FR3021660A1

FR3021660A1 - Copolymeres de formule (i) et utilisations

Info

Publication number: FR3021660A1
Application number: FR1454838A
Authority: FR
Inventors: Patrick Couvreur; Julien Nicolas; Thomas Blin; Abdessatar Chtourou; Nicolas Genevaz
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Paris Sud Paris 11; LFB SA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Paris Sud Paris 11; LFB SA
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2015-12-04
Anticipated expiration: 2034-05-28
Also published as: WO2015181504A1; JP2017525654A; CA2950265A1; FR3021660B1; US20170079928A1; EP3149069A1; AR102029A1

Abstract

La présente invention se rapporte à un copolymère de formule suivante (I) : dans laquelle : - x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, - y est un entier compris entre 10 et 100, de préférence entre 20 et 60, - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, - R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane ou un ligand d'affinité, et - R' représente un hydrogène, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, ainsi qu'à ses utilisations.

Description

1 L'invention concerne un copolymère de formule suivante (I) : (I) dans laquelle : - x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, - y est un entier compris entre 10 et 100, de préférence entre 20 et 60, - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, - R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, ou un ligand d'affinité, et - R' représente un hydrogène, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie. De préférence, R' représente un hydrogène.

Les principes actifs biologiques sont des principes actifs largement utilisés en thérapie. Ces principes actifs sont parfois utilisés pour le traitement de patients pendant de longues périodes, parfois même tout au long de la vie du patient, ce qui implique des administrations répétées à une fréquence plus ou moins importante. Ces administrations répétées causent souvent des inconvénients considérables pour le patient à qui le principe actif est administré.

En général, de fortes doses et une fréquence d'administration élevée sont nécessaires pour atteindre et maintenir l'effet thérapeutique ou prophylactique désiré, ce qui est à la fois restrictif pour le patient et coûteux.

II a été montré que la plupart des principes actifs biologiques sont sensibles à la dégradation, par exemple aux clivages protéolytiques, ce qui peut générer la formation de produits de 3021660 2 dégradation dépourvus d'effet thérapeutique ou prophylactique. Cette dégradation peut diminuer considérablement la demi-vie et/ou la biodisponibilité des principes actifs biologiques. Afin d'améliorer la qualité des traitements thérapeutiques et/ou prophylactiques avec les 5 principes actifs biologiques, il serait avantageux de disposer de compositions pharmaceutiques permettant d'augmenter la demi-vie et/ou la biodisponibilité des principes actifs biologiques, par rapport aux compositions pharmaceutiques actuelles. Il serait particulièrement avantageux de disposer de compositions pharmaceutiques dans lesquelles les principes actifs biologiques présentent une stabilité améliorée et sont moins sensibles aux dégradations, par rapport aux 10 compositions actuelles. En particulier, il serait avantageux de disposer de compositions pharmaceutiques (ou formulations) qui permettent d'augmenter la stabilité des principes actifs biologiques dans l'organisme et de contrôler leur libération dans le temps. Cela permettrait en effet de diminuer la 15 fréquence d'administration desdites formulations, et ainsi d'améliorer la qualité de vie des patients et de faciliter le travail des praticiens. La présente invention a pour but de fournir des moyens pour stabiliser des principes actifs biologiques dans des formulations administrées à un patient, notamment par voie parentérale, 20 et de contrôler leur libération dans le temps. De tels moyens permettent notamment de diminuer la fréquence d'administration desdites formulations. La présente invention a ainsi pour objet un copolymère de formule suivante (I) : 0 0 (I) 25 dans laquelle : - x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, 3021660 3 - y est un entier compris entre 10 et 100, de préférence entre 20 et 60, - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, - R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, ou un ligand d'affinité, et 5 - R' représente un hydrogène, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, un ligand d'affinité, une sonde d'imagerie. De préférence, R' représente un hydrogène. Un tel copolymère est appelé « copolymère selon l'invention » dans la présente demande. 10 En effet, de tels copolymères sont capables de former des micelles encapsulant des principes actifs biologiques, notamment des protéines thérapeutiques, dans une formulation. Ces micelles ont notamment pour effet de stabiliser lesdits principes actifs biologiques. 15 Le copolymère selon l'invention est un copolymère à blocs. Il est composé de deux types de blocs : un bloc de monomères éthylène glycol, l'ensemble desdits monomères formant un bloc de poly(éthylène glycol) (PEG), dont le premier monomère éthylène glycol est lié à un groupe méthoxy, 20 - un bloc de monomères dérivés de glutamate triazolés, et - éventuellement des monomères de glutamate ou des monomères dérivés de glutamate thioétherés. Dans le cas où R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", on parle de monomères dérivés de glutamate thioétherés. Dans le cas où R' représente un hydrogène, on parle de monomères de glutamate. 25 Plus particulièrement, le bloc PEG est composé de x monomères d'éthylène glycol, x étant un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, notamment égal à 45 ou 114. Le bloc PEG composé de 45 monomères d'éthylène glycol a une masse moléculaire totale de 2000 g/mol, et celui de 114 monomères d'éthylène glycol a une masse moléculaire totale de 5000 g/mol.

