 de uno o más puentes de fosfodiéster por puentes --hidroxibencil fosfonato como se describe en WO 96/01363. En otra modalidad preferida de la invención, el oligonucleótido comprende una modificación de la estructura de base de fosfato de azúcar, preferiblemente a través de unidades PNA. 25 También otros patrones de modificación son posibles, por i"" miüJÉMiiftr ipÉti i i '"•* * — ejemplo, ADN-PNA-ADN, PNA-ADN. También son posibles patrones de modificación comparables para quimeras de PHONA/ADN . Estos patrones de modificación pueden ser combinados con otro tipo de patrones de modificación y tomar por supuesto, patrones similares de 5 modificación también son posibles para otros oligonucleótidos de acuerdo con la invención. Los oligonucleótidos concretos anteriores, secuencia particular, tipo particular de modificación(es) en posiciones particulares ("patrón de modificación" específico) son sólo ejemplos para 10 diferentes modalidades de la invención. La invención no está limitada a estos oligonucleótidos concretos. También son posibles otras combinaciones de secuencias y patrones de modificación. Un oligonucleótido acuerdo con la invención específicamente inhibe la expresión de la proteína objetivo (la cual es egd) o la 15 secuencia objetivo (un ácido nucleico que codifica egd, preferiblemente ARNm de egd), respectivamente. De preferencia, un oligonucleótido de acuerdo con la invención específicamente inhibe la expresión de egd. Esto va como resultado una reducción en el nivel de proteína egd en comparación con la expresión no tratada. 20 El carácter específico, por ejemplo, puede ser demostrado determinando el efecto de un oligonucleótido de acuerdo con la invención después de la expresión de egd en comparación con el efecto de alcohol oligonucleótido sobre la expresión de beta-actina sobre el ARNm y/o el nivel de proteína. Después del tratamiento con 25 un oligonucleótido de acuerdo con la invención, solamente se reduce *s««a .t * * .« i.. .?.i el nivel de ARNm de egd y/o de proteína egd, mientras que, por ejemplo, el ARNm de beta-actina (una proteína de alojamiento) y/o el nivel de proteína de beta-actina permanece sin cambio. Preferiblemente, un oligonucleótido de acuerdo con la invención eficientemente puede inhibir la expresión de egd en células humanas y/o tienen la habilidad de inhibir el crecimiento de tumores en vertebrados. Preferiblemente, un oligonucleótido de acuerdo con la invención reduce el nivel deAR Nm de egd y/o de proteína en tumores de individuos tratados con relación a individuos no tratados. Preferiblemente, un oligonucleótido de acuerdo con la invención reduce el volumen de tumor en un vertebrado, por ejemplo, en ratones comparado con ratones no tratados o con relación al volumen de tumor del mismo animal determinado antes de tratamiento. La invención también se refiere a un método para la preparación de un oligonucleótido de acuerdo con la invención. Un método para la preparación comprende la síntesis química del oligonucleótido. De preferencia, la síntesis qu ímica se realiza a través de un método estándar conocido por ser utilizados para la síntesis de oligonucleótidos, por ejemplo, el método de fosforamidita de acuerdo con Caruthers (1983) Tetrahedron Letters 24, 24d, el método H-phosphonate (Todd y otros ( 1967) J. Chem . Soc. 3291 ) o el método fosfotriéster (Sonveaux (1986) Bioorg. Chem. 14, 274; Gait, M.J. "Oligonucleotide Synthesis, A practical Approach" I RL Press, Oxford, 1984), o métodos mejorados o variados derivados de estos métodos estándares. Un oligonucleótido de acuerdo con la invención puede ser, por ejemplo, preparado como se describe en el ejemplo 1. Preferiblemente, un oligonucleótido de acuerdo con invención es sintetizado sobre una fase sólida condensando monómeros adecuadamente protegidos (por ejemplo, nucleósidos) con el fin de formar puentes de internucleósido entre estos monómeros. La invención se refiere, por ejemplo, a un método para preparar un oligonucleótido o un derivados del mismo, en donde una unidad de nucleótido con un grupo de fósforo (V) 3'- o 2'-terminal y una agrupación diferentes d'-hidroxilo o mercato se hace reaccionar con una unidad del nucleótidos adicional con un fósforo (l l l) o un fósforo V agrupando en la posición 3', o sus derivados activados, y en donde opcionalmente se utilizan grupos protectores, los cuales pueden ser temporalmente introducidos en el oligonucleótido con el fin de proteger otras funciones y que se remueven después de síntesis, y el oligonucleótido que ha sido separado de la fase sólida opcionalmente puede ser convertido a una sal fisiológicamente tolerada. Con el fin de sintetizar un oligonucleótido modificado, los métodos estándares son variados a cierto grado. Aquellas variaciones son conocidas por algún experto en la técnica y se describen en, por ejemplo, AgrawaI S. "Protocols for oligonucleotides and analogs" (1993, Human Press Inc. , Totowa, New Yersey). La preparación de un oligonucleótido modificado también se describe en EP 0 710 667, EP 0 680 969, EP 0 464 638, EP 0 693 901 , WO 96/01363, EP 0 672 677, EP 0 739 898 y EP 0 662 766. Los métodos para preparar oligonucleótidos • » « > s^--* -- modificados descritos en los documentos anteriores se incorporan aqui por referencia. La invención además se refiere a un método para inhibir la expresión de egd y/o modular la expresión de una egd que codifica un ácido nucleico, en donde un oligonucleótido de acuerdo con la invención se pone en contacto con una egd que codifica un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADNc) si el oligonucleótido es y privilegiado con esta egd que codifica el ácido nucleico. Por lo tanto, la invención también se refiere a un método en donde el oligonucleótido se pone en contacto con una egd que codifica el ácido nucleico (por ejemplo, ARNm, ADNc) por ejemplo, introduciendo el oligonucleótido en una célula a través de métodos conocidos, por ejemplo, mediante incubación de células con el oligonucleótido o una formulación del mismo, dicha formulación puede comprender mejoradores de eliminación, tales como iipofectina, lipofectamina, celfectina o policationes (por ejemplo polilisina). Por ejemplo, un oligonucleótido que fue incubado previamente con celfectina durante, por ejemplo, 30 minutos a temperatura ambiente, después se incubó aproximadamente cinco horas o menos con una célula con el fin de introducir el oligonucleótido a la célula.
