FR2973249A1 - Utilisation de l'epigallocatechine gallate comme agent antiviral contre les infections par le virus de l'hepatite c - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à un composé flavonoïde de formule I dans laquelle au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule II, ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC). L'invention porte également sur une méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation du VHC comprenant une étape de mise en contact dudit virus de l'hépatite C avec un composé de formule (I).

Description

Utilisation de l'epigallocatechine gallate comme agent antiviral contre les infections par le virus de l'hépatite C L'invention concerne un composé flavonoïde ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC). L'invention concerne également, une méthode d'inactivation in vitro du VHC comprenant une étape de mise en contact dudit VHC avec un composé flavonoïde ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables. L'Hépatite C virale est une cause majeure de maladie chronique du foie qui touche environ 3 % de la population mondiale. Les patients infectés ont un risque élevé de développer une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire nécessitant un recours à la greffe de foie. Le VHC est un virus à ARN monocaténaire linéaire de polarité positive appartenant à la famille des Fia viviridae dans le genre Hepacivirus. Ce virus est le seul membre connu du genre des Hepacivirus. Il y a six principaux génotypes du VHC et plus de 50 sous-types qui sont différemment répartis géographiquement. A titre indicatif, le génotype 1 du VHC est prédominant en Europe et aux Etats-Unis, le génotype 4 au Moyen-Orient et en Afrique. La grande hétérogénéité génétique du VHC liée à la forte propension du virus à muter, a d'importantes implications cliniques et diagnostiques et peut expliquer les difficultés dans le développement de vaccins et l'absence de réponse aux traitements actuels. En effet, les traitements de référence, à savoir, une combinaison d'interféron (IFN) alpha pégylée (peginterféron alfa) et d'un antiviral tel que la ribavirine, sont non spécifiques et d'efficacité modérée. Ainsi, une rémission est observée dans 40 à 80% des cas de patients infectés suivant le génotype viral concerné, le génotype 1 étant celui le plus résistant aux traitements. A côté d'une efficacité limitée, ce traitement combiné comporte des effets secondaires importants. Les effets indésirables les plus fréquemment observés d'une thérapie IFN sont des symptômes pseudo-grippaux tels que la fièvre, les douleurs musculaires ou articulaires ou la perte de poids. En outre, des effets secondaires neuropsychiatriques, y compris des sautes d'humeur voire des psychoses d'idées suicidaires sont décrits. L'interféron pégylé peut également induire des maladies auto-immunes voire peut aggraver des troubles auto-immuns préexistants. Un effet secondaire fréquemment observé avec la ribavirine est l'anémie, notamment l'anémie hémolytique, ce qui nécessite un contrôle continu des paramètres sanguins pendant la durée du traitement.

Ces différents effets indésirables sont une raison majeure de refus de ce traitement par les patients. Il y a donc un besoin de traitements plus efficaces, pratiques et mieux tolérés. Une large majorité des antiviraux anti-VHC développés dans l'art antérieur sont dépendants du génotype viral, voire du sous-type viral. Tel est le cas des inhibiteurs du métabolisme viral spécifiques des protéases ou des polymérases virales. Il y a donc également un besoin d'inhibiteurs indépendant du génotype viral du VHC. Afin de résoudre ces problèmes de l'art antérieur, les inventeurs ont montré que les flavonoïdes contenant un groupement 3,4,5-trihydroxy-phényl de formule OH OH OH et plus particulièrement certaines catéchines, avaient un effet antiviral spécifique du VHC indépendamment de son génotype viral. Les composés flavonoïdes sont naturellement présents dans les végétaux et notamment dans la plupart des fruits et légumes. Ils sont responsables de la couleur variée des fleurs et des fruits et représentent une source importante d'antioxydants dans l'alimentation. Ils forment une sous-classe des polyphénols. De nombreux composés flavonoïdes possèdent des vertus thérapeutiques et sont très connus pour leur excellent potentiel d'inhibition des processus d'angiogenèse et de formation de métastases. Parmi les flavonoïdes et plus particulièrement parmi les 3-hydroxyflavonoïdes, on distingue les sous-classes des flavonols, des anthocyanes, des leucoanthocyanes et des catéchines. Les catéchines sont les composés flavonoïdes les plus étudiés. Les catéchines, leurs dérivés, voire leurs produits de dégradation, possèdent de multiples propriétés thérapeutiques. Leurs effets thérapeutiques sont largement décrits que ce soit sous la forme d'une catéchine isolée que sous la forme d'extraits de thé vert duquel elles sont majoritairement issues. On peut citer à titre indicatif, la catéchine, l'(-)-épicatéchine (EC) ; l'(-)-épigallocatéchine (EGC), l'(-)-épicatéchine-3-gallate (ECG) ou l'épigallocatéchine-3-gallate (EGCG). C'est ainsi que les catéchines sont décrites comme ayant un effet préventif sur l'obésité ou sur les maladies cardiovasculaires telles que l'athérosclérose. Elles sont décrites également comme ayant un effet antioxydant, anticarcinogène, antibactérien ou antiviral (Khan N.et al., Life Sci. 200781, 19-33.). Les modes d'action de ces catéchines sont divers. Ainsi, leur anti-carcinogénicité dans le cas du cancer du sein ou de la prostate, serait lié à un effet cytotoxique de l'EGCG sur les cellules cancéreuses (Stuart EC.et al., Life Sci. 2006, 79: 2329-36). L'effet antiviral des catéchines passerait par différentes voies métaboliques. Dans le cas du virus de l'influenza ou de l'hépatite B, l'EGCG et/ou l'ECG inhiberaient la réplication virale et/ou la transcription (Song J-M et al., Antiviral Research 2005 68 66-74 ; Xu et al., 2007). Concernant les virus de l'influenza ou de l'Immunodéficience Humaine sous type 1 (VIH-1), I'EGCG inhiberait la liaison à leurs cellules hôtes respectives (Song J-M et al., Antiviral Research 2005 68 66-74 et Nance CL. et al., J Allergy Clin Immunol. 2009 123:459-65). Dans le cas du Virus de l'Herpes Simplex (type 1 et 2), I'EGCG induirait la mort virale par création de pores à la suite d'une liaison aux glycoprotéines de l'enveloppe (Isaacs CE. et al., Antimicrob Agents Chemother. 2008 52 :962-70). Au niveau hépatique, les catéchines sont décrites comme hépato-protectrices notamment du fait de leur caractère antioxydant. En outre, elles sont souvent associées aux traitements des maladies hépatiques. C'est ainsi que les catéchines sont décrites dans les traitements des hépatites virales de type B ou C comme réduisant la nécrose cellulaire (Patrick Let al., Altern Med Rev. 1999 Aug;4(4):220-38.). Cet effet est indépendant de l'infection virale en elle-même, mais permet de réduire l'inflammation nécrotique du foie qui y est associée. Les catéchines ont été proposées pour le traitement de maladies impliquant la voie d'immunosuppression médiée par l'indoléamine 2,3-dioxygénase (IDO), parmi lesquelles certains cancers mais également des infections virales dont l'hépatite C (WO 2008115804). Cette voie de traitement est donc non spécifique et indirecte puisqu'il s'agit d'un traitement par immunomodulation. L'art antérieur décrit également un traitement de l'hépatite C par l'utilisation d'un agent antiviral en mélange avec un inhibiteur du protéasome cellulaire. Parmi l'ensemble des inhibiteurs du protéasome cellulaire cités, on retrouve I'EGCG. Le mécanisme d'action et l'avantage d'un inhibiteur du protéasome dans ce traitement n'est néanmoins pas décrit (WO2011/009961). Les catéchines sont également évoquées dans le traitement de l'hépatite C sous une forme polymérique (US 2010/0055065). Ce polymère de polyphénols est décrit comme ayant une activité antivirale par inhibition de la réplication du VHC, sous réserve de contenir au moins 3 monomères. De nombreux polyphénols sont envisagés comme potentiels monomères et plus particulièrement l'ensemble des catéchines. Cependant, au cours de cette étude, seul le réplicon de génotype 1 b tel que décrit par Lohmann et al. Science, 1999 est utilisé par les auteurs. Néanmoins, aucun document de l'art antérieur ne décrit une molécule ayant un effet antiviral spécifique du VHC qui soit à la fois efficace, ayant peut ou pas d'effets secondaires sur le patient traité et qui soit spécifique au VHC quelque soit le génotype viral concerné.

Afin de répondre à l'ensemble des problèmes de l'art antérieur, l'invention porte sur un composé de formule (I) dans laquelle : X est O quand a est une liaison simple ou O+ quand a est une liaison double, R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl, R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il) OH OH OH R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou 15 un groupement OH, R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone auquel ils sont liés, un groupement C=O, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison, a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double 20 liaison, sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de formule (Il) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange 25 d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques, pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC).