Le copolymère selon l'invention comprend y monomères dérivés de glutamate triazolés, y étant un entier compris entre 10 et 100, de préférence compris entre 20 et 60, y étant de préférence égal à 21. Enfin, le copolymère selon l'invention peut comprendre z monomères de glutamate ou de monomères dérivés de glutamate thioétherés, z étant un entier compris entre 0 et (100y). Dans un mode de réalisation particulier z est égal à 0.

Le terme "alkyle " désigne un radical hydrocarboné linéaire, cyclique ou ramifié, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone. Le radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone est notamment 3021660 4 choisi parmi les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle, n-pentyle, isopentyle, néopentyle, n-hexyle, n-nonyle, le 2-méthylcyclopentyle et le 1-cyclohexyléthyle. De préférence, le radical alkyle a de 4 à 9 atomes de carbone, et est choisi parmi les radicaux n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle, n-pentyle, isopentyle, néopentyle, 5 n-hexyle, n-nonyle, le 2-méthylcyclopentyle et le 1-cyclohexyléthyle. Le terme « phospholipide » désigne un lipide amphiphile, i.e. constitué d'une « tête » polaire hydrophile et de deux « queues » aliphatiques hydrophobes. De préférence, le phospholipide est choisi parmi : 10 les phosphoglycérides, dont la tête est constituée d'un résidu glycérol 3-phosphate estérifié par une molécule polaire, et dont les deux queues sont les chaînes aliphatiques de deux acides gras ; et les sphingomyélines, constitués de sphingosine, d'un acide gras, d'un phosphate et d'un alcool azoté.

15 Le phosphoglycéride est de préférence choisi parmi l'acide phosphatidique, la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylsérine. Le terme « glycosaminoglycanes » désigne des polymères polysaccharidiques linéaires, de type disaccharide formé d'un hexose lié à un hexosamine. Les glycosaminoglycanes sont 20 d'importants constituants des matrices extracellulaires des tissus conjonctifs. Parmi les glycosaminoglycanes, on peut citer de préférence le chondroïtine sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, l'acide hyaluronique, l'héparane sulfate et l'héparine. Le terme « héparine » désigne l'héparine naturelle et les héparines de bas poids moléculaire 25 (HBPM). L'héparine naturelle est un mélange de différents polymères constitués essentiellement des unités disaccharidiques trisulfatées suivantes : l'acide L-iduronique-2-O-sulfate et la Dglucosamine-N-sulfate, 6-0-sulfate. L'héparine fait partie des glycosaminoglycanes. Les HBPM sont des polymères sulfonés et glycosylés complexes, fabriqués par 30 dépolymérisation chimique ou enzymatique de l'héparine. De préférence, l'HBPM est choisie parmi l'enoxaparine, la tinzaparine, la nadroparine et le fondaparinux (dérivé d'héparine de synthèse). On entend par « ligand d'affinité » une molécule qui se lie de manière réversible et spécifique, 35 par interactions non covalentes (par exemple interactions électrostatiques, hydrophobes, ou par liaisons hydrogène) avec le principe actif biologique, notamment une protéine thérapeutique. On peut notamment citer, comme ligands d'affinité : 3021660 5 les substrats ou les effecteurs, lorsque les protéines thérapeutiques sont les enzymes correspondantes ; les antigènes, lorsque les protéines thérapeutiques sont les anticorps les ciblant ; ou encore 5 les molécules se liant à un récepteur, lorsque les protéines thérapeutiques sont lesdits récepteurs. On entend par « sonde d'imagerie » une molécule permettant la visualisation d'une information à visée médicale et utilisée dans une technique d'imagerie choisie parmi la fluorescence, les 10 rayons X, la résonnance magnétique nucléaire, la réflexion d'ondes ultrasons, la radioactivité, la spectroscopie dans les régions proche infra-rouge ou UV-visible et la tomographie par émission de positons. On peut notamment citer, comme sonde d'imagerie, la sonde FluoroProbe® 547H, émettant dans le visible, ou la sonde FluoroProbe® 682, émettant dans le proche infra-rouge.