La invención además se refiere al uso del oligonucleótido, preferiblemente como oligonucleótido antisentido (unión del oligonucleótido a una egd que codifica ARNm) o, ribozima (unión a una egd que codifica ARNm y escisión de este ARNm). En otra - • - *-..« — *• -'-• ¿^a . -i -* modalidad especial de la invención, el oligonucleótido puede ser usados para inducir la escisión de RNAse H de la egd que codifica ARNm, dando como resultado a sí una reducción en la expresión de egd. 5 La invención se refiere al uso de un oligonucleótido para inhibir la formación de una base mitótica bipolar y, por lo tanto, para inhibir la proliferación de células, especialmente crecimiento de tumores. La invención además se refiere al uso del oligonucleótido como un producto farmacéutico y al uso del oligonucleótido para preparar 10 una composición farmacéutica. En particular, el oligonucleótido puede ser usado en una composición farmacéutica, la cual será empleada para prevenir y/o tratar enfermedades están asociadas con la expresión de egd, o que pueden ser curadas a través de la inhibición de la expresión de la egd. 15 La invención además se refiere a una composición farmacéutica que comprende un oligonucleótido y/o sus sales fisiológicamente tolerada a además de excipientes farmacéuticamente no objecionables o sustancias auxiliares. La invención se refiere a una composición farmacéutica que 20 comprende por lo menos un oligonucleótido de acuerdo con ia invención que puede ser usado para el tratamiento de enfermedades que pueden ser curadas a través de la inhibición de la expresión de egd, tal como restenosis y cáncer. La invención además se refiere a un método para preparar una 25 composición farmacéutica, la cual comprende mezclar uno o más ^^*^»^^-^--- oligonucleótidos de acuerdo con la invención conexcipientes fisiológicamente aceptables y opcionalmente substancias adicionales , por ejemplo, si es apropiado con aditivos adecuados y/o auxiliares. La invención además se refiere en particular al uso de un oligonucleótido o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo por el tratamiento de cáncer, por ejemplo, para inhibir el crecimiento de tumor y metástasis del tumor. Por ejemplo, el oligonucleótido o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo, puede ser usada para el tratamiento de tumores sólidos, como cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de cerebro, cáncer a dominar, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer de hígado, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma múltiple, y el tratamiento de cáncer en la piel, como melanoma, para el tratamiento de linfoma y cáncer en la sangre. La invención además se refiere al uso de un oligonucleótido de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo para inhibir la expresión de egd y/o para inhibir la acumulación de ascitos en el fluido y efusión pleural en diferentes tipos de cáncer, por ejemplo, cáncer de pecho, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza, cáncer del cuello, cáncer en el cerebro, cáncer abdominal , cáncer del colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer de hígado, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, - «* « - cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma múltiple, cáncer de piel , melanoma, linfoma y cáncer en la sangre. En cuanto al efecto inhibidor sobre la expresión de egd un oligonucleótido de acuerdo con la invención o una composición farmacéutica preparada a partir del mismo puede mejorar la calidad de vida. La invención además se refiere al uso de un oligonucleótido o una composición farmacéutica del mismo, por ejemplo, para el tratamiento de cáncer o para prevenir metástasis de tumor, en combinación con otros farmacéuticos y/u otros métodos terapéuticos, por ejemplo, con farmacéuticos conocidos y/o métodos terapéuticos conocidos, tales como, por ejemplo, aquellos que actualmente son empleados para tratar cáncer y/o para prevenir metástasis de tumor. Se da preferencia a una combinación con terapia de radiación y agentes quimioterapéuticos, tales como cisplatino, ciclofosfamida, d- fluorouracilo, adriamicina, daunorubicina o tamoxifen. El oligonucleótido y/o su sal fisiológicamente tolerada puede ser administrada a un animal, preferiblemente un mamífero, y en particular un ser humano, como tal, en una mezcla con otro oligonucleótido (por su sal fisiológicamente tolerada), o en la forma de una composición farmacéutica que permite el uso tópico, percutáneo, parenteral o entérico y que comprende, como el constituyente activo, una dosis efectiva de por lo menos un oligonucleótido, además de los éxito y en tres de costumbre farmacéuticamente no objecionables y sustancias auxiliares. Dicha »•* « -> * > composición farmacéutica normalmente comprende de aproximadamente 0.1 a 90% en peso del oligonucleótido(s) terapéuticamente activo. La dosis puede variar dentro de amplios límites y será ajustada a las circunstancias individuales en cada caso individual. Con el fin de tratar psoriasis, se da preferencia a un uso tópico. En el caso de cáncer, se da preferencia a infusiones, administración oral y rectal, o aplicación nasal en un aerosol, preferiblemente en el caso de cáncer de pulmón, mientras que en el caso de retinopatía diabética, se da preferencia a una administración tópica, intravítrea, y oral. Una composición farmacéutica puede ser preparada en una forma conocida per se (por ejemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co. , Easton, PA (1986)), con excipientes y no orgánicos y/u orgánicos farmacéuticamente inertes. La lactosa , almidón de maíz y/o derivados de los mismos, talco, ácido esteárico y/o sus sales, etcétera, pueden ser usados, por ejemplo, para preparar pildoras, tabletas, tabletas cubiertas con una película y cápsulas de gelatina dura. Ejemplos de excipientes de cápsulas de gelatina suave y/o supositorios son ceras, grasas, polioles semisólidos y líquidos, aceites naturales y/o endurecidos, etcétera. Los ejemplos de excipientes adecuados para preparar soluciones y/o jarabes son agua, sacarosa, azúcar invertida, glucosa, polioles, etcétera. Los excipientes adecuados para preparar soluciones de inyección son agua, alcoholes, glicerol, polioles, aceites vegetales, etcétera. Excipientes adecuados para micro cápsulas, implantes y/o ^?^J?J^m ?¿^km barras son polímeros mixtos de ácido glicólico y ácido lático. Además, existen formulaciones de liposoma que, por ejemplo, se describen por N. Weiner (Drug Develop Ind Pharm 16 (1989) 1623), "Liposome Dermatics" (Springer Verlag 1992) y Hayashi (Gene Therapy 3 (1996) 878). La composición farmacéutica también puede comprender una formulación que mejora la disponibilidad oral del oligonucleótido, tal como mejoradores de absorción intestinal, por ejemplo, manitol, urea, sales biliares, tales como CDCA (quenodesoxicolato) (2%). También se puede efectuar la administración dérmica, por ejemplo, utilizando métodos iontoforéticos y/o a través de electroporación.. Además, se puede hacer uso de lipofectinas y otros sistemas de portador, por ejemplo aquellos que pueden ser usados en terapia de gen. Los sistemas que pueden ser usados para introducir oligonucleótido en una forma altamente eficiente las células eucarióticas o a los núcleos de las células eucarióticas son particularmente adecuados. U na composición farmacéutica también puede comprender dos o más diferentes oligonucleótidos y/o sus sales fisiológicamente tolerada y, además, a por lo menos un oligonucleótido, uno o más ingredientes activos terapéuticos diferentes. Además de los ingredientes y excipientes activos, una composición farmacéutica también comprende aditivos, tales como llenadores, agentes de extensión, desintegradores, aglutinantes, lubricantes, agentes humectantes, agentes de estabilización, emulsificadores, conservadores, edulcorantes, tintes, saborizantes o agentes aromatizantes, espesantes, diluyentes o sustancias reguladoras de pH , y, además, solventes y/o agentes de solubilización y/o agentes para lograr un efecto de liberación lenta, y también sales para alterar la presión osmótica, agentes de 5 recubrimiento y/o antioxidantes.
