WO2015181504A1 - Copolymeres de formule (i) et utilisations - Google Patents

Copolymeres de formule (i) et utilisations Download PDF

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WO2015181504A1
WO2015181504A1 PCT/FR2015/051408 FR2015051408W WO2015181504A1 WO 2015181504 A1 WO2015181504 A1 WO 2015181504A1 FR 2015051408 W FR2015051408 W FR 2015051408W WO 2015181504 A1 WO2015181504 A1 WO 2015181504A1
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formula
copolymer
carbon atoms
group
integer
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PCT/FR2015/051408
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English (en)
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Patrick Couvreur
Julien Nicolas
Thomas BLIN
Abdessatar Chtourou
Nicolas GENEVAZ
Original Assignee
Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies
Centre National De La Recherche Scientifique - Cnrs -
Universite Paris-Sud
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
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    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)

Definitions

  • the invention relates to a copolymer of following formula (I):
  • x is an integer between 10 and 250, preferably between 40 and 120,
  • y is an integer between 4 and 100, preferably between 10 and 100, preferably between 19 and 60, preferably between 20 and 60,
  • z is an integer between 0 and (100-y), preferably equal to 0,
  • R represents an alkyl radical having from 1 to 10 carbon atoms, a phospholipid, a glycosaminoglycan, in particular heparin, or an affinity ligand, and
  • R ' represents hydrogen, -CH 2 -C ⁇ CH, -CH 2 -1 M -1, 2,3-triazole, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SR ", where R "represents an alkyl radical having 1 to 10 carbon atoms, a phospholipid, a glycosaminoglycan, in particular heparin, an affinity ligand or an imaging probe.
  • R ' represents a hydrogen.
  • Biological active principles are active ingredients widely used in therapy. These active ingredients are sometimes used for the treatment of patients for long periods, sometimes even throughout the patient's life, which involves repeated administrations at a greater or lesser frequency. These repeated administrations often cause considerable inconvenience for the patient to whom the active ingredient is administered. In general, high doses and high frequency of administration are required to achieve and maintain the desired therapeutic or prophylactic effect, which is both patient-restrictive and expensive. It has been shown that most biological active principles are sensitive to degradation, for example to proteolytic cleavages, which can generate the formation of degradation products devoid of therapeutic or prophylactic effect. This degradation can significantly reduce the half-life and / or bioavailability of biological active ingredients.
  • compositions which make it possible to increase the half-life and / or the bioavailability of the biological active principles, compared with the pharmaceutical compositions. current. It would be particularly advantageous to have pharmaceutical compositions in which the biological active principles have improved stability and are less sensitive to degradation, compared to current compositions.
  • compositions or formulations which make it possible to increase the stability of the biological active principles in the body and to control their release over time. This would indeed reduce the frequency of administration of said formulations, and thus improve the quality of life of patients and facilitate the work of practitioners.
  • the present invention aims to provide means for stabilizing biological active ingredients in formulations administered to a patient, including parenterally, and control their release over time. Such means make it possible in particular to reduce the frequency of administration of said formulations.
  • x is an integer between 10 and 250, preferably between 40 and 120,
  • y is an integer between 4 and 100, preferably between 10 and 100, preferably between 19 and 60, preferably between 20 and 60,
  • z is an integer between 0 and (100-y), preferably equal to 0,
  • R represents an alkyl radical having from 1 to 10 carbon atoms, a phospholipid, a glycosaminoglycan, in particular heparin, or an affinity ligand, and
  • R ' represents a hydrogen, a group -CH 2 -C ⁇ C, a group -CH 2 -1 H-1, 2,3-triazole, a group -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SR ", where R "represents an alkyl radical having 1 to 10 carbon atoms, a phospholipid, a glycosaminoglycan, in particular heparin, an affinity ligand, an imaging probe.
  • R ' represents a hydrogen.
  • R ' represents the -CH 2 -C ⁇ C group.
  • copolymer according to the invention Such a copolymer is called “copolymer according to the invention” in the present application.
  • such copolymers are capable of forming micelles encapsulating biological active principles, especially proteins, preferably therapeutic proteins, in a formulation. These micelles have the effect of stabilizing said biological active principles.
  • the copolymer according to the invention is a block copolymer. It is composed of two types of blocks:
  • R ' is a group -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SR ", we speak of monomers derived from thioetherated glutamate In the case where R' represents a hydrogen, we speak of glutamate monomers.
  • the PEG block is composed of x ethylene glycol monomers, x being an integer between 10 and 250, preferably between 40 and 120, in particular equal to 45 or 1 14.
  • the PEG block composed of 45 monomers of ethylene glycol has a total molecular weight of 2000 g / mol, and that of 1 14 ethylene glycol monomers has a total molecular weight of 5000 g / mol.
  • the copolymer according to the invention comprises y monomers derived from triazole glutamate, y being an integer between 4 and 100, preferably between 10 and 100, preferably between 19 and 60, preferably between 20 and 60, preferably being equal to 19 or 21.
  • the copolymer according to the invention may comprise monomers of glutamate or of monomers derived from thioetherated glutamate, z being an integer between 0 and (100-y). In a particular embodiment z is equal to 0.
  • alkyl refers to a linear hydrocarbon radical, cyclic or branched, comprising from 1 to 10 carbon atoms.
  • the alkyl radical having 1 to 10 carbon atoms is especially chosen from methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl and neopentyl radicals. , n-hexyl, n-nonyl, 2-methylcyclopentyl and 1-cyclohexylethyl.
  • the alkyl radical has from 4 to 9 carbon atoms, and is chosen from n-butyl, sec-butyl, isobutyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neopentyl and n-hexyl radicals. -Nonyl, 2-methylcyclopentyl and 1-cyclohexylethyl.
  • phospholipid refers to an amphiphilic lipid, i.e. consisting of a hydrophilic polar "head” and two hydrophobic aliphatic "tails".
  • the phospholipid is chosen from:
  • phosphoglycerides whose heads consist of a glycerol 3-phosphate residue esterified by a polar molecule, and whose two tails are the aliphatic chains of two fatty acids;
  • sphingomyelins consisting of sphingosine, a fatty acid, a phosphate and a nitrogenous alcohol.
  • the phosphoglyceride is preferably selected from phosphatidic acid, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine and phosphatidylserine.
  • glycosaminoglycans denotes linear polysaccharide polymers of the disaccharide type formed of a hexose linked to a hexosamine. Glycosaminoglycans are important constituents of extracellular matrices of connective tissues. Among the glycosaminoglycans, there may be mentioned preferably chondroitin sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate, hyaluronic acid, heparan sulfate and heparin.
  • heparin refers to natural heparin and low molecular weight heparins (LMWH).
  • Natural heparin is a mixture of different polymers consisting essentially of the following trisulfated disaccharide units: L-iduronic acid-2-O-sulfate and D-glucosamine-N-sulfate, 6-O-sulfate. Heparin is one of the glycosaminoglycans.
  • LMWHs are complex sulfonated and glycosylated polymers made by chemical or enzymatic depolymerization of heparin.
  • ⁇ is chosen from enoxaparin, tinzaparin, nadroparin and fondaparinux (synthetic heparin derivative).
  • affinity ligand is meant a molecule that binds in a reversible and specific manner, by non-covalent interactions (for example electrostatic, hydrophobic, or hydrogen bonded interactions) with the biological active ingredient, in particular a therapeutic protein. It may be mentioned, as affinity ligands:
  • the affinity ligand is covalently bound to the copolymer of formula (I) by a group which does not bind to the biological active principle.
  • imaging probe means a molecule allowing the visualization of information for medical purposes and used in an imaging technique chosen from fluorescence, X-rays, nuclear magnetic resonance, ultrasonic wave reflection, radioactivity, near infra-red or UV-visible spectroscopy, and positron emission tomography. Imaging probes can include, for example, the FluoroProbe® 547H probe, emitting in the visible, or the FluoroProbe® 682 probe, emitting in the near infra-red.
  • the radical R present in the block copolymer of formula (I) may be identical or different from monomers derived from triazole glutamate, said monomers being present in number y.
  • R is identical for these monomers and it has the same definition each time, or R is different for these monomers and in this case we finally obtain a copolymer with monomers derived from different triazole glutamate.
  • the radical R present in the copolymer of formula (I) represents an alkyl radical having from 4 to 9 carbon atoms, a phospholipid or a glycosaminoglycan. More preferably, R is a phospholipid, preferably phosphatidic acid. Phosphatidic acid is a lipid formed by esterification of two fatty acids, preferably saturated, and a phosphoric acid with a glycerol.
  • the phosphatidic acid according to the invention is formed by esterification of two fatty acids, preferably saturated, having a carbon chain of 3 to 22 carbon atoms, and a phosphoric acid with a glycerol.
  • fatty acid having a carbon chain of 3 to 22 carbon atoms is preferably meant a fatty acid chosen from butyric acid, valeric acid, myristic acid, palmitic acid and stearic acid. and arachidic acid.
  • the phosphatidic acid according to the invention is formed by esterification of two butyric acids and a phosphoric acid with a glycerol.
  • the phosphatidic acid according to the invention is formed by esterification of two valeric acids and a phosphoric acid with a glycerol.
  • R is the phosphatidic acid of the following formula:
  • R 1 and R 2 are identical and represent an aliphatic chain of a fatty acid having from 3 to 22 carbon atoms, preferably R 1 and R 2 are each - (CH 2 ) 2 -CH 3 or - (CH 2 ) 3 -CH 3
  • the radical R 'present in the block copolymer of formula (I) may be identical or different from the glutamate monomers or thioetherated glutamate derivatives, said monomers being present in z number.
  • R ' is identical for these monomers and it has the same definition each time, ie R' is different for these monomers and in this case a copolymer with glutamate monomers and monomers derived from thioetherated glutamate is ultimately obtained.
  • the present invention also relates to the use of a copolymer according to the invention for encapsulating one or more proteins, preferably one or more therapeutic proteins.
  • the therapeutic proteins are chosen in particular from antibodies, coagulation factors (in particular factors I, II, V, VII, VIIa, VIII, IX, X, XI, XII, XIII and von Willebrand factor), modified coagulation factors.