15 Le radical R présent dans le copolymère à blocs de formule (I) peut être identique ou différent parmi les monomères dérivés de glutamate triazolés, lesdits monomères étant présents en nombre y. Ainsi, soit R est identique pour ces monomères et il a la même définition à chaque fois, soit R est différent pour ces monomères et dans ce cas on obtient in fine un copolymère avec des 20 monomères dérivés de glutamate triazolés différents. De préférence, le radical R présent dans le copolymère de formule (I) représente un radical alkyle ayant de 4 à 9 atomes de carbone, un phospholipide ou un glycosaminoglycane. Plus préférentiellement, R est un phospholipide, de préférence l'acide phosphatidique. L'acide 25 phosphatidique est un lipide formé par estérification de deux acides gras, de préférence saturés, et d'un acide phosphorique avec un glycérol. De préférence, l'acide phosphatidique selon l'invention est formé par estérification de deux acides gras, de préférence saturés, ayant une chaîne carbonée de 3 à 22 atomes de carbone, et d'un acide phosphorique avec un glycérol. Par « acide gras ayant une chaîne carbonée de 3 à 22 atomes de carbone », on 30 entend de préférence un acide gras choisi parmi l'acide butyrique, l'acide valérique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique et l'acide arachidique. Plus préférentiellement, l'acide phosphatidique selon l'invention est formé par estérification de deux acides butyriques et d'un acide phosphorique avec un glycérol.

35 Le radical R' présent dans le copolymère à blocs de formule (I) peut être identique ou différent parmi les monomères de glutamate ou dérivés de glutamate thioéthérés, lesdits monomères étant présents en nombre z.

3021660 6 Ainsi soit R' est identique pour ces monomères et il a la même définition à chaque fois, soit R' est différent pour ces monomères et dans ce cas on obtient in fine un copolymère avec des monomères de glutamate et des monomères dérivés de glutamate thioéthérés.

5 La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un copolymère selon l'invention pour encapsuler des protéines thérapeutiques. Les protéines thérapeutiques sont notamment choisies parmi les anticorps, les facteurs de coagulation (notamment les facteurs I, Il, V, VII, Vila, VIII, IX, X, XI, XII, XIII et facteur von Willebrand), les facteurs de coagulation modifiés, le facteur H, l'ITI (Inter-alpha-trypsin inhibitor), l'alpha 1-antitrypsine, l'antithrombine, l'albumine, le 10 fibrinogène, le complexe prothrombique humain, la protéine C, l'insuline, les interférons et les érythropoïétines. Par facteur de coagulation modifié, on entend un fragment de ce facteur, une protéine comprenant un fragment de ce facteur ou un facteur muté. De préférence, les protéines thérapeutiques sont les facteurs de coagulation, modifiés ou non modifiés. De préférence, la protéine thérapeutique est le facteur VII, de préférence sous sa forme activée.

15 Les copolymères selon l'invention permettent en effet d'encapsuler des principes actifs biologiques, notamment des protéines thérapeutiques, par la formation de micelles polymériques. Ces micelles sont facilement biodégradables, ont un diamètre moyen compris entre 10 et 150 nm, et sont injectables, notamment par voie intraveineuse.

20 La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, au moins un copolymère de formule (I) selon l'invention, et au moins une protéine thérapeutique. Par « milieu pharmaceutiquement acceptable », on entend un milieu compatible avec une administration chez un patient.