EJEMPLOS Ejemplo 1 : Síntesis de oligonucleótido 10 Se sintetizaron oligonucleótidos (ONs) utilizando un sintetizador Applied Biosystems 394 (Perkin Elmer Applied Biosystems, Inc. , Foster City USA) y química de fosforamidita estándar. Después de acoplamiento, se introdujeron enlaces de fosforotioatoa través de sulfurización utilizando el reactivo de 15 Beaucage seguido por capar con anhidrido ascético y N-metiimidazol. Después de la escisión del soporte sólido y la desprotección final a través del tratamiento con amoniaco concentrado, los oligonucleótidos fueron purificados a través de electroforesis en gel de poliacrilamida. Los oligonucleótidos 2'-O-metil modificados 20 fueron preparados reemplazando las fosforamiditas estándares en el ciclo correspondiente con 2'-O-metil-ribonucleósido- fosforamidítas. Todos los oligonucleótidos fueron analizados a través de espectroscopia de masas de electroaspersión de ion negativo (Fisons Bio-Q), la cual en todos los casos confirmó la masa calculada. Los 25 oligonucleótidos modificados de 16 átomos de carbono fueron sintetizados utilizando hexadeciloxi(cianoetoxi)-N, N-diisopropil- aminofosfano como un reactivo de fosfopitilación a partir de un producto sólido correspondientemente derivatizado. El enlazador de trietilenglicol está comercialmente disponible de Glen Research 5 Corporation. Las 2'-fosforamiditas de además sin nada y cordiceptina fueron obtenidas de Chem. Genes Corporation y Chemogen Corporation, respectivamente. La introducción de residuos d'-fosfatos o tiofosfato se realizó como se describió previamente (Uhlmann y Engels (1986) Tetrahedron Lett. 27, 1023). 10 Las quimeras de PNA-ADN se preparan como se describe en EP 0 672 677. El análisis de los oligonucleótidos se realizó mediante 212 a) electroforesis en gel analítica en 20% de acrilamida, 8M urea, 45µM de regulador de pH de tris-borato, pH 7.0, y/o 15 b) análisis de HPLC: columna de Waters GenPak FAX, gradiente de CH3CN (400ml), H2O (1.61), NaH2PO4 (3.1 g), NaCI (1 1.7g) , pH6.8 (0.1 M NaCI), después, CH3CN (400ml), H2O (1.61) , NaH2PO4 (3.1 g), NaCI (17.53g), pH6.8 (1.6M NaCI); y/o c) electroforesis capilar utilizando una columna de 20 capilaridad de gel U100P de Beckmann eCAP™, con una longitud de 65 cm, un diámetro interno de 100 milímetros, una ventana de 15 centímetros para un extremo, un regulador de pH de 140µM, 360mM de borato, 7M urea y/o d) espectrometría de masas de electroaspersión de ion 25 negativo que en todos los casos confirmó los valores de masa Xfmt? ^^^^ ******<**- esperados. Los métodos para analizar oligonucleótidos de acuerdo con a) , b) , c) y d) son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Estos métodos, por ejemplo, se describen en Schweitzer y Engeis 'Analysis of oligonucleotides" (en "Antisense - from technology to therapy" un manual del laboratorio y libro de texto, Schilingensiepen y otros eds . , Biol . Science Vol . 6 ( 1 997) p . 78- 103). Los siguientes oligonucleótidos fueron preparados (ver descripción) y probados: 10 ON1: 3-'C*TTA AG G C'A G TA C'C G'C A G'C (K3) SEQ ID NO. 10 ON2: 3'-A'C'C*A C*T CT A C G TCT G GT A'A (K4) SEQ ID NO. 11 ON3: 3'-A*A*G'A GT C*A CT C*T C*CT A G G*C (K5) SEQ. ID NO. 19 ON4: 3-'C*TT'A A G G CA G 7? C'C G*C A G*C-FITC-d' (K6) SEQ ID NO. 10 15 ONd: 3'-G*G'C A G *T A C*C G*C A G C*G SEQ ID NO. 22 ON6: 3'-C'TTA A G G*C A G'TA SEQ ID NO. 13 ON7: 3'-TA*A G G C*A G*T A*C*C SEQ ID NO. 14 ON8: 3'-G*G*C A G*T A C*C'G C'A SEQ ID NO. 16 ON9: 3'-C*A*G*T A C*C G'C A G'C SEQ ID NO. 23 20 ON 10: 3'-A*G*T A CC G'C A G'C'G SEQ ID NO. 16 ON11: 3'-C*C*G*C A G'C G TC G*G SEQ ID NO. 17 ON12: 3'-G*C'A G C*G TC G GTT SEQ ID NO. 18 ON 13: 3'-A*A*G*A G*T C'A CT C*T C*C*T A G G'C-Flu-d' (Vergleich 1) SEQ ID NO. 19 25 ON14: 3'-G*G'C'A G*T A C'C G C*A G'C G TC G'G SEQ ID NO. 12 *aal * «**a^»» **.« ON15: 3'-C'TTA A G GC A G*TA-FITC SEQ ID NO. 13 en donde "*" es un puente de internucleósido de fosforotioato, 5 y FITC es una etiqueta de fluorescencia. Los oligonucleótidos 1 a 12 fueron probados en un ensayo basado en células para su efectividad para inhibir la proliferación de células de leucemia REH los oligonucleótidos ON 1 , ON2, ON4-ON 12, ON 14, ON 1 d son oligonucleótidos antisentido dirigidos contra la 10 región de inicio de traducción de ARNm de egd. El oligonucleótido 4 es un análogo marcado con d'-fluoresceína en el oligonucleótidos 1 y el oligonucleótidos 3 que es un oligonucleótidos de comparación. Los resultados del experimento de inhibición de proliferación se muestran en la figura 1. 15 Ejemplo 2. Determinación de la actividad antiproliferativa de los oligonucleótidos al antisentido egd Las células REH (células de leucemia pre-B humanas, DSM , ACC 22) o las células de tumor A649 se cultivaron en OptiMEM 20 (Gibco BRL) un 10% de suero de bovino fetal (FCS, GIBCO-BRL) a 37°C bajo 6% de CO2. La densidad de las células para el ensayo fue de aproximadamente 1 x106/ml. Los oligonucleótidos (0.17mM) se mezclaron con celfectina (0.83 mg/ml; Gibco-BRL) para la formación compleja para mejorar la eliminación celular. El complejo de 25 oligonucleótido/celfectina fue incubado con las células en placas de 24 cavidades durante 4 horas en ausencia de suero. El complejo de ohgonucleótido/celfectina después fue removido y se agregó suero a una concentración final de 10% Después de 96 horas de incubación a 37°C, bajo CO2 al 5%, se emitió la densidad de célula con Casy 1 5 (de Schárfe). Para esto, las células en cada cavidad se mezclaron concienzudamente e inmediatamente se diluyeron con 1 : 100 con Casyton . Los valores medios de la densidad de células se determinaron en cada caso a parir de tres cavidades individuales de la misma concentración de oügonucleótido. Los resultados de la 10 actividad antiproliferativa se ilustran en la figura 1 .