Selon le composé de formule (I), a et b sont soit une simple liaison, soit une double liaison et a et b ne sont pas simultanément une double liaison. Tels qu'ils sont utilisés ici, les termes « pharmaceutiquement acceptable », et les variations grammaticales qui s'y référèrent, renvoient à des compositions, des transporteurs, diluants et réactifs, qui sont utilisés de façon interchangeable et peuvent être administrés à un mammifère sans induction d'effets physiologiques indésirables tels que nausées, étourdissements, troubles gastriques, etc. L'expression « sels ou esters pharmaceutiquement acceptables » fait référence aux sels d'addition acide relativement non toxiques, inorganiques et organiques, ou aux esters des composés de la présente invention, qui sont généralement préparés par réaction de l'acide libre avec une base organique ou inorganique approprié. Ces sels ou esters peuvent être préparés in situ pendant l'isolement final et la purification des composés. En particulier, les sels d'addition acide peuvent être préparés en faisant réagir séparément le composé purifié sous sa forme épurée avec un acide organique ou inorganique et en isolant le sel ainsi formé. Parmi les exemples de sels d'addition acide, on trouve les sels bromhydrate, chlorhydrate, sulfate, bisulfate, phosphate, nitrate, acétate, oxalate, valerate, oléate, palmitate, stéarate, laurate, borate, benzoate, lactate, phosphate, tosylate, citrate, maléate, fumarate, succinate, tartrate, naphthylate, mésylate, glucoheptanate, lactobionate, sulfamates, malonates, salicylates, propionates, méthylènebis-b-hydroxynaphtoates, acide gentisique, iséthionates, di-p-toluoyltartrates, méthanesulfonates, éthanesulfonates, benzènesulfonates, p-toluènesulfonates, cyclohexyl sulfamates et quinateslaurylsulfonate, et analogues. (Voir par exemple S.M. Berge et al. « Pharmaceutical Salts » J. Pharm. Sci, 66 :p.1-19 (1977) qui est incorporé ici par référence).

Le composé selon l'invention est un inhibiteur spécifique du VHC en ce qu'au sein des virus à ARN simple brin, il inhibe un seul membre de la famille des Fiaviviridae : le VHC. Par ailleurs, contrairement à de nombreux inhibiteurs viraux anti-VHC, le composé selon l'invention à un effet antiviral efficace vis-à-vis de l'ensemble des génotypes du VHC et ce même envers les génotypes les plus résistants aux antiviraux classiques. Tel est le cas du VHC de génotype 1. Ceci en fait un inhibiteur d'intérêt. En outre, les inventeurs ont montré que parmi les molécules de la famille des flavonoïdes, seules les molécules ayant un groupement 3,4,5-trihydroxy-phényl avaient un effet antiviral sur le VHC. Ainsi, la présence du groupement 3,4,5-trihydroxy-phényl est essentielle pour l'activité antivirale du composé selon l'invention. Cette structure est retrouvée dans le groupement galloyle de formule (Il) ainsi qu'en C2 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) lorsque R1 et R2 sont des groupements hydroxyles.

Selon une première variante du composé selon l'invention, l'un quelconque des groupes R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (Il), et les groupes R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH. Selon une seconde variante du composé selon l'invention, au moins deux des groupes R3, R5 et R7 sont des groupements de formule (Il). Les inventeurs ont mis en évidence un effet additif des groupements 3,4,5-trihydroxy-phényl sur le caractère antiviral des composés de formule (I), de sorte que l'effet antiviral d'un composé de formule (I) comprenant deux groupements 3,4,5-trihydroxy-phényl est bien supérieur à celui d'un composé n'en comportant qu'un.

Avantageusement, le composé selon l'invention est un composé de formule (I) dans laquelle, les groupes R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un groupement 0-alkyl sélectionné dans le groupe constitué d'un groupement 0-méthyl, O-éthyl ou 0-propyl. Par « groupement 0-glycosyle » on entend une ou plusieurs chaines carbonées comprenant au moins un saccharide à savoir, un monosaccharide ou un oligosaccharide lié à un groupement OH du composé de formule (I), le monosaccharide ou l'oligosaccharide étant susceptible d'être substitué par des groupements alkyls en C1-C6 ou par des groupements phénoliques. Typiquement le groupement 0-glycosyle comprend au moins un monosaccharide sélectionné dans le groupe constitué du glucose, galactose, rhamnose et arabinose. De préférence, le groupement glycosyle est sélectionné dans le groupe constitué d'un monosaccharide, un disaccharide ou un tri-saccharide. Avantageusement, le composé selon l'invention est aglycane. Selon une première variante, le composé selon l'invention est un composé de formule (III) : dans laquelle : - R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl, R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il) OH OH OH - R6 est un atome d'hydrogène ou un groupement OH, et au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (Il), ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables. Préférentiellement, le composé est une anthocyanidine ou une anthocyane.

Typiquement, le composé selon l'invention est un composé de formule (III) dans laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 sont des groupements OH et R6 est un atome d'hydrogène. Un tel composé de formule (III) est la delphinidine (3,3',4',5,5',7-Hexahydroxyflavyliumchloride N° CAS 528-53-0). La delphinidine peut être modifiée par glycosylation sur les groupes R3, R5 et/ou R7.

Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (III) dans laquelle R1, R2, R5 et R7 sont des groupements OH et R3 et R6 sont des atomes d'hydrogène. Un tel composé de formule (III) est la tricétinidine (31,41,5,51,7-pentahydroxyflavylium chloride ; N° CAS 65618-21-5). La tricétinidine peut être modifiée par glycosylation sur les groupes R3, R5 ou R7. La tricétinidine est retrouvée dans le thé et serait le produit de dégradation par dégallation oxydative de l'EGCG. Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (III) dans laquelle R1, R2, R3 et R7, sont des groupements OH ; R6 est un atome d'hydrogène, R5 est un groupement 0-méthyl. Un tel composé de formule (III) est la Pulchéllidine (3,7,3',4',5'-Pentahydroxy-5-méthoxyflavylium, N CAS 19077-86-2. La Pulchéllidine peut être modifiée par glycosylation sur les groupes R3 et R7. Delphinidine Tricétinidine Pulchéllidine OH OH OH OMe HO OH OH30 Selon une seconde variante, le composé selon l'invention est un composé de formule (IV) o dans laquelle : R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl, R3 est groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il) OH OH OH R5 et R7 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il), R6 est un atome d'hydrogène ou un groupement OH, et au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (Il), ou R1 et R2 15 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables. Préférentiellement, le composé selon l'invention est un flavonol (3-hydroxy-2-phénylchromèn-4-one). Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (IV) dans 20 laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 sont des groupements OH ; R6 est un atome d'hydrogène. Un tel composé de formule (IV) est la Myricétine (ou 3,3',4',5',5,7-hexahydroxy-2- phénylchromen-4-one ; N° CAS529-44-2). La Myricétine peut être modifiée par glycoylation notamment sur le groupe R3. OH HO OH OH 25 Myricétine 5 Selon une troisième variante, le composé selon l'invention est un composé de formule (V) dans laquelle : R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl, R3 est un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il) OH OH OH 10 - R5 et R7 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il), et au moins un des R3, R5 ou R7 est un groupement de formule (Il), ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, 15 ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables. Préférentiellement, le composé selon l'invention est un flavan-3-ol (flavanol ou catéchine). Les catéchines sont une sous-famille de flavonoïdes dont la structure est basée sur la 2-phényl-3-chromano. 20 Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (V) dans laquelle R1, R2, R3, R5 et R7 sont des groupements OH, le composé selon l'invention est dénommé l'(-)-Epigallocatéchine (EGC) ((2R,3R)-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)chromane-3,5,7-triol, numéro CAS 970-74-1) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en cis et dénommé la (-)-Gallocatéchine (2H-1- 25 Benzopyran-3,5,7-triol,3,4-dihydro-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)-(2S,3R) ; numéro CAS 3371-27-5) ou la ((+)-Gallocatechin (GC) (2H-1-Benzopyran-3,5,7-triol,3,4-dihydro-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)-, (2R,3S) ; N° CAS 970-73-0) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en trans.