25 De préférence, la composition pharmaceutique comprend, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, des micelles formées par les copolymères de formule (I) selon l'invention, lesdites micelles encapsulant des protéines thérapeutiques. La composition pharmaceutique comprend de préférence un ratio massique protéine thérapeutique : copolymères compris entre 1 :100 et 100 :100.

30 La composition pharmaceutique est de préférence obtenue de la façon suivante : les copolymères sont dissous dans l'eau à une concentration comprise entre 5 et 30 mg/mL. La solution est vortexée pendant 5 à 15 minutes puis passée au bain à ultrasons pendant 5 à 30 minutes. La taille des micelles est contrôlée par diffusion de la lumière, 35 la solution de micelles est ajoutée à une solution aqueuse de protéine thérapeutique, dans un tampon adapté, à un pH adapté, 3021660 7 le mélange est placé entre 4 et 25°C, sous agitation douce, pendant le temps nécessaire à l'encapsulation, soit entre 5 min et 24 h. Avantageusement, la composition pharmaceutique peut contenir un agent stabilisant de type acide aminé ou sucre.

5 Avantageusement, la composition pharmaceutique peut contenir un agent osmotique de type sel, acide aminé ou sucre. La composition pharmaceutique peut être administrée sous forme unitaire d'administration. De telles formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles 10 que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, sublinguales ; les formes d'administration buccale tels que les aérosols ; les implants sous-cutanés ; et les formes d'administration transdermique, topique, intra-péritonéale, intramusculaire, parentérale (intraveineuse, intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée), intrathécale, intranasale et rectale. Une forme préférée est par injection ou perfusion, 15 notamment en intraveineuse, sous forme de solution ou suspension. De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention est adaptée pour une administration parentérale, ce qui comprend une administration sous-cutanée, intradermique, intramusculaire et intraveineuse. L'administration intraveineuse est préférée. La composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous forme liquide ou sous forme 20 lyophilisée. De préférence, dans ce cas, l'homme du métier comprend que, indépendamment de la forme dans laquelle la composition pharmaceutique est stockée (i.e. sous forme lyophilisée ou sous forme liquide), ladite composition pharmaceutique est administrée au patient sous forme liquide.

25 La présente invention a également pour objet des micelles obtenues à partir de copolymères tels que définis dans la présente invention, et comprenant une protéine thérapeutique encapsulée. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant les micelles décrites ci-avant.

30 La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un copolymère selon l'invention, comprenant une étape de chimie Click entre l'alcyne de formule (Il) suivante : 3021660 8 dans laquelle : - x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, - y est un entier compris entre 10 et 100, de préférence entre 20 et 60, 5 - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, et un composé de formule R-N3, R étant tel que défini pour le copolymère selon l'invention, en présence de cuivre (I). L'étape de chimie Click entre l'alcène de formule (II) et le composé R-N3 permet d'obtenir le composé de formule (III) suivante: 10 Ce composé de formule (III) peut ensuite : - soit subir une étape d'oxydation et de clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène, 15 - soit subir une étape de chimie Click avec un thiol de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, 3021660 9 un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R". Ainsi, le procédé de préparation d'un copolymère selon l'invention comprend : 5 a) une étape de chimie Click entre l'alcyne de formule (II) suivante : 0 0 dans laquelle : - x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, - y est un entier compris entre 10 et 100, de préférence entre 20 et 60, et 10 - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, et un composé de formule R-N3, R étant tel que défini pour le copolymère selon l'invention, en présence de cuivre (I), afin d'obtenir le composé de formule (III) suivante : 0 0 puis 15 b) une étape de modification de la fonction allyle du composé de formule (III).

3021660 10 Selon une première variante, l'étape b) est une étape de déprotection du groupement protecteur allyle du composé de formule (III), de préférence cette étape comprend l'oxydation et le clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène.

5 Selon une deuxième variante, l'étape b) est une étape de chimie Click entre le composé de formule (III) et un thiol de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R".

10 Une réaction de chimie Click est une réaction simple à haut rendement et stéréospécifique, qui est réalisée sans groupement protecteur, et qui a une force motrice thermodynamique supérieure ou égale à 20 kcal/mol. Les réactions de chimie Click permettent de lier deux unités différentes.