CUADRO 1 Secuencia de nucleótidos de eg5 humana (SEC ID NO. 20) 1 GAATTCCGTC ATGGCGTCGC AGCCAAATTC GTCTGCGAAG AAGAAAGAGG 15 51 AGAAGGGGAA GAACATCCAG GTGGTGGTGA GATGCAGACC ATTTAATTTG 101 GCAGAGCGGA AAGCTAGCGC CCA TCAATA GTAGAATGTG ATCCTGTACG 151 AAAAGAAGTT AGTGTACGAA CTGGAGGATT GGCTGACAAG AGCTCAAGGA 201 AAACATACAC TTT GATATG GTGTTTGGAG CATCTACTAA ACAGATTGAT 251 GTTTACCGAA GTGT GTTTG TCCAATTCTG GATGAAGTTA TTATGGGCTA 301 TAATTGCACT ATCTTTGCGT ATGGCCAAAC GGCAC GGA AAAACTTTTA 20 351 CAA GGAAGG GAAAGGTCA CCTAATGAAG AG ATACCTG GGAAGAGGAT 401 CCCTTGGCTG G ATAATTCC ACGTACCCTT CATCAAAT T TTGAGAAACT 451 TACTGATAAT GGTACTGAAT TTTCAGTCAA AG GTCTCTG TTGGAGATCT 501 ATAA GAAGA GCTTTTTGAT CTTCTTAATC CATCATCTGA TGTTTCTGAG 551 AGACTACAGA TGT TGA GA TCCCCGTAAC AAGAGAGGAG TGATAATTAA 601 AGGTT AGAA GAAATTACAG TACACAACAA GGATGAAGTC TATCAAATTT 25 651 TAGAAAAGGG GGCAGCAAAA AGGACAACTG CAGCTACTCT GATGAATGCA f? iii r ffiiBÉhp 701 TACTCTAGTC GTTCCC?CTC AGTTTTCTCT GTTACAATAC ATATGAAAGA 751 AACTACGATT GATGGAGAAG AGCTTGTTAA AATCGGAAAG TTGAACTTGG 801 TTGATCTTGC AGGAAGTGAA AACATTGGCC GTTCTGGAGC TGTTGATAAG 851 AGAGCTCGGG AAGCTGGAAA TATAAATCAA TCCCTGTTGA CTTTGGGAAG 901 GGTCATTACT GCCCTTGTAG AAAGAACACC TCATGTTCCT TATCGAGAAT r 951 CTAAACTAAC TAGAATCCTC CAGGATTCTC TTGGAGGGCG TACAAGAACA 1001 TCTATAATTG CAACAATTTC TCCTGCATCT CTCAATCTTG AGGAAACTCT 1051 GAGTACATTG GAATATGCTC ATAGAGCAAA GAACATATTG AATAAGCCTG 1101 AAGTGAATCA GAAACTCACC AAAAAAGCTC TTATTAAGGA GTATACGGAG 1151 GAGATAGAAC! GTTTAAAACG AGATCTTGCT GCAGCCCGTG AGAAAAATGG 1201 AGTGTATATT TCTGAAGAAA ATTTTAGAGT CATGAGTGGA AAATTAACTG 1251 TTCAAGAAiGA GCAGATTGTA GAATTGATTG AAAAAATTGG TGCTGTTGAG 10 1301 GAGGAGCTGA ATAGGGTTAC AGAGTTGTTT ATGGATAATA AAAATGAACT 1351 TGACCAGTGT AAATCTGACC TGCAAAATAA AACACAAGAA CTTGAAACCA 1401 CTCAAAAACA TTTQCAAGAA ACTAAATTAC AACTTGTTAA AGAAGAATAT 1451 ATCACATCAG CTTTGGAAAG TACTGAGGAG AAACTTCATG ATGCTGCCAG 1501 CAAGCTGCTT AACACAGTTG AAGAAACTAC AAAAGATGTA TCTGGTCTCC 1551 ATTCCAAACT GGATCGTAAG AAGGCAGTTG ACCAACACAA TGCAGAAGCT 1601 CAGGATATTT TTGGCAAAAA CCTGAATAGT CTGTTTAATA ATATGGAAGA 15 1651 ATTAATTAAG GATGGCAGCT CAAAGCAAAA GGCCATGCTA GAAGTACATA 1701 AGACCTTATT TGGTAATCTG CTGTCTTCCA GTGTCTCTGC ATTAGATACC 1751 ATTACTACAG TAGCACTTGG ATCTCTCACA TCTATTCCAG AAAATGTGTC 1801 TACTCATGTT TCTCAGATTT TTAATATGAT ACTAAAAGAA CAATCATTAG 1851 CAGCAGAAAG TAAAACTGTA CTACAGGAAT TGATTAATGT ACTCAAGACT 1901 GATCTTCTAA GTTCACTGGA AATGATTTTA TCCCCAACTG TGGTGTCTAT 1951 ACTGAAAATC AATAGTCAAC TAAAGCATAT TTTCAAGACT TCATTGACAG 20 2001 TGGCCGATAA GATAGAAGAT CAAAAAAAAA GGAACTCAGA TQGCTTTCTC 2051 AGTATACTGT GTAACAATCT ACATGAACTA CAAGAAAATA CCATTTGTTC 2101 CTTGGTTGAG TCACAAAAGC AATGTGGAAA CCTAACTGAA GACCTGAAGA 2151 CAATAAAGCA GACCCATTCC CAGGAACTTT GCAAGTTAAT GAATCTTTGG 2201 ACAGAGAGAT TCTGTGCTTT GGAGGAAAAG TGTGAAAATA TACAGAAACC 2251 ACTTAGTAGT GTCCAGGAAA ATATACAGCA GAAATCTAAG GATATAGTCA 5 2J01 ACAAAATGAC TTTTCACAGT CAAAAATTTT GTGCTGATTC GATGGCTTC 2351 TCACAGGAAC TCAGAAATTT TAACCAAGAA GGTACAAAAT TGGTTGAAGA 2401 ATCTGTGAAA CACTCTGATA AACTCAATGG CAACCTGGAA AAAATATCTC 2451 AAGAGACTGA ACAGAGATGT GAATCTCTGA ACACAAGAAC AGTTTATTTT 2501 TCTGAACAGT GGGTATCTTC CTTAAATGAA AGGGAACAGG AACTTCACAA 2551 CTTATTGGAG GTTGTAAGCC AATGTTGTGA GGCTTCAAGT TCAGACATCA 2601 CTGAGAAATC AGATGGACGT AAGGCAGCTC ATGAGAAACA GCATAACATT 2651 TTTCTTGATC AGATGACTAT TGATGAAGAT AAATTGATAG CACAAAATCT 2701 AGAACTTAAT GAAACCATAA AAATTGGTTT GACTAAGCTT AATTGCTTTC 2751 