  • H-factor H-factor, ITI (Inter-alpha-trypsin inhibitor), alpha-1 antitrypsin, antithrombin, albumin, fibrinogen, human prothrombin complex, protein C, insulin, interferons and erythropoietins.
  • Modified coagulation factor means a fragment of this factor, a protein comprising a fragment of this factor or a mutated factor.
  • the therapeutic proteins are coagulation factors, modified or unmodified.
  • the therapeutic protein is factor VII, preferably in its activated form, FVIII or FIX.
  • copolymers according to the invention indeed make it possible to encapsulate biological active principles, in particular therapeutic proteins, by the formation of polymeric micelles.
  • These micelles are easily biodegradable, have a mean diameter of between 10 and 150 nm, and are injectable, especially intravenously.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, in a pharmaceutically acceptable medium, at least one copolymer of formula (I) according to the invention, and at least one therapeutic protein.
  • pharmaceutically acceptable medium is meant a medium compatible with administration in a patient.
  • the pharmaceutical composition comprises, in a pharmaceutically acceptable medium, micelles formed by the copolymers of formula (I) according to the invention, said micelles encapsulating therapeutic proteins.
  • the pharmaceutical composition preferably comprises a mass ratio therapeutic protein: copolymers of between 1: 100 and 100: 100.
  • the pharmaceutical composition is preferably obtained as follows:
  • the copolymers are dissolved in water at a concentration of between 5 and 30 mg / ml.
  • the solution is vortexed for 5 to 15 minutes and then passed in an ultrasonic bath for 5 to 30 minutes.
  • the size of the micelles is controlled by light scattering,
  • the micelle solution is added to an aqueous solution of therapeutic protein, in a suitable buffer, at a suitable pH,
  • the pharmaceutical composition may contain a stabilizing agent of amino acid or sugar type.
  • the pharmaceutical composition may contain an osmotic agent of salt, amino acid or sugar type.
  • the pharmaceutical composition can be administered in unit dosage form.
  • suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral, sublingual solutions or suspensions; oral administration forms such as aerosols; subcutaneous implants; and forms of transdermal, topical, intraperitoneal, intramuscular, parenteral (intravenous, intradermal, intramuscular or subcutaneous), intrathecal, intranasal and rectal administration.
  • a preferred form is by injection or infusion, especially intravenously, in the form of a solution or suspension.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is adapted for parenteral administration, which comprises a subcutaneous, intradermal, intramuscular and intravenous administration. Intravenous administration is preferred.
  • the pharmaceutical composition according to the invention may be in liquid form or in freeze-dried form.
  • a pharmaceutical composition is administered to the patient in liquid form.
  • the present invention also relates to micelles obtained from copolymers as defined in the present invention, and comprising an encapsulated therapeutic protein.
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising the micelles described above.
  • the present invention also relates to a method for preparing a copolymer according to the invention, comprising a step of chemistry Click between the alkyne of formula (II) below:
  • x is an integer between 10 and 250, preferably between 40 and 120,
  • y is an integer between 4 and 100, preferably between 10 and 100, preferably between 19 and 60, preferably between 20 and 60,
  • z is an integer between 0 and (100-y), preferably equal to 0,
  • the process for preparing a copolymer according to the invention comprises:
  • x is an integer between 10 and 250, preferably between 40 and 120,
  • y is an integer between 4 and 100, preferably between 10 and 100, preferably between 19 and 60, preferably between 20 and 60, and
  • z is an integer between 0 and (100-y), preferably equal to 0,
  • step b) is a step of deprotection of the allyl protecting group of the compound of formula (III), preferably this step comprises the oxidation and cleavage of the allyl protecting group, in order to obtain a copolymer of formula (I) wherein R 'is hydrogen.
  • step b) is a step of chemistry Click between the compound of formula (III) and a thiol of formula R "-SH, where R" represents an alkyl radical having from 1 to 10 carbon atoms, a phospholipid, a glycosaminoglycan, an affinity ligand or an imaging probe, in order to obtain a copolymer of formula (I) in which R 'is a group -CH 2 -CH 2 -CH 2 -SR.
  • step a) of chemistry Click between the alkyne of formula (II) and the compound of formula R-N3 can also be carried out incompletely, so obtaining a copolymer of formula (I) according to the invention comprising y monomers derived from triazole glutamate, and z glutamate monomers in which R 'represents a group -CH2-C ⁇ CH.
  • a Click Chemistry reaction is a simple, high-throughput, stereospecific reaction that is carried out without a protective group and has a thermodynamic driving force greater than or equal to 20 kcal / mol. Click Chemistry reactions link two different units.
  • the Click chemistry reaction used in the present invention involves the 1,3-dipolar cycloaddition between an azide function and an alkyne function, to form a substituted 1,2,3-triazole.
  • a copper (I) catalyst makes it possible to obtain exclusively the regioisomer 1, 4, and reduces the time and temperature of the reaction. Therefore, according to the process of the present invention, the alkyne copolymer of formula (II), i.e. comprising a triple bond, is reacted with an azide to form a copolymer of formula (III) comprising a triazole ring.
  • the copper (I) used in the Click chemistry step according to the invention is present in the form of salts or complexes.
  • Such salts are in particular chosen from copper bromide (I) (Cu (I) Br) and copper iodide (I) (Cu (I) 1).
  • the complexes are in particular chosen from [Cu (OTf) (C 6 H 6 )], [Cu (Ph 3 P) 3 Br] and [Cu (NCCH 3 ) 4 ] [PF 6 ].
  • a nitrogen base such as triethylamine, N-diisopropylethylamine, PMDETA (/ V, / V, / V
  • the chemical reaction of Click is carried out in a medium comprising a solvent, preferably the solvent is selected from toluene, tetrahydrofuran, A, N, N-pentamethyldiethylenetriamine, pyridine or 2,6-lutidine.
  • the Click chemical reaction according to the invention is carried out in the presence of Cu (I) Br, PMDETA and DMF, at a temperature of between 25 ° and 50 ° C., and for a period of between 15 and 48 hours. More preferably, the Click chemistry step according to the invention is carried out in the presence of Cu (I) Br, PMDETA and DMF, at a temperature of between 30 ° C. and 40 ° C., preferably of about 35 ° C., and for a period of between 20h and 40h, preferably 24 hours.
  • the Click chemistry step according to the invention is, in the presence of copper (I), between the alkyne of formula (II) and the azide derivative of phosphatidic acid (compound of formula RN 3 ) of following formula (IV): CH 2 -0 (P0 3 2 )
  • the azide derivative of formula (IV) used is especially obtained from diethyl-L-tartrate. It makes it possible to obtain in fine a copolymer comprising a phosphatidic acid as radical R.
  • this azide derivative of formula (IV) is obtained by the method described in Smith et al., Modular synthesis of biologically active phosphatidic acid probes using Click chemistry, Molecular Biosystems, 2009, 5, 962-972. In particular, it is obtained by the method described in Scheme 1 of this publication.
  • the compound of formula RN 3 can also be azidobutane or azidononane, in order to obtain copolymers of formula (I) in which R is respectively a butyl or nonyl chain.
  • the radical R present in the copolymer of formula (I) may be different from monomers derived from triazole glutamate and glutamate monomers.
  • a copolymer with different monomers derived from triazole glutamate and various glutamate monomers is finally obtained.
  • Such a copolymer of formula (I) can be obtained by the following method:
  • the carboxylic acid functions are deprotected according to the protocol described in the publication by Poché et al., Synthesis of novel ⁇ -alkenyl L-glutamate derivatives containing a terminal CC double bond to produce polypeptides with unsaturation, Macromolecules, 1997, 30, 8081 -8084.
  • the deprotection step can in particular be a step of oxidation and cleavage of the allyl protecting group, in order to obtain a copolymer of formula (I) in which R 'is a hydrogen.
  • This compound is a copolymer of formula (I), where R 'is a group -Ch Ch Ch S-FT with x, y, z, R "and R as described above.
  • Step A Preparation of PLG-NCA monomer (Proparayl-L-Glutamate-N-CarboxyAnhydride)
  • Step B Ring-opening polymerization of the mPEG-NH initiated PLG-NCA monomer to obtain the mfPEG1 ⁇ -b-PPLG ⁇ copolymer
  • Step A Preparation of Azidobutane (C4) and Azidononane (C9)
  • iodobutane 10 g, 54 mmol
  • sodium azide 5.26 g, 81 mmol
  • anhydrous dimethylsulfoxide 100 mL
  • the system is placed at 95 ⁇ for 24 hours.
  • the solution is cooled and then mixed with a solution of water.
  • the aqueous phase is then extracted with diethyl ether.
  • the organic phase is then washed with water and then dried with MgSO 4 .
  • the diethyl ether is evaporated using a rotary evaporator and azidobutane (4.3 g, 43 mmol, 80% yield) is dried under vacuum.
  • C4 copolymer a copolymer of formula (I) according to the invention
  • the solution is redissolved in 10 mL of dimethylsulfoxide and the mixture is then dialyzed for 7 days against a 10 mM EDTA solution and then for 5 days against a milli-Q water solution. Finally, the C4 copolymer (0.4735 g) is recovered after lyophilization.
  • Step C Click chemistry reaction between the m (PEG) - -b-PPLG ' ⁇ copolymer obtained in Example 1 and the azidononane, to obtain a copolymer of formula (I) according to the invention (hereinafter " C9 copolymer)
  • Step A Preparation of the Azide Derivative of Phosphatidic Acid (Product A 1)
  • the preparation of the azide derivative of the phosphatidic acid requires six synthesis steps.
  • Step 1 The first step of this synthesis is to protect the diol function with an acetal.
  • the reaction is schematized as follows:
  • the product A1 (4.5 g, 16.5 mmol, 85% yield) is obtained in the form of a yellow oil after purification on a silica chromatographic column (eluent: cyclohexane, front ratio of 0.4, developer : phosphomolybdic acid) and evaporation.
  • the second step consists of reducing the ester groups according to alcohol, to obtain the product A2.
  • Product A1 (5 g, 18.4 mmol) is diluted in anhydrous THF (16 mL) under argon.
  • a solution of UAIH4 (1.4 mg, 36.7 mmol) in anhydrous THF (20 mL) is then prepared at 0 ° C under argon.