15 La réaction de chimie Click utilisée dans la présente invention (étape a)) implique la cycloaddition 1,3-dipolaire entre une fonction azide et une fonction alcyne, pour former un 1,2,3triazole substitué. La présence d'un catalyseur de cuivre (I) permet d'obtenir exclusivement le régioisomère 1,4, et diminue le temps et la température de la réaction. Par conséquent, selon le procédé de la présente invention, on fait réagir le copolymère alcyne de formule (II), i.e. 20 comprenant une liaison triple, avec un azide, pour former un copolymère de formule (III) comprenant un cycle triazole. De préférence, le cuivre (I) utilisé dans l'étape de chimie Click selon l'invention est présent sous forme de sels ou de complexes.

25 De tels sels sont notamment choisis parmi le bromure de cuivre (I) (Cu(I)Br) et l'iodure de cuivre (I) (Cu(I)I). Les complexes sont notamment choisis parmi [Cu(OTf)(C6H6)], [Cu(Ph3P)3Br] et [Cu(NCCH3)4][PF6]. Lorsque des sels ou des complexes de cuivre (I) sont utilisés, il est préférable d'ajouter dans le milieu une base azotée, comme la triéthylamine, la N,N-diisopropyléthylamine, la PMDETA 30 (N,N,N',N',N"-pentamethyldiethylenetriamine), la pyridine ou la 2,6-lutidine. La réaction de chimie Click se fait dans un milieu comprenant un solvant. De préférence, le solvant est choisi parmi le toluène, le tétrahydrofurane, le N,N-diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxide, l'acétone, le chloroforme, l'acétonitrile, le butanol, l'eau et leurs mélanges.

35 De préférence, la réaction de chimie Click selon l'invention se fait en présence de Cu(I)Br, PMDETA et DMF, à une température comprise entre 25°C et 50°C, et pendant une durée 3021660 11 comprise entre 15 et 48 heures. Plus préférentiellement, l'étape de chimie Click selon l'invention est réalisée en présence de Cu(I)Br, PMDETA et DMF, à une température comprise entre 30°C et 40°C, de préférence d'environ 35°C, et pendant une durée comprise entre 20h et 40h, de préférence de 24 heures.

5 De préférence, l'étape de chimie Click selon l'invention se fait, en présence de cuivre (I), entre l'alcyne de formule (II) et le dérivé azide de l'acide phosphatidique (composé de formule R-N3) de formule (IV) suivante : 10 CH2-0(P032) R2-00-0-CH I R1-00-0-CH 15 I CH2-N3 (IV) Avec R1 = R2 = chaîne aliphatique d'un acide gras ayant de 3 à 22 atomes de carbone, de préférence -(CH2)2-CH3. De préférence, le dérivé azide de l'acide phosphatidique est formé par 20 estérification de deux acides butyriques et d'un acide phosphorique avec un glycérol (formule (IV) ci-dessus avec R1 = R2 = -(CH2)2-CH3). Le dérivé azide de formule (IV) utilisé est notamment obtenu à partir du diéthyl-L-tartrate. Il permet d'obtenir in fine un copolymère comprenant un acide phosphatidique comme radical R.

25 De préférence, ce dérivé azide de formule (IV) est obtenu par le procédé décrit dans la publication Smith et al, Modular synthesis of biologically active phosphatidic acid probes using Click chemistry, Molecular Biosystems, 2009, 5, 962-972. Notamment, il est obtenu par le procédé décrit dans le schéma 1 de cette publication.

30 Comme décrit ci-avant, le radical R présent dans le copolymère de formule (I) peut être différent parmi les monomères dérivés de glutamate triazolés et les monomères de glutamate. Dans ce cas, on obtient in fine un copolymère avec différents monomères dérivés de glutamate triazolés et différents monomères de glutamate. Un tel copolymère de formule (I) peut être obtenu par le 35 procédé suivant : a) par greffage des molécules possédant des groupements de type azide (notamment en utilisant la chimie Click) et ensuite b) par déprotection du groupement protecteur allyle, afin, dans ce dernier cas, de régénérer des groupements acide carboxylique. On obtient dans ce cas un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène.