TGGAACAGGA TCTGAAACTG GATATCCCAA CAGGTACGAC ACCACAGAGG 2801 AAAAGTTATT TATACCCATC AACACTGGTA AGAACTGAAC CACGTGAACA 2851 TCTCCTTGAT CAGCTGAAAA GGAAACAGCC TGAGCTGTTA ATGATGCTAA 2901 ACTGTTCAGA AAACAACAAA GAAGAGACAA TTCCGGATGT GGATGTAGAA 2951 GAGGCAGTTC TGGGGCAGTA TACTGAAGAA CCTCTAAGTC AAGAGCCATC 3001 TGTAGATGCT GGTGTGGATT GTTCATCAAT TGGCGGGGTT CCATTTTTCC 3051 AGCATAAAAA ATCACATGGA AAAGACAAAG AAAACAGAGG CATTAACACA 3101 CTGGAGAGGT CTAAAGTGGA AGAAACTACA GAGCACTTGG TTACAAAGAG 3151 CAGATTACCT CTGCGAGCCC AGATCAACCT TTAATTCACT TGGGGGTTGG 3201 CAATTTTATT TTTAAAGAAA AACTTAAAAA TAAAACCTGA AACCCCAGAA 3251 CTTGAGCCTT GTGTATAGAT TTTAAAAGAA TATATATATC AGCCGGGCGC 3301 GTGGCTCTAG CTGTAATCCC AGCTAACTTT GGAGGCTGAG GCGGGTGGAT 3351 TGCTTGAGCC CAGGAGTTTG AGACCAGCCT GGCCAACGTG CGCTAAAACC 3401 TTCGTCTCTG TTAAAAATTA GCCGGGCGTG GTGGGCACAC TCCTGTAATC 3451 CCAGCTACTG GGGAGGCTGA GGCACGAGAA TCACTTGAAC CCAGAAGCGG 3501 GGTTGCAGTG AGCCAAAGGT ACACCACTAC ACTCCAGCCT GGGCAACAGA 3551 GCAAGACTCG GTCTCAAAAA TAAAATTTAA AAAAGATATA AGGCAGTACT 3601 GTAAATTCAG TTGAATTTTG ATATCTACCC ATTTTTCTGT CATCCCTATA 3651 GTTCACTTTG TATTAAATTG GGTTTCATTT GGGATTTGCA ATGTAAATAC 3701 GTATTTCTAG TTTTCATATA AAGTAGTTCT TTTAGGAATT C CUADRO 2 SEC ID NO. 21 : secuencia de P. falcioarum (secuencia parcial; Genbank. ID Z98551 ) 5 ' TT TTITTTTTTTATTa TGGATGTTCTTGG rrcTTTTATACGTTTTAAAG<^GGGGATGCCrTTTTA8 TAATTTTTGTAGATTGAAATTTAT ATTATTATTA TA TATTGTTGTTGTTGTT^ TTGTTGTTGTTATTATTTGAATAATTATTTGTTATATGAAC^^ COTTCTTTC^TATTCTTTTAAACTTGTTACACTC TATTATGTTGATTGTTATTTAAATAATTTAATTCT GATATGTTTCATCT GGATTATCCGTTGTATTCTTATTATATAGC?TATATTCATTTAAGGGTAGATTATTGTGATT AGT TTTAC?T TAATTTATTTTTATCACerTTATTATT ATATTATGAGG^ TCGTTGTATGA C^TTTAAACTAT GTAACX^GAGTAATTATTT^^ TC?TCITGAATAAGAAATTGGAAGTTTTCATCGATTTG^ ATCATGTGTTGTTGTAATTTGTTCTAT(HCTTTC?TC^ AATTTTGTCTTATGATAT<^TCATTATAAAGATAATAAT AT^ TTATTATO ^TTATAAAGATAATAA TATGATGATÍ^CCTTGA^ ATTATAAAGATAATTATTATGATC^TGACCTTGATCC^TTTTATTATCATCATTATAAAGAT AATTATTATGATCATGACCITGATCí^TTTTATTATCATCATTATAAAGATAATTATTATGA TC?TGAtX^TGATCCATTTTATTATC^TCATAATTATTAT^ ATGATCATTTTTATTATTGTC?CC^TTTTOAT^^ GATTATTTTTATTATTAT ^TGATTATTTTTATTATTAT(^^ TTCGTGTOSTAAGTaSAATCCX rATTTAGTGATGTGATTTTC?TCC^^ GA^TTCAC?AACGTTTCCCTTATCCTTTGTAC?T^ (?TCCATATTTTCC^TGAGAT ^TAACTTGATGTACT^^ TTTTTTAATATATCTATTAATTCTGCTATATAC?TA ACAT TGTTTAAATTT*^^ TATATTATTAAAAAGTTTTATATTT CATTAGACT T.^^ TTTGTTCTTGTGATTCTTTATTTTTATTTTGT^^ TTTC STTTCTCTATTTTGTTTATATTAGTTT^^ ATTTAGAT ATTTGTATATAATAAATTATTATAAATATTTAAACT^ GTG c i7t cr a?TA AAC t?trc?t^ GTA GATAATTTGTTATCTTCCT TTAATATCARA ATTAATATTGCATTCAGAAAAATGTTGTATAGTATCATCGATC^ AAACAGATTTATAATTTTTTTTTX^CTTATC?TATAA TTATT(^TTTTTTCATAAATATCTTCCA<^TTT^ AATATTTTCTTTAAATTCITGTATATCI CATTTATCATTT^ TATTATCXrrcCTTTTC^AAAACATCATATTTTTTATAAATATAT^^ ATCTTCTTGTCCOTATCCX^TGTATATATTTTT(^TGAí^^^ 1 a^fc^- GATTCGTTTAAAAAAATATGAAATATATTACATATACTTTTAATATATTGTATTAATGATT TTGCATTATATAACTTTT1"ITCAGATTCGTGATTATCTAAATTTTGTATAATATCTTCACCT TGTCTATTTAATAATAAATCI TTATAAATTCTTTATTCT^ TATATGGTCAAATGGCATCTGATTATTTTCTTCTTTA^ CTTCAO^TTTTGTTTTT^(^TATTATTCC T(_?CCGTTTTC T(^CCGTTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTC^^ ACCGTTTTGTTTTTC?CATATTATCTTTTCACCAC CACTTTGTTTTTCACATATTATCTTTTCACCACTT G TTATATAC?CCAATAATTGCTGGCATTTTCTGCTTGGCTTC^^ TATTTTACATTGTGATATTTCCTTTTTAATATTT^ ATTTTTGTAAAATATO^TATGGTCC^GTATAAAATTCA^ ATGTTACTATTGAGTTCTTCAAAATGGTTAATATAATCATTGTATGATTTTT^ TAGATAATTTTTGGTATCATCTAAAATGAATAAGATGGTTTTACATATATCGTTTAAAAGAT