  • the solution of the product A1 is added dropwise to the solution of LiAIH 4 at ⁇ ' ⁇ .
  • the reaction medium is stirred for a further 1 h at ⁇ ' ⁇ and then 1 h at room temperature.
  • the solution is then cooled to 0 ° C.
  • successive and very slow additions of water (2 mL), 10% NaOH (4 mL) and water (2 mL) are made to stop the reaction.
  • the reaction mixture is stirred for an additional 30 minutes and dried over MgSO 4 for 30 minutes.
  • the solution is finally filtered and concentrated using a rotary evaporator.
  • the third step of the synthesis consists in substituting an alcohol function with an azide function to obtain the product A3.
  • product A2 (1.44 g, 7.66 mmol) is suspended in dichloromethane (40 mL). Then, after complete dissolution, the silver oxide (2.66 g, 1.15 mmol), tosyl chloride (1.606 g, 8.42 mmol) and potassium iodide (128 mg, 0.766 mmol) are added to the suspension. The resulting solution is then stirred at room temperature for 2 hours. To to remove the silver oxide, the reaction medium is filtered through a small silica column using ethyl acetate as eluent. The filtrate is concentrated using a rotary evaporator.
  • the product A3 (1.3 g, 6.1 mmol, 80% yield) is obtained in the form of an orange liquid after purification on a chromatographic column of silica (eluent: ethyl acetate / cyclohexane v / v 1 / 1, frontal ratio of 0.57, developer: phosphomolybdic acid) and evaporation.
  • Step 4 Substitution of the alcohol by a phosphotriester group
  • the fourth step of the synthesis consists in substituting the remaining alcohol function with a phosphotriester group, to obtain the product A4.
  • the product A3 (850 mg, 3.98 mmol) is dissolved in 20 mL of anhydrous dichloromethane. Then, 7H-tetrazole (26.6 mL, 11.96 mmol, 0.45M) is added and the solution is placed at 0 ° C under argon. Then, the dibenzyldiisopropylphosphoramidite (1.442 mL, 4.38 mmol) is added dropwise. Stirring is continued for 10 minutes at ⁇ ' ⁇ and then for 1 hour at room temperature.
  • the solution is again cooled to ⁇ ' ⁇ and the acid n choloroperbenzoic acid (2.06 g, 11.96 mmol, 57% purity) is added to the solution. Stirring is continued for 1 h 30. The reaction is stopped by the addition of a saturated solution of sodium bicarbonate (40 mL). Then, the solution is extracted with dichloromethane (3x100 mL), dried with MgSO 4 and finally concentrated using a rotary evaporator.
  • the product A4 (1.5 g, 3.1 mmol, 80% yield) is obtained in the form of a pale yellow oil after purification on a silica chromatographic column (eluent: ethyl acetate / cyclohexane v / v 1: 1, 0.61 frontal ratio, developer: phosphomolybdic acid) and evaporation.
  • the fifth step of the synthesis consists in deprotecting the diol function, in order to obtain the product A5.
  • the product A4 (1.605 g, 3.39 mmol) is dissolved in methanol (25 mL).
  • P-Toluenesulphonic acid (64.5 mg, 0.339 mmol) is added with stirring.
  • the solution is stirred at ambient temperature for 15 hours and the reaction is stopped by adding a saturated solution of sodium bicarbonate (30 ml).
  • the product is then extracted into chloroform (2 ⁇ 100 mL).
  • the organic phase is dried with MgSO 4 and concentrated using a rotary evaporator.
  • the product A5 (0.873 g, 2.1 mmol, 55% yield) is obtained in the form of a pale yellow oil after purification on a chromatographic column of silica (eluent: ethyl acetate / cyclohexane v / v 8 / 2, 0.36 frontal ratio, developer: phosphomolybdic acid) and evaporation.
  • Step 6 Esterification of the diol with an alkyl chain
  • the sixth and final step of the synthesis is to esterify the diol with two alkyl chains, to obtain the product A6.
  • a carbon chain C5 was used.
  • the product A6 (0.332 g, 0.58 mmol, 49% yield) is obtained in the form of a white solid after purification on a chromatographic column of silica (eluent: ethyl acetate / cyclohexane v / v 1/9 , 0.65 frontal ratio, developer: phosphomolybdic acid) and evaporation.
  • Step C Deprotection of the phosphate group to obtain a copolymer of formula (I) according to the invention (hereinafter "phospholipid copolymer deprotected")
  • step B 42 mg of the copolymer obtained in step B are dissolved in 1.6 ml of dichloromethane under an argon atmosphere, and bromotrimethylsilane (0.350 ml, 2.6 mmol) is added.
  • the reaction medium is then subjected to vigorous stirring for 1 h at room temperature.
  • the solvent is then evaporated under vacuum and the product obtained is taken up in 2 mL of methanol and stirred vigorously for 1 h at room temperature.
  • the methanol is then evaporated under vacuum. Five cycles of washing with methanol / evaporation are then carried out to remove impurities and recover the phospholipid copolymer deprotected according to the invention.
  • a solution of C4 and C9 copolymers is prepared by dissolving 10 mg of C4 or C9 copolymer in 2 mL of milli-Q water. Then, the mixture is vortexed for 5 minutes and finally filtered using a 1 ⁇ filter. 2) Results:
  • the C4 copolymer is capable of forming micelles of average diameter between 15 nm and 120 nm. Almost 12% of the micelles formed have an average diameter of 93 nm.
  • the C9 copolymer is capable of forming micelles of average diameter between 20 nm and 500 nm. About 15% of the micelles formed have an average diameter of 197 nm.
  • the pharmacokinetic profiles of coagulation factors (FVII, FVIII or FIX) encapsulated in micelles of copolymer according to Example 3 are determined after a single intravenous injection in catheterized rats OFA SD (200-250g body weight) at 1 mg / ml. kg, 100 or 200 IU / kg.
  • 3 rats are injected with micelles-FVII, micelles-FVIII, or micelles-FIX, 3 rats are injected with FVII, FVIII or FIX alone, and 2 control rats are injected with micelles alone to evaluate the effects. toxicological.
  • the plasma is collected several times after injection (before injection, 5min, 1h, 3h, 6h, 24h, 48h, 72h and 96h).
  • the blood samples are immediately treated with citrate 10% (sample ratio: citrate equal to 9: 1, 3.13% by weight / volume), centrifuged at 1500 g for 15 minutes at ⁇ ⁇ ' ⁇ , and stored at -20 ' ⁇ before analysis .
  • the concentrations of FVII, FVIII or FIX in the plasma are determined by ELISA, and the data analyzed by non-compartmental analysis using the WinNonlin® version 6.3 software.
  • the pharmacokinetic parameters are determined. They include the maximum plasma concentration (Cmax), the area under the plasma concentration-time curve at from the time of dose administration to the last measurable concentration (AUCLast), elimination half-life (t1 / 2), volume of distribution (Vd), clearance (Cl) and time of average residence (MRT).

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Abstract

La présente invention se rapporte à un copolymère de formule suivante (I) : dans laquelle :- x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, - y est un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100, de préférence entre 19 et 60, - z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0, - R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane ou un ligand d'affinité, et - R' représente un hydrogène, le groupement -CH2-C≡CH, un groupement –CH2-1H-1,2,3-triazole, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R'', où R'' représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, ainsi qu'à ses utilisations.

Description

CO POLYMERES DE FORMULE (I) ET UTILISATIONS
L'invention concerne un copolymère de formule suivante (I) :
Figure imgf000003_0001
dans laquelle :
- x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120,
- y est un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100, de préférence entre 19 et 60, de préférence entre 20 et 60,
- z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0,
- R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, ou un ligand d'affinité, et
- R' représente un hydrogène, un groupement -CH2-C≡CH, un groupement -CH2-1 H-1 ,2,3- triazole, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie. De préférence, R' représente un hydrogène.
Les principes actifs biologiques sont des principes actifs largement utilisés en thérapie. Ces principes actifs sont parfois utilisés pour le traitement de patients pendant de longues périodes, parfois même tout au long de la vie du patient, ce qui implique des administrations répétées à une fréquence plus ou moins importante. Ces administrations répétées causent souvent des inconvénients considérables pour le patient à qui le principe actif est administré. En général, de fortes doses et une fréquence d'administration élevée sont nécessaires pour atteindre et maintenir l'effet thérapeutique ou prophylactique désiré, ce qui est à la fois restrictif pour le patient et coûteux. II a été montré que la plupart des principes actifs biologiques sont sensibles à la dégradation, par exemple aux clivages protéolytiques, ce qui peut générer la formation de produits de dégradation dépourvus d'effet thérapeutique ou prophylactique. Cette dégradation peut diminuer considérablement la demi-vie et/ou la biodisponibilité des principes actifs biologiques.
Afin d'améliorer la qualité des traitements thérapeutiques et/ou prophylactiques avec les principes actifs biologiques, il serait avantageux de disposer de compositions pharmaceutiques permettant d'augmenter la demi-vie et/ou la biodisponibilité des principes actifs biologiques, par rapport aux compositions pharmaceutiques actuelles. Il serait particulièrement avantageux de disposer de compositions pharmaceutiques dans lesquelles les principes actifs biologiques présentent une stabilité améliorée et sont moins sensibles aux dégradations, par rapport aux compositions actuelles.
En particulier, il serait avantageux de disposer de compositions pharmaceutiques (ou formulations) qui permettent d'augmenter la stabilité des principes actifs biologiques dans l'organisme et de contrôler leur libération dans le temps. Cela permettrait en effet de diminuer la fréquence d'administration desdites formulations, et ainsi d'améliorer la qualité de vie des patients et de faciliter le travail des praticiens.
La présente invention a pour but de fournir des moyens pour stabiliser des principes actifs biologiques dans des formulations administrées à un patient, notamment par voie parentérale, et de contrôler leur libération dans le temps. De tels moyens permettent notamment de diminuer la fréquence d'administration desdites formulations.