OH (+)-gallocatéchine GC OH (-)-épigallocatéchine EGC Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (V) dans laquelle R1, R5 et R7 sont des groupements OH ; R2 est un atome d'hydrogène ; R3 est un groupement galloyle de formule (Il), le composé selon l'invention étant dénommé (-)- Epicatechin-3-gallate (ECG) ((2R,3R)-2-(3,4-Dihydroxyphényl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyrane-3,5,7-triol 3-(3,4,5-trihydroxybenzoate); N° CAS 1257-08-5) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en cis et dénommé la catéchine-3-gallate (CG) ((2S,3R)-2-(3,4-Dihydroxyphényl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5,7-triol 3-(3,4,5-trihydroxybenzoate) N° CAS 130405-40-2) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en trans. (+)- catéchine-3-gallate (CG) (-)-épicatéchine-3-gallate ECG

Typiquement, le composé selon l'invention est le composé de formule (V) dans laquelle R1, R2, R5 et R7 sont des groupements OH ; R3 est un groupement galloyle de formule (Il), le composé selon l'invention étant nommé (-)-Epigallocatéchine-3-Gallate (EGCG) ((2R,3R)-5,7-dihydroxy-2-(3,4,5-trihydroxyphényl)-3, 4-dihydro-2H-chromen-3-yl 3,4,5-trihydroxybenzoate ; N° CAS 989-51-5) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en cis et nommé la (-)-Gallocatéchine gallate (GCG) ((2S,3R)-2-(3,4,5-Trihydroxyphényl)-3,4-dihydro-1(2H)-benzopyran-3,5, 7-triol 3-(3,4,5-trihydroxybenzoate), N° CAS 4233-96-9) lorsque les groupements en C2 et C3 de l'hétérocycle central (hétérocycle chromane) sont en trans. OH OH HO OH OH HO OH (+)-gallocatéchine-3-gallate (GCG) OH (-)-épigallocatéchine-3-gallate (EGCG) Préférentiellement, le composé selon l'invention est sélectionné dans le groupe constitué de la delphinidine, la Myricétine, la tricétinidine, la Pulchéllidine, l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et leurs mélanges. De façon avantageuse, ledit composé selon l'invention est sélectionné dans le groupe constitué de l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et leurs mélanges. Préférentiellement, ledit composé selon l'invention est l'épigallocatéchine gallate (EGCG) ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables. Les composés flavonoïdes selon l'invention étant naturellement présents dans les végétaux et notamment dans la plupart des fruits et légumes, ils peuvent être obtenus par purification. A titre d'exemple, les catéchines peuvent être obtenues par extraction du thé vert ou noir par différents procédés de filtration, tels que ceux décrits dans les brevets US 6.383.392 ou EP 1 077 211. Les anthocyanines peuvent également être obtenues par purification à partir de plantes tel que décrit dans l'état de la technique et notamment dans les demandes de brevet US 2010041877 ou US 2003147980. De tels composés flavonoïdes sont retrouvés dans le commerce. Les composés flavonoïdes peuvent également être obtenus par synthèse chimique par la mise en oeuvre de procédés connus de l'homme du métier tels que notamment des procédés de synthèse en phase solide. De tels composés flavonoïdes sont retrouvés dans le commerce. Dans le cadre de la présente invention, l'expression « virus de l'Hépatite C » ou « VHC » doit être comprise comme faisant référence à l'ensemble des génotypes du virus de l'hépatite C, génotypes déjà décrits ou non décrits, en particulier les génotypes numérotés de 1 à 6, ainsi que leurs différents sous-types, plus particulièrement les génotypes 1 a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5, et 6. Cette expression doit également être comprise comme faisant référence à un virus VHC recombinant ou non recombinant capable d'infecter un hôte, tel qu'une cellule d'un sujet. L'expression « agent antiviral » est utilisé en référence à un agent susceptible d'interagir directement avec le VHC ou avec un ou plusieurs de ses constituants et induit l'inhibition de l'infection par le VHC soit par une diminution ou une abolition de l'entrée virale, de la réplication virale ou de la pathogénie ou tout autre évènement ayant lieu dans la cellule hôte ou leurs combinaisons. Cette action directe de l'agent antiviral est à opposer à l'action indirecte de composés utilisés dans le traitement des infections par le VHC et agissant par stimulation du système immunitaire par exemple. L'expression « infection par le VHC » ou « infection virale » en référence au VHC, se réfère à la condition d'un sujet ou d'un patient infecté par le VHC. L'infection par le VHC désigne indifféremment une infection asymptomatique ou chronique par le VHC, quel que soit son stade de développement. Cette expression se rapporte également à l'entrée, la réplication ou tout autre événement ou processus impliqué dans la pathogenèse du VHC dans une cellule hôte. Ainsi, l'infection comprend l'introduction d'un agent infectieux, comme un virus VHC recombinant ou non recombinant, capable d'infecter un hôte, tel qu'une cellule d'un sujet. Le terme « prévention », tel qu'il est utilisé présentement en référence à une infection par le VHC se rapporte à la réduction du risque ou à l'inhibition du développement d'une infection virale. Le terme « traitement », tel qu'il est utilisé présentement, désigne généralement l'amélioration d'un signe ou d'un symptôme d'une maladie ou d'un état pathologique lié, par exemple, à une infection par le VHC notamment du fait de l'inhibition du virus, l'arrêt de son développement, la diminution de la charge virale du patient ou l'éradication du virus. Il est ainsi fait référence à des moyens de régression, de réduction, d'inhibition de la progression du VHC, ou la prévention de l'infection par le VHC ou un ou plusieurs symptômes de cette infection. Ledit composé selon l'invention est un agent antiviral en particulier, par inhibition de l'infection d'une cellule hépatocytaire par le virus de l'hépatite C et/ou de la transmission du virus de l'hépatite C d'une cellule hépatocytaire infectée à une cellule hépatocytaire non-infectée. Le composé selon l'invention inhibe les deux grands modes d'infection virale à savoir, l'infection d'une cellule hépatocytaire saine (non-infectée) par le virus isolé et le second mode, la dissémination virale de cellules à cellules, autrement dit, l'infection par une cellule hépatocytaire infectée d'une cellule hépatocytaires non-infectée. Ce dernier mode de transmission est important puisqu'on le suspecte d'être une voie prépondérante in vivo pour certaines familles de virus enveloppés. Préférentiellement, ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'entrée du virus de l'hépatite C. L'utilisation d'un inhibiteur d'entrée peut être particulièrement avantageux dans le cas d'une transplantation hépatique afin d'éviter l'infection du foie transplanté. Les inventeurs ont mis en évidence une telle inhibition, par l'usage d'un modèle d'étude de référence permettant l'expression de glycoprotéines de l'enveloppe virale d'intérêts que ce sont les pseudoparticules virales infectieuses. Ainsi, selon l'invention, l'expression « inhibition de l'entrée virale » ou « inhibition de l'entrée du virus » doit être comprise comme l'inhibition du passage d'un génome viral de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule hôte, qu'il s'agisse d'une infection médiée par une particule virale individualisée ou tout autre mécanisme conduisant à l'infection d'une cellule hôte non-infectée. Cette expression peut également être comprise comme l'inhibition de l'une quelconque des étapes de l'infection virale préalable au relargage du génome viral dans le cytoplasme de la cellule hôte. Ces étapes préalables sont : i) l'attachement du virus ou d'une cellule hôte infectée à la surface de la cellule hôte non infectée, ii) l'interaction avec le(s) récepteur(s) spécifique(s) viraux et iii) la fusion de l'enveloppe lipidique virale, de la particule virale avec une membrane cellulaire (plasmique ou endosomale) permettant l'introduction du génome viral dans le cytoplasme de la cellule infectée. Les inventeurs ont réalisé des expériences visant à fractionner le mécanisme de l'entrée du VHC dans la cellule hôte en ses 3 étapes constitutives et ont ainsi montré que seule l'étape d'attachement est inhibée par l'EGCG. L'étape d'attachement est l'étape la plus précoce du mécanisme d'entrée virale. De tels résultats peuvent être confortés par des expériences de « binding » et de quantification par RT-PCR quantitative de l'ARN du virus attaché à la cellule ou de quantification de la protéine de capside. Préférentiellement, ledit composé est un agent antiviral par inhibition des glycoprotéines de surface du VHC dans leur fonction au cours des étapes de l'entrée du génome viral dans la cellule hôte non infectée. Ceci peut être confirmé par des essais de pull down ou de microcalorimétrie et de résonnance plasmonique de surface (Biacore).