GATTTTCTTGATGAATATTTTTTTTTATATTT^ TTTGTTTTAATTrcTTGAAAAGATT TT TTGAT TATAAAAT^^ TTTATTTAATAAGAATTGTGTAATATATTTTTCTTCTATTA^ GAAATGCTTGTATATTTTTATATTTTTGAATAGTATC^^ TGTAGATCATCTGTATTATCCA TTTATTTAATAAAT^ TAAAArrTTTTeiTTTTCTAATAATATTTenT'AT^ TATAT CTTCTGTATC^GATAAACACCTCTCTTTTCTCT X:TTAAATTCAGTC AACTT TCGATTTC^TTATTTAAATCCRRTTATTTTTAATTG^ CTCGGGTCTATTCITAATATTCTTAGCGCGAAAGACATAATCTAAAGTGCTTAAAGTC CAATA(^TAAAGAGGAGGGTGATATAGTGGCGA(^ATAAAAGTCTTCGTTTTCCCACCTAAC GAATCITCTAATAATCTGGTTAATTTAGAATCTCTGTAAGG^^ C^OSAATTAATAACTXRRACCTAAGGTTAATAAAGAT^^ GTCTAATTTTTAAAGAACCATAAGAGCTTTT ^AAGCATTTTCACTACCCGCTAA^ AAATTTAATTTTCCTATTTTTGTTATAC rcTCT^^ TGTTATAGTAAAAATCGAATGACTTCTACrcGATTTT^ TTCTTTTTTTAATAGCTGAACATATAATATAATATATT^ TCTTCTAACT^ATOU^TTTAATCCTTTACT^ TT C?TATTT a TTTCTTCAACTTAATAAATCACATAATT^^ AGCTAATTTTTATATTAAAATCGTA<^TATTCTr^^ TTCCTATTTTTATCTAC?CTAC^TTTTTGT^^ GT AACTAAO?^TTGTTAGGTTCITTATTAATTTTTAAATTATTATAAATAT^ CAATATTTATTTTGTTACATAATAAATTATTATAA TATTATTAATAATATTATTATTGTTA CCATTAGTTTCCraATTTATTA^TTTATATCTTC^ TTTTCC rTTAAAATGTCGAATCTTTTCTTCTTTCCTTTTAT^ TCGTAACTCGAAATATAAGTCOVGTAT X:TCATTCTC?C^AAGTTCATAGCAATAGCT^ TCGCTATTAATACTTTCATTCAAATCC^CCTTTTTA^ TAGTATTTTCCCTTCK^TAGTATAGGTCTTACXXXS^^ TACAA TGAATCCTTGOAAACCTGAAGCGGCXSAAaAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATATAT ATATATATGTAC?TGTATATTTATATGTATATGTATATATATATGTATAGTTATATGTATTT TTATTTTTATTTTTATTTTTATATTTATTTTTATTTT^ ATTTTTATTTTTATATTTATATTTATATATGTG^ CCATATATTTTTTTTTTTTAATCTATTTAATAAA^ ATATAC?TGGTATTTATTTAIT TT TTTATATATTTTTCAT TTGTTTCCTAGGAATA'ITCTTTTTTTTT^^ AATACATC?TGGAATAATTTATATATATATATATATATATGTATATTTTATTTTACCGCAT CTACTATTTGGTAAATATAATTATTGAACAAAGTTTTCI^ TAATCAAAACTATATTTTTTTTCGTATATTTC^TTGTT^ ATTATTATTAATTOSAACTACCTCTT^TTAT^ GTCTACACCTTACGATAACTTTTATATTTACGCAACTTGAT^ 10 CTGAGC?TTTTACT'TTTATTCAAATAAT 15 20 25 ^gHj|^ ¡ SM£flÉfiAfcflfc»aafa..».« « , , *, *£ > . .^^..., -MÉhrtr t v4Ím*ri +° CUADRO 3 Homología de secuencia : comparación de la secuencia eg5 humana con la secuencia eg5 de P. falciparum 1 60 human . SEQ GAATTCCGTCAT GGCGTC GCAGCC .AAATTC . . . G CTGCGAAGAAG PLASMO . SEQ TTTTrTTTn'l'l ATTCCTTGGATGTTCTTGGTAGTTTAAA 61 120 human . SEQ AAAGA GGAGAAGGGGAAGAACATCCAGGTGGTGGTGAGATGCAGACC PLASMO. SEQ TCTTCTTTTATACGTTTTAAAG ?GGGGATGCCTTTTTAGGAAAT^ 121 180 human . SEQ A . TTTAATTTGGCAGAGCGGAAAGCTAGCGCCCAT . TCAATAGTAGAATGTGATCCTGTA PLASMO. SEQ GCTTTAATTTTTGTAGATTGAAATTTATTATTATTATTATTATTATT ^ 10 181 240 human . SEQ CGAAAAGAAGTTAGTGT . ACGAACTGGAGGATTGGCTG . . ACAAGAGCTCAAGGAAAACA PLASMO . SEQ GTTGTTGTTGTTGTTGTTATTATTTGAATAATTAT^^ 241 300 human . SEQ 2AC?CTTTTGAT ATGGTGTTTGGAGC ATCTACTAAAC . .AG PLASMO . SEQ TATATTTCTCTTTCTTTCATATTCTT^ 15 301 360 human . SEQ ATTGA . . TGTTTACCG AAGTGTTGTTTG TCCAATTCTGGATGAAGTT . AT . PLASMO . SEQ ATCAAATCTTTTATTATGTTGATTGTTATTTAAATAATTTAATTCTTGATAT^ 361 420 human . SEQ TATGGGCTATA ATTGCAC TATCTTTGC . GTATGGC . CAAACT GG PLASMO . SEQ TATTGGTTGTATAGGATTATCCGTTGTATTCTTATTATATAGCATATATTC^TTTAAGGG 421 480 20 human.SEQ CA CTG.GAAAAACTTTTACAATGGA...AGGTGAAAGGTC ACCTA PLASMO.SEQ TAGATTATTGTGATTAGTTTTACATTTAATTTATTTTTATCACCTTTA^ Figura 1 : esta figura resume los resultados de los ejemplos 1 + 2: Se muestra el efecto de los oligonucleótidos ON 1 a ON12 25 (antisentido egd) sobre la inhibición de la proliferación de células REH (en porcentaje). m Primer experimento. * Segundo experimento. CF: comparación de celfectina.