La présente invention a ainsi pour objet un copolymère de formule suivante (I) :
Figure imgf000005_0001
dans laquelle :
- x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120,
- y est un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100 de préférence entre 19 et 60, de préférence entre 20 et 60,
- z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0,
- R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, ou un ligand d'affinité, et
- R' représente un hydrogène, un groupement -CH2-C≡C, un groupement -CH2-1 H-1 ,2,3- triazole, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, en particulier l'héparine, un ligand d'affinité, une sonde d'imagerie. De préférence, R' représente un hydrogène. De préférence, R' représente le groupement -CH2-C≡C.
Un tel copolymère est appelé « copolymère selon l'invention » dans la présente demande.
En effet, de tels copolymères sont capables de former des micelles encapsulant des principes actifs biologiques, notamment des protéines, de préférence des protéines thérapeutiques, dans une formulation. Ces micelles ont notamment pour effet de stabiliser lesdits principes actifs biologiques.
Le copolymère selon l'invention est un copolymère à blocs. Il est composé de deux types de blocs :
un bloc de monomères éthylène glycol, l'ensemble desdits monomères formant un bloc de poly(éthylène glycol) (PEG), dont le premier monomère éthylène glycol est lié à un groupe méthoxy,
- un bloc de monomères dérivés de glutamate triazolés, et - éventuellement des monomères de glutamate ou des monomères dérivés de glutamate thioétherés. Dans le cas où R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", on parle de monomères dérivés de glutamate thioétherés. Dans le cas où R' représente un hydrogène, on parle de monomères de glutamate.
Plus particulièrement, le bloc PEG est composé de x monomères d'éthylène glycol, x étant un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120, notamment égal à 45 ou 1 14. Le bloc PEG composé de 45 monomères d'éthylène glycol a une masse moléculaire totale de 2000 g/mol, et celui de 1 14 monomères d'éthylène glycol a une masse moléculaire totale de 5000 g/mol.
Le copolymère selon l'invention comprend y monomères dérivés de glutamate triazolés, y étant un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100, de préférence compris entre 19 et 60, de préférence entre 20 et 60, y étant de préférence égal à 19 ou 21 . Enfin, le copolymère selon l'invention peut comprendre z monomères de glutamate ou de monomères dérivés de glutamate thioétherés, z étant un entier compris entre 0 et (100-y). Dans un mode de réalisation particulier z est égal à 0.
Le terme "alkyle " désigne un radical hydrocarboné linéaire, cyclique ou ramifié, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone. Le radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone est notamment choisi parmi les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n-butyle, sec-butyle, isobutyle, te/t-butyle, n-pentyle, isopentyle, néopentyle, n-hexyle, n-nonyle, le 2-méthylcyclopentyle et le 1 -cyclohexyléthyle. De préférence, le radical alkyle a de 4 à 9 atomes de carbone, et est choisi parmi les radicaux n-butyle, sec-butyle, isobutyle, te/t-butyle, n-pentyle, isopentyle, néopentyle, n-hexyle, n-nonyle, le 2-méthylcyclopentyle et le 1 -cyclohexyléthyle. Le terme « phospholipide » désigne un lipide amphiphile, i.e. constitué d'une « tête » polaire hydrophile et de deux « queues » aliphatiques hydrophobes.
De préférence, le phospholipide est choisi parmi :
- les phosphoglycérides, dont la tête est constituée d'un résidu glycérol 3-phosphate estérifié par une molécule polaire, et dont les deux queues sont les chaînes aliphatiques de deux acides gras ; et
- les sphingomyélines, constitués de sphingosine, d'un acide gras, d'un phosphate et d'un alcool azoté.
Le phosphoglycéride est de préférence choisi parmi l'acide phosphatidique, la phosphatidylcholine, la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylsérine.
Le terme « glycosaminoglycanes » désigne des polymères polysaccharidiques linéaires, de type disaccharide formé d'un hexose lié à un hexosamine. Les glycosaminoglycanes sont d'importants constituants des matrices extracellulaires des tissus conjonctifs. Parmi les glycosaminoglycanes, on peut citer de préférence le chondroïtine sulfate, le dermatane sulfate, le kératane sulfate, l'acide hyaluronique, l'héparane sulfate et l'héparine. Le terme « héparine » désigne l'héparine naturelle et les héparines de bas poids moléculaire (HBPM).
L'héparine naturelle est un mélange de différents polymères constitués essentiellement des unités disaccharidiques trisulfatées suivantes : l'acide L-iduronique-2-O-sulfate et la D- glucosamine-N-sulfate, 6-O-sulfate. L'héparine fait partie des glycosaminoglycanes.
Les HBPM sont des polymères sulfonés et glycosylés complexes, fabriqués par dépolymérisation chimique ou enzymatique de l'héparine. De préférence, ΙΉΒΡΜ est choisie parmi l'enoxaparine, la tinzaparine, la nadroparine et le fondaparinux (dérivé d'héparine de synthèse).
On entend par « ligand d'affinité » une molécule qui se lie de manière réversible et spécifique, par interactions non covalentes (par exemple interactions électrostatiques, hydrophobes, ou par liaisons hydrogène) avec le principe actif biologique, notamment une protéine thérapeutique. On peut notamment citer, comme ligands d'affinité :
- les substrats ou les effecteurs, lorsque les protéines thérapeutiques sont les enzymes correspondantes ;
- les antigènes, lorsque les protéines thérapeutiques sont les anticorps les ciblant ; ou encore
- les molécules se liant à un récepteur, lorsque les protéines thérapeutiques sont lesdits récepteurs.
De préférence, le ligand d'affinité est lié de manière covalente au copolymère de formule (I) par un groupement qui ne se lie pas au principe actif biologique.
On entend par « sonde d'imagerie » une molécule permettant la visualisation d'une information à visée médicale et utilisée dans une technique d'imagerie choisie parmi la fluorescence, les rayons X, la résonnance magnétique nucléaire, la réflexion d'ondes ultrasons, la radioactivité, la spectroscopie dans les régions proche infra-rouge ou UV-visible et la tomographie par émission de positons. On peut notamment citer, comme sonde d'imagerie, la sonde FluoroProbe® 547H, émettant dans le visible, ou la sonde FluoroProbe® 682, émettant dans le proche infra-rouge. Le radical R présent dans le copolymère à blocs de formule (I) peut être identique ou différent parmi les monomères dérivés de glutamate triazolés, lesdits monomères étant présents en nombre y. Ainsi, soit R est identique pour ces monomères et il a la même définition à chaque fois, soit R est différent pour ces monomères et dans ce cas on obtient in fine un copolymère avec des monomères dérivés de glutamate triazolés différents. De préférence, le radical R présent dans le copolymère de formule (I) représente un radical alkyle ayant de 4 à 9 atomes de carbone, un phospholipide ou un glycosaminoglycane. Plus préférentiellement, R est un phospholipide, de préférence l'acide phosphatidique. L'acide phosphatidique est un lipide formé par estérification de deux acides gras, de préférence saturés, et d'un acide phosphorique avec un glycérol. De préférence, l'acide phosphatidique selon l'invention est formé par estérification de deux acides gras, de préférence saturés, ayant une chaîne carbonée de 3 à 22 atomes de carbone, et d'un acide phosphorique avec un glycérol. Par « acide gras ayant une chaîne carbonée de 3 à 22 atomes de carbone », on entend de préférence un acide gras choisi parmi l'acide butyrique, l'acide valérique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide stéarique et l'acide arachidique.
Plus préférentiellement, l'acide phosphatidique selon l'invention est formé par estérification de deux acides butyriques et d'un acide phosphorique avec un glycérol.
Alternativement, plus préférentiellement, l'acide phosphatidique selon l'invention est formé par estérification de deux acides valériques et d'un acide phosphorique avec un glycérol. De préférence, R est l'acide phosphatidique de formule suivante :
CH2-0(P03 2 )
R2-CO-0-CH RrCO-O-CH
I
CH2- où R1 et R2 sont identiques et représentent une chaîne aliphatique d'un acide gras ayant de 3 à 22 atomes de carbone, de préférence R1 et R2 sont chacun -(CH2)2-CH3 ou -(CH2)3-CH3
Le radical R' présent dans le copolymère à blocs de formule (I) peut être identique ou différent parmi les monomères de glutamate ou dérivés de glutamate thioéthérés, lesdits monomères étant présents en nombre z.
Ainsi soit R' est identique pour ces monomères et il a la même définition à chaque fois, soit R' est différent pour ces monomères et dans ce cas on obtient in fine un copolymère avec des monomères de glutamate et des monomères dérivés de glutamate thioéthérés. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un copolymère selon l'invention pour encapsuler une ou plusieurs protéines, de préférence une ou plusieurs protéines thérapeutiques. Les protéines thérapeutiques sont notamment choisies parmi les anticorps, les facteurs de coagulation (notamment les facteurs I, II, V, VII, Vlla, VIII, IX, X, XI, XII, XIII et facteur von Willebrand), les facteurs de coagulation modifiés, le facteur H, l'ITI (Inter-alpha- trypsin inhibitor), l'alpha 1 -antitrypsine, l'antithrombine, l'albumine, le fibrinogène, le complexe prothrombique humain, la protéine C, l'insuline, les interférons et les érythropoïétines. Par facteur de coagulation modifié, on entend un fragment de ce facteur, une protéine comprenant un fragment de ce facteur ou un facteur muté. De préférence, les protéines thérapeutiques sont les facteurs de coagulation, modifiés ou non modifiés. De préférence, la protéine thérapeutique est le facteur VII, de préférence sous sa forme activée, le FVIII ou le FIX.
Les copolymères selon l'invention permettent en effet d'encapsuler des principes actifs biologiques, notamment des protéines thérapeutiques, par la formation de micelles polymériques. Ces micelles sont facilement biodégradables, ont un diamètre moyen compris entre 10 et 150 nm, et sont injectables, notamment par voie intraveineuse.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, au moins un copolymère de formule (I) selon l'invention, et au moins une protéine thérapeutique. Par « milieu pharmaceutiquement acceptable », on entend un milieu compatible avec une administration chez un patient.
De préférence, la composition pharmaceutique comprend, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, des micelles formées par les copolymères de formule (I) selon l'invention, lesdites micelles encapsulant des protéines thérapeutiques.