Avantageusement, le composé selon l'invention est un agent antiviral par inhibition de l'adhésion du virus de l'hépatite C, ou d'une cellule hépatocytaire infectée par le virus de l'hépatite C, à la membrane d'une cellule hépatocytaire non-infectée. Préférentiellement, ledit composé est un agent antiviral par inhibition des glycoprotéines de surface du VHC et plus particulièrement de la glycoprotéine E2. Ainsi, les inventeurs ont démontré que l'inhibition par l'EGCG implique spécifiquement la glycoprotéine E2. Notamment par l'isolation d'un VHC résistant à l'EGCG comportant une mutation au niveau de la séquence peptidique de la protéine membranaire E2 (résultats non montrés). De plus, les inventeurs ont mis en évidence que l'effet inhibiteur de l'entrée virale médié par l'EGCG, implique directement les glycoprotéines de l'enveloppe virale au niveau d'une zone conservée de celles-ci. En effet, les inventeurs ont montrés que l'effet inhibiteur de l'EGCG était observé sur l'ensemble des génotypes viraux du VHC. De plus, la mutation identifiée chez le virus résistant située dans la protéine E2 se trouve au niveau d'un acide aminé très conservé en sein des génotypes du VHC. Selon l'invention, le traitement et/ou la prévention de l'infection par le virus de l'hépatite C est destiné à un patient résistant ou intolérant au traitement d'une infection par le VHC, par un agent immunomodulateur et/ou par un inhibiteur du métabolisme viral. Le génotype 1 de VHC est le plus réfractaire aux traitements actuels. Il serait responsable de 70 % des cas connus d'hépatite C aux Etats-Unis, au Japon et en Europe occidentale. Or, moins de 50 % des patients obtiennent une réponse virologique soutenue avec le traitement actuel. Le composé selon l'invention permet l'inhibition de l'infection par le VHC de l'ensemble des génotypes décrits et plus particulièrement le VHC de génotype 1 pour lequel il montre une très forte capacité antivirale. Les « inhibiteurs viraux » peuvent être définis en trois groupes. Le premier comprend les inhibiteurs du métabolisme viral. Par « inhibiteurs du métabolisme viral » on entend, i) les inhibiteurs de la traduction notamment les inhibiteurs de l'IRES (Internai Ribosome Entry Site), les ribozymes ou les SiRNA ; ii) les inhibiteurs de la maturation protéique tels que les inhibiteurs de protéases (protéases NS3/NS4a), iii) les inhibiteurs de la réplication du génome viral notamment les inhibiteurs de la liaison entre l'ARN viral et l'ARN polymérase ou les inhibiteurs de la polymérase NS5B qui peuvent être inhibiteurs nucléosidique ou non-nucléosidique ou les inhibiteurs des hélicases, vi) les inhibiteurs de l'assemblage viral tels que les inhibiteurs de la glycosylation. Le second groupe d'inhibiteurs comprend les « inhibiteurs de l'entrée virale » dans l'hépatocyte. Sont considérés comme tels notamment toute molécule susceptible d'inhiber partiellement ou totalement l'étape de reconnaissance de la cellule hôte par une particule virale individualisée, ou par la membrane d'une cellule hôte infectée ou l'étape d'attachement du virus ou de la membrane d'une cellule hôte infectée, à la surface cellulaire de la cellule hôte non-infectée ou l'étape d'endocytose des particules virales par la cellule hôte ou l'étape de fusion de la membrane virale avec la membrane endosomale. Le troisième comprend les « agents immunomodulateurs ». Par « agents immunomodulateurs » on entend, des molécules d'origine synthétique ou naturelle qui permettent d'initier ou de potentialiser la réponse immunitaire des mammifères au cours d'une infection virale. On peut citer à titre d'exemple d'agents immunomodulateurs, les interférons type 1 (tels que les interférons alpha (IFN-a), beta (IFN-13) ou oméga (IFN-w)), les interférons type 2 (tels que l'interféron gamma l'IFN-y) et les interférons pegylatés. Selon une première variante préférentielle, le composé selon l'invention est co- administré avec un agent additionnel destiné au traitement et/ou à la prévention d'une infection par le VHC. Ledit agent additionnel est de préférence, un inhibiteur viral tel que défini ci-dessus. L'utilisation d'une telle combinaison de plusieurs inhibiteurs permet une réduction des risques de résistance virale souvent observée dans le cadre de traitements de virus à haut taux de mutations. Avantageusement, l'agent additionnel est un agent immunomodulateur ou un inhibiteur du métabolisme viral du VHC. Selon une seconde variante préférentielle, ledit composé est le seul agent antiviral administré pour le traitement et/ou la prévention de l'infection par le virus de l'hépatite C.

Avantageusement, ledit composé est formulé sous forme d'une composition pharmaceutique. Typiquement, ladite composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable et le composé selon l'invention. Par « véhicule pharmaceutiquement acceptable », on entend tout solvant, milieu de dispersion, agent retardant l'absorption, etc., qui ne produit pas de réaction secondaire, par exemple allergique, chez l'humain ou l'animal. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables sont bien connus de l'homme de l'art, et incluent ceux décrits dans « Remington's Pharmaceutical Sciences » (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985). Le véhicule pharmaceutiquement acceptable est notamment choisi en fonction de la voie d'administration, qui peut par exemple être orale, sous-linguale, nasale, buccale, transdermique, intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire et/ou rectale. La dose dépend de facteurs tels que le principe actif considéré, le mode d'administration, l'indication thérapeutique, l'âge, le poids et l'état du patient. L'invention concerne également une méthode de traitement ou de prévention d'une infection par le VHC, comprenant l'administration à un individu en ayant besoin d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un composé de formule (I) leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables ou leurs mélanges, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques, préférentiellement, ledit composé de formule (I) est sélectionné dans le groupe constitué de la delphinidine, la Myricétine, la tricétinidine, la Pulchéllidine, l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et leurs mélanges. L'individu est de préférence un mammifère, plus particulièrement un humain. La dose thérapeutique efficace peut facilement être déterminée par l'homme du métier.

L'expression « quantité thérapeutiquement efficace » ou « dose thérapeutique efficace » utilisée dans la présente signifie la quantité d'agents antiviral tels que des composés flavonoïdes de formule (I) ou leurs dérivés provoquant une réponse biologique ou médicale dans un tissu, un système biologique animal ou humain qui comprend le soulagement des symptômes de l'infection par le VHC du fait notamment de l'inhibition du virus, l'arrêt de son développement, la diminution de la charge virale du patient ou l'éradication du virus. Aux fins de la prévention, une quantité thérapeutiquement efficace peut aussi être considérée comme un «quantité prophylactique» d'agents actifs. Les termes et expressions «patient» ou «patient qui en a le besoin » sont destinés à un mammifère humain ou non-humain affecté ou susceptible d'être affecté par le VHC.

Dans un mode de réalisation préférentiel, le patient est un être humain. Dans un autre mode de réalisation, le patient est un chimpanzé. L'objet de l'invention porte également sur une méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation d'un virus de l'hépatite C (VHC) comprenant une étape de mise en contact dudit virus de l'hépatite C avec un composé de formule (I) : dans laquelle : X est O quand a est une liaison simple ou O+ quand a est une liaison double, R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl, R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il) : OH OH OH R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement OH, R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone auquel ils sont liés, un groupement C=O, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison, a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison, sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de formule (Il) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémique. Le VHC est mis en contact avec le composé de formule (I) pendant une durée et dans des conditions suffisantes pour obtenir une inactivation ou une inhibition du virus partielle ou totale Par « infectiosité » on entend le caractère infectieux du virus, à savoir la capacité du virus en entrainer une infection virale au sens de la présente invention. Avantageusement, la méthode ex vivo selon l'invention, peut être mise en oeuvre en mettant en contact un échantillon susceptible de comprendre un VHC et un composé de formule (I) dans milieu liquide ou semi liquide, le composé de formule (I) est préférentiellement appliqué à une concentration de 0,5 à 100 µM, avantageusement, à une concentration de 10 à 80 µM voire 20 à 70 µM. Typiquement, le composé de formule (I) est appliqué à une concentration de 50µM. La méthode peut être mise en oeuvre à une température de 4 à 37°C, préférentiellement, de 4 à 10°C ou de 20 à 37°C. Le composé selon l'invention peut être mis en contact avec ledit virus durant 15 à 90 min, préférentiellement, de 30 à 45 min. Préférentiellement, selon la méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation du VHC, ledit virus de l'hépatite C est présent dans un échantillon biologique. L'expression « échantillon biologique » désigne un échantillon d'origine biologique ou prélevé sur un organisme biologique tel qu'un organe, un tissu, une cellule, une population de cellules, un fluide biologique, une protéine ou un peptide purifié. Des exemples non limitatifs comprennent des échantillons liquides d'origine biologique tel que le sang, le plasma, le sérum, le liquide céphalo-rachidien, la lymphe ou des lysats cellulaires ; des échantillons solides tels que des organes notamment destinés à la transplantation ou des tissus ou des cultures cellulaire pouvant être destinés à une greffe. Selon une variante avantageuse, la méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation du VHC selon l'invention comprend une étape additionnelle de lavage de l'échantillon biologique. Cette étape permet la réduction ou l'élimination du composé de formule (I) dudit échantillon biologique. L'étape de lavage peut être précédée d'une étape d'incubation du mélange composé de formule (I) dans ledit échantillon biologique. La méthode ex vivo selon l'invention, peut également comprendre une étape additionnelle de contrôle de l'infectiosité d'un échantillon biologique. Une telle étape peut être envisagée avant l'étape de mise en contact du composé de formule (I) avec l'échantillon biologique ou après la mise en contact ; afin de déterminer si un autre cycle de mise en contact de l'échantillon biologique avec le composé de formule (I) est à envisager. Une telle étape de contrôle peut être effectuée par tout moyen permettant en particulier, une détection rapide d'une infection par le VHC. Ainsi, une mise en évidence d'un marqueur spécifique du VHC peut être effectuée, par exemple par l'usage d'un anticorps spécifique d'une protéine virale ou par une détection par PCR de l'ARN du VHC. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh7 par le virus JFH1-RLuc en fonction de la présence de (+)-catéchine (C), (-)-épicatéchine (EC), (-)-épicatéchine-3-gallate (ECG), (-)-épigallocatéchine (EGC) et (-)-épigallocatechine-3-gallate commercialisée par EXTRASYNTHESE® (EGCG EXTRASYNTHESE®) ou par CALBIOCHEM® (EGCG de CALBIOCHEM®) à 50µM ou de DMSO. Figure 2 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh-7 par le virus JFH1-RLuc en fonction de la concentration du milieu en EGCG (0 ; 0,5 ; 5 ; 50 pM) pendant l'infection ou en prétraitement du virus à 50 pM d'EGCG avant l'étape infection. Figure 3 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh-7 infectées par des pseudoparticules virales infectieuses (VHCpp) exprimant à leur surface les protéines d'enveloppe El et E2 du virus VHC des génotypes la, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5, ou 6 ou infectées par les pseudoparticules du virus VSV exprimant la protéine d'enveloppe du VSV (VSVpp) en fonction de la présence d'EGCG (50 pM) ou de DMSO dans le milieu d'infection. Figure 4 : Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh-7 infectées par le virus de la fièvre jaune (YFV) ou le virus Sindbis (SINV) ou les cellules MDBK infectées le virus de la diarrhée bovine (BVDV) en fonction de la présence d'EGCG (50 pM) ou de DMSO dans le milieu d'infection. Figure 5 : Illustration du nombre de cellules par foyer infectieux de l'infection virale de cellules Huh-7 par le virus JFH1 en présence ou non d'EGCG (à 50 µM).