3021660 12 De préférence, les fonctions acide carboxylique sont déprotégées suivant le protocole décrit dans la publication de Poché et al, Synthesis of novel y-alkenyl L-glutamate derivatives containing a terminal C-C double bond to produce polypeptides with pendent unsaturation, 5 Macromolecules, 1997, 30, 8081-8084. L'étape de déprotection peut notamment être une étape d'oxydation et de clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène. Lorsque les fonctions acide carboxylique protégées par le groupement allyle ne sont pas 10 déprotégées, cette même fonction peut être engagée dans une réaction de chimie Click, dite réaction Thiol-ène, avec un dérivé thiolé de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, pour former le copolymère de formule (V) suivante : H H H 15 O R N \N N s R" (V) Ce composé est un copolymère de formule (I), où R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", avec x, y, z, R" et R tels que décrits ci-avant. L'invention est maintenant illustrée par différents exemples de réalisation.

20 25 EXEMPLES Exem - le 1 : e - aration du co - ol mère m PEG -b-PPLG21 Etape A préparation du monomère PLG-NCA (Propargyl-L-Glutamate-N-CarboxyAnhydride) 3021660 13 1) Greffage de l'alcool propargylique sur l'acide glutamique : La réaction est schématisée comme suit : OH OH + / HO HOS 5 Dans un ballon est ajouté l'acide L-glutamique (19,6 g, 133 mmol) ainsi que l'alcool propargylique (500 mL, 8,66 mol). Puis, la solution est refroidie à 0°C sous argon. Ensuite, le chlorure de triméthylsilyle (36,2 mL, 333 mmol) est ajouté goutte à goutte à la solution en 1 h. Enfin, la solution est mélangée à 20°C pendant 36 heures. Après réaction, le mélange est filtré 10 afin d'éliminer le produit n'ayant pas réagi. Puis, le produit est précipité dans un volume d'éther diéthylique correspondant à 10 fois le volume de la solution. Le précipité formé est ensuite filtré, redissous dans un mélange 10/1 acétonitrile/DMF. Après 18 heures à 2°C, les cristaux formés sont rincés avec de l'acétonitrile froid et enfin séchés sous vide. On obtient ainsi 25,2 g (rendement de 88%) de y-propargyl-L-glutamate. 15 2) Fermeture du cycle NCA, pour obtenir le monomère PLG-NCA : La réaction est schématisée comme suit : OH Triphogène Acétate d'éthyle 85°C / 6h 0 20 Dans un ballon de type bicol surmonté d'un réfrigérant, sont ajoutés le y-propargyl-L-glutamate (5,5 g, 24,6 mmol) et le triphosgène (2,4 g, 8,1 mmol). Puis, le système est placé sous argon en prenant la précaution de relier la sortie du réfrigérant à une solution de KOH (afin de piéger d'éventuelles traces de phosgène formées lors de la réaction). Puis, l'acétate d'éthyle anhydre (150 mL) est ajouté. Le mélange est ensuite placé sous bullage d'argon à 85°C pendant 6 25 heures. Après réaction, le mélange est filtré, puis lavé très rapidement avec 30 mL d'eau froide puis avec 30 mL d'une solution saturée en NaCI. La phase organique est ensuite séchée avec du MgSO4 puis filtrée et concentrée sous vide. Le produit PLG-NCA (2,9 g, rendement de 55%) 0 HN)L0 3021660 14 doit se conserver au congélateur pour éviter tout risque d'ouverture du cycle Ncarboxyanhydride. Etape B : polymérisation par ouverture de cycle du monomère PLG-NCA amorcée par le 5 mPEG-NH2 -our obtenir le cool mère m PEG -b-PPLG21 La réaction est schématisée comme suit : Copolymère mPEG45-b-PPLG2, (composé de formule (Il)) H\ H / 21 DMF / 72h / 30°C mPEG-NH2 10 Pour la synthèse d'un copolymère mPEG45-b-PPLG2, la synthèse est décrite comme suit. Dans un bicol surmonté d'un réfrigérant dont l'extrémité est reliée à un système de bullage est ajouté le mPEG-NH2 (0,242 g, 0,121 mmol). Puis, le système est placé sous système d'argon. Ensuite, le DMF anhydre est ajouté (15 mL). Enfin, une solution de PLG-NCA (0,5068 g, 2,425 15 mmol) dans le DMF anhydre (5 mL) est ajoutée au mélange précédent. Après 72 heures de réaction à 30°C, le produit est simplement précipité dans 300 mL d'éther diéthylique froid, redissous dans 10 mL de DMF puis précipité une nouvelle fois dans un volume 300 mL d'éther diéthylique froid. Le polymère est ensuite filtré puis séché sous vide pendant une nuit.