La composition pharmaceutique comprend de préférence un ratio massique protéine thérapeutique : copolymères compris entre 1 :100 et 100 :100.
La composition pharmaceutique est de préférence obtenue de la façon suivante :
- les copolymères sont dissous dans l'eau à une concentration comprise entre 5 et 30 mg/mL. La solution est vortexée pendant 5 à 15 minutes puis passée au bain à ultrasons pendant 5 à 30 minutes. La taille des micelles est contrôlée par diffusion de la lumière,
- la solution de micelles est ajoutée à une solution aqueuse de protéine thérapeutique, dans un tampon adapté, à un pH adapté,
- le mélange est placé entre 4 et 25^, sous agitation douce, pendant le temps nécessaire à l'encapsulation, soit entre 5 min et 24 h. Avantageusement, la composition pharmaceutique peut contenir un agent stabilisant de type acide aminé ou sucre.
Avantageusement, la composition pharmaceutique peut contenir un agent osmotique de type sel, acide aminé ou sucre.
La composition pharmaceutique peut être administrée sous forme unitaire d'administration. De telles formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, sublinguales ; les formes d'administration buccale tels que les aérosols ; les implants sous-cutanés ; et les formes d'administration transdermique, topique, intra-péritonéale, intramusculaire, parentérale (intraveineuse, intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée), intrathécale, intranasale et rectale. Une forme préférée est par injection ou perfusion, notamment en intraveineuse, sous forme de solution ou suspension. De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention est adaptée pour une administration parentérale, ce qui comprend une administration sous-cutanée, intradermique, intramusculaire et intraveineuse. L'administration intraveineuse est préférée.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut être sous forme liquide ou sous forme lyophilisée. De préférence, dans ce cas, l'homme du métier comprend que, indépendamment de la forme dans laquelle la composition pharmaceutique est stockée (i.e. sous forme lyophilisée ou sous forme liquide), ladite composition pharmaceutique est administrée au patient sous forme liquide.
La présente invention a également pour objet des micelles obtenues à partir de copolymères tels que définis dans la présente invention, et comprenant une protéine thérapeutique encapsulée. L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant les micelles décrites ci-avant.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un copolymère selon l'invention, comprenant une étape de chimie Click entre l'alcyne de formule (II) suivante :
Figure imgf000011_0001
dans laquelle :
- x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120,
- y est un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100, de préférence entre 19 et 60, de préférence entre 20 et 60,
- z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0,
et un composé de formule R-N3, R étant tel que défini pour le copolymère selon l'invention, en présence de cuivre (I).
L'étape de chimie Click entre l'alcène de formule (II) et le composé R-N3 permet d'obtenir le composé de formule (III) suivante:
Figure imgf000011_0002
Ce composé de formule (III) peut ensuite :
- soit subir une étape d'oxydation et de clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène, - soit subir une étape de chimie Click avec un thiol de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R".
Ainsi, le procédé de préparation d'un copolymère selon l'invention comprend :
a) une étape de chimie Click entre l'alcyne de formule (II) suivante :
Figure imgf000012_0001
dans laquelle :
- x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120,
- y est un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100, de préférence entre 19 et 60 de préférence entre 20 et 60, et
- z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0,
et un composé de formule R-N3, R étant tel que défini pour le copolymère selon l'invention, en présence de cuivre (I), afin d'obtenir le composé de formule (III) suivante :
O O
Figure imgf000012_0002
puis
b) de préférence, lorsque z est différent de 0, une étape de modification de la fonction allyle du composé de formule (III). Selon une première variante, l'étape b) est une étape de déprotection du groupement protecteur allyle du composé de formule (III), de préférence cette étape comprend l'oxydation et le clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène.
Selon une deuxième variante, l'étape b) est une étape de chimie Click entre le composé de formule (III) et un thiol de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R .
Lorsque z est égal à 0 pour le composé de formule (II), l'étape a) de chimie Click entre l'alcyne de formule (II) et le composé de formule R-N3 peut également être réalisée de façon incomplète, de façon à obtenir un copolymère de formule (I) selon l'invention comprenant y monomères dérivés de glutamate triazolés, et z monomères de glutamate dans lesquels R' représente un groupement -CH2-C≡CH.
Une réaction de chimie Click est une réaction simple à haut rendement et stéréospécifique, qui est réalisée sans groupement protecteur, et qui a une force motrice thermodynamique supérieure ou égale à 20 kcal/mol. Les réactions de chimie Click permettent de lier deux unités différentes.
La réaction de chimie Click utilisée dans la présente invention (étape a)) implique la cycloaddition 1 ,3-dipolaire entre une fonction azide et une fonction alcyne, pour former un 1 ,2,3- triazole substitué. La présence d'un catalyseur de cuivre (I) permet d'obtenir exclusivement le régioisomère 1 ,4, et diminue le temps et la température de la réaction. Par conséquent, selon le procédé de la présente invention, on fait réagir le copolymère alcyne de formule (II), i.e. comprenant une liaison triple, avec un azide, pour former un copolymère de formule (III) comprenant un cycle triazole.
De préférence, le cuivre (I) utilisé dans l'étape de chimie Click selon l'invention est présent sous forme de sels ou de complexes.
De tels sels sont notamment choisis parmi le bromure de cuivre (I) (Cu(l)Br) et l'iodure de cuivre (I) (Cu(l)l). Les complexes sont notamment choisis parmi [Cu(OTf)(C6H6)], [Cu(Ph3P)3Br] et [Cu(NCCH3)4][PF6]. Lorsque des sels ou des complexes de cuivre (I) sont utilisés, il est préférable d'ajouter dans le milieu une base azotée, comme la triéthylamine, la A/JV-diisopropyléthylamine, la PMDETA (/V,/V,/V,/V,/V"-pentaméthyldiéthylenetriamine), la pyridine ou la 2,6-lutidine. La réaction de chimie Click se fait dans un milieu comprenant un solvant. De préférence, le solvant est choisi parmi le toluène, le tétrahydrofurane, le A/JV-diméthylformamide (DMF), le diméthylsulfoxide, l'acétone, le chloroforme, l'acétonitrile, le butanol, l'eau et leurs mélanges.
De préférence, la réaction de chimie Click selon l'invention se fait en présence de Cu(l)Br, PMDETA et DMF, à une température comprise entre 25^ et 50 'C, et pendant une durée comprise entre 15 et 48 heures. Plus préférentiellement, l'étape de chimie Click selon l'invention est réalisée en présence de Cu(l)Br, PMDETA et DMF, à une température comprise entre 30°C et 40 ^, de préférence d'environ 35°C, et pendant une durée comprise entre 20h et 40h, de préférence de 24 heures.
De préférence, l'étape de chimie Click selon l'invention se fait, en présence de cuivre (I), entre l'alcyne de formule (II) et le dérivé azide de l'acide phosphatidique (composé de formule R-N3) de formule (IV) suivante : CH2-0(P03 2 )
R2-CO-0-CH
RrCO-O-CH
I
CH2-N3 (IV)
Avec R1 = R2 = chaîne aliphatique d'un acide gras ayant de 3 à 22 atomes de carbone, de préférence -(CH2)2-CH3 ou -(CH2)3-CH3. De préférence, le dérivé azide de l'acide phosphatidique est formé par estérification de deux acides butyriques et d'un acide phosphorique avec un glycérol (formule (IV) ci-dessus avec R1 = R2 = -(CH2)2-CH3). De préférence, le dérivé azide de l'acide phosphatidique est formé par estérification de deux acides valériques et d'un acide phosphorique avec un glycérol (formule (IV) ci-dessus avec R1 = R2 = -(CH2)3-CH3).
Le dérivé azide de formule (IV) utilisé est notamment obtenu à partir du diéthyl-L-tartrate. Il permet d'obtenir in fine un copolymère comprenant un acide phosphatidique comme radical R. De préférence, ce dérivé azide de formule (IV) est obtenu par le procédé décrit dans la publication Smith et al, Modular synthesis of biologically active phosphatidic acid probes using Click chemistry, Molecular Biosystems, 2009, 5, 962-972. Notamment, il est obtenu par le procédé décrit dans le schéma 1 de cette publication.
Le composé de formule R-N3 peut également être l'azidobutane ou l'azidononane, afin d'obtenir des copolymères de formule (I) dans lesquels R est respectivement une chaîne butyle ou nonyle.
Comme décrit ci-avant, le radical R présent dans le copolymère de formule (I) peut être différent parmi les monomères dérivés de glutamate triazolés et les monomères de glutamate. Dans ce cas, on obtient in fine un copolymère avec différents monomères dérivés de glutamate triazolés et différents monomères de glutamate. Un tel copolymère de formule (I) peut être obtenu par le procédé suivant :
a) par greffage des molécules possédant des groupements de type azide (notamment en utilisant la chimie Click) et ensuite
b) par déprotection du groupement protecteur allyle, afin, dans ce dernier cas, de régénérer des groupements acide carboxylique. On obtient dans ce cas un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène.
De préférence, les fonctions acide carboxylique sont déprotégées suivant le protocole décrit dans la publication de Poché et al, Synthesis of novel γ-alkenyl L-glutamate derivatives containing a terminal C-C double bond to produce polypeptides with pendent unsaturation, Macromolecules, 1997, 30, 8081 -8084. L'étape de déprotection peut notamment être une étape d'oxydation et de clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène.
Lorsque les fonctions acide carboxylique protégées par le groupement allyle ne sont pas déprotégées, cette même fonction peut être engagée dans une réaction de chimie Click, dite réaction Thiol-ène, avec un dérivé thiolé de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, pour former le copolymère de formule (V) suivante :
Figure imgf000016_0001
(V)
Ce composé est un copolymère de formule (I), où R' est un groupement -Ch Ch Ch S-FT avec x, y, z, R" et R tels que décrits ci-avant.