Figure 6 : Illustration du pourcentage de cellules infectées par les surnageants de cellules aux passages PO à P4 suivant que le milieu d'infection ait été traité au DMSO ou à l'EGCG. Figure 7 : Figure 7 A. Schéma illustrant les conditions expérimentales pour l'étude de l'effet inhibiteur de l'EGCG sur l'entrée du VHC (échantillon 5) et plus particulièrement sur les étapes d'attachement (échantillon 2), d'interaction avec les récepteurs de la cellule hôte (échantillon 3) et l'étape d'endocytose et de fusion des membranes virales et cellulaires (échantillon 4), le DMSO étant utilisé au titre de témoin (échantillon 1). Figure 7B. Illustration de l'infection virale relative des cellules Huh7 par le virus JFH1-RLuc en fonction de la présence de DMSO ou de d'EGCG (à 50 µM) dans les échantillons 1 à 5. EXEMPLES Matériels et méthodes Réactifs.

Le Milieu modifié de Dulbecco (Dulbecco's modified Eagle's medium DMEM; GIBCO®), le Milieu essentiel minimum de Dulbecco (Minimum Essential Medium Eagle MEM; GIBCO®), le tampon phosphate salin (phosphate-buffered saline PBS), le milieu à apport en sérum réduit (OptiMEM® de GIBCO®), la L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAXITM), le sérum de chèvre, le sérum de cheval, ainsi que le sérum de veau foetal (SVF) sont des produits commercialisés par INVITROGEN®. Le 4',6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI) a été obtenu auprès de MOLECULAR PROBES®. La (-)-Epigallocatechine Gallate (EGCG CALBIOCHEM®) et l'alcool polyvinylique (MOWIOL® 3-88) sont commercialisés par CALBIOCHEM®. Le réactif de transfection in vivo ExGen500® est commercialisé par EUROMEDEX®. La (+)-catéchine, la (-)-épicatéchine, la (-)-épicatéchine-3-gallate (ECG), la (-)-épigallocatéchine (EGC), et la (-)-épigallocatechine-3-gallate (EGCG Extrasynthèse®) sont commercialisées par la société Extrasynthèse® (Lyon, France). Les autres réactifs ont été commercialisés par la société SIGMA®.

Anticorps. Les anticorps monoclonaux de souris (MAb) dirigés contre les protéines de l'enveloppe (E) du virus de la fièvre jaune (YFV) référencé MAb 2D12 (ATCC CRL-1689) et les anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la protéine NS3 du virus de la diarrhée virale bovine (anti-BVDV) référencés NS3 MAb Osc-23 (Boulanger, D., et al., J. Gen. Virol., 1991. 7: p. 1195-1198) ont été produit in vitro en utilisant l'appareil MiniPerm® (HERAEUS®) selon les recommandations du fabriquant. Les anticorps monoclonaux de souris anti-CD81 référencés MAb 5A6 (Oren, R., et al., Mol Ce/1 Biot, 1990. 10(8): p. 4007-15) ont été aimablement fournis par S. Levy (Stanford University) et les anticorps monoclonaux anti-CD81 (référencé MAb JS-81) sont commercialisés par BD Pharmingen®. Les anticorps de chèvre conjugué Cy3 anti-IgG de souris sont commercialisés par MOLECULAR PROBES®. Lignées cellulaires et conditions de culture cellulaire La lignée cellulaire hépatique Huh-7 (Nakabayashi, H. et al ; Cancer Res, 1982. 42(9) p3858-63) ainsi que les cellules HEK 293T ont été mises en culture dans du milieu DMEM (Invitrogen®) supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-ITM) et à 10% de sérum de veau foetal. Les cellules rénales bovines de Madin-Darby (Madin-Darby Bovine Kidney MDBK) ont été mises en culture dans du milieu DMEM supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-ITM) à 10% de sérum de cheval. Les cellules BHK-21 ont été mises en culture dans du milieu MEM (Invitrogen®) supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-ITM) et à 10% de sérum de veau foetal. VHCcc. La version modifiée du plasmide codant pour le génome de l'isolat JFH1 (génotype 2a; GenBank numéro d'accès AB237837) a été aimablement fourni par M. T. Wakita (Institut National des Maladies Infectieuses, Tokyo, Japon) (Wakita, T., et al., Nat Med, 2005. 11(7): p. 791-6.). Le clone viral JFH1 modifié contient des mutations conduisant aux changements d'acides aminés suivants F172C, P173S et N534K qui ont été montrés comme induisant une augmentation de la charge virale (Delgrange, D., et al., J Gen Virol, 2007. 88(Pt 9): p. 2495-503.). De plus, la séquence El codant pour les résidus 196TSSSYMVTNDC a été modifiée afin de reconstituer l'épitope A4 (SSGLYHVTNDC) de la glycoprotéine El de VHC (Dubuisson, J., et al., J Virol, 1994. 68(10): p. 6147-60.) comme décrit dans l'état de la technique (Goueslain, L., et al., J Virol, 2010. 84(2): p. 773-87). Le plasmide JFH-Luc contient le gène de la luciférase de Renilla reniformis (RLuc) au titre de gène rapporteur et le plasmide JFH-AE1 E2-Luc contient une délétion n'entrainant 20 pas un décalage de lecture dans la région E1 E2 (Wakita, T., et al., Nat Med, 2005. 11(7): p. 791-6), tel que décrit dans l'art antérieur (Goueslain, L., et al., J Virol, 2010. 84(2): p. 773-87 et Rocha-Perugini, V., et al., PLoS ONE, 2008. 3(4): p. e 1866). Afin de générer un ARN génomique de VHC, les plasmides sont linéarisés à l'extrémité 3' de l'ADNc du VHC par une coupure au site de restriction Xbal. Consécutivement au traitement par la nucléase de haricot Mungo, l'ADN linéaire est ensuite utilisé comme matrice pour la transcription in vitro avec le kit MEGAscript® commercialisé par AMBION®. L'ARN transcrit in vitro est transfecté par électroporation dans les cellules Huh-7 tel que décrit dans l'art antérieur (Kato, T., et al., Gastroenterology, 2003. 125(6): p. 1808-17). Les extraits viraux ont été obtenus tel que décrit dans l'art antérieur (De/grange, D., et al., J Gen Virol, 2007. 88(Pt 9): p. 2495-503). Concernant les essais d'infection par les virus VHCcc, les cellules Huh-7 sont mises en culture dans des plaques 24 puits, dans lesquelles l'infection est effectuée durant 2 heures à 37°C. Concernant les essais avec le EGCG, les virus sont préincubés en présence d'EGCG pendant 45 min avant l'infection et/ou l'EGCG est ajouté au cours de l'infection avec le milieu de culture jusqu'au terme de la réaction, sauf indication contraire. Au cours de certains essais, l'EGCG est ajouté après l'étape d'infection pendant des temps variés (24, 48 ou 72 heures post-infection). Le taux d'infection est évalué par la mesure de l'activité luciférase 48 heures après l'étape d'infection dans les lysats cellulaires, par l'utilisation du kit Renilla luciferase assay system commercialisé par PROMEGA® ou par immunofluorescence avec les anticorps anti-E1 (A4) à 48 heures ou 72 heures après l'infection. VHCpp. Les particules rétrovirales pseudotypées ont été décrites par l'art antérieur (Bartosch, B., J. Dubuisson, and F.L. J Exp Med, 2003. 197(5): p. 633-42). Brièvement, les cellules 293T ont été co-transfectées avec un vecteur de transfection dérivés du virus de la leucémie murine (MLV) codant pour la luciférase (Op De Beeck, A., et al., J Virol, 2004. 78(6): p. 2994-3002.), un vecteur comportant une construction des gènes Gag-Pol du virus de la leucémie murine et un vecteur exprimant la glycoprotéine de l'enveloppe.