LISTA PE SECUENCIAS <110> Avantis Pharma Deutschland GMBH <120> Oligonucleótidos Para La Inhibición De La Expresión De Egd Humana <130> HMR 1999/L046 <140> <141> <150> 19936303.4 <151> 1999-07-28 <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (19) <400> 1 cgacgccatg acggaattc 19 <210> 2 i • <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (19) <400> 2 aatggtctgc atctcacca 19 <210> 3 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (19) <400> 3 ggctgcgacg ccatgacgg 19 <210> 4 <21 1 > 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética 5 <220> <223> Descripción de la secuencia sintética- oligonucleótido antisentido <220> <221 > varias_características 10 <222> (1 ) .. (12) <400> 4 atgacggaat te 12 <210> 5 15 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido 20 antisentido <220> <221 > varias_características <222> (1 ) .. (12) <400> 6 25 ccatgacgga at 12 <210> 6 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (19) <400> 6 acgccatgac gg 12 <210> 7 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (12) <400> 7 gcgacgccat ga 12 •-""*-"•—' i jflttfrfr-* 1 - i - ' <210> 8 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (12) <400> 8 ggctgcgacg cc 12 <210> 9 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (12) <400> 9 ttggctgcga cg 12 <210> 9 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_característícas <222> (1) .. (19) <400> 10 cgacgccatg acggaattc 19 <210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (19) <400> 11 aatggtctgc atctcacca 19 <210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (19) <400> 12 ggctgcgacg ccatgacgg 19 <210> 13 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (19) <400> 13 atgacggaat te 12 ^^y^^ .., ..3....*,., ...... ^^ái <210> 14 <21 1 > 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética 5 <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221 > varias_características 10 <222> (1 ) .. (12) <400> 12 ccatgacgga at 12 <210> 15 15 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido 20 antisentido <220> <221 > varias_características <222> (1 ) .. (19) <400> 15 25 acgccatgac gg 12 iíl?1? ?????ftftilllüir??Tf lpr ?1 I - - - <210> 16 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (12) <400> 16 gcgacgccat ga 12 <210> 17 <211> 12 <212> ADN <213> Secuencia sintética <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221> varias_características <222> (1) .. (12) <400> 17 ggctgcgacg cc 12 <210> 18 <21 1 > 12 <212> A DN <21 3> Secuencia sintética 5 <220> <223> Descripción de la secuencia sintética: oligonucleótido antisentido <220> <221 > varias_características 10 <222> ( 1 ) .. ( 12) <400> 1 8 ttggctgcga cg 12 <210> 1 9 15 <21 1 > 3784 <212> ADN <21 3> Homo sapiens <400> 15 gaattccgtc atggcgtcgc agccaaattc gtctgcgaag aa?aaagagg agaaggggaa 60 20 gaacatccag gtggtggtga gatgcagacc atttaattcg Ogcagagcgg aaagctagcg 120 cccattcaat agtagaatgt gatcctgtac gaaaagaagt tagtgcacga actggaggat 180 tggctgacaa gagctcaagg aOaaacatac acttttgata tggtgtttg? agcacccact 240 aaaca?attg atgtttaccg aagtgtcgtt tgtccaatcc tggatgaagt tactatgggc 300 25 caOCaattge accatccccg cgtatggcca aactggcact ggaaaaacct ttacaatgga 360 aggcgaaagg ccacccaacg aagagtacac ctgggaagag gatOcccttg gccggtataa 420 ttccac tac ccttcatcaa attttrgaga aacctactga taacggcacc gaattttcag 480 tcaaagcgcc tct?tcggag acctOataac saagagcttt ctgatcttct taatccatca 540 tctgatgcct ccgagagacc acagatgctc gatgatcccc gtaacaagag aggagcgaca 600 atcaaoaggt ttagaagaaa ctacagtaca caacaaggat gaagcccatc aaattttaga 660 aaagggggca gcaaaaa?ga caaetgcagc taccccgacg aacgcaOtac tccagccgcc 720 cccactcagc tetctccgct acaatacata tgaaagaaac tacgattgat ggagaagagc 780 ttgttaaaac cggaaagccg aactcggOtt gatcccgcag gaagtgaaaa cactggccgt 840 cccggagccg CCgaCaagag agcccgggaa gccggaaaca Caaatcaacc cctgttgact 900 ttgggaagOg gcca taccg cccctgtaga aagaacacct catgctcctt atcgagaacc 960 taaactaact agaatccccc aggattctct tggaggg gt acaagaacaO OtcCataacc 1020 gcaacaattt ctcctgcatc tctcaatctt gaggaaactc COgagtacac tggaatatgc Z080 tcatagagca aagaacacac tgaataagcc tgOaagtgaa teagaaaccc accaaaaaag 1140 ctct attaa ggagCataeg gaggagatag aacgcttaaa acgaga cct gccgcagccc 1200 gcgagaaaaa cggOagtgca tattcccgaa gaaaatttta gagtcatgag cggaaaatca 1260 accgttcaag aagagcagat tgtagaattg attgaaaaaa ttggtgctgt tgagOgagga 1320 gctgaatagg gttacagagt tgtttatgga taataaaaat gaacttgacc agcgtaaatc 1380 Cgacccgcaa aataaaacac aagaacttga aaccaOctca aaaacatttg caagaaacta 1440 aactacaact Cgttaaagaa ?aacatacca catcagc tt ggaaagtact gaggagaaac 1500 ttcatgatgc tgccagOcaa gctgcttaac acagttgaag aaactacaaa agatgtatct 1560 ggtctccatt ccaaactgga tcgcaagaag gcagctgacc aacacaatgc agaagctOea 1620 ggatattttt ggcaaaaace cgaacagtct gtttaataat atggaagaac taatcaagga 1680 Cggcagc ca aagcaaaagg ceatgc aga agtacataOa gaccctactt ggcaacctgc 1740 tgtcttccag cgcccctgca ttagatacca ttactacagt agcactcgga cctctcacat 1800 ctattccaga aaatgcgccO tactcatgtt tctcagattt ttaatacgat actaaaagaa 1860 caatcattag cagcagaaag taaaaccgta ctacaggaat cgattaatgt actcaagacc 1920 Ogatcttcca agttcactgg aaatgatttt atccccaact gtggtgccca tactgaaaat 1980 caatagtcaa ctaaagcata ttttcaagac tccatCgaca gOOcggccga caagatagaa 2040 gatcaaaaaa aaaggaaccc agatggcctc tcOagtata ccgtgtaaca atccacatga 2100 actacaagaa aataccattt gttcOcttgg ttgagtcaca aaagcaatgt ggaaacetaa 2160 ctgaagacct gaagacaata aagcagaccc actcccagga acttcgcaag ttaacgaatc 2220 tttggOacag agagactccg tgccctg?ag gaaaagtgtg aaaatataca gaaaccactt 2280 agtagtgtcc aggaaaacat acagcagaaa tctaaggata tagtcaOßca aaatgactct 2340 tcacagtca* aaattttgcg ctgaccc ga tggctcccea caggaactca gaaatcttaa 2400 ecaagaaggt acaaaattgg ttgaagaOat ctgtgaaaca ctctgataaa ctcaatggca 2460 acctggaaaa aatatctcaa gagactgaac agagacgcga atccctgaac acaagaacag 2520 CtcattttOt ctgaacagtg ggt'atccccc tcaaacgaaa gggaacagga accccacaac 2580 ctattggagg ttgtaagcca atgtcgcgag gcttcaagcc cagacaccaO ccgagaaatc 2640 agacggacg aaggcagctc acga?aaaca gcataacatt tttcttgatc agatgactat 2700 tgacgaagat aaatcgaCag cacaaaatct Oagaacttaa cgaaaccata aaaattggct 2760 tgaccaagcc taattgctct ctggaacagg acct?aaact ggacatccca acaggcacga 2820 caccacagag gOaaaagtta tttataccca tcaa?accgg taagaactga accacgcgaa 2880 cacccccttg atcagctgaa aaggaaacag cccgagccgt caatgatgct aaOacrgtcc 2940 agaaaacaac aaagaagaga caatcccgga Cgcggatgca gaagaggcag ttccggggca 3000 gcacaccgaa gaacctctaa gtcaagagcc accOOcgtag atgctggtgc ggaccgctca 3060 tcaaccggcg gggtcccatt tctccOagca caaaaaatca cacggaaaag acaaagaaaa 3120 cagaggcacc aacacaOccg gagaggcc a aagtggaaga aaccacagag cacccggcca 3180 caaagagcag atcacctceg cgagcccaga ccaaccttta «tccacttgg gggttggOca 3240 acttcatttt taaagaaaaa ctcaaaaata aaacccgaaa -cccagaact tgagccttgt 3300 gtatagattt taaaagaata tatatatcag ccgggcgcOg -?gctcta?c tgtaatccca 