L'invention est maintenant illustrée par différents exemples de réalisation. EXEMPLES Exemple 1 : préparation du copolymère mfPEG b-PPLGgi
Etape A : préparation du monomère PLG-NCA (Proparayl-L-Glutamate-N-CarboxyAnhydride)
1 ) Greffage de l'alcool propargylique sur l'acide qlutamique
La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000016_0002
Dans un ballon est ajouté l'acide L-glutamique (19,6 g, 133 mmol) ainsi que l'alcool propargylique (500 mL, 8,66 mol). Puis, la solution est refroidie à 0°C sous argon. Ensuite, le chlorure de triméthylsilyle (36,2 mL, 333 mmol) est ajouté goutte à goutte à la solution en 1 h. Enfin, la solution est mélangée à 20 ^ pendant 36 heures. Après réaction, le mélange est filtré afin d'éliminer le produit n'ayant pas réagi. Puis, le produit est précipité dans un volume d'éther diéthylique correspondant à 10 fois le volume de la solution. Le précipité formé est ensuite filtré, redissous dans un mélange 10/1 acétonitrile/DMF. Après 18 heures à 2 <Ό, les cristaux formés sont rincés avec de l'acétonitrile froid et enfin séchés sous vide. On obtient ainsi 25,2 g (rendement de 88%) de γ-propargyl-L-glutamate. 2) Fermeture du cycle NCA pour obtenir le monomère PLG-NCA :
La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000017_0001
Dans un ballon de type bicol surmonté d'un réfrigérant, sont ajoutés le γ-propargyl-L-glutamate (5,5 g, 24,6 mmol) et le triphosgène (2,4 g, 8,1 mmol). Puis, le système est placé sous argon en prenant la précaution de relier la sortie du réfrigérant à une solution de KOH (afin de piéger d'éventuelles traces de phosgène formées lors de la réaction). Puis, l'acétate d'éthyle anhydre (150 mL) est ajouté. Le mélange est ensuite placé sous bullage d'argon à 85 'Ό pendant 6 heures. Après réaction, le mélange est filtré, puis lavé très rapidement avec 30 mL d'eau froide puis avec 30 mL d'une solution saturée en NaCI. La phase organique est ensuite séchée avec du MgS04 puis filtrée et concentrée sous vide. Le produit PLG-NCA (2,9 g, rendement de 55%) est conservé au congélateur sous argon pour éviter tout risque d'ouverture du cycle N- carboxyanhydride.
Etape B : polymérisation par ouverture de cycle du monomère PLG-NCA amorcée par le mPEG-NH , pour obtenir le copolymère mfPEGl^-b-PPLG^
La réaction est schématisée comme suit : Copolymère mPEG45-ib-PPLG2i (composé de formule (II))
Figure imgf000017_0002
Pour la synthèse d'un copolymère mPEG45-ib-PPLG2i la synthèse est décrite comme suit.
Dans un bicol surmonté d'un réfrigérant dont l'extrémité est reliée à un système de bullage est ajouté le mPEG-NH2 (0,242 g, 0,121 mmol). Puis, le système est placé sous système d'argon. Ensuite, le DMF anhydre est ajouté (15 mL). Enfin, une solution de PLG-NCA (0,5068 g, 2,425 mmol) dans le DMF anhydre (5 mL) est ajoutée au mélange précédent. Après 72 heures de réaction à 30°C, le produit est simplement précipité dans 300 mL d'éther diéthylique froid, redissous dans 10 mL de DMF puis précipité une nouvelle fois dans un volume 300 mL d'éther diéthylique froid. Le polymère est ensuite filtré puis séché sous vide pendant une nuit.
Exemple 2 : préparations de copolymères de formule (I) selon l'invention
1 ) Copolymères obtenus avec azidobutane ou azidononane :
Etape A : préparation d'azidobutane (C4) et d'azidononane (C9)
La réaction est schématisée comme suit :
' : :;il f; DMSO / 95°C / 2 h ' ' i su fi
Avec X = Br ou I Pour la synthèse de l'azidobutane, la synthèse est décrite comme suit.
Dans un ballon placé sous argon est ajouté le iodobutane (10 g, 54 mmol) ainsi que l'azoture de sodium (5,26 g, 81 mmol) et le diméthylsulfoxyde anhydre (100 mL). Puis, le système est placé à 95^ pendant 24 heures. Après réaction, la solution est refroidie puis mélangée à une solution d'eau. La phase aqueuse est ensuite extraite avec l'éther diéthylique. La phase organique est ensuite lavée à l'eau puis séchée avec le MgS04. Enfin, l'éther diéthylique est évaporé à l'aide d'un évaporateur rotatif et l'azidobutane (4,3 g, 43 mmol, rendement de 80%) est séché sous vide.
Figure imgf000018_0001
1 et l'azidobutane, pour obtenir un copolymère de formule (I) selon l'invention (ci-après « copolymère C4 »)
La réaction est schématisée comme suit : Copolymère C4.
Figure imgf000019_0001
Dans un ballon sont ajoutés le mPEG >-PPLG2i (0,4 g, 1 ,5 mmol de fonction alcyne), l'azidobutane (0,297g, 3 mmol) et le diméthylformamide (10 mL). Ce mélange est dégazé avec l'argon pendant 30 minutes. D'autre part, une solution de Cu(l)Br (0,1075 g, 0,75 mmol), de PMDETA (313 μΙ_, 1 ,5 mmol) et de diméthylformamide (5 mL) est mise à dégazer pendant 30 minutes. Après dégazage, cette dernière solution est ajoutée au ballon et le mélange est agité pendant 24 heures à 35^. Puis, la solution est redissoute dans 10 mL de diméthylsulfoxyde et le mélange est ensuite dialysé pendant 7 jours contre une solution d'EDTA 10mM puis pendant 5 jours contre une solution d'eau milli-Q. Enfin, le copolymère C4 (0,4735 g) est récupéré après lyophilisation.
Etape C : réaction de chimie Click entre le copolymère m(PEG)^-b-PPLG '^obtenu à l'exemple 1 et l'azidononane, pour obtenir un copolymère de formule (I) selon l'invention (ci-après « copolymère C9 »)
La réaction est schématisée comme suit :
Copolymère C9.
Figure imgf000019_0002
Dans un ballon sont ajoutés le mPEG45-ib-PPLG2i (0,4 g, 1 ,5 mmol de fonction alcyne), l'azidononane (0,777 g, 3 mmol) et le DMF (10 mL). Ce mélange est dégazé avec l'argon pendant 30 minutes. D'autre part, une solution de Cu(l)Br (0,1075 g, 0,75 mmol), de PMDETA
(313 μ\-, 1 ,5 mmol) et de diméthylformamide (5 mL) est mise à dégazer pendant 30 minutes.
Après dégazage, cette dernière solution est ajoutée au ballon et le mélange est agité pendant
24 heures à 35°C. Puis, la solution est redissoute dans 10 mL de diméthylsulfoxyde et le mélange est ensuite dialysé pendant 7 jours contre une solution d'EDTA 10mM puis pendant 5 jours contre de l'eau milli-Q. Enfin, le copolymère C9 (0,5576 g) est récupéré après lyophilisation. 2) Copolymères obtenus avec le dérivé azide de l'acide phosphatidique:
Etape A : préparation du dérivé azide de l'acide phosphatidique (produit A 1)
La préparation du dérivé azide de l'acide phosphatidique nécessite six étapes de synthèse.
Etape 1 : La première étape de cette synthèse consiste à protéger la fonction diol par un acétal. La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000020_0001
Dans un ballon sont ajoutés le diéthyl-L-tartrate (4,05 g, 19,6 mmol) et le toluène (130 mL). A cette solution sont ajoutés la cyclopentanone (8,7 mL, 98 mmol) et l'acide p- toluènesulfonique (373 mg, 1 ,96 mmol). Ensuite, une distillation azéotropique est effectuée à 130°C pendant 15 heures à l'aide d'un montage Dean-Stark. Puis, du bicarbonate de sodium solide (329 mg) est ajouté à la solution et l'agitation est maintenue pendant 10 minutes supplémentaires. Le milieu réactionnel est filtré et le filtrat est concentré à l'aide d'un évaporateur rotatif. Enfin, le produit A1 (4,5 g, 16,5 mmol, 85% de rendement) est obtenu sous forme d'une huile jaune après purification sur colonne chromatographique de silice (éluant : cyclohexane, rapport frontal de 0,4, révélateur : l'acide phosphomolybdique) et évaporation.
Etape 2 : Réduction des groupements ester en alcool
La deuxième étape consiste à réduire les groupements ester en fonction alcool, pour obtenir le produit A2.
La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000021_0001
Le produit A1 (5 g, 18,4 mmol) est dilué dans du THF anhydre (16 mL) sous argon. Une solution de UAIH4 (1 ,4 mg, 36,7 mmol) dans le THF anhydre (20 mL) est ensuite préparée à Ο'Ό sous argon. La solution du produit A1 est ajoutée goutte à goutte à la solution de LiAIH4 à Ο 'Ό. Une fois l'addition terminée, le milieu réactionnel est agité pendant 1 h supplémentaire à Ο 'Ό, puis 1 h à température ambiante. La solution est ensuite refroidie à 0°C. Ensuite, des additions successives et très lentes d'eau (2 mL), de NaOH 10% (4 mL) et d'eau (2 mL) sont réalisées afin de stopper la réaction. Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes supplémentaires et séché sur MgS04 pendant 30 minutes. La solution est enfin filtrée et concentrée à l'aide d'un évaporateur rotatif.
Enfin, le produit A2 (3,3 g, 17,4 mmol, 95% de rendement) est obtenu sous forme d'un solide blanc après purification sur colonne chromatographique de silice (éluant : acétate d'éthyle, Rapport frontal=0,48, révélateur : acide phosphomolybdique) et évaporation. Etape 3 : Substitution d'un alcool par une fonction azoture
La troisième étape de la synthèse consiste à substituer une fonction alcool par une fonction azoture, pour obtenir le produit A3.