La co-transfection a été mise en oeuvre en utilisant le réactif de transfection Exgen® 500 dans les conditions recommandées par le fournisseur. Les plasmides suivants codant pour la glycoprotéine de l'enveloppe virale du VHC de génotype lb - UKN1 b-5.23 (AY734976) ; de génotype 2b- UKN2b-1.1 (AY734982) ; de génotype 3a - UKN3a-1.28 (AY734984) ; de génotype 4 - UKN4-11.1 (AY734986) ; de génotype 5- UKN5-14.4 (AY785283) ; de génotype 6- UKN6-5.340 (AY736194), ont été aimablement fournis par J.

Bali (Université de Nottingham, GB) (Lavillette, D., et al., Hepatology, 2005. 41(2): p. 265-74.). Le plasmide de génotype 1 a- H77 (AAB67037 avec une mutation au niveau de 3 acides aminés: R564C, V566A, G650E) a été décrit dans l'art antérieur (Bartosch, B., J. Dubuisson, et F.L. Cosset, J Exp Med, 2003. 197(5): p. 633-42.), et le plasmide de génotype 2a- JFH-1 (AB047639) a été aimablement fourni par R. Bartenschlager (Université d'Heidelberg, Allemagne). Le vecteur d'expression phCMV-G, codant pour la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV G), a été utilisé pour une production contrôlée des particules rétrovirales pseudotypées arborant les glycoprotéines de l'enveloppe VSV G sur des centres correspondant au virus de la leucémie murine (VSVpp). Les réactions de transfection par des VHCpp exprimant la luciférase ont été décrites dans la littérature (Op De Beeck, A., et al., J Virol, 2004. 78(6): p. 2994-3002.). Autres virus La lignée NADL du virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) et la lignée 17D du virus de la fièvre jaune (YFV) ont été utilisées comme contrôle. Les BVDV ont été produits comme précédemment décrit (Lecot, S., et al., J Virol, 2005. 79(16): p. 10826-9.). Les cellules MDBK ont été ensemencées sur les lamelles de plaques 24 puits et infectées 24 heures après. Les cellules sont infectées en présence d'EGCG pendant 1 heure à 37°C avec le virus BVDV à une multiplicité d'infection (MI) d'environ 1, puis elles sont mises en culture durant 15 heures. Les cellules infectées ainsi que les cellules contrôles sont rincées dans le tampon PBS, puis fixées par 3% de paraformaldéhyde, afin de subir un marquage par immunofluorescence avec les anticorps anti-NS3 MAb (osc-23). Concernant les infections YFV, les cellules Huh-7 ont été ensemencées sur des lamelles d'une plaque à 24 puits puis infectées 24 heures plus tard. Les cellules ont été infectées en présence d'EGCG pendant 1 heure à 37°C avec le virus YFV et à une MI d'environ 1, puis elles sont mises en culture durant 23 h. Les cellules infectées ainsi que les cellules témoins sont rincées dans le tampon PBS, fixées avec 3% de paraformaldéhyde. La réaction d'immunofluorescence est effectuée avec un anticorps anti-E MAb 2D12. Les échantillons de Toto1101/Luc (Bick, M.J., et al., J Virol, 2003. 77(21): p. 11555-62.), ainsi que le virus Sindbis (SINV) exprimant la luciférase (système luciferase Firefly) (aimablement fourni par M. MacDonald, Université de Rockefeller, NY, USA), ont été obtenus par électroporation de cellules BHK-21 d'ARN transcrit in vitro. Brièvement, 15µg d'ARN sont mélangés avec 4 x 106 cellules BHK-21 suivie d'une étape d'électroporation à 251.1F et 140V avec un électroporateur à ondes rectangulaires. Le surnageant est récupéré après 48heures.35

23 Microscopie d'immunofluorescence Indirecte. La procédure de détection des protéines virales immunofluorescentes exprimées dans les cellules infectées est mise en oeuvre comme décrit dans la littérature (Rouille, Y., et al., J Virol, 2006. 80(6): p. 2832-41.). Les noyaux sont colorés par une incubation de 5- min dans un tampon PBS contenant 1 pg/ml de 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI). Les lamelles sont montées sur des lames de verre en utilisant le milieu de montage Mowiol® (10% Mowiol, 25% glycérol, Tris-HCL O,1M pH 8,5) puis observées au moyen du microscope à fluorescence ZEISS® AXIOPHOT équipé avec un grossissement de 10x et 20x, des objectifs d'ouverture numérique de 0,5. Le signal fluorescence est collecté avec un appareil photo Coolsnap ES (Photometrix) utilisant spécifiquement des filtres d'excitation et d'émission de fluorescence. Les images sont assemblées et travaillées en utilisant le logiciel Adobe Photoshop®. Concernant l'étape de quantification, des images d'aires de chaque lamelle prise au hasard sont enregistrées. Les cellules marquées avec les anticorps anti-El MAb A4, anti-BVDV NS3 ou anti-YFV E sont comptabilisées au titre de cellules infectées. Le nombre total de cellules a été comptabilisé par marquage nucléaire au DAPI. Les infections sont définies comme les ratios de cellules infectées sur le nombre total de cellules. Essais de transmission de cellule à cellule des virus VHCcc. Les cellules Huh-7 mises en culture dans des plaques 24 puits sont infectées avec les VHCcc pendant 2 heures. L'inocula est éliminé et remplacé par du milieu DMEM complémenté avec du GLUTAMAX®-I, 10 % de SVF et 1% de gel d'agarose à bas point de fusion (SeaPlaque® Agarose commercialisé par LONZA®) contenant de l'EGCG (50 µM) ou un volume équivalent de Diméthyle sulfoxide (DMSO) au titre de témoin. Les cellules sont incubées à 37°C durant 3 jours au terme desquelles l'agarose est éliminé et les foyers infectieux sont détectés en utilisant l'immunofluorescence indirecte pour les protéines VHC El comme précédemment décrit. Expérimentation de liaison. Les cellules Huh-7 ont été infectées par des virus JFH-Luc pendant 1h à 4°C (attachement/étape de liaison) en présence de DMSO ou de 50 pM d'EGCG. Les cellules ont été lavées avec du PBS puis à nouveau incubées pendant une 1h à 4°C (post-attachement/ étape de fixation aux récepteurs de la cellule hôte) en présence de DMSO ou de 50 pM d'EGCG. Les cellules sont ensuite lavées afin d'éliminer l'EGCG ou le DMSO puis mise à incuber pendant 1h à 37°C en présence de DMSO ou de 50 pM d'EGCG (endocytose/ étape de fusion). Enfin, les cellules sont lavées puis mises en culture avec du milieu DMEM (Invitrogen®) supplémenté en L-alanyl-L-glutamine (GLUTAMAX-ITM) et à 10% de sérum de veau foetal à 37°C pendant 48h. Le niveau d'infection est calculé par la mesure de l'activité luciférase dans les lysats cellulaires en utilisant le kit Reni/ta luciferase assay system commercialisé par PROMEGA®.