20 Exemple 2 : préparation de copolymères de formule (I) selon l'invention Etape A : préparation d'azidobutane (C4) et d'azidononane (C9) La réaction est schématisée comme suit : NaN, 25 DMSO / 95*C f 2417 Avec X = Br ou I Pour la synthèse de l'azidobutane, la synthèse est décrite comme suit. Dans un ballon placé sous argon est ajouté le iodobutane (10 g, 54 mmol) ainsi que l'azoture de 30 sodium (5,26 g, 81 mmol) et le diméthylsulfoxyde anhydre (100 mL). Puis, le système est placé 3021660 15 à 95°C pendant 24 heures. Après réaction, la solution est refroidie puis mélangée à une solution d'eau. La phase aqueuse est ensuite extraite avec l'éther diéthylique. La phase organique est ensuite lavée à l'eau puis séchée avec le MgSO4. Enfin, l'éther diéthylique est évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif et l'azidobutane (4,3 g, 43 mmol, rendement de 80%) 5 est séché sous vide. Eta-e B : réaction de chimie Click entre le co-ol mère m PEG 45-b-PPLG21 obtenu à l'exem-le 1 et l'azidobutane, pour obtenir un copolymère de formule (I) selon l'invention (ci-après « copolymère C4 ») 10 La réaction est schématisée comme suit : Copolymère C4 o o O 45 H H H\ N H t H as H /21 N3 Cu(I)Br / PMDETA DMF / 35°C / 24h /\/ Dans un ballon sont ajoutés le mPEG45-b-PPLG2, (0,4 g, 1,5 mmol de fonction alcyne), l'azidobutane (0,297g, 3 mmol) et le diméthylformamide (10 mL). Ce mélange est dégazé avec 15 l'argon pendant 30 minutes. D'autre part, une solution de Cu(I)Br (0,1075 g, 0,75 mmol), de PMDETA (313 gL, 1,5 mmol) et de diméthylformamide (5 mL) est mise à dégazer pendant 30 minutes. Après dégazage, cette dernière solution est ajoutée au ballon et le mélange est agité pendant 24 heures à 35°C. Puis, la solution est redissoute dans 10 mL de diméthylsulfoxyde et le mélange est ensuite dialysé pendant 7 jours contre une solution d'EDTA 10mM puis pendant 20 5 jours contre une solution d'eau milli-Q. Enfin, le copolymère C4 (0,4735 g) est récupéré après lyophilisation. Eta - e C : réaction de chimie Click entre le co - ol mère m PEG 45-b-PPLG21 obtenu à l'exem -le 1 et l'azidononane, pour obtenir un copolymère de formule (I) selon l'invention (ci-après 25 « copolymère C9 ») La réaction est schématisée comme suit : Copolymère C9 3021660 16 o o H\ 0 NT H as H \ 121 Cu(I)Br PMDETA DMF / 35°C / 24h Dans un ballon sont ajoutés le mPEG45-b-PPLG21 (0,4 g, 1,5 mmol de fonction alcyne), l'azidononane (0,777 g, 3 mmol) et le DMF (10 mL). Ce mélange est dégazé avec l'argon pendant 30 minutes. D'autre part, une solution de Cu(I)Br (0,1075 g, 0,75 mmol), de PMDETA 5 (313 gL, 1,5 mmol) et de diméthylformamide (5 mL) est mise à dégazer pendant 30 minutes. Après dégazage, cette dernière solution est ajoutée au ballon et le mélange est agité pendant 24 heures à 35°C. Puis, la solution est redissoute dans 10 mL de diméthylsulfoxyde et le mélange est ensuite dialysé pendant 7 jours contre une solution d'EDTA 10mM puis pendant 5 jours contre de l'eau milli-Q. Enfin, le copolymère C9 (0,5576 g) est récupéré après 10 lyophilisation. Exemple 3 : tests de micellisation des copolymères C4 et C9 15 1) Protocole : Une solution de copolymères C4 et C9 est préparée en dissolvant 10 mg de copolymère C4 ou C9 dans 2 mL d'eau milli-Q. Puis, le mélange est vortexé pendant 5 minutes et enfin filtré à l'aide d'un filtre 1 lm. 20 2) Résultats : Les résultats montrent que le copolymère C4 est capable de former des micelles de diamètre moyen compris entre 15 nm et 120 nm. Quasiment 12% des micelles formées ont un diamètre 25 moyen de 93 nm. Le copolymère C9 est capable de former des micelles de diamètre moyen compris entre 20 nm et 500 nm. Environ 15% des micelles formées ont un diamètre moyen de 197 nm. 30