La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000021_0002
Dans un ballon, le produit A2 (1 ,44 g, 7,66 mmol), est suspendu dans le dichlorométhane (40 mL). Puis, après complète dissolution, l'oxyde d'argent (2,66 g, 1 1 ,5 mmol), le chlorure de tosyle (1 ,606 g, 8,42 mmol) et l'iodure de potassium (128 mg, 0,766 mmol) sont ajoutés à la suspension. La solution résultante est alors agitée à température ambiante pendant 2h. Afin d'éliminer l'oxyde d'argent, le milieu réactionnel est filtré à travers une petite colonne de silice en utilisant l'acétate d'éthyle comme éluant. Le filtrat est concentré à l'aide d'un évaporateur rotatif. Ensuite, le DMF (80 mL) et l'azoture de sodium (1 ,244 g, 19,16 mmol) sont ajoutés au filtrat. La solution est ensuite agitée à 85 °C pendant 15 heures. La solution est concentrée à l'aide d'un évaporateur rotatif. De l'eau (30mL) est ajoutée puis le produit est extrait avec du chloroforme (3x100 mL), la phase organique est séchée avec du MgS04 et concentré à l'aide d'un évaporateur rotatif.
Enfin, le produit A3 (1 ,3 g, 6,1 mmol, 80% de rendement) est obtenu sous forme d'un liquide orangé après purification sur colonne chromatographique de silice (éluant : acétate d'éthyle/cyclohexane v/v 1 /1 , Rapport frontal de 0,57, révélateur : l'acide phosphomolybdique) et évaporation.
Etape 4 : Substitution de l'alcool par un groupement phosphotriester
La quatrième étape de la synthèse consiste à substituer la fonction alcool restante par un groupement phosphotriester, pour obtenir le produit A4.
La réaction est schématisée comme suit
Figure imgf000022_0001
Dans un ballon, le produit A3 (850 mg, 3,98 mmol) est dissous dans 20 mL de dichlorométhane anhydre. Puis, le 7H-tétrazole (26,6 mL, 1 1 ,96 mmol, 0,45M) est ajouté et la solution est placée à 0°C sous argon. Ensuite, le dibenzyldiisopropylphosphoramidite (1 ,442 mL, 4,38 mmol) est ajouté goutte à goutte. L'agitation est poursuivie pendant 10 minutes à Ο'Ό et ensuite pendant 1 h à température ambiante. A ce point, la solution est de nouveau refroidie à Ο 'Ό et l'acide m- choloroperbenzoïque (2,06 g, 1 1 ,96 mmol, 57% de pureté) est ajouté à la solution. L'agitation est poursuivie pendant 1 h30. La réaction est arrêtée par l'ajout d'une solution saturée de bicarbonate de sodium (40 mL). Puis, la solution est extraite avec le dichlorométhane (3x100 mL), séché avec du MgS04 et enfin concentrée à l'aide d'un évaporateur rotatif. Enfin, le produit A4 (1 ,5 g, 3,1 mmol, 80% de rendement) est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle après purification sur colonne chromatographique de silice (éluant : acétate d'éthyle/cyclohexane v/v 1 /1 , Rapport frontal de 0,61 , révélateur : l'acide phosphomolybdique) et évaporation.
Etape 5 : Déprotection de la fonction diol
La cinquième étape de la synthèse consiste à déprotéger la fonction diol, afin d'obtenir le produit A5.
La réaction est schématisée comme suit
Figure imgf000023_0001
Dans un ballon, le produit A4 (1 ,605 g, 3,39 mmol) est dissous dans le méthanol (25 mL). L'acide p-toluènesulfonique (64,5 mg, 0,339 mmol) est ajouté sous agitation. La solution est agitée à température ambiante pendant 15h et la réaction est stoppée par ajout d'une solution saturée de bicarbonate de sodium (30 mL). Le produit est ensuite extrait dans du chloroforme (2x100 mL). La phase organique est séchée avec du MgS04 et concentrée à l'aide d'un évaporateur rotatif. Enfin, le produit A5 (0,873 g, 2,1 mmol, 55% de rendement) est obtenu sous forme d'une huile jaune pâle après purification sur colonne chromatographique de silice (éluant : acétate d'éthyle/cyclohexane v/v 8/2, Rapport frontal de 0,36, révélateur : l'acide phosphomolybdique) et évaporation.
Etape 6 : Estérification du diol par une chaîne alkyle
La sixième et dernière étape de la synthèse consiste à estérifier le diol par deux chaînes alkyles, pour obtenir le produit A6. Dans ce cas, une chaîne carbonée C5 a été utilisée.
La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000024_0001
Dans un ballon sont ajoutés le produit A5 (482 mg, 1 ,18 mmol), l'acide valérique (362 mg, 3,55 mmol), le dicyclohexylcarbodiimide (732 mg, 3,55 mmol), la 4- diméthylaminopyridine (144 mg, 1 ,18 mmol) et enfin le dicholorométhane (12 ml_). Cette solution est agitée à température ambiante pendant 15h. Après réaction, le milieu réactionnel est filtré et lavé avec de l'acétate d'éthyle. Après filtration, le filtrat est concentré à l'aide d'un évaporateur rotatif.
Enfin, le produit A6 (0,332 g, 0,58 mmol, 49% de rendement) est obtenu sous forme d'un solide blanc après purification sur colonne chromatographique de silice (éluant : acétate d'éthyle/cyclohexane v/v 1 /9, Rapport frontal de 0,65, révélateur : l'acide phosphomolybdique) et évaporation.
Figure imgf000024_0002
similaire à celui décrit en exemple 1) et le dérivé azide de l'acide phosphatidigue, pour obtenir un copolymère de formule (I) selon l'invention (ci-après « copolymère phospholipide protégé ») Cette réaction se déroule en présence de Cu(l)Br comme catalyseur et avec la PMDETA. La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000025_0001
Dans un ballon, 40 mg de copolymère (0,15 mmol de fonction alcyne) et 2 équivalents du dérivé azide de l'acide phosphatidique (165 mg, 0,29 mmol) sont mélangés dans 5 mL de DMF anhydre. La solution est dégazée avec l'argon pendant 30 minutes. Une solution de 0,5 équivalent de Cu(l)Br (0,0108 g, 0,075 mmol) et de 1 équivalent de N,N,N',N",N"- pentamethyldiéthylenetriamine (PMDETA, 31 μί, 0,15 mmol) dans 5 mL de DMF anhydre est dégazée avec l'argon pendant 30 minutes. Puis la solution de Cu(l)Br et de PMDETA est ajoutée à la solution comprenant le copolymère et le dérivé azide de l'acide phosphatidique. Le mélange est agité pendant 24 h à 35°C. En fin de réaction, le mélange est dialysé pendant 2 jours contre une solution d'EDTA 10 mM puis pendant 4 jours supplémentaires contre de l'eau milli-Q. La solution est enfin lyophilisée afin de récupérer le produit final.
Analyse par RMN :
Les spectres obtenus sont les suivants
Figure imgf000026_0001
8.5 8 .5 .0 6.5 6 5.5 5 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2 .5 0.5 0 fl (ppm)
RMN 1 H (DMSO, 300 MHz, δ ppm) : 7,36 (10H, 2*C6H5), 5,48 (2H, C-CH2-0 cliqué), 5,21 (2H, N-CH2), 5,03 (4H, 2*CH2-C6H5), 4,60 (2H, 0-CH2-C non cliqué), 4,14 (4H, 0-CH2, N-CH2), 3,50 (4H, -CH2-CH2 2,28 (4H, 2*CH2-CH2-CH2-CH3), 1 ,46 (4H, 2*CH2-CH2-CH2-CH3), 1 ,24 (4H, 2*CH2-CH2-CH2-CH3) 0,81 (6H, 2*CH3).
Etape C : déprotection du groupement phosphate pour obtenir un copolymère de formule (I) selon l'invention (ci-après « copolymere phospholipide déprotégé »)
La réaction est schématisée comme suit :
Figure imgf000026_0002
Dans un pilulier, 42 mg du copolymère obtenu à l'étape B sont dissous dans 1 ,6 mL de dichlorométhane sous atmosphère d'argon, et le bromotriméthylsilane (0,350 mL, 2,6 mmol) est ajouté. Le milieu réactionnel est ensuite soumis à une forte agitation durant 1 h à température ambiante. Le solvant est ensuite évaporé sous vide et le produit obtenu est repris dans 2 mL de méthanol et soumis à une forte agitation durant 1 h à température ambiante. Le méthanol est ensuite évaporé sous vide. Cinq cycles de lavage au méthanol/évaporation sont ensuite effectués afin d'éliminer les impuretés et récupérer le copolymère phospholipide déprotégé selon l'invention.
Analyse par RMN :
Les spectres obtenus sont les suivants :
Figure imgf000027_0001
RMN 1 H (DMSO, 300 MHz, δ ppm) : 7,33 (10H, 2*C6H5), 5,49 (2H, C-CH2-0 cliqué), 5,24 (2H, N-CH2), 4,62 (2H, 0-CH2-C non cliqué), 3,50 (4H, -CH2-CH2 PEG), 2,28 (4H, 2*CH2-CH2-CH2- CH3), 1,46 (4H, 2*CH2-CH2-CH2-CH3), 1,27 (4H, 2*CH2-CH2-CH2-CH3) 0,84 (6H, 2*CH3) Exemple 3 : tests de micellisation des copolymères C4 et C9
1 ) Protocole :
Une solution de copolymères C4 et C9 est préparée en dissolvant 10 mg de copolymère C4 ou C9 dans 2 mL d'eau milli-Q. Puis, le mélange est vortexé pendant 5 minutes et enfin filtré à l'aide d'un filtre 1 μηι. 2) Résultats :
Les résultats montrent que le copolymère C4 est capable de former des micelles de diamètre moyen compris entre 15 nm et 120 nm. Quasiment 12% des micelles formées ont un diamètre moyen de 93 nm.
Le copolymère C9 est capable de former des micelles de diamètre moyen compris entre 20 nm et 500 nm. Environ 15% des micelles formées ont un diamètre moyen de 197 nm.
Exemple 4 : tests pharmacocinétiques avec des facteurs de coagulation comme protéines thérapeutiques
Les profils pharmacocinétiques de facteurs de coagulation (FVII, FVIII ou FIX) encapsulés dans des micelles de copolymère selon l'exemple 3 sont déterminés après une injection intraveineuse unique chez des rats OFA SD cathétérisés (200-250g de masse corporelle) à 1 mg/kg, 100 ou 200 Ul/kg.
3 rats sont injectés avec des micelles-FVII, des micelles-FVIII, ou des micelles-FIX, 3 rats sont injectés avec du FVII, du FVIII ou du FIX seul, et 2 rats contrôles sont injectés avec des micelles seules pour évaluer les effets toxicologiques.
Le plasma est collecté à plusieurs temps après injection (avant injection, 5min, 1 h, 3h, 6h, 24h, 48h, 72h et 96h). Les échantillons de sang sont immédiatement traités sur citrate 10% (ratio échantillon:citrate égal à 9:1 ; 3.13% en poids/volume), centrifugés à 1500g pendant 15minutes à Ι δ'Ό, et stockés à -20 'Ό avant analyse.
Les concentrations en FVII, FVIII ou FIX dans le plasma sont déterminés par ELISA, et les données analysées par analyse non-compartimentale en utilisant le logiciel WinNonlin® version 6.3.
Les paramètres pharmacocinétiques sont déterminés. Ils incluent la concentration plasmatique maximale (Cmax), l'aire sous la courbe de la concentration plasmatique en fonction du temps à partir du temps de l'administration de la dose jusqu'à la dernière concentration mesurable (AUCLast), la demi-vie d'élimination (t1/2), le volume de distribution (Vd), la clairance (Cl) et le temps de résidence moyen (MRT).

Claims

REVENDICATIONS
. Copolymère de formule suivante (I)
Figure imgf000030_0001
dans laquelle :
- x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120,
- y est un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100, de préférence entre 19 et 60,
- z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0,
- R représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane ou un ligand d'affinité, et
- R' représente un hydrogène, le groupement -CH2-C≡CH, un groupement -CH2-1 /-/-1 ,2,3- triazole, un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R", où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie.
2. Copolymère selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone est choisi parmi les radicaux méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n- butyle, sec-butyle, isobutyle, te/t-butyle, n-pentyle, isopentyle, néopentyle, n-hexyle, n-nonyle, le 2-méthylcyclopentyle et le 1 -cyclohexyléthyle.
3. Copolymère selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que R représente un radical alkyle ayant de 4 à 9 atomes de carbone, un phospholipide ou un glycosaminoglycane et/ou en ce que R' représente un hydrogène ou le groupement -CH2-C≡CH.
4. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le phospholipide est choisi parmi les phosphoglycérides et les sphingomyélines.
5. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le glycosaminoglycane est l'héparine.
6. Copolymère selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'héparine est choisie parmi l'héparine naturelle, l'enoxaparine, la tinzaparine, la nadroparine et le fondaparinux.
7. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que R est l'acide phosphatidique, de préférence l'acide phosphatidique formé par estérification de deux acides gras, de préférence saturés, ayant une chaîne carbonée de 3 à 22 atomes de carbone, et d'un acide phosphorique avec un glycérol.
8. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que R est l'acide phosphatidique de formule suivante :
CH2-0(P03 2 ) R2-CO-0-CH
RrCO-O-CH
I
CH2- où R1 et R2 sont identiques et représentent une chaîne aliphatique d'un acide gras ayant de 3 à 22 atomes de carbone, de préférence R1 et R2 sont chacun -(CH2)2-CH3 ou -(CH2)3-CH3
9. Copolymère selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que R est identique ou différent parmi les monomères dérivés de glutamate triazolés.
10. Composition pharmaceutique comprenant, dans un milieu pharmaceutiquement acceptable, au moins un copolymère selon l'une des revendications 1 à 9, et au moins une protéine thérapeutique.
1 1 . Utilisation d'un copolymère selon l'une des revendications 1 à 9, pour encapsuler une ou plusieurs protéines, et en particulier une protéine thérapeutique.
12. Composition selon la revendication 10 ou utilisation selon la revendication 1 1 , caractérisée en ce que les protéines thérapeutiques sont choisies parmi les anticorps, les facteurs de coagulation I, II, V, VII, Vlla, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, ou le facteur von Willebrand, les facteurs de coagulation modifiés, le facteur H, ΓΙΤΙ, l'alpha 1 -antitrypsine, l'antithrombine, l'albumine, le fibrinogène, le complexe prothrombique humain, la protéine C, l'insuline et les érythropoïétines.
13. Procédé de préparation d'un copolymère selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant : a) une étape de chimie Click entre l'alcyne de formule (II) suivante :
Figure imgf000032_0001
dans laquelle :
- x est un entier compris entre 10 et 250, de préférence entre 40 et 120,
- y est un entier compris entre 4 et 100, de préférence entre 10 et 100, de préférence entre 19 et 60, et
- z est un entier compris entre 0 et (100-y), de préférence égal à 0,
et un composé de formule R-N3, R étant tel que défini selon l'une des revendications 1 à 8, en présence de cuivre (I), afin d'obtenir le composé de formule (III) :
Figure imgf000033_0001
puis
b) de préférence lorsque z est différent de 0, une étape de modification de la fonction allyle du composé de formule (III).
14. Procédé de préparation selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape de chimie Click est réalisée en présence de Cu(l)Br, PMDETA et DMF, à une température comprise entre 30 °C et 40 ^, et pendant une durée comprise entre 20 et 40 heures.
15. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que l'étape b) est une étape de déprotection du groupement protecteur allyle du composé de formule (III), de préférence par oxydation et clivage du groupement protecteur allyle, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un hydrogène.
16. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que l'étape b) est une étape de chimie Click entre le composé de formule (III) et un thiol de formule R"-SH, où R" représente un radical alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, un phospholipide, un glycosaminoglycane, un ligand d'affinité ou une sonde d'imagerie, afin d'obtenir un copolymère de formule (I) dans lequel R' est un groupement -CH2-CH2-CH2-S-R".
17. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que, lorsque z est égal à 0 pour le composé de formule (II), l'étape a) de chimie Click entre l'alcyne de formule (II) et le composé de formule R-N3 est réalisée de façon incomplète, de façon à obtenir un copolymère de formule (I) :
Figure imgf000034_0001
(I) dans lequel R' représente le groupement -CH2-C≡CH.
18. Micelles obtenues à partir de copolymères tels que définis dans l'une des revendications 1 à 9, et comprenant une protéine thérapeutique encapsulée.
19. Composition pharmaceutique comprenant les micelles selon la revendication 18.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023180457A1 (fr) * 2022-03-24 2023-09-28 Universite De Rouen-Normandie Glycérophospholipides synthétiques comprenant au moins une fonction réactive, leur procédé de préparation et leurs utilisations dans différentes applications

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3808801A1 (fr) * 2016-07-13 2021-04-21 Sekisui Kasei Co., Ltd. Mousse moulée d'élastomère à base d'ester, ses utilisations, billes expansées d'élastomère à base d'ester

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2014308A2 (fr) * 2007-07-10 2009-01-14 Cordis Corporation Revêtement utilisant un conjugué anti-thrombotique
WO2011056645A2 (fr) * 2009-10-28 2011-05-12 Massachusetts Institute Of Technology Poly(propargyl-l-glutamate) et ses dérivés
CN102942695A (zh) * 2012-12-04 2013-02-27 中国科学院长春应用化学研究所 聚合物、葡萄糖纳米凝胶、葡萄糖纳米凝胶组合物及其制备方法
CN102977362A (zh) * 2012-11-28 2013-03-20 中国科学院长春应用化学研究所 聚氨基酸嵌段共聚物、其制备方法及温度敏感型水凝胶

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2014308A2 (fr) * 2007-07-10 2009-01-14 Cordis Corporation Revêtement utilisant un conjugué anti-thrombotique
WO2011056645A2 (fr) * 2009-10-28 2011-05-12 Massachusetts Institute Of Technology Poly(propargyl-l-glutamate) et ses dérivés
CN102977362A (zh) * 2012-11-28 2013-03-20 中国科学院长春应用化学研究所 聚氨基酸嵌段共聚物、其制备方法及温度敏感型水凝胶
CN102942695A (zh) * 2012-12-04 2013-02-27 中国科学院长春应用化学研究所 聚合物、葡萄糖纳米凝胶、葡萄糖纳米凝胶组合物及其制备方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE WPI Week 201374, Derwent World Patents Index; AN 2013-J15482, XP002735078 *
DATABASE WPI Week 201401, Derwent World Patents Index; AN 2013-K32902, XP002743026 *
MOHIUDDIN A. QUADIR ET AL: "PEG-Polypeptide Block Copolymers as pH-Responsive Endosome-Solubilizing Drug Nanocarriers", MOLECULAR PHARMACEUTICS, vol. 11, no. 7, 12 May 2014 (2014-05-12), pages 2420 - 2430, XP055164643, ISSN: 1543-8384, DOI: 10.1021/mp500162w *
MORTON STEPHEN W ET AL: "FRET-enabled biological characterization of polymeric micelles", BIOMATERIALS, vol. 35, no. 11, 26 January 2014 (2014-01-26), pages 3489 - 3496, XP028609485, ISSN: 0142-9612, DOI: 10.1016/J.BIOMATERIALS.2014.01.027 *
POCHÉ ET AL.: "Synthesis of novel y-alkenyl L-glutamate derivatives containing a terminal C-C double bond to produce polypeptides with pendent unsaturation", MACROMOLECULES, vol. 30, 1997, pages 8081 - 8084
SMITH ET AL.: "Modular synthesis of biologically active phosphatidic acid probes using Click chemistry", MOLECULAR BIOSYSTEMS, vol. 5, 2009, pages 962 - 972
XIAOYONG ZHAO ET AL: "Enhanced Stability of Polymeric Micelles Based on Postfunctionalized Poly(ethylene glycol)-b-poly(gamma-propargyl L-glutamate): The Substituent Effect", BIOMACROMOLECULES, vol. 13, no. 5, 14 May 2012 (2012-05-14), pages 1315 - 1322, XP055164639, ISSN: 1525-7797, DOI: 10.1021/bm201873u *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023180457A1 (fr) * 2022-03-24 2023-09-28 Universite De Rouen-Normandie Glycérophospholipides synthétiques comprenant au moins une fonction réactive, leur procédé de préparation et leurs utilisations dans différentes applications
FR3133855A1 (fr) * 2022-03-24 2023-09-29 Universite De Rouen-Normandie glycérophospholipides synthétiques comprenant au moins une fonction réactive, leur procédé de préparation et leurs utilisations dans différentes applications

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