Exemple 1 Test de l'effet des différentes catéchines de thé vert sur l'infection du virus VHC Des cellules Huh-7 ont été infectées par du virus JFH1-Rluc pendant 2h en présence de DMSO ou de 50µM de différentes catéchines à savoir : la (+)-catéchine (C), la (-)-épicatéchine (EC), la (-)-épicatéchine-3-gallate (ECG), la (-)-épigallocatéchine (EGC) et la (-)-épigallocatechine-3-gallate commercialisée par EXTRASYNTHESE® (EGCG EXTRASYNTHESE®) ou par CALBIOCHEM® (EGCG de CALBIOCHEM®). Ces compositions d'EGCG diffèrent par leur degré de pureté EXTRASYNTHESE® >99%, CALBIOCHEM® > 95%. Le DMSO étant utilisé comme solvant pour les différentes catéchines, il sert d'essais contrôle. OH OH OH OH HO U 7 HO OH OH HO OH OH OH OH OH (+)-catéchine (C) (-)-épicatéchine (EC) (-)-épigallocatéchine EGC OH OH (-)-épicatéchine-3-gallate ECG (-)-épigallocatéchine-3-gallate (EGCG)

Les cellules ont été lysées 48h après l'infection et l'expression de la luciférase est quantifiée. La mesure de l'infection virale relative des cellules Huh7 par le virus JFH1-RLuc 25 en fonction de la catéchine présente dans le milieu au cours de l'infection (figure 1), permet clairement de constater que ni la (+)-catéchine, ni l'(-)-épicatéchine n'induit OH OH HO l'inhibition de l'infection virale par le VHC. En effet, la mesure de l'infection virale relative est identique à celle observée pour le DMSO. En revanche, on remarque que l'EGCG qu'il soit commercialisé par CALBIOCHEM® ou par EXTRASYNTHESE® montre un effet antiviral majeur avec une inhibition de l'infection virale supérieure à 95%. Concernant les molécules ECG et EGC un effet antiviral est également constaté, néanmoins, avec un taux d'inhibition de l'infection virale inférieur, de l'ordre d'environ 40% et 80% respectivement. La mesure de l'infection virale relative en présence de ECG ou d'EGO comparativement à l'EGCG, suggère un effet additif du groupement 3,4,5-trihydroxy- phényl en C2 de l'hétérocycle chromane et cette même structure retrouvée dans le groupement galloyle en C3 de l'hétérocycle chromane sur le rôle antiviral de l'EGCG. Les molécules d'EGCG qu'elles soient fournies par CALBIOCHEM® ou par EXTRASYNTHESE®, ayant un effet identique quant à l'inhibition de l'infection par VHC, seul l'EGCG fourni par CALBIOCHEM® sera exemplifié par la suite.

Exemple 2 Des cellules Huh-7 cultivées in vitro ont été infectées pendant 2 heures par le virus JFH1-RLuc en présence de doses croissantes d'EGCG (0 ; 0,5 ; 5 ; 50 pM) ou par le virus préalablement incubé 45 minutes avec de l'EGCG (50 pM). Après infection, les cellules sont lavées avec du milieu de culture DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal et incubées dans ce même milieu. Quarante-huit heures après infection, les cellules sont lysées et l'activité Renilla luciférase est quantifiée au luminomètre après incubation de 20 pL de lysat cellulaire avec le substrat de la luciférase. La figure 2 montre que l'inhibition de l'infection virale par l'EGCG est dose dépendante.

A 50 pM l'EGCG diminue l'infection virale de cellules Huh-7 en culture d'un facteur supérieur à 10 (IC50 = 5 µM). Or, la réplication virale n'est pas affectée par l'EGCG (résultats non montrés). En conséquence, l'EGCG inhibe les premières étapes de l'infection virale, à savoir, les étapes permettant l'entrée du virus dans la cellule. Par contre, aucun effet de l'EGCG n'est observé sur l'entrée virale, si les cellules non-infectées sont traitées par la molécule avant ou après infection. Par conséquent, l'inhibition induite par l'EGCG agit directement sur le virus et non sur la cellule hôte. Cette hypothèse est confortée par l'observation d'une augmentation de l'effet inhibiteur de l'EGCG lorsque le virus est incubé avec la molécule avant infection (prétraitement 50 µM).

Exemple 3 Les protéines de l'enveloppe virale jouent un rôle prépondérant dans l'entrée virale. En effet, en plus de permettre l'interaction avec le(s) récepteur(s) cellulaire(s) hôte, ces protéines permettent d'induire la fusion entre les enveloppes virale et cellulaire. Afin d'étudier l'effet de l'EGCG sur les premières étapes d'infection par le VHC, un model d'étude de référence a été utilisé permettant l'expression de glycoprotéines de l'enveloppe virale d'intérêt : ce sont les pseudoparticules virales infectieuses. Différents génotypes du virus VHC sont présents dans la population mondiale. Ainsi, afin de déterminer la spécificité de l'effet inhibiteur de l'EGCG quant au génotype viral du VHC, différents génotypes de glycoprotéines d'enveloppe El et E2 du virus VHC ont été étudiés. Ont été produites, les pseudoparticules virales infectieuses (VHCpp) exprimant à leur surface les protéines d'enveloppe El et E2 du virus VHC des génotypes 1 a, 1 b, 2a, 2b, 3, 4, 5, et 6 ; et, à titre de contrôle, les pseudoparticules du virus VSV exprimant la protéine d'enveloppe du VSV (VSVpp). Les différentes pseudoparticules produites expriment la luciférase afin de quantifier l'infection. Pour ce faire, des cellules Huh-7 ont été infectées pendant 2 heures par les pseudoparticules VHCpp des différents génotypes testés ou par les pseudoparticules VSVpp en présence d'EGCG à 50 pM ou de DMSO. Le DMSO étant le solvant de l'EGCG, il est utilisé comme contrôle. A quarante-huit heures post-infection, les cellules sont lysées et l'activité luciférase est quantifiée au luminomètre après incubation de 20 pL de lysat cellulaire avec le substrat de la luciferase. Bien que sans effet sur l'infection par le VSVpp, l'EGCG (à 50 µM) a un effet inhibiteur sur l'infection des VHCpp de tous les génotypes testés (Figure 3). En conséquence, l'effet inhibiteur de l'EGCG implique directement les glycoprotéines de l'enveloppe virale. Ainsi, l'inhibition de l'entrée virale médiée par l'EGCG est soit due à une inhibition de l'étape d'attachement à savoir les premières interactions avec le(s) récepteur(s) cellulaire(s) hôte soit une inhibition de l'étape de fusion entre les enveloppes virale et cellulaire, soit ces deux étapes. Par ailleurs, l'usage des VHCpp exprimant les glycoprotéines virales des différents génotypes viraux montre que l'EGCG est un antiviral efficace du VHC quelque soit le génotype testé. On observe une infection relative pratiquement nulle en présence d'EGCG, lors d'une infection par les VHCpp de génotype 1 b, 2a, 2b et 4. Les infections relatives observées sont très basses pour les génotypes 1 a, 3a, 5 et 6, soit entre 5 et 13%. Ainsi, alors qu'une infection par les VSVpp induit la mesure d'une infection relative de 85% en présence d'EGCG, une infection par les VHCpp quelque soit le génotype concerné induit la mesure d'une infection relative entre 13 à 0% en présence d'EGCG. 26 Ces résultats montrent le fort potentiel de l'EGCG comme antiviral dans le traitement de l'hépatite C quelque soit le génotype viral. En outre, il est important de noter que le génotype 1 de VHC qui est le plus réfractaire aux traitements actuels et le génotype majoritaire dans la population européenne et américaine est également inhibé par l'EGCG. Exemple 4 L'exemple 2 démontre le caractère antiviral de l'EGCG à l'encontre du VHC indépendamment de son génotype. L'exemple 2 démontre de plus, que cet effet est spécifique de l'VHC puisque l'EGCG n'inhibe pas l'infection par le VSV. Or, alors que l'VHC est un virus à ARN simple brin à polarité positive, le VSV est un virus à ARN à sens négatif non segmenté. Ainsi, afin de déterminer le niveau de spécificité de l'EGCG au sein même des virus à ARN simple brin positif, des expériences d'infection en présence d'EGCG ont été réalisées avec d'autres virus de la famille des Flaviviridae.

Ont été testés le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus Sindbis (SINV) et le virus de la diarrhée bovine (BVDV). Les infections sont réalisées soit en présence de DMSO soit d'EGCG à 50 pM. Les cellules infectées par ces différents virus ont été les Huh-7 pour le YFV ou le SINV et les cellules MDBK pour le BVDV. La quantification de l'infection a été réalisée par immunofluorescence après marquage des cellules infectées avec un anticorps anti-E (2D12) pour le virus YFV ou un anticorps anti-NS3 (osc23) pour le virus BVDV. Une étape de révélation avec un anticorps secondaire marqué au Cy3 est ensuite réalisée. Concernant le virus SINV, ce dernier exprimant la luciférase, la mesure de l'infection relative a été réalisée par la quantification de la luciférase. La quantification de l'infection en fonction de la présente d'EGCG ou de DMSO dans le milieu au cours de l'infection des cellules par les virus YFV, BVDV et SINV (figure 4) montre clairement que l'EGCG n'a pas d'effet inhibiteur de l'infection cellulaire par l'un quelconque de ces virus. En conséquence, l'EGCG n'est pas un antiviral pour les autres membres de la famille des Flaviviridae. L'effet antiviral de l'EGCG est donc spécifique au VHC.

Exemple 5 Les résultats décrits précédemment montrent que l'EGCG inhibe l'entrée du virus dans les cellules en culture. Un deuxième mode d'infection virale est la transmission du virus de cellule à cellule. Pour déterminer si l'EGCG inhibe également la propagation du virus de cellule à cellule, des cellules Huh-7 ont été infectées par le virus JFH1 pendant 2 heures, puis incubées dans un milieu contenant 1% d'agarose en présence ou non d'EGCG (à 50 µM). L'agarose évite l'infection des cellules par le virus sécrété dans le milieu et permet ainsi de visualiser la transmission du virus de cellules à cellules par contact des cellules entre elles.

A soixante-douze heures post-infection, les cellules sont fixées et l'infection est détectée par immunofluorescence après marquage par un anticorps anti-El. Une étape de révélation est ensuite réalisée avec un anticorps secondaire couplé au Cy3. Les noyaux sont colorés au marquage DAPI. Le nombre de cellules par foyer infectieux est quantifié (Figure 5). En présence d'EGCG les foyers infectieux sont beaucoup plus petits.

Ils contiennent en moyenne 3-4 cellules infectées montrant que le virus ne s'est pas propagé après avoir infecté une cellule. Par contre, les foyers contrôles contiennent en moyenne 45 cellules infectées. Au vu de ce qui précède, l'EGCG est un inhibiteur de la propagation du virus VHC de cellule à cellule. L'EGCG semble être un bon candidat comme antiviral pour empêcher la réinfection d'un foie sain après une greffe chez un patient infecté. Exemple 6 Des expériences d'infection successives en présence ou non d'EGCG à partir de surnageants de cellules infectées ont été menées afin de tester l'efficacité de l'EGCG sur la virulence d'un surnageant de cellules infectées, ainsi que ses capacités d'éradication du virus de surnageants de culture infectés. Des cellules Huh-7 ont été infectées par le virus VHC JFH1 (P0). Du DMSO ou 50 pM d'EGCG ont été ajoutés post-infection. Le surnageant de culture est collecté après 48 heures puis utilisé pour infecter des cellules saines en présence de DMSO ou de 50 pM d'EGCG (P1). Le surnageant de cette culture (P1) est collecté à son tour après 48 heures et utilisé pour réinfecter des cellules saines (P2). Cette procédure est reproduite encore deux fois (jusqu'à P4). Le nombre de cellules infectées a été quantifié à chaque passage par immunofluorescence après marquage des cellules avec un anticorps dirigé contre la protéine d'enveloppe virale E1 (A4). Le nombre total de cellules est quantifié par comptage des noyaux après coloration au marquage DAPI.

L'étude du pourcentage de cellules infectées à chaque passage d'un surnageant d'une culture à une autre en fonction l'adjonction d'EGCG ou de DMSO (figure 6), montre que l'EGCG permet une élimination du VHC du surnageant de culture dès le troisième passage et une complète élimination au quatrième passage. Ceci permet de conclure que l'EGCG est un bon candidat comme molécule curative chez les patients infectés par le VHC.

Exemple 7 L'entrée du VHC dans la cellule hôte est composée de 3 étapes i) l'attachement du virus ou d'une cellule hôte infectée à la surface de la cellule hôte non infectée, ii) l'interaction avec le(s) récepteur(s) spécifique(s) viraux et iii) la fusion de l'enveloppe lipidique virale et de la cellule hôte infectée (membrane plasmique ou endosomale) permettant l'introduction du génome viral dans le cytoplasme de la cellule infectée. Afin de déterminer laquelle de ces étapes est inhibée par l'EGCG, l'entrée virale a été fractionnée de sorte à étudier séparément l'effet inhibiteur de l'EGCG sur chacune de ces étapes (voir figure 7 A).

L'étape d'attachement des particules virales aux cellules s'effectue par une mise en présence du virus suivie d'une incubation d'une heure à 4°C. La seconde étape s'effectue par incubation des cellules pendant une heure à 4°C après retrait des inocula viraux, permettant aux virus attachés de renforcer leur attachement avec leurs récepteurs. A 4°C, le processus d'endocytose est bloqué. Ainsi, la troisième étape d'endocytose et de fusion des membranes virales et cellulaires s'effectue à 37°C durant une heure. Du DMSO ou 50 µM d'EGCG sont ajoutés durant ces différentes étapes suivant les échantillons concernés comme représenté sur le diagramme (Figure 7A). Ainsi, l'échantillon 1 est l'échantillon témoin ayant reçu du DMSO au cours de la première étape. Les autres échantillons correspondant à l'adjonction de 50 µM d'EGCG durant l'étape d'attachement (échantillon 2), d'interaction avec les récepteurs de la cellule hôte (échantillon 3), d'endocytose et de fusion de l'enveloppe lipidique virale et de la cellule hôte infectée (échantillon 4) ou durant l'ensemble des trois étapes de l'entrée (échantillon 5). Les cellules sont ensuite incubées pendant 45h à 37°C puis lysées afin de quantifier l'activité luciférase. L'infection est exprimée en pourcentage de l'activité luciférase mesurée sans l'EGCG. Les expériences sont réalisées en triplicate et les valeurs données correspondent aux valeurs moyennes de ces trois différentes expériences. Comme montré à la figure 7B, une forte réduction de l'infection est observée lorsque l'EGCG est ajouté dès l'étape d'attachement (échantillons 2 et 5). Par contre, l'EGCG ne semble pas avoir d'effet sur l'étape d'interaction avec les récepteurs de la cellule hôte (échantillon 3) ou lors de l'étape d'endocytose ou de fusion (échantillon 4). L'ensemble de ces résultats démontre que l'EGCG inhibe les étapes précoces de liaison du VHC à la membrane plasmique de la cellule hôte à s'avoir l'étape d'attachement du VHC à la cellule hôte. 29

Claims (1)

1. REVENDICATIONS1.- Composé de formule (I) dans laquelle : X est O quand a est une liaison simple ou O+ quand a est une liaison double, R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl, R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il) OH OH OH R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou 15 un groupement OH, R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone auquel ils sont liés, un groupement C=O, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison, a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double 20 liaison, sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de formule (Il) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange 25 d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques, pour une utilisation comme agent antiviral dans le traitement et/ou la prévention d'une infection par le virus de l'hépatite C (VHC). 31

   2.- Composé pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'infection d'une cellule hépatocytaire par le VHC et/ou de la transmission du VHC d'une cellule hépatocytaire infectée à une cellule hépatocytaire non-infectée.

   3.- Composé pour son utilisation la revendication 2, caractérisé en ce que ledit composé est un agent antiviral par inhibition de l'entrée du VHC dans une cellule hépatocytaire non-infectée. 10

   4.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le traitement et/ou la prévention de l'infection par le VHC est destiné à un patient résistant ou intolérant au traitement d'une infection par le VHC par un agent immunomodulateur et/ou par un inhibiteur du métabolisme viral. 15

   5.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit composé est sélectionné dans le groupe constitué de l'épigallocatéchine (EGC), l'épigallocatéchine gallate (EGCG), la gallocatéchine (GC), la catéchine gallate (CG), la gallocatéchine gallate (GCG), l'épicatéchine (EC), l'épicatéchine gallate (ECG), leurs sels et esters pharmaceutiquement acceptables, et 20 leurs mélanges.

   6.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit composé est l'épigallocatéchine gallate (EGCG) ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables.

   7.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit composé est co-administré avec un agent additionnel destiné au traitement et/ou à la prévention d'une infection par le VHC. 30

   8.- Composé pour son utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que ledit composé est le seul agent antiviral administré pour le traitement et/ou la prévention de l'infection par le VHC.

   9.- Méthode ex vivo de réduction de l'infectiosité ou d'inactivation d'un virus de 35 l'hépatite C (VHC), ladite méthode comprenant une étape de mise en contact dudit VHC avec un composé de formule (I) 25 510dans laquelle : X est O quand a est une liaison simple ou O+ quand a est une liaison double, R1 et R2 sont indépendamment l'un de l'autre un atome d'hydrogène, un groupement hydroxyle ou un groupement méthoxyl, R3, R5 et R7 sont indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène, un groupement OH, un groupement 0-glycosyle, un alcoxyle en (C1-C18) ou un groupement de formule (Il) OH OH OH R4 et R6 sont indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un groupement OH, R4' est un atome d'hydrogène ou R4' est avec R4 et l'atome de carbone 15 auquel ils sont liés, un groupement C=O, lorsque a est une simple liaison ou R4' n'est rien lorsque a est une double liaison, a et b identiques ou différents étant soit une simple liaison, soit une double liaison, sous réserve qu'au moins l'un des groupes R3, R5 et R7 est un groupement de 20 formule (Il) et/ou R1 et R2 sont l'un et l'autre des groupements OH, ou un de ses sels ou esters pharmaceutiquement acceptables, ledit composé de formule (I) étant sous forme de stéréoisomère pur ou sous forme de mélange d'énantiomères et/ou de diastéréoisomères, y compris de mélanges racémiques. 25

   10.- Méthode ex vivo d'inactivation selon la revendication 9, dans laquelle ledit VHC est présent dans un échantillon biologique.