3360 gctaactttg gaggccgag? cgggtggatt gcttgagccc ¿?gagtttga gaccagcctg 3420 gccaacgcgc gccaaaaceO ttcgcctctg ttaaaaatta cccgggcgtg gtgggcacac 3480 tcctgtaacc ccagctaccg gggaggctga ggcacgagaa :cacttgaac ccagaagcgg 3540 Osgttgcagt gagccaaagg tacaccacta cactccagce cgggcaacag agcaagactc 3600 ggtctcaaaa ataaaattta aaaaagatat aaggcagcac CCgtaaattc agttgaattt 3660 tgatatctac ccacttttct gtcatcccta tagttcactt tgtattaaat tgggtttcat 3720 ttgggatttg caatgcaaac acOgtacttc eagccttcat acaaagtagt tcttttagga 3780 actc 3784 <210> 20 <211> 5340 10 <212> ADN <213> Plasmodium falciparum tcttccttct tctacccccc ggatgttctc ggtagcccaa accctccact tttgtagctt 60 tct ctttta cacgtetcaa agcaggggac gecccctcag gaaatg ccc atcttcaata 120 gcttcaactt ctgtagactg aaacctatca tt ttatcat tattattgtt gttgttgtcg 180 tcgtcgttgt cgccgttatt atccgaataa ccacctgtta tatgaacatt ttgaacattt 2*0 atatctctcc ccctttcata ttcttttaaa ctt ttacac tcatattttc tgcatttaca 300 ccaaatccct 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cggagcaaac acacc atga cattcacaaa cgtcccccCC 1200 atcctttgca catcatcccc catatttaga taaaactcac catccatact CtccaCgaga 1260 tcacaacccg atgcacttgg aatgtctcgt aagtaatctt tcttttttaa tacatctatc 1320 aactccgcca catacatact acatttgttt aaattttgct caaatatatc atcaaaaagt 1380 tttatatttt cattagactt taacacatgt acacgacgcc cccctttctg ctcttgcgat 1440 cctttatttt taccttgtaa aaccccccca gacacaacgr tatataactt ecgtttetet 1500 attttgttta catcagttcg acccgcaaag tcatttacga ttttatcaat attcagatta 1560 tttgtatata ataaaccatc ataaatactt aaagtateat tcaaacattt gctgtgttcc 1622 tcccectcaa cacaactctt tctttreaaa taa?ataata tgtcatataa aacagtacga 1680 25 taacccgtca ccctccttct aataccatta ttaatactat tatattcctt ttcatcatta 1740 j^. ataccgcacc cagaaaaacg tt tacagca ccacctatcc ccttcacaga attcataaaa 1800 acagatttat aatccctcct cgactcatca tataattctt tacttaataa accgaacccg 1860 ctattcattc tttcataaat atcttccaca ttcctattta taag aattc aatatcctcc 1920 aaaatacccr cttcaaatcc ctgcatatct tcicttatca tccccttata attattaact 1980 ataataccac cccccttctc 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tt tgagcat ttta tttta ttcaaataat 5340 i - ^ . -I >? & ? ? *z.. . . 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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1 . Un oligonucleótidos antisentido o un derivado del mismo, del cual corresponde a una parte de una secuencia que codifica egd.
2. Un nucleótidos antisentido o derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1 , del cual corresponde a 8-100 nucleótidos de una secuencia de codificación de egd.
3. Un oligonucleótidos antisentido o un derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de la reivindicación es uno y dos, el cual tiene una longitud de 8 a 20 nucleótidos.
4. Un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 3, el cual corresponde a una parte de egd humana y/o la secuencia de codificación de egd de Plasmodium falciparum. 6. Un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 4; en donde tiene una de las secuencias SEC I D NO: 1 , SEC I D NO: 2, SEC ID NO: 3, SEC I D NO: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC I D NO: 7, SEC I D NO: 8 o SEC ID NO: 9, en donde SEC ID NO. 1 es 5'-CGACGCCATGACGGAATTC-3' SEC I D NO. 2 es d'-AATGGTCTGCATCTCACCA-3' SEC I D NO. 3 es 5'-GGCTGCGACGCCATGACGG-3' SEC ID NO. 4 es d'-ATGACGGAATTC-3' SEC I D NO. d es d'-CCATGACGGAAT-3' SEC ID NO. 6 es d'-ACGCCATGACGG-3' SEC ID NO. 7 es d'-GCGACGCCATGA-3* SEC ID NO. 8 es 5'-GGCTGCGACGCC-3' y SEC ID NO. 9 es d'-TTGGCTGCGACG-3\ 6. Oligonucleótido antisentido o un derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a d, en donde el oligonucieótido tiene una o más modificaciones, y en donde cada modificación se localiza en un puente de internucleósido de fosfodiéster particular y/o una ß-D-2'-desoxiribosa particular, y/o una posición de base de nucleósido natural particular, en comparación con un un oligonucleótido de la misma secuencia que está compuesto de ADN natural. 7. Un oligonucleótido antisentido o un derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 6, en donde en de 1 a d unidades de nucleótidos terminal en el extremo 6' y/o en el extremo 3' del oligonucleótido se protegen a través de puentes de internucleósido modificado localizados en el extremo 5' y/o 3' del nucleósido(s) correspondiente. 8. Un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 7, en donde por lo menos un nucleósido de pirimidina interno y/o un puente de internucleósido localizado en el extremo 6' y/o el extremo 3' de este nucleósido de pirimidina es modificado. 9. Un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 8, en donde cada modificación se selecciona independientemente de: a) el reemplazo del puente de fosfodiéster en el extremo 3' y/o 5' de un nucleósido a través de un puente de internucleósido modificado, b) el reemplazo de un puente de fosfodiéster en el extremo 3' y/o 6' de un nucleósido a través de un puente defosfo, c) el reemplazo de un recibo de fosfato de azúcar de la estructura de base del fosfato de azúcar por otro residuo, d) el reemplazo de una unidad de ß-D-2'-desoxiribosa a través de una unidad de azúcar modificada , e) el reemplazo de una base del nucleósido natural a través de una base de nucleósido modificada, f) la conjugación a una molécula que tiene influencia en las propiedades del oligonucleótido, g) la conjugación a una molécula de oligoadenilato 2'5 -enlazada o un derivado de la misma, opcionalmente a través de una molécula enlazadora apropiada, y h) la introducción de la inversión de 3'-3' y/o d'-d' en el extremo 3' y/o d' del oligonucleótido. 10. Un método para hacer un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo de conformidad con una o más de las reivindicaciones 1 a 9, condensando monómeros adecuadamente protegidos sobre una fase sólida . 1 1 . El uso de un oligonucleótido antisentido o derivado del mismo de acuerdo con una a más de las reivindicaciones 1 a 9 para - *-* -*- - - la inhibición de la expresión de egd. 12. Un método para inhibir la expresión de egd, en donde un oligonucleótido antisentido o un derivado del mismo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 se pone en contacto con un 5 ácido nucleico que codifica egd y se une con este último. 13. Un método para hacer una composición farmacéutica mezclando uno o más oligonucleótidos antisentido o un derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 9 con un excipiente fisiológicamente aceptable y sustancias opcionalmente 10 adicionales. 14. Una composición farmacéutica que comprende por lo menos un oligonucleótido antisentido o un derivado del mismo de acuerdo con una o más de las reivindicaciones 1 a 9. 15
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