Claims

REVENDICATIONS1. Copolymère de formule suivante (I) : (I) dans laquelle : - x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, - y est un entier compris entre 10 et 100, de préférence entre 20 et 60, - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, - R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane ou un ligand d'affinité, et - R' représente un hydrogène, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie.
2. Copolymère selon la revendication 1, caractérisé en ce que le radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone est choisi parmi les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, tert-butyle, n-pentyle, isopentyle, néopentyle, n-hexyle, n-nonyle, le 2-méthylcyclopentyle et le 1-cyclohexyléthyle.
3. Copolymère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R représente un radical alkyle ayant de 4 à 9 atomes de carbone, un phospholipide ou un glycosaminoglycane et en ce que R' représente un hydrogène.
4. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le phospholipide est choisi parmi les phosphoglycérides et les sphingomyélines. 3021660 18
5. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le glycosaminoglycane est l'héparine.
6. Copolymère selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'héparine est choisie parmi 5 l'héparine naturelle, l'enoxaparine, la tinzaparine, la nadroparine et le fondaparinux.
7. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que R est l'acide phosphatidique, de préférence l'acide phosphatidique formé par estérification de deux acides gras, de préférence saturés, ayant une chaîne carbonée de 3 à 22 atomes de carbone, et d'un 10 acide phosphorique avec un glycérol.
8. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que R est identique ou différent parmi les monomères dérivés de glutamate triazolés. 15
9. Composition pharmaceutique comprenant, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, au moins un copolymère selon l'une des revendications 1 à 8, et au moins une protéine thérapeutique.
10. Utilisation d'un copolymère selon l'une des revendications 1 à 8, pour encapsuler une ou 20 plusieurs protéines thérapeutiques.
11. Composition selon la revendication 9 ou utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que les protéines thérapeutiques sont choisies parmi les anticorps, les facteurs de coagulation I, II, V, VII, Vila, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, ou le facteur von Willebrand, les facteurs de 25 coagulation modifiés, le facteur H, l'ITI, l'alpha 1-antitrypsine, l'antithrombine, l'albumine, le fibrinogène, le complexe prothrombique humain, la protéine C, l'insuline et les érythropoïétines.
12. Procédé de préparation d'un copolymère selon l'une des revendications 1 à 8, comprenant : a) une étape de chimie Click entre l'alcyne de formule (II) suivante : 3021660 19 dans laquelle : - x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, 5 - y est un entier compris entre 10 et 100, de préférence entre 20 et 60, et - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, et un composé de formule R-N3, R étant tel que défini selon l'une des revendications 1 à 8, en présence de cuivre (I), afin d'obtenir le composé de formule (III) : 0 0 10 puis b) une étape de modification de la fonction allyle du composé de formule (III).
13. Procédé de préparation selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'étape de chimie Click est réalisée en présence de Cu(I)Br, PMDETA et DMF, à une température comprise entre 15 30°C et 40°C, et pendant une durée comprise entre 20 et 40 heures. 3021660 20
14. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que l'étape b) est une étape de déprotection du groupement protecteur allyle du composé de formule (III), de préférence par oxydation et clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène. 5
15. Procédé selon l'une des revendications 12 ou 13, caractérisé en ce que l'étape b) est une étape de chimie Click entre le composé de formule (III) et un thiol de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, afin d'obtenir un copolymère 10 de formule (I) dans lequel R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R".
16. Micelles obtenues à partir de copolymères tels que définis dans l'une des revendications 1 à 8, et comprenant une protéine thérapeutique encapsulée. 15
17. Composition pharmaceutique comprenant les micelles selon la